CN111766312A - 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法 - Google Patents

一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法，所述的抗真菌药物包括：氟康唑(FCZ)、伏立康唑(VCZ)、伏立康唑N‑氧化物(OVCZ)、泊沙康唑(PCZ)、伊曲康唑(ICZ)、羟基伊曲康唑(HICZ)、卡泊芬净(CPF)；采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理血清中抗真菌药物的含量，利用质谱同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出血清中目标药物的浓度；本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.0min之内同时完成7种常用的抗真菌药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，为临床上抗真菌药物浓度监测提供简单快速的检测方法。

Description

一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的 方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，更具体的是涉及一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法。
背景技术
真菌感染是临床上不可忽视的问题，院内感染中，真菌感染约占7.5％，甚至更高。特别是对于危重症、器官移植、免疫缺陷、免疫抑制疗法的病人。真菌感染造成这些病人的感染率和死亡率都非常高，现有的批准用于临床的抗真菌药物比较少，一些抗真菌药物出现了耐药性，导致抗真菌感染的治疗变得更加困难，因此需要更合理的使用现有药物。氟康唑(Fluconazole，FCZ)、伏立康唑(Voriconazole，VCZ)、泊沙康唑(Posacona zole，PCZ)、伊曲康唑 (Itraconazole，ICZ)、卡泊芬净(Caspofungin，CPF)是常用的抗真菌药物。其中氟康唑、伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑均属于三唑类抗真菌药物。氟康唑是是一种广谱的抗真菌药物，但治疗窗较窄，高的血药浓度具有较强的毒性。伏立康唑属于新一代的广谱三唑类抗真菌药物，抗菌谱和抗菌活性大于氟康唑，是目前临床上被广泛应用的抗真菌药物。伏立康唑的在患者体内药物代谢个体差异较大，药物动力学复杂，且可以与多种药物如环孢素A等产生相互作用，从而造成伏立康唑的血药浓度与临床治疗效果不佳，甚至引起不良反应和毒性，其代谢产物伏立康唑氮氧化物也具有较弱的抗菌活性，因此了解其代谢产物在体内的浓度有利于确定伏立康唑及其代谢产物对机体产生的作用，使药物治疗更加有效和安全。泊沙康唑是一种高效、低毒、广谱的治疗和预防侵袭性真菌感染的药物，对于对多烯类和其他三唑类抗真菌药物产生耐药性的真菌具有较好的疗效，由于其可以与CYP3A4产生相互作用，因此和其他药物联用时极易发生药物相互作用，在临床使用时非常有必要对其进行药物浓度监测。伊曲康唑也属于三唑类抗真菌药物，通过抑制酵母菌和真菌细胞膜的主要成分发挥作用，用于治疗严重或顽固性皮肤真菌感染，伊曲康唑在肝脏中被代谢为多种代谢产物，其中羟基伊曲康唑(Hydroxy itraconazole，HICZ)为主要代谢产物，且与伊曲康唑具有相似的抗菌效果。但是伊曲康唑的水溶性比较差，口服后吸收较差，从而导致体内有效血药浓度较低，且个体差异较大。伊曲康唑可以与多种药物发生相互作用，因此在临床使用时需要对伊曲康唑及其代谢产物其中羟基伊曲康唑进行体内血药浓度监测。卡泊芬净是一种一线的抗真菌药物，属于棘白菌素类药物，抗真菌作用良好，对人体较为安全，常被用于对唑类药物产生耐药性或危重症患者念珠菌感染的治疗和预防，由于重症患者药物吸收的特异性，需要对药物浓度及进行监测。
目前针对抗真菌药物体内浓度检测的方法主要有微生物法、高效液相色谱法、超高效液相-串联质谱法，文献报道的多为一次性针对1-4种药物进行检测，也有专利报道，比如中国专利申请(公布号：CN 109030672 A)公开了一种：“同时测定干血斑中四种抗真菌药物的试剂盒及其应用”，针对4种抗真菌药物进行检测，单个样本采集时间长，线性范围不适宜；中国专利申请(公布号：CN 110470775 A)公开了：“一种血液中氟康唑药物浓度监测试剂盒及其检测方法”，仅针对一种药物，需要配制特殊设备，适用性不强，样本量需求大，样品前处理复杂和存在基质效应干扰等不足。也有文献报道对多种抗真菌药物的 LC-MS/MS检测方法，比如一篇名为“An ultra performance liquid chromatography-tandem massspectrometry method for the therapeutic drug monitoring of isavuconazole andseven other antifungal compounds in plasma samples”报道了检测7种抗真菌药物的检测方法，但该方法检测化合物的定量下限高，线性范围不符合临床检测实际情况，不利于临床开展。再比如一篇名为“Reliable and easy-to-use liquid chromatography-tandemmass spectrometry method for simultaneous analysis of fluconazole,isavuconazole,itraconazole, hydroxy-itraconazole,posaconazole,andvoriconazole in human plasma and serum”报道了检测6种抗真菌药物的检测方法，该方法检测种类少，且定量下限高，线性范围不适宜，检测临床意义有限。而抗真菌药物种类繁多，本发明采用 LC-MS/MS法，可以一次性对7种常用的抗真菌药物进行检测，灵敏度高、准确性好，可很好应用于临床，可为抗真菌药联合用药研究提供可靠依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法。
所述抗真菌药物包括：氟康唑(Fluconazole，FCZ)、伏立康唑(Voriconazole，VCZ)、伏立康唑N-氧化物(Voriconazole N-Oxide，OVCZ)、泊沙康唑 (Posaconazole，PCZ)、伊曲康唑(Itraconazole，ICZ)、羟基伊曲康唑(Hydroxy itraconazole，HICZ)、卡泊芬净(Caspofungin，CPF)。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法，所述抗真菌药物包括FCZ、VCZ、 OVCZ、PCZ、ICZ、HICZ和CPF；
