CN111812217B - 一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度的方法，可以一次性对5种抗动脉粥样硬化药物进行检测，目标药物与代谢产物同时监测，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.0分钟之内完成血浆中抗动脉粥样硬化药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血浆中抗动脉粥样硬化药物的定量分析，为临床上血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度监测提供简单快速的检测方法。

Description

一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度的方法
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度的方法，其中抗动脉粥样硬化药物分别为：阿托伐他汀(Atorvastatin，ATT)、邻羟基阿托伐他汀(o-Hydroxy Atorvastatin，o-HATT)、对羟基阿托伐他汀(p-HydroxyAtorvastatin，p-HATT)、瑞舒伐他汀(Rosuvastatin，ROS)和地高辛(Digoxin，DGX)。
背景技术
根据中国心血管疾病报告报告，心血管疾病是中国居民疾病死亡的主要原因。高血压和高脂血症通常并存，是心血管疾病(CVD)进展和发展的基础。高脂血症是动脉粥样硬化进展的主要危险因素，动脉粥样硬化又会导致一些心血管并发症，如冠心病，缺血性脑血管疾病和外周血管疾病。高脂血症是指包括脂肪，脂肪酸，胆固醇，胆固醇酯，磷脂和甘油三酸酯在内的脂质在血液中的升高，控制高脂血症对于预防动脉粥样硬化及其相关疾病很重要。
3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂(他汀类药物)，是最有效、耐受性最好、应用最广泛的降脂药物，被认为是高脂血症的一线治疗药物。阿托伐他汀(ATO)是有效的3-羟基-3-甲基戊二烯基(HMG)-CoA还原酶的合成抑制剂，可降低总胆固醇和血浆甘油三酸酯。对羟基阿托伐他汀(p-HATT)和邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)是阿托伐他汀在体内经过肝药酶代谢，得到两种活性代谢产物。这三种他汀类药物是最常用的降胆固醇药物，由于其高疗效和安全性，已在许多国家广泛用于治疗高脂血症。在全球范围内，阿托伐他汀(ATV)钙(纽约辉瑞制药公司的
Figure BDA0002515229350000011
)是最畅销的处方药。
在他汀类药物中，瑞舒伐他汀(ROS)为新型降血脂药，于2003年8月在美国批准用于治疗血脂异常，广泛应用于治疗高胆固醇血症和预防冠状动脉疾病。由于其独特的特性，例如选择性摄入肝细胞，优异的结合亲和力和在酶活性位点的紧密结合相互作用，它对胆固醇和甘油三酯的降低作用最大，是最有效和有效的他汀类药物之一。
然而，相当一部分接受他汀类药物治疗的患者未能达到目标。造成这种失败的原因包括患者依从性差、药物反应的变异性以及他汀类药物剂量方面问题。由于他汀类药物单一疗法的局限性，可以联合地高辛治疗，进一步降低血脂水平。
地高辛是一种广泛用于治疗充血性心力衰竭的强心苷，其药用用途于1785年被Withering首次提出。其治疗范围较窄(0.8-2.0ng/mL)，增加了地高辛使用的复杂性，因此，地高辛药代动力学的微小变化可能导致治疗效果下降或潜在的严重毒性。
目前针对血浆抗动脉粥样硬化药物体内浓度检测的文献专利有报道，比如中国专利申请(公布号：CN 107102079 A)公开了一种“检测人血浆中阿托伐他汀及代谢物的液相色谱-串联质谱方法及临床药学研究应用”同时检测3种药物，样本量需要100μL，且需要氮吹浓缩，前处理复杂；此外还有文献报告针对其中一种或几种此类药物进行检测，效率相对比较低，存在单个样品分析时间长、灵敏度低、线性范围不适宜、样品前处理复杂和进样量大，基质效应干扰等不足。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度的方法。
本发明的技术方案如下：
一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度的方法，
所述抗动脉粥样硬化药物分别为：阿托伐他汀(ATT)、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)、瑞舒伐他汀(ROS)和地高辛(DGX)。
所述抗动脉粥样硬化药物对应的内标物分别为：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)和地高辛-d3(DGX-d3)。
血浆样本通过蛋白沉淀后，振荡、离心取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗动脉粥样硬化药物，先利用超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述抗动脉粥样硬化药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.005％～0.1％甲酸-1～5mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1×50mm，1.8μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为80～100:20～0；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至40:60；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例；每个样品采集时间为5.0分钟；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸和甲酸铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中抗动脉粥样硬化药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗癫痫药物的分离和检测。在一种优选方案中，流动相A为0.01％～0.1％甲酸-2～5mM甲酸铵水溶液，在不影响本发明效果的情况下，优选地，流动相A为0.05％甲酸-2mM甲酸铵水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用乙腈和0.005％～0.1％甲酸-1～5mM甲酸铵水溶液作为流动相，色谱柱型号为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1×50mm，1.8μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强，准确度和精密度基本满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用阿托伐他汀-d5(ATT-d5)、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)和地高辛-d3(DGX-d3)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中的抗动脉粥样硬化药物时的重现性、准确度均较好。
