CN111812224A - 一种检测血清中抗痴呆药物浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测血清中抗痴呆药物浓度的方法，前处理操作简单、快捷、样本用量少、分析时间短，4.5min之内可完成血清中3种抗痴呆药物的分离和检测；采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量；可同时满足临床上高通量样本检测需求，为临床上抗痴呆药物的浓度监测提供简单快速的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体一种检测血清中抗痴呆药物浓度的方法，其中，抗痴呆药物分别为：美金刚(Memantine，MMT)、卡巴拉汀(Rivastigmine，RVT)和多奈哌齐(Donepezil，DNP)。
背景技术
治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring，TDM)是针对不同患者个体，量体裁衣式地制定给药方案的一种方法。通过定量测定血清或血清中药物浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低毒副作用。
传统的微生物法费时且烦琐；而免疫分析法成本昂贵，专一性差，难以实现高通量检测，关键问题由于代谢产物的存在，抗体可能交叉反应使测定结果偏高。目前，液相色谱串联质谱技术(LC-MS/MS)因特异性强、灵敏度高、高通量等优点已经广泛应用于TDM的检测，临床上多种治疗药物的同时监测具有重要意义。
多奈哌齐(DNP)为新一代特异的可逆性中枢乙酰胆碱酯酶(AchE)抑制剂，它可逆性地抑制乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱的水解，从而提高乙酰胆碱的浓度，能够增加大脑乙酰胆碱含量，是目前治疗早、中期阿尔茨海默症的有效药物。由于多奈哌齐治疗窗较窄，体内代谢过程存在较大的个体差异，所以对其血液中药物浓度的检测是调整剂量，减少不良反应的重要参考，在临床用药中具有重大意义。
美金刚(MMT)是一种非竞争性N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，它可以阻断谷氨酸浓度病理性升高导致的神经元损伤，从而防止细胞凋亡，达到增强脑的记忆功能，临床上主要用于治疗阿尔茨海默病和血管性痴呆方面具有显著的疗效和较好的耐受性。
卡巴拉汀(RVT)是一种氨基甲酸类的乙酰胆碱酯酶抑制剂，它通过延缓胆碱能神经元所释放的乙酰胆碱的降解而促进胆碱能神经传导，是国内外临床应用最普遍的阿尔茨海默型痴呆症状改善类药物。
以上涉及的抗痴呆药物，目前已有文献报道采用HPLC-UV、GC-MS和LC-MS/MS法测定人体或动物血清中的药物含量，文献“Simultaneous determination of antidementiadrugs in human plasma:Procedure transfer from HPLC–MS to UPLC–MS/MS”报道一种液质联用检测血浆中抗痴呆药方法，前处理复杂，需要氮吹，样本需要量大，每个样本250μL等，另外一些报道大部分采用液液萃取法或需要衍生化处理血清样品，存在操作步骤繁琐、血清用量大、单个样品分析时间长、灵敏度低等缺点。再比如，中国专利号(CN 110361483A)公开了“一种血液中多奈哌齐药物浓度监测试剂盒及其检测方法”，该方法是采用多维在线固相萃取液相色谱法只测定了血液中的多奈哌齐药物，虽操作简单，但样本用量大(需4mL)、灵敏度低(定量限10ng/mL)，且分析时间长达17分钟。
综上所述，现有方法存在检测时间长、检测项目单一、效率低，而且基本都是采用外标法或与待测物相近的化学物质作为内标进行定量分析，受基质效应影响较大，缺乏准确性。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种检测血清中抗痴呆药物浓度的方法。
本发明的技术方案如下：
一种检测血清中抗痴呆药物浓度的方法，
所述抗痴呆药物分别为：美金刚(MMT)、卡巴拉汀(RVT)和多奈哌齐(DNP)；
上述抗痴呆药物对应的同位素内标物分别为：美金刚-d3(MMT-d3)、卡巴拉汀-d4(RVT-d4)和多奈哌齐-d7(DNP-d7)；
血清样本中加入混合内标工作液涡旋均匀，加入蛋白沉淀剂，涡旋振荡，离心后取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗痴呆药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中抗痴呆药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.001％～0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Thermo Scientific Hypersil BDS C18(4.0×50mm，3μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由92:8匀速渐变至40:60；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至5:95；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至92:8；每个样品采集时间为4.5min；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血清中抗痴呆药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，4.5min之内完成抗痴呆药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.01％～0.1％甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.01％甲酸水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.001％～0.1％甲酸水溶液和乙腈作为流动相，色谱柱型号：ThermoScientific Hypersil BDS C18(4.0×50mm，3μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，4.5min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用美金刚-d3(MMT-d3)、卡巴拉汀-d4(RVT-d4)和多奈哌齐-d7(DNP-d7)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中抗痴呆药物时的重现性、准确度均较好。
在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.4mL/min。
进一步地，柱温为30～50℃，优选为45℃。
更进一步地，进样体积为0.2～10μL，优选为1μL。
本发明提及的甲酸水溶液的浓度一般指体积浓度。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗痴呆药物时，具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：0.01％甲酸-水溶液；
