CN111812222A - 超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法 - Google Patents

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，这些药物分别为：安非他酮、阿戈美拉汀、羟安非他酮、去甲替林、o‑去甲文拉法辛、米安色林、米氮平、文拉法辛、阿米替林、多虑平、去甲氟西汀、度洛西汀、氟西汀、氟伏沙明、西酞普兰、帕罗西汀、曲唑酮和伏硫西汀。血清样本经预处理后，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中药物的含量。本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，4.5min之内可完成分离和检测，准确度和精密度基本满足要求。

Description

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的 方法
技术领域
本发明属于血液检测技术领域，具体涉及超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法。
背景技术
目前抑郁症常用的治疗药物根据其作用机制分为：去甲肾上腺素再摄取抑制剂、5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂(SSRI)、5-HT和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)、去甲肾上腺素和特异性的5-HT能抗抑郁药(NaSSA)、5-HT2受体拮抗药和5-HT再摄取抑制剂、去甲肾上腺素和多巴胺再摄取抑制剂和褪黑素受体激动药。
国内外文献报道中测定人血清或血浆中抗抑郁药的方法主要有HPLC-UV法、GC-MS法和LC-MS/MS法，比如文献“Quantification of 33antidepressants by LC-MS/MS—comparative validation in whole blood,plasma and serum”报道一种液液萃取检测33种抗抑郁药方法，但是前处理需要液液萃取，氮吹浓缩等复杂程序，每个样本采集需要30分钟。比如，中国专利(CN108982714A)公开了“一种简便高效检测人血浆中文拉法辛及其活性代谢物o-去甲文拉法辛浓度的方法”，该发明是将500μL血浆样本加入乙醚进行液液萃取，然后氮吹后复溶进样，再通过高效液相荧光法检测待测物浓度；此发明前处理费时费力，样本用量大，而且单个样本的分析时间较长。另，中国专利(CN 109655568A)公开了一种“高效液质联用同时测定35种精神药物的方法及试剂盒”，该发明虽前处理简单，但使用外标法定量，准确性差。再比如，西北药学杂志2019年11月第34卷第6期题为“LC-MS/MS法同时测定人血浆中氟西汀、去甲氟西汀、帕罗西汀和氟伏沙明的质量浓度”，该发明使用200μL血浆进行蛋白沉淀，样本用量大；使用罗红霉素作为所有待测物的内标，缺乏普遍适用性和准确性，可能会存在基质效应干扰；4种药物的线性范围均相同，未经临床验证，缺乏合理性。此外，因为临床样本极其珍贵，因此前处理样本量尽量要少，且进样量大会严重污染仪器，增加仪器维护成本。本发明采用单一方法评估不同抗抑郁药将会大大简化和方便实验室监测，满足临床的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，
血清样本通过预处理取上清进样，先利用超高效液相色谱将抗抑郁药物浓度与血清基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算抗抑郁药物的含量。具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：水(含0.01％甲酸)；
流动相B：甲醇(含0.01％甲酸)；
色谱柱：Phenomenex Kintex C18(2.1×100mm，2.6μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，见表1；所述梯度洗脱过程如下：
在0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15匀速渐变至25:75；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由25:75匀速渐变至3:97；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由3:97匀速渐变至85:15；流速为0.4mL/min，每个样品采集时间为4.5min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
表1流动相梯度洗脱参数
Figure BDA0002517885920000021
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标；各个目标物的去簇电压和碰撞电压等参数，见表2：
表2抗抑郁药物检测质谱参数
Figure BDA0002517885920000022
Figure BDA0002517885920000031
所述的抗抑郁药物选自BPP、AML、HBPP、NTP、NVLF、MAS、MTZ、VLF、ATP、DXP、NFXT、DLX、FXT、FVX、CTP、PXT、TZD、VXT中的一种或多种。
其中，所述的血清为人或动物的血清。
作为本发明的一种优选，所述流动相A为0.005％-0.05％甲酸水溶液，进一步优选为0.01％甲酸水溶液；所述流动相B为0.005％-0.05％甲酸甲醇溶液，进一步优选为0.01％甲酸甲醇溶液；所述流速为0.4mL/min；所述柱温为45℃；所述进样体积为1μL。
作为本发明的一种优选，血清样本的预处理方法为：将血清样本经蛋白沉淀后，振荡、离心取上清。
其中，所述的蛋白沉淀采用的蛋白沉淀剂优选甲醇、乙腈中的任意一种,或甲醇和乙腈的混合溶剂，进一步优选为甲醇和乙腈体积比1:2的混合溶剂。
本发明所述的预处理的血清样本的方法进一步优选为：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋数秒后振荡5s；加入430μL甲醇/乙腈＝1:2(V/V)，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
作为本发明的一种优选，所述的混合内标工作液按如下方法制备得到：