采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理血清中抗真菌药物的含量，利用同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出血清中7种抗真菌药物的浓度；
(1)具体色谱条件：
流动相A：含0.01％～0.2％甲酸的水；
流动相B：乙腈；
色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C18(3×100mm,1.8μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
流速为0.2～0.5mL/min，每个样品采集时间为5.0min，柱温为30～50℃，进样体积为0.2～5μL；流动相A和流动相B的初始比为90:10～100:0；
表1流动相梯度洗脱参数
Figure RE-GDA0002646693420000041
(2)具体质谱条件：电喷雾电离正离子模式，多反应监测的质谱扫描模式； 喷雾电压：3.0kV；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h， 锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、 去簇电压和碰撞电压，参数见表2；
表2质谱检测参数
Figure BDA0002516164080000041
其中，所述的血清为人或动物的血清。
其中，所述的预处理血清按照如下方法制备得到：取50μL血清于1.5mL 离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，高速振荡5min；14000 r/min，4℃离心5min后取上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
其中，所述的含内标的蛋白沉淀剂按如下方法制备得到：使用甲醇配制 FCZ-d41mg/mL、VCZ-d3 0.1mg/mL、CPF-d4 0.5mg/mL、OVCZ-d3 1mg/mL、 PCZ-d4 0.5mg/mL、ICZ-d50.5mg/mL、HICZ-d5 1mg/mL，然后分别移取FCZ-d4 4μL、VCZ-d3 10μL、CPF-d4 4μL、OVCZ-d31μL、PCZ-d4 4μL、ICZ-d5 10μL、 HICZ-d5 4μL加入963μL甲醇得到1mL混合内标溶液，取200μL混合内标溶液加入到19.8mL蛋白沉淀剂中，得到含内标的蛋白沉淀剂。其中FCZ-d440ng/mL、VCZ-d3 10ng/mL、CPF-d4 20ng/mL、OVCZ-d3 10ng/mL、PCZ-d4 20ng/mL、ICZ-d550ng/mL、HICZ-d5 40ng/mL。
其中，所述的蛋白沉淀剂为甲醇和乙腈的混合溶剂，甲醇与乙腈的体积比为1:4。
其中，所述的标准品按照如下步骤制备得到：
分别将抗真菌药物配制成的标准品母液，浓度分别为：FCZ 50mg/mL、VCZ 20mg/mL、CPF 5mg/mL、OVCZ 1mg/mL、PCZ 1mg/mL、ICZ 2mg/mL、 HICZ 0.5mg/mL，然后分别移取FCZ 16μL、VCZ 10μL、CPF 80μL、OVCZ 200 μL、PCZ 100μL、ICZ 100μL、HICZ 400μL，加入94μL甲醇得到1mL混合标准品储备液；
本发明将混合标准品储备液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准品储备液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点(S7)；
取第一高值浓度点(S7)用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S7)用3倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点(S5)；取第二高值浓度点(S6)用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S5)用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点(S3)；取第四高值浓度点(S4)用4倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点(S2)；取第五高值浓度点(S3)用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点(S1)，具体过程如下表3；
表3标准曲线配制及浓度(单位：ng/mL)
Figure BDA0002516164080000061
其中，所述的空白血清基质为不含目标药物的空白血清；
七个不同校准品样本每个浓度点取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，然后高速振荡5min，14000r/min，4℃离心 5min后取上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
有益效果：本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5.0 min之内同时完成7种常用的抗真菌药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血清中抗真菌药物的定量分析，为临床上抗真菌药物浓度监测提供简单快速的检测方法。
附图说明
图1为抗真菌药物标准品提取离子流谱图；
图2为血清中抗真菌药物提取离子流谱图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.材料
(1)方法学研究实验的样本来自于上海中山医院2019年9月份门诊收集的血清样本。
(2)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class 超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012 高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪 (Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf0.5～10μL，10～100μL，100～1000 μL)；玻璃仪器、量筒等。