流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Thermo Scientific Hypersil BDS C18(4.0×50mm，3μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由92:8匀速渐变至40:60；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至5:95；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至92:8；每个样品采集时间为4.5min；具体梯度洗脱过程见表1；流速为0.4mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL；
表1流动相梯度洗脱参数
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物MMT(180.0→163.1)、RVT(251.2→206.1)和DNP(380.1→90.9)以及同位素内标MMT-d3(183.1→166.1)、RVT-d4(255.2→210.1)和DNP-d7(387.2→98.0)；各个目标物的去簇电压和碰撞电压等参数，见表2。
表2抗痴呆药物检测质谱参数
本发明提及的血清为人或动物血清。
在一种方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；其中，蛋白质沉淀剂为异丙醇、甲醇和乙腈混合溶液。
优选地，蛋白质沉淀剂中异丙醇、甲醇和乙腈的体积比1:1～2:1～3，在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中异丙醇、甲醇和乙腈的体积比1:1:2。
在一种优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入430μL蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇和乙腈的体积比1:1～2:1～3)，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
在一种更优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋数秒后振荡5s；加入430μL蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇和乙腈的体积比1:1:2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
在一种方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：
将0.1mg/mL美金刚-d3(MMT-d3)同位素内标母液、0.1mg/mL卡巴拉汀-d4(RVT-d4)同位素内标母液和0.1mg/mL多奈哌齐-d7(DNP-d7)同位素内标母液以甲醇配制成包含有1000ng/mL美金刚-d3(MMT-d3)、1000ng/mL卡巴拉汀-d4(RVT-d4)和500ng/mL多奈哌齐-d7(DNP-d7)的混合内标溶液。
取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇，混合均匀得混合内标工作液。
在一种优选方案中，混合内标工作液按照如下方法制备：
依次取10μL 0.1mg/mL美金刚-d3(MMT-d3)同位素内标母液、10μL 0.1mg/mL卡巴拉汀-d4(RVT-d4)同位素内标母液和5μL 0.1mg/mL多奈哌齐-d7(DNP-d7)同位素内标母液，加至975μL甲醇中配制成包含有1000ng/mL美金刚-d3(MMT-d3)、1000ng/mL卡巴拉汀-d4(RVT-d4)和500ng/mL多奈哌齐-d7(DNP-d7)的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇，混合均匀得混合内标工作液。其中，混合内标工作液中包含：100ng/mL美金刚-d3(MMT-d3)、100ng/mL卡巴拉汀-d4(RVT-d4)和50ng/mL多奈哌齐-d7(DNP-d7)。
在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
将0.2mg/mL美金刚(MMT)标准品母液、0.1mg/mL卡巴拉汀(RVT)标准品母液和1mg/mL多奈哌齐(DNP)标准品母液以甲醇配制成包含有10000ng/mL美金刚(MMT)、5000ng/mL卡巴拉汀(RVT)和20000ng/mL多奈哌齐(DNP)的混合标准溶液；
将上述混合标准溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
美金刚(MMT)的七个浓度依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；
卡巴拉汀(RVT)的七个浓度依次为：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL和250ng/mL；
多奈哌齐(DNP)的七个浓度依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。
进一步地，空白血清基质为不含抗痴呆目标药物的空白血清。
在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
依次取50μL 0.2mg/mL美金刚(MMT)标准品母液、50μL 0.1mg/mL卡巴拉汀(RVT)标准品母液和20μL 1mg/mL多奈哌齐(DNP)标准品母液，加至880μL甲醇中配制成包含有10000ng/mL美金刚(MMT)、5000ng/mL卡巴拉汀(RVT)和20000ng/mL多奈哌齐(DNP)的混合标准溶液。
将上述混合标准溶液以空白血清基质(不含抗痴呆目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点。
每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋数秒后振荡5s；加入430μL蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇和乙腈的体积比1:1:2),高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
本发明还包括制备质控品，所述质控品为含有抗痴呆药物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。其中，
QC(L)为上述混合标准溶液以空白血清基质稀释至5000倍；
QC(M)为上述混合标准溶液以空白血清基质稀释至500倍；
QC(H)为上述混合标准溶液以空白血清基质稀释至50倍。
优选地，空白血清基质为不含抗痴呆目标药物的空白血清。
在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准溶液以不含抗痴呆目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表3所示。
表3抗痴呆药物质控品对应浓度(单位ng/mL)
QC(L)中包含：2ng/mL美金刚(MMT)、1ng/mL卡巴拉汀(RVT)和4ng/mL多奈哌齐(DNP)。
QC(M)中包含：20ng/mL美金刚(MMT)、10ng/mL卡巴拉汀(RVT)和40ng/mL多奈哌齐(DNP)。