在一种优选方案中，流动相A和流动相B的初始比例为85～95:15～5。进一步优选地，流动相A和流动相B的初始比例为90:10。
在一种优选方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为30～50℃，优选为40℃。
在一种方案中，进样体积为0.2～5μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗动脉粥样硬化药物时，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.05％甲酸-2mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1×50mm，1.8μm)；
流动相A和流动相B的初始比例为90:10；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至40:60；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至90:10；每个样品采集时间为5.0分钟。梯度洗脱方式具体见表1；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL；
表1流动相梯度洗脱参数
时间(min) 流速(mL/min) ％A ％B Curve
0.0 0.3 90 10 -
1.0 0.3 40 60 6
3.0 0.3 2 98 6
5.0 0.3 90 10 1
(2)质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各个目标物的质谱参数见表3。
表2质谱源参数
Figure BDA0002515229350000041
表3抗动脉粥样硬化药物检测质谱参数
Figure BDA0002515229350000042
Figure BDA0002515229350000051
本发明提及的血浆为人或动物的血浆。
本发明提及的经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为甲醇与异丙醇混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比为1:1～3；更优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比1:2。
在一种优选方案中，本发明提及的经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白质沉淀剂，振荡3～5min，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样；所述蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比1:2。
在一种更优选方案中，本发明提及的经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比为1:2),高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
在一种方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
以甲醇配制如下同位素内标母液：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)20μg/mL、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)4μg/mL、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)4μg/mL、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)20μg/mL和地高辛-d3(DGX-d3)5μg/mL。
分别移取各同位素内标母液：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)10μL、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)10μL、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)10μL、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)10μL和地高辛-d3(DGX-d3)10μL；再加入至950μL甲醇中得到1mL混合内标溶液。
取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种方案中，上述蛋白质沉淀剂为甲醇与异丙醇混合溶液；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比为1:1～3；更优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与异丙醇的体积比为1:2。
在一种优选方案中，本发明提及的含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
以甲醇配制如下同位素内标母液：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)20μg/mL、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)4μg/mL、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)4μg/mL、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)20μg/mL和地高辛-d3(DGX-d3)5μg/mL。
分别移取各同位素内标母液：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)10μL、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)10μL、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)10μL、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)10μL和地高辛-d3(DGX-d3)10μL；再加入至950μL甲醇中得到1mL混合内标溶液。
取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比为1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。其中，蛋白沉淀剂中包含：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)2ng/mL、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)0.4ng/mL、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)0.4ng/mL、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)2ng/mL和地高辛-d3(DGX-d3)0.5ng/mL。
在一种方案中，本发明提及的标准品按照如下方法制备：