称取各同位素内标物，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成同位素内标母液，分别为1mg/mL BPP-d9、0.1mg/mL AML-d6、0.1mg/mL HBPP-d6、0.1mg/mL NVLF-d6、0.1mg/mL NTP-d3、0.1mg/mL MAS-d3、0.1mg/mL MTZ-d3、0.1mg/mL VLF-d6、0.1mg/mL ATP-d3、0.1mg/mLDXP-d3、0.1mg/mL NFXT-d5、0.1mg/mL DLX-d7、0.1mg/mL FXT-d5、0.1mg/mL FVX-d3、0.1mg/mL CTP-d4、0.1mg/mL PXT-d6、0.1mg/mL TZD-d6和0.01mg/mL VXT-d8的同位素内标母液。
上述各同位素内标母液再用甲醇溶液配制成包含有2000ng/mL BPP-d9、200ng/mLAML-d6、2000ng/mL HBPP-d6、1000ng/mL NVLF-d6、500ng/mL NTP-d3、200ng/mL MAS-d3、500ng/mL MTZ-d3、1000ng/mL VLF-d6、1000ng/mL ATP-d3、500ng/mL DXP-d3、1000ng/mLNFXT-d5、500ng/mL DLX-d7、1000ng/mL FXT-d5、1000ng/mL FVX-d3、200ng/mL CTP-d4、200ng/mL PXT-d6、2000ng/mL TZD-d6和100ng/mL VXT-d8的混合内标溶液。
取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇溶液，混合均匀得混合内标工作液。
作为本发明的一种优选，所述的标准溶液按照如下步骤制备得到：
称取各待测物标准品，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成标准品母液，分别为5mg/mL BPP、2mg/mL AML、5mg/mL HBPP、2mg/mL NTP、0.2mg/mL MAS、4mg/mL MTZ、5mg/mL VLF、2mg/mL ATP、2mg/mL DXP、5mg/mL NFXT、2mg/mL DLX、5mg/mL FXT、4mg/mL FVX、0.5mg/mLCTP、2mg/mL PXT、5mg/mL TZD、1mg/mL VXT和1mg/mL NVLF的标准品母液。
上述各标准品母液再用甲醇溶液配制成包含有100000ng/mL BPP、10000ng/mLAML、100000ng/mL HBPP、20000ng/mL NTP、10000ng/mL MAS、20000ng/mL MTZ、50000ng/mLVLF、50000ng/mL ATP、20000ng/mL DXP、50000ng/mL NFXT、20000ng/mL DLX、50000ng/mLFXT、40000ng/mL FVX、10000ng/mL CTP、10000ng/mL PXT、100000ng/mL TZD、5000ng/mLVXT和200000ng/mL NVLF的混合标准溶液。
将上述混合标准溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品样本，配制过程如下：
取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点。
所述校准品样本的七个浓度点为：
AML/MAS/CTP/PXT的浓度相同，依次为1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL；
BPP/HBPP/TZD的浓度相同，依次为10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL和5000ng/mL；
NTP/MTZ/DXP/DLX的浓度相同，依次为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；
VLF/ATP/NFXT/FXT的浓度相同，依次为5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL和2500ng/mL；
NVLF的浓度依次为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL和10000ng/mL；
FVX的浓度依次为4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL；
VXT的浓度依次为0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL和250ng/mL；
七个不同浓度校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋数秒后振荡5s；加入430μL甲醇/乙腈＝1:2(V/V)，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，取1μL进样。
有益效果：本发明前处理过程简单、灵敏度高、样本用量少、单个样品分析时间短、通量高，4.5min之内完成血清中18种抗抑郁药物的分离和检测，采用同位素内标定量法准确度高，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上联合用药的药代动力学及临床研究，为临床上抗抑郁药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为抗抑郁药物标准品的提取离子流色谱图
图2为血清中抗抑郁药物的提取离子流色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
1.材料
方法学研究实验的样本来自于南京鼓楼医院2019年10月份门诊收集的血清样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；色谱柱：Phenomenex Kintex C18(2.1×100mm，2.6μm)(Phenomenex)。
(3)标准品：本专利涉及的所有抗抑郁药物的标准品购买信息如表3所示。
表3标准品购买信息
Figure BDA0002517885920000061
Figure BDA0002517885920000071
(4)质控品：含有本专利涉及的抗抑郁药物分子的血清溶液，分低中高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表4所示。
表4质控品对应浓度(单位：ng/mL)
Figure BDA0002517885920000072
Figure BDA0002517885920000081
2.方法