QC(H)中包含：200ng/mL美金刚(MMT)、100ng/mL卡巴拉汀(RVT)和400ng/mL多奈哌齐(DNP)。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供一种检测血清中抗痴呆药物浓度的方法，前处理操作简单、快捷、样本用量少、分析时间短，4.5min之内可完成血清中3种抗痴呆药物的分离和检测；采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量；可同时满足临床上高通量样本检测需求，为临床上联合应用提供药动学参考。
附图说明
图1为抗痴呆药物标准品的提取离子流色谱图；
图2为血清样本中抗痴呆药物标准品的提取离子流色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一、实验材料与仪器
1.材料
样本来自于北京301医院2019年9月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱：Thermo Scientific Hypersil BDS C18(4.0×50mm，3μm)。
(3)标准品：多奈哌齐标准品购自于百灵威，多奈哌齐同位素内标、卡巴拉汀和美金刚标准品及其同位素内标均购自于TRC。
(4)质控品：含有抗痴呆药物的空白血清基质，分低中高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表3所示。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.01％甲酸-水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：ThermoScientific Hypersil BDS C18(4.0×50mm，3μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.4mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。各目标待测物的质谱采集参数见表2。
三、实验过程
(1)标准品配制：
依次取50μL 0.2mg/mL美金刚(MMT)标准品母液、50μL 0.1mg/mL卡巴拉汀(RVT)标准品母液和20μL 1mg/mL多奈哌齐(DNP)标准品母液，加至880μL甲醇中配制成包含有10000ng/mL美金刚(MMT)、5000ng/mL卡巴拉汀(RVT)和20000ng/mL多奈哌齐(DNP)的混合标准溶液。
将上述混合标准溶液以空白血清基质(不含抗痴呆目标药物的空白血清)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点。
所述校准品溶液的七个浓度点为：
美金刚(MMT)的七个浓度依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；
卡巴拉汀(RVT)的七个浓度依次为：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL和250ng/mL；
多奈哌齐(DNP)的七个浓度依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。
(2)混合内标工作液配制
依次取10μL 0.1mg/mL美金刚-d3(MMT-d3)同位素内标母液、10μL 0.1mg/mL卡巴拉汀-d4(RVT-d4)同位素内标母液和5μL 0.1mg/mL多奈哌齐-d7(DNP-d7)同位素内标母液，加至975μL甲醇中配制成包含有1000ng/mL美金刚-d3(MMT-d3)、1000ng/mL卡巴拉汀-d4(RVT-d4)和500ng/mL多奈哌齐-d7(DNP-d7)的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇，混合均匀得混合内标工作液。其中，混合内标工作液中包含：100ng/mL美金刚-d3(MMT-d3)、100ng/mL卡巴拉汀-d4(RVT-d4)和50ng/mL多奈哌齐-d7(DNP-d7)。
(3)质控品配制：
取上述混合标准溶液以不含抗痴呆目标药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表3所示。
QC(L)中包含：2ng/mL美金刚(MMT)、1ng/mL卡巴拉汀(RVT)和4ng/mL多奈哌齐(DNP)。
QC(M)中包含：20ng/mL美金刚(MMT)、10ng/mL卡巴拉汀(RVT)和40ng/mL多奈哌齐(DNP)。
QC(H)中包含：200ng/mL美金刚(MMT)、100ng/mL卡巴拉汀(RVT)和400ng/mL多奈哌齐(DNP)。
(4)样品处理
1)标准品前处理：每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋数秒后振荡5s；加入430μL蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇和乙腈的体积比1:1:2),高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋数秒后振荡5s；加入430μL蛋白沉淀剂(异丙醇、甲醇和乙腈的体积比1:1:2),高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：抗痴呆药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗痴呆药物标准品的提取离子流色谱图；图2为血清样本中抗痴呆药物标准品的提取离子流色谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗痴呆药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表4。
表4抗痴呆药物线性回归方程及线性相关系数
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，抗痴呆药物的加标回收率在92.05％-110.07％之间，5次重复试验的RSD在1.95％-7.01％范围，参见表5。
表5抗痴呆药物加标回收率结果(单位ng/mL)
4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度抗痴呆药物标准溶液，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，以同位素内标法定量测定抗痴呆药物的浓度，批内精密度为1.74-7.42％，三日内分3批处理，计算批间精密度为4.49-11.75％，结果见表6。
表6批内批间精密度测试结果(浓度单位：ng/mL)
五、讨论
本发明采用高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定了人体血清中的多奈哌齐、美金刚和卡巴拉汀三种抗痴呆药物的浓度。该方法同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。再者，因为临床样本极其珍贵，因此前处理样本量尽量少，且进样量大也会严重污染仪器，增加仪器维护成本。