(3)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸 (Fisher，美国)；色谱柱AgilentZorbax Eclipse XDB C18(3×100mm,1.8μm)。
(4)质控品：含有抗真菌药物分子的血清溶液，分低、中、高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表4所示。
表4质控品对应浓度(单位：ng/mL)
Figure DEST_PATH_IMAGE001
2.方法
(1)色谱条件
流动相A：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：Agilent ZorbaxEclipse XDB C18(3×100mm,1.8μm)，采用梯度洗脱的方式。流速为0.3 mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件
电喷雾电离正离子模式，多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压：3.0kV；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150 L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表2。
(3)标准品的配制
分别将抗真菌药物配制成的标准品母液，浓度分别为：FCZ 50mg/mL、 VCZ 20mg/mL、CPF 5mg/mL、OVCZ 1mg/mL、PCZ 1mg/mL、ICZ 2mg/mL、HICZ 0.5mg/mL，然后分别移取FCZ16μL、VCZ 10μL、CPF 80μL、OVCZ 200 μL、PCZ 100μL、ICZ 100μL、HICZ 400μL，加入94μL甲醇得到1mL混合标准溶液。
使用甲醇配制FCZ-d4 1mg/mL、VCZ-d3 0.1mg/mL、CPF-d4 0.5mg/mL、 OVCZ-d31mg/mL、PCZ-d4 0.5mg/mL、ICZ-d5 0.5mg/mL、HICZ-d5 1mg/mL，然后分别移取FCZ-d4 4μL、VCZ-d3 10μL、CPF-d4 4μL、OVCZ-d3 1μL、PCZ-d4 4μL、ICZ-d5 10μL、HICZ-d5 4μL加入963μL甲醇得到1mL混合内标溶液，取200μL混合内标溶液加入到19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比为1:4) 中，得到含内标的蛋白沉淀剂，其中，蛋白沉淀剂包含：FCZ-d4 40ng/mL、VCZ-d3 10ng/mL、CPF-d4 20ng/mL、OVCZ-d3 10ng/mL、PCZ-d4 20ng/mL、 ICZ-d5 50ng/mL、HICZ-d5 40ng/mL。
(4)质控品的配制
低浓度质控品：将中浓度质控品用无待测物干扰的空白血清稀释10倍。
中浓度质控品：用无待测物干扰的空白血清稀释混合标准品储备液200 倍，得中浓度质控样品。
高浓度质控品：用无待测物干扰的空白血清稀释混合标准品储备液50倍，得高浓度质控样品。
(5)样品处理
1)标准曲线配制
采用梯度稀释法进行标准曲线配制，将混合标准品储备液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：
取10μL混合标准品储备液加入190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点(S7)；
取第一高值浓度点(S7)用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S7)用3倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点(S5)；取第二高值浓度点(S6)用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S5)用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点(S3)；取第四高值浓度点(S4)用4倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点(S2)；取第五高值浓度点(S3)用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点(S1)，具体过程如下表3；
表3标准曲线配制及浓度(单位：ng/mL)
Figure BDA0002516164080000091
Figure BDA0002516164080000101
2)预处理血清的制备：取50μL血清样本于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:4)，然后高速振荡5min， 14000r/min下4℃离心5min后取上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于 1.5mL离心管中，然后跟血清样品前处理方法一致，此处不再赘述。
3.方法验证
1)提取离子流谱图：由图1-2可知，抗真菌药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测。
2)校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗真菌药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表5。
表5抗真菌药物线性回归方程及线性相关系数
Figure BDA0002516164080000102
3)准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品储备液，以相同步骤重复处理测定5次，结果显示，抗真菌药物的加标回收率在86.35％-112.10％之间，5次重复试验的RSD在1.34％-7.81％范围，统计结果见表6。
表6抗真菌药物添加回收率结果
Figure BDA0002516164080000111
4)精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度抗真菌药物的混合标准品储备液，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗真菌药物的浓度，批内精密度为 2.44～8.14％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.95～7.54％，结果见表7。