(1)色谱条件：流动相A：水(含0.01％甲酸)；流动相B：甲醇(含0.01％甲酸)。色谱柱型号：Phenomenex Kintex C18(2.1×100mm，2.6μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.4mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标，各目标物的去簇电压和碰撞电压等参数，见表2。
(3)标准品配制：
1)混合内标工作液的配制：
分别准确移取一定体积的抗抑郁药物同位素内标母液，加入860μL甲醇溶液，混匀得到1mL混合内标溶液，见表5；
取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇溶液，混合均匀得混合内标工作液。建议分装冻存在-80℃冰箱，即取即用。浓度参见下表5。
表5混合内标工作溶液配制
Figure BDA0002517885920000082
Figure BDA0002517885920000091
2)混合标准溶液的配制
分别准确移取一定体积的抗抑郁药物标准母液，加入555μL甲醇溶液，充分混匀得到1mL混合标准溶液，见表6。
表6混合标准溶液的配制
Figure BDA0002517885920000092
3)标曲的配制：
将上述混合标准溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品样本，配制过程如下：
取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点。
七个不同浓度点的校准品样本S1～S7分别为：
S1:包含AML/MAS/CTP/PXT各1ng/mL，BPP/HBPP/TZD各10ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各2ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各5ng/mL，NVLF20 ng/mL，FVX4ng/mL，VXT 0.5ng/mL；
S2:包含AML/MAS/CTP/PXT各2.5ng/mL，BPP/HBPP/TZD各25ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各5ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各12.5ng/mL，NVLF 50ng/mL，FVX10ng/mL，VXT 1.25ng/mL；
S3:包含AML/MAS/CTP/PXT各5ng/mL，BPP/HBPP/TZD各50ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各10ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各25ng/mL，NVLF 100ng/mL，FVX20ng/mL，VXT 2.5ng/mL；
S4:包含AML/MAS/CTP/PXT各25ng/mL，BPP/HBPP/TZD各250ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各50ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各125ng/mL，NVLF 500ng/mL，FVX100ng/mL，VXT 12.5ng/mL；
S5:包含AML/MAS/CTP/PXT各50ng/mL，BPP/HBPP/TZD各500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各100ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各250ng/mL，NVLF 1000ng/mL，FVX 200ng/mL，VXT25ng/mL；
S6:包含AML/MAS/CTP/PXT各250ng/mL，BPP/HBPP/TZD各2500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各500ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各1250ng/mL，NVLF 5000ng/mL，FVX 1000ng/mL，VXT125ng/mL；
S7:包含AML/MAS/CTP/PXT各250ng/mL，BPP/HBPP/TZD各2500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各500ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各1250ng/mL，NVLF 5000ng/mL，FVX 1000ng/mL，VXT125ng/mL。
(4)质控品的配制
低浓度质控品：将中浓度质控用混合血清稀释10倍。
中浓度质控品：用混合血清稀释混合标准溶液500倍，得中浓度质控样品。
高浓度质控品：用混合血清稀释混合标准溶液50倍，得高浓度质控样品。
(5)样品处理
1)校准品前处理：每个浓度点样品取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋数秒后振荡5s；加入430μL甲醇/乙腈＝1:2(V/V)，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋数秒后振荡5s；加入430μL甲醇/乙腈＝1:2(V/V)，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)，QC(M)，QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后跟血清样品前处理方法一致，此处不再赘述。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：抗抑郁药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗抑郁药物标准品的提取离子流色谱图；图2为血清中抗抑郁药物的提取离子流色谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗抑郁药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.990以上，满足定量要求，见表7。
表7抗抑郁药物线性回归方程及线性相关系数
Figure BDA0002517885920000111