以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗痴呆药物的加标回收率为92.05％-110.07％之间，5次重复试验的RSD在1.95％-7.01％，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗痴呆药物的批内精密度为1.74-7.42％，批间精密度为4.49-11.75％，方法的重现性良好。且建立的血清样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血清用量少仅50μL。
总之，本发明的检测方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，4.5min之内可完成化合物的分离和检测，基质效应、提取回收率以及精密度满足要求，可用于临床上血清抗痴呆药物浓度的定量分析，为临床上抗痴呆药物浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种检测血清中抗痴呆药物浓度的方法，
所述抗痴呆药物分别为：美金刚、卡巴拉汀和多奈哌齐；
上述抗痴呆药物对应的同位素内标物分别为：美金刚-d3、卡巴拉汀-d4和多奈哌齐-d7；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗痴呆药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中抗痴呆药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.001％～0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：Thermo Scientific Hypersil BDS C18；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由92:8匀速渐变至40:60；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由40:60匀速渐变至5:95；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由5:95匀速渐变至92:8；每个样品采集时间为4.5min；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.01％～0.1％甲酸水溶液；流速为0.2～0.5mL/min；柱温为30～50℃；进样体积为0.2～10μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.01％甲酸水溶液；所述流速为0.4mL/min；所述柱温为45℃；所述进样体积为1μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血清为人或动物血清。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为异丙醇、甲醇和乙腈混合溶液；优选地，所述蛋白质沉淀剂中异丙醇、甲醇和乙腈的体积比1:1～2:1～3；更优选地，所述蛋白质沉淀剂中异丙醇、甲醇和乙腈的体积比1:1:2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，涡旋后加入430μL蛋白沉淀剂，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样；所述蛋白质沉淀剂中异丙醇、甲醇和乙腈的体积比1:1:2。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，
所述混合内标工作液按照如下方法制备：
将0.1mg/mL美金刚-d3同位素内标母液、0.1mg/mL卡巴拉汀-d4同位素内标母液和0.1mg/mL多奈哌齐-d7同位素内标母液以甲醇配制成包含有1000ng/mL美金刚-d3、1000ng/mL卡巴拉汀-d4和500ng/mL多奈哌齐-d7的混合内标溶液；
取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇，混合均匀得混合内标工作液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述标准品按照如下方法制备：
将0.2mg/mL美金刚标准品母液、0.1mg/mL卡巴拉汀标准品母液和1mg/mL多奈哌齐标准品母液以甲醇配制成包含有10000ng/mL美金刚、5000ng/mL卡巴拉汀和20000ng/mL多奈哌齐的混合标准溶液；
将上述混合标准溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
美金刚的七个浓度依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；
卡巴拉汀的七个浓度依次为：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL和250ng/mL；
多奈哌齐的七个浓度依次为：2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述混合内标工作液按照如下方法制备：
依次取10μL 0.1mg/mL美金刚-d3同位素内标母液、10μL 0.1mg/mL卡巴拉汀-d4同位素内标母液和5μL 0.1mg/mL多奈哌齐-d7同位素内标母液，加至975μL甲醇中配制成包含有1000ng/mL美金刚-d3、1000ng/mL卡巴拉汀-d4和500ng/mL多奈哌齐-d7的混合内标溶液；取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇，混合均匀得混合内标工作液；
所述混合标准溶液按照如下方法制备：
依次取50μL 0.2mg/mL美金刚标准品母液、50μL 0.1mg/mL卡巴拉汀标准品母液和20μL1mg/mL多奈哌齐标准品母液，加至880μL甲醇中配制成包含有10000ng/mL美金刚、5000ng/mL卡巴拉汀和20000ng/mL多奈哌齐的混合标准溶液。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述空白血清基质为不含抗痴呆目标药物的空白血清。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116183783A (zh) * | 2023-04-27 | 2023-05-30 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 一种同时检测血液中6种药物浓度的方法 |
| CN118032984A (zh) * | 2024-02-23 | 2024-05-14 | 山东省食品药品检验研究院 | 一种同时测定人血浆中美金刚和多奈哌齐浓度的lc-ms/ms方法 |
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| CN109655568A (zh) * | 2019-01-22 | 2019-04-19 | 杭州度安医学检验实验室有限公司 | 高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒 |
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2020
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Patent Citations (1)
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