将上述抗动脉粥样硬化药物配制成如下浓度的标准品母液：阿托伐他汀(ATT)500μg/mL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)100μg/mL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)100μg/mL、瑞舒伐他汀(ROS)500μg/mL和地高辛(DGX)100μg/mL；
分别移取各标准品母液：阿托伐他汀(ATT)10μL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)10μL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)10μL、瑞舒伐他汀(ROS)10μL和地高辛(DGX)10μL；再加入至950μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液。在混合标准品储备液中包含：阿托伐他汀(ATT)5000ng/mL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)1000ng/mL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)1000ng/mL、瑞舒伐他汀(ROS)5000ng/mL和地高辛(DGX)1000ng/mL。
将上述混合标准储备溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
阿托伐他汀(ATT)和瑞舒伐他汀(ROS)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL。
邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)和地高辛(DGX)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。
在一种优选方案中，空白血浆基质为不含抗动脉粥样硬化目标药物的空白血浆。
在一种更优选方案中，本发明将混合标准品储备液以空白血浆基质(不含抗动脉粥样硬化目标药物的空白血浆)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL混合标准品储备液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点。
七个不同校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比为1:2),高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
本发明还包括制备质控品，其中，质控品为含有抗动脉粥样硬化药物的空白血浆，分低、中、高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)；
QC(L)为上述混合标准储备溶液以空白血浆基质稀释至5000倍。
QC(M)为上述混合标准储备溶液以空白血浆基质稀释至500倍。
QC(H)为上述混合标准储备溶液以空白血浆基质稀释至50倍。
优选地，空白血浆基质为不含抗动脉粥样硬化目标药物的空白血浆。
在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准储备溶液以不含抗动脉粥样硬化目标药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体见表4所示。
表4质控品对应浓度(单位:ng/mL)
Figure BDA0002515229350000071
QC(L)中包含：阿托伐他汀(ATT)1ng/mL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)0.2ng/mL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)0.2ng/mL、瑞舒伐他汀(ROS)1ng/mL和地高辛(DGX)0.2ng/mL。
QC(M)中包含：阿托伐他汀(ATT)10ng/mL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)2ng/mL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)2ng/mL、瑞舒伐他汀(ROS)10ng/mL和地高辛(DGX)2ng/mL。
QC(H)中包含：阿托伐他汀(ATT)100ng/mL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)20ng/mL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)20ng/mL、瑞舒伐他汀(ROS)100ng/mL和地高辛(DGX)20ng/mL。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度的方法，可以一次性对5种抗动脉粥样硬化药物进行检测，目标药物与代谢产物同时监测，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.0分钟之内完成血浆中抗动脉粥样硬化药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血浆中抗动脉粥样硬化药物的定量分析，为临床上血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度监测提供简单快速的检测方法。
附图说明
图1为抗动脉粥样硬化药物标准品的提取离子流色谱图；
图2为血浆中抗动脉粥样硬化药物的提取离子流色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一、实验材料与仪器
1.材料
本实施例实验的样本来自于北京301医院2019年11月份门诊收集的血浆样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级异丙醇(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；色谱柱型号：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1×50mm，1.8μm)(Agilent Corporation)。
(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见表5
表5标准品和内标
序号 中文名称 厂家
1 阿托伐他汀 TRC
2 阿托伐他汀-d5 TRC
3 邻羟基阿托伐他汀 clearsynth
4 邻羟基阿托伐他汀-d5 TRC
5 对羟基阿托伐他汀 TRC
6 对羟基阿托伐他汀-d5 isoreag
7 瑞舒伐他汀 TRC
8 瑞舒伐他汀-d3 TRC
9 地高辛 TRC
10 地高辛-d3 TRC
(4)质控品：含有抗动脉粥样硬化药物的空白血浆，分低、中、高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体见表4所示。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.05％甲酸-2mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18(2.1×50mm，1.8μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；脱溶剂气温度为400℃，脱溶剂气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；质谱源参数如表2所示，同时监测了各目标物及其对应同位素内标，各个目标物的质谱参数见表3。