Figure BDA0002517885920000121
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果显示，抗抑郁药物的加标回收率在91.60％-109.88％之间，5次重复试验的RSD在0.75％-7.81％范围，见表8。
表8抗抑郁药物在血清中加标回收率结果
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4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度抗抑郁药物标准品，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，以同位素内标法定量测定抗抑郁药物的浓度，批内精密度为1.20-10.81％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.95-12.74％，计算批间精密度结果见表9。
五、讨论
本研究建立了一种超高效液相色谱串联质谱技术(UPLC-MS/MS)，同时测定人体血清中18种抗抑郁药物的方法。针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。再者，因为临床样本极其珍贵，因此前处理样本量尽量少，且进样量大也会严重污染仪器，增加仪器维护成本。本发明采用单一方法评估不同抗抑郁药将会大大简化和方便实验室监测，满足临床的需求。
以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗抑郁药物的加标回收率为91.60％-109.88％之间，5次重复试验的RSD为0.75％-7.81％，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗抑郁药物的批内精密度为1.20-10.81％，批间精密度为2.95-12.74％，方法的重现性良好。实验为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，考察了不同流动相及电解质的种类和浓度，并尽可能实现化合物和基质干扰的基线分离。且建立的血清样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血清用量仅50μL。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，4.5min之内可完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清抗抑郁药物的定量分析，为临床上抗抑郁药物浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
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Claims (9)

1.超高效液相色谱串联质谱技术同时检测血清中抗抑郁药物的方法，其特征在于，血清样本通过预处理后取上清进样，先利用超高效液相色谱将抗抑郁药物与血清基质分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算抗抑郁药物的含量；具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：含0.001％～0.1％甲酸水溶液；
流动相B：含0.001％～0.1％甲酸甲醇溶液；
色谱柱：Phenomenex Kintex C18(2.1×100mm，2.6μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0-2.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15匀速渐变至25:75；在2.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由25:75匀速渐变至3:97；在2.5-4.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由3:97匀速渐变至85:15；流速为0.2～0.5mL/min，每个样品采集时间为4.5min，柱温为30～50℃，进样体积为0.2～10μL；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标；
所述的抗抑郁药物选自BPP、AML、HBPP、NTP、NVLF、MAS、MTZ、VLF、ATP、DXP、NFXT、DLX、FXT、FVX、CTP、PXT、TZD、VXT中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，其特征在于，所述的血清为人或动物的血清。
3.根据权利要求1所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，其特征在于，所述流动相A为0.005％-0.05％甲酸水溶液，优选为0.01％甲酸水溶液；所述流动相B为0.005％-0.05％甲酸甲醇溶液，优选为0.01％甲酸甲醇溶液；所述流速为0.4mL/min；所述柱温为45℃；所述进样体积为1μL。
4.根据权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，其特征在于，血清样本的预处理方法为：将血清样本经蛋白沉淀后，振荡、离心取上清。
5.根据权利要求4所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，其特征在于，所述的蛋白沉淀采用的蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈中的任意一种,或甲醇和乙腈的混合溶剂，优选为甲醇和乙腈体积比1:2的混合溶剂。
6.根据权利要求5所述的高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，其特征在于，所述的血清样本的预处理方法为：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入20μL混合内标工作液，然后涡旋数秒后振荡5s；加入430μL所述的蛋白沉淀剂，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中待进样。
7.根据权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，其特征在于，所述的混合内标工作液按如下方法制备得到：