表7批内、批间精密度试验
Figure BDA0002516164080000121
Figure BDA0002516164080000131
Figure BDA0002516164080000141
Figure BDA0002516164080000151
4.讨论
本研究采用ID-UPLC-MS/MS方法测定了人体血清中的抗真菌药物的浓度。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗真菌药物的加标回收率为86.35％-112.10之间， 5次重复试验的RSD为1.34％-7.81％，准确度良好。
方法的重现性结果表明，抗真菌药物的批内精密度为2.44～8.14％，批间精密度为2.95～7.54％。实验为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，考察了不同流动相及电解质的种类和浓度，并尽可能实现化合物和基质干扰的基线分离，且建立的血清样品前处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血清用量仅 50μL。
总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，5.0min之内可完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清抗真菌药物浓度的定量分析，为临床上抗真菌药物浓度治疗监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法，其特征在于，所述的抗真菌药物包括FCZ、VCZ、OVCZ、PCZ、ICZ、HICZ和CPF；
采用超高效液相色谱串联质谱法检测预处理血清中FCZ、VCZ、OVCZ、PCZ、ICZ、HICZ和CPF的含量，利用质谱同位素内标法定量，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出血清中目标药物的浓度；
(1)具体色谱条件：
流动相A：含0.01％～0.2％甲酸的水；
流动相B：乙腈；
色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse XDB C18(3×100mm,1.8μm)；
采用梯度洗脱的方式，见表1；
流速为0.2～0.5mL/min，每个样品采集时间为5.0min，柱温为30～50℃，进样体积为0.2～5μL；
表1流动相梯度洗脱参数
Figure FDA0002516164070000011
(2)具体质谱条件：电喷雾电离正离子检测模式，多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压：3.0kV；源温度：120℃；雾化气温度：400℃，雾化气流速：800L/h，锥孔气流速：150L/h；同时监测目标物对应的标准品和内标母离子、子离子、去簇电压和碰撞电压，参数见表2；
表2质谱检测参数
Figure FDA0002516164070000021
。
2.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法，其特征在于，所述的血清为人或动物的血清。
3.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法，其特征在于，所述的预处理血清按照如下方法制备得到：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，高速振荡5min；14000r/min，4℃离心5min后取上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。
4.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法，其特征在于，所述的标准品按照如下步骤制备得到：
分别将抗真菌药物配制成的标准品母液，浓度分别为：FCZ 50mg/mL、VCZ 20mg/mL、CPF5mg/mL、OVCZ 1mg/mL、PCZ 1mg/mL、ICZ 2mg/mL、HICZ 0.5mg/mL，然后分别移取FCZ 16μL、VCZ 10μL、CPF 80μL、OVCZ 200μL、PCZ 100μL、ICZ 100μL、HICZ 400μL，加入94μL甲醇得到1mL混合标准品储备液；
取10μL混合标准品储备液加入至190μL空白血清基质中作为第一个高值浓度点(S7)；取第一高值浓度点(S7)用等体积空白血清基质稀释得第二高值浓度点(S6)；取第一高值浓度点(S7)用3倍体积空白血清基质稀释得第三高值浓度点(S5)；取第二高值浓度点(S6)用9倍体积空白血清基质稀释得第四高值浓度点(S4)；取第三高值浓度点(S5)用9倍体积空白血清基质稀释得第五高值浓度点(S3)；取第四高值浓度点(S4)用4倍体积空白血清基质稀释得第六高值浓度点(S2)；取第五高值浓度点(S3)用4倍体积空白血清基质稀释得第七高值浓度点(S1)。
5.根据权利要求3所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法，其特征在于，所述的含内标的蛋白沉淀剂按如下方法制备得到：使用甲醇配制FCZ-d41mg/mL、VCZ-d3 0.1mg/mL、CPF-d4 0.5mg/mL、OVCZ-d3 1mg/mL、PCZ-d4 0.5mg/mL、ICZ-d50.5mg/mL、HICZ-d5 1mg/mL，然后分别移取FCZ-d4 4μL、VCZ-d3 10μL、CPF-d4 4μL、OVCZ-d31μL、PCZ-d4 4μL、ICZ-d5 10μL、HICZ-d5 4μL加入963μL甲醇得到1mL混合内标溶液，取200μL混合内标溶液加入到19.8mL蛋白沉淀剂中，得到含内标的蛋白沉淀剂，其中FCZ-d4 40ng/mL、VCZ-d3 10ng/mL、CPF-d4 20ng/mL、OVCZ-d3 10ng/mL、PCZ-d4 20ng/mL、ICZ-d5 50ng/mL、HICZ-d5 40ng/mL。
6.根据权利要求4所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法，其特征在于，所述的空白血清基质为不含目标药物的空白血清。
7.根据权利要求5所述的一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗真菌药物的方法，其特征在于，所述的蛋白沉淀剂为甲醇、乙腈或甲醇和乙腈的混合溶剂。
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