三、实验过程
(1)标准品配制：
将抗动脉粥样硬化药物配制成如下浓度的标准品母液：阿托伐他汀(ATT)500μg/mL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)100μg/mL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)100μg/mL、瑞舒伐他汀(ROS)500μg/mL和地高辛(DGX)100μg/mL。
分别移取各标准品母液：阿托伐他汀(ATT)10μL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)10μL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)10μL、瑞舒伐他汀(ROS)10μL和地高辛(DGX)10μL；再加入至950μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液。在混合标准品储备液中包含：阿托伐他汀(ATT)5000ng/mL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)1000ng/mL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)1000ng/mL、瑞舒伐他汀(ROS)5000ng/mL和地高辛(DGX)1000ng/mL。
将上述混合标准储备溶液以空白血浆基质(不含抗动脉粥样硬化目标药物的空白血浆)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL混合标准品储备液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点。
所述校准品溶液的七个浓度点为：
阿托伐他汀(ATT)和瑞舒伐他汀(ROS)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL。
邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)和地高辛(DGX)的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.1ng/mL、0.25ng/mL、0.5ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。
(2)含内标的蛋白沉淀剂配制
以甲醇配制如下同位素内标母液：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)20μg/mL、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)4μg/mL、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)4μg/mL、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)20μg/mL和地高辛-d3(DGX-d3)5μg/mL。
分别移取各同位素内标母液：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)10μL、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)10μL、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)10μL、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)10μL和地高辛-d3(DGX-d3)10μL；再加入至950μL甲醇中得到1mL混合内标溶液。
取200uL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比为1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。其中，蛋白沉淀剂中包含：阿托伐他汀-d5(ATT-d5)2ng/mL、邻羟基阿托伐他汀-d5(o-HATT-d5)0.4ng/mL、对羟基阿托伐他汀-d5(p-HATT-d5)0.4ng/mL、瑞舒伐他汀-d3(ROS-d3)2ng/mL和地高辛-d3(DGX-d3)0.5ng/mL。
(3)质控品配制：
取上述混合标准储备溶液以不含抗动脉粥样硬化目标药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体见表4所示。
QC(L)中包含：阿托伐他汀(ATT)1ng/mL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)0.2ng/mL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)0.2ng/mL、瑞舒伐他汀(ROS)1ng/mL和地高辛(DGX)0.2ng/mL。
QC(M)中包含：阿托伐他汀(ATT)10ng/mL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)2ng/mL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)2ng/mL、瑞舒伐他汀(ROS)10ng/mL和地高辛(DGX)2ng/mL。
QC(H)中包含：阿托伐他汀(ATT)100ng/mL、邻羟基阿托伐他汀(o-HATT)20ng/mL、对羟基阿托伐他汀(p-HATT)20ng/mL、瑞舒伐他汀(ROS)100ng/mL和地高辛(DGX)20ng/mL。
(4)样品处理
1)标准品处理：七个不同校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比为1:2)，高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
2)血浆样品前处理：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与异丙醇的体积比为1:2),高速振荡5min；在14000r/min，4℃离心5min后；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血浆样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：抗动脉粥样硬化药物的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗动脉粥样硬化药物标准品提取离子流色谱图，图2为血浆中抗动脉粥样硬化药物提取离子流色谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。抗动脉粥样硬化药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表6。
表6抗动脉粥样硬化药物线性回归方程及线性相关系数
Figure BDA0002515229350000111
Figure BDA0002515229350000121