称取各同位素内标物，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成同位素内标母液，分别为1mg/mL BPP-d9、0.1mg/mL AML-d6、0.1mg/mL HBPP-d6、0.1mg/mL NVLF-d6、0.1mg/mL NTP-d3、0.1mg/mL MAS-d3、0.1mg/mL MTZ-d3、0.1mg/mL VLF-d6、0.1mg/mL ATP-d3、0.1mg/mL DXP-d3、0.1mg/mL NFXT-d5、0.1mg/mL DLX-d7、0.1mg/mL FXT-d5、0.1mg/mL FVX-d3、0.1mg/mLCTP-d4、0.1mg/mL PXT-d6、0.1mg/mL TZD-d6和0.01mg/mL VXT-d8的同位素内标母液；
上述各同位素内标母液再用甲醇溶液配制成包含有2000ng/mL BPP-d9、200ng/mLAML-d6、2000ng/mL HBPP-d6、1000ng/mL NVLF-d6、500ng/mL NTP-d3、200ng/mL MAS-d3、500ng/mL MTZ-d3、1000ng/mL VLF-d6、1000ng/mL ATP-d3、500ng/mL DXP-d3、1000ng/mLNFXT-d5、500ng/mL DLX-d7、1000ng/mL FXT-d5、1000ng/mL FVX-d3、200ng/mL CTP-d4、200ng/mL PXT-d6、2000ng/mL TZD-d6和100ng/mL VXT-d8的混合内标溶液；
取100μL混合内标溶液，加入900μL甲醇溶液，混合均匀得混合内标工作液。
8.根据权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，其特征在于，标准溶液按照如下步骤制备得到：
称取各待测物标准品，分别加入纯甲醇完全溶解，配制成标准品母液，分别为5mg/mLBPP、2mg/mL AML、5mg/mL HBPP、2mg/mL NTP、0.2mg/mL MAS、4mg/mL MTZ、5mg/mL VLF、2mg/mL ATP、2mg/mL DXP、5mg/mL NFXT、2mg/mL DLX、5mg/mL FXT、4mg/mL FVX、0.5mg/mL CTP、2mg/mL PXT、5mg/mL TZD、1mg/mL VXT和1mg/mL NVLF的标准品母液；
上述各标准品母液再用甲醇溶液配制成包含有100000ng/mL BPP、10000ng/mL AML、100000ng/mL HBPP、20000ng/mL NTP、10000ng/mL MAS、20000ng/mL MTZ、50000ng/mL VLF、50000ng/mL ATP、20000ng/mL DXP、50000ng/mL NFXT、20000ng/mL DLX、50000ng/mL FXT、40000ng/mL FVX、10000ng/mL CTP、10000ng/mL PXT、100000ng/mL TZD、5000ng/mL VXT和200000ng/mL NVLF的混合标准溶液；
将上述混合标准溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品样本S1～S7：
S1:包含AML/MAS/CTP/PXT各1ng/mL，BPP/HBPP/TZD各10ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各2ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各5ng/mL，NVLF20 ng/mL，FVX4 ng/mL，VXT 0.5ng/mL；
S2:包含AML/MAS/CTP/PXT各2.5ng/mL，BPP/HBPP/TZD各25ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各5ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各12.5ng/mL，NVLF 50ng/mL，FVX 10ng/mL，VXT 1.25ng/mL；
S3:包含AML/MAS/CTP/PXT各5ng/mL，BPP/HBPP/TZD各50ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各10ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各25ng/mL，NVLF 100ng/mL，FVX 20ng/mL，VXT 2.5ng/mL；
S4:包含AML/MAS/CTP/PXT各25ng/mL，BPP/HBPP/TZD各250ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各50ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各125ng/mL，NVLF 500ng/mL，FVX 100ng/mL，VXT 12.5ng/mL；
S5:包含AML/MAS/CTP/PXT各50ng/mL，BPP/HBPP/TZD各500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各100ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各250ng/mL，NVLF 1000ng/mL，FVX 200ng/mL，VXT25 ng/mL；
S6:包含AML/MAS/CTP/PXT各250ng/mL，BPP/HBPP/TZD各2500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各500ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各1250ng/mL，NVLF 5000ng/mL，FVX 1000ng/mL，VXT125ng/mL；
S7:包含AML/MAS/CTP/PXT各250ng/mL，BPP/HBPP/TZD各2500ng/mL，NTP/MTZ/DXP/DLX各500ng/mL，VLF/ATP/NFXT/FXT各1250ng/mL，NVLF 5000ng/mL，FVX 1000ng/mL，VXT125ng/mL。
9.根据权利要求8所述的超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗抑郁药物浓度的方法，其特征在于，所述空白血清基质为不含目标药物的空白血清。
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