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血浆样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理测定5次，结果显示，抗动脉粥样硬化药物的加标回收率在97.0％-110.0％之间，5次重复试验的RSD在2.11％-9.71％范围，统计结果见表7。
表7抗动脉粥样硬化药物添加回收率结果
Figure BDA0002515229350000122
4.精密度试验：取无干扰空白血浆样本，加入不同浓度抗动脉粥样硬化药物标准品，得到低、中、高三个浓度血浆样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗动脉粥样硬化药物的浓度，批内精密度为1.11-14.09％，三日内分3批处理，计算批间精密度为3.51-10.04％，结果见表8。
表8批内及批间精密度试验结果
Figure BDA0002515229350000123
Figure BDA0002515229350000131
Figure BDA0002515229350000141
五、讨论
本发明采用ID-UPLC-MS/MS方法测定了人体血浆中的抗动脉粥样硬化药物的浓度。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗动脉粥样硬化药物的加标回收率为97.0％-110.0％之间，5次重复试验的RSD为2.11％-9.71％，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗动脉粥样硬化药物的批内精密度为1.11-14.09％，批间精密度为3.51-10.04％。且建立的血浆样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血浆用量仅50μL。
总之，本发明的检测方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，5.0分钟之内可完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度的定量分析，为临床上血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (6)

1.一种检测血浆中抗动脉粥样硬化药物浓度的方法，其特征在于，
所述抗动脉粥样硬化药物分别为：阿托伐他汀、邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和地高辛；
所述抗动脉粥样硬化药物对应的内标物分别为：阿托伐他汀-d5、邻羟基阿托伐他汀-d5、对羟基阿托伐他汀-d5、瑞舒伐他汀-d3和地高辛-d3；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗动脉粥样硬化药物，先利用超高效液相色谱将待测物与血浆基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算上述抗动脉粥样硬化药物的含量，具体色谱条件为：
（1）超高效液相色谱条件：
流动相A：0.05%甲酸-2mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，所述流动相A和流动相B的初始比例为90:10；所述梯度洗脱过程如下：在0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至40:60；在1.0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至2:98；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至初始比例；每个样品采集时间为5.0 分钟；
（2）质谱条件：
在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式，毛细管电压为3.0kV（ESI+）；源温度为120℃；脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流速为800 L/h，锥孔气流速为150 L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标；
所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50 μL血浆于1.5 mL离心管中，向其中加入200 µL含内标的蛋白质沉淀剂，振荡3~5 min，在12000~15000 r/min，1~5℃离心4~10min后，转移离心管中的上清液60 μL至塑料内衬管中，待进样；
所述含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：以甲醇配制如下同位素内标母液：阿托伐他汀-d5 20 μg/mL、邻羟基阿托伐他汀-d5 4 μg/mL、对羟基阿托伐他汀-d5 4 μg/mL、瑞舒伐他汀-d3 20 μg/mL和地高辛-d3 5 μg/mL；
分别移取各同位素内标母液：阿托伐他汀-d5 10μL、邻羟基阿托伐他汀-d5 10μL、对羟基阿托伐他汀-d5 10μL、瑞舒伐他汀-d3 10μL和地高辛-d3 10μL；再加入至950μL甲醇中得到1mL混合内标溶液；取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL的体积比为1:2甲醇与异丙醇中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流速为0.2~0.5 mL/min；柱温为30~50℃；进样体积为0.2~5 µL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述流速为0.3 mL/min；所述柱温为40℃；所述进样体积为1 µL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物的血浆。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述标准品按照如下方法制备：
将上述抗动脉粥样硬化药物配制成如下浓度的标准品母液：阿托伐他汀 500 μg/mL、邻羟基阿托伐他汀 100 μg/mL、对羟基阿托伐他汀 100 μg/mL、瑞舒伐他汀 500 μg/mL和地高辛100 μg/mL；
分别移取各标准品母液：阿托伐他汀 10μL、邻羟基阿托伐他汀 10μL、对羟基阿托伐他汀 10μL、瑞舒伐他汀 10μL和地高辛10μL；再加入至950μL甲醇中得到1mL混合标准储备溶液；
将上述混合标准储备溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
阿托伐他汀和瑞舒伐他汀的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.5 ng/mL、1.25 ng/mL、2.5 ng/mL、12.5 ng/mL、25 ng/mL、125 ng/mL、250 ng/mL；
邻羟基阿托伐他汀、对羟基阿托伐他汀和地高辛的浓度相同，其七个浓度点为依次为：0.1 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述空白血浆基质为不含抗动脉粥样硬化目标药物的空白血浆。
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