CN108828077B - 一种同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒及其检测方法与应用 - Google Patents
一种同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒及其检测方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒，卡培他滨及其代谢产物分别是：卡培他滨、5′‑脱氧‑5‑氟胞苷、5′‑脱氧‑5‑氟尿苷、2′‑脱氧‑5‑氟尿苷、5‑氟尿嘧啶、5‑氟‑5,6‑二氢尿嘧啶；所述同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒包括以下试剂：洗脱液、对照品母液、混合内标溶液、稀释液、萃取液、质控液。本发明还公开了一种所述同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒在制备恶性肿瘤血液学诊断或筛查试剂盒中的应用。采用本发明的同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒，同时检测卡培他滨及其代谢产物，灵敏度高、特异性强、准确度高且前处理过程简单。
Description
技术领域
本发明属于血液定量检测技术领域，具体的说，涉及一种同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒及其检测方法与应用。
背景技术
自上世纪九十年代初开始，癌症已上升为我国第一位死因的疾病，其中消化道恶性肿瘤在所有恶性肿瘤的发病率和死亡率中占据前列，严重危害着人们的健康和生命[项永兵.消化道恶性肿瘤的流行与现状.肿瘤,2002,22(4):336-339.]。据统计，2013年全国消化道恶性肿瘤新发患者约105万，约占恶性肿瘤总发病率的30％，其中胃癌新发患者约42万、结直肠癌新发患者35万、食管癌新发患者28万；同年消化道恶性肿瘤死亡患者约67万，其中胃癌死亡患者30万、结直肠癌死亡患者16万、食管癌死亡患者20万[陈万青,郑荣寿,张思维,等.2013年中国恶性肿瘤发病和死亡分析.中国肿瘤,2017,26(1):1-10.]。高发病率及高死亡率的消化道恶性肿瘤给社会造成了巨大的经济负担。目前，基于氟尿嘧啶类药物的化疗方案是治疗消化道恶性肿瘤的主要手段之一，有效的提高了消化道恶性肿瘤患者的生存率。
卡培他滨(capecitabine)是一种可以在体内转变成5-氟尿嘧啶的抗代谢氟嘧啶脱氧核苷氨基甲酸酯类药物，能够抑制细胞分裂、干扰DNA和RNA合成。卡培他滨分子式C15H22O6N3F，分子量359.35[Walko CM,Lindley C.Capecitabine:A review.ClinicalTherapeutics,2005,27(1):23-44.]，化学结构如下：
临床上卡培他滨主要用于治疗各类消化系统恶性肿瘤，尤以胃癌和结直肠癌为主，其代谢产物包括5′-脱氧-5-氟胞苷(5′-deoxy-5-fluorocytidine)、5′-脱氧-5-氟尿苷(5′-deoxy-5-fluorouridine)、2′-脱氧-5-氟尿苷(2′-deoxy-5-fluorouridine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶(5-fluoro-5,6-dihydrouracil)[DeenenMJ,Rosing H,Hillebrand MJ,et al.Quantitative determination of capecitabineand its six metabolites in human plasma using liquid chromatography coupledto electrospray tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography BAnalytical Technologies in the Biomedical&Life Sciences,2013,913-914(2):30-40.]。近年来，随着卡培他滨临床用量的逐年上升，使用过程中也逐渐发现一些问题。一方面，由于其在体内代谢通路长，参与代谢的酶种类多，在不同患者体内的药代动力学参数变化大，以致不同患者体内药物暴露量差异大；另一方面，在抗肿瘤作用的同时，卡培他滨对快速分裂的正常细胞也具有一定的细胞毒作用，且其多种代谢产物均与药物肝毒性、皮肤毒性及骨髓毒性相关。因此，采用灵敏、快速、准确的方法对卡培他滨及其代谢产物进行血药浓度检测，以预防血药浓度暴露量偏移，降低不良反应发生率是研究工作者亟待解决的临床问题。
目前，临床上常用免疫法对一些重要的药物进行体内暴露量的监测，免疫法通常具有操作简单和成本低的优势，但基质效应及交叉反应常会降低其灵敏度且影响特异性。
超高效液相串联质谱法同时采用液相色谱分离和质谱离子对对化合物进行检测，灵敏度高、特异性强，能最大程度避免基质效应和交叉反应，因而具有独特的优势。已有文献报道超高效液相串联质谱法用于卡培他滨及其代谢产物的检测[Liceaperez H,Wang S,Bowen C.Development of a sensitive and selective LC-MS/MS method for thedetermination of alpha-fluoro-beta-alanine,5-fluorouracil and capecitabine inhuman plasma.Journal of Chromatography B,2009,877(11-12):1040-1046.VainchteinLD,Rosing H,Schellens JHM,et al.A new,validated HPLC‐MS/MS method for thesimultaneous determination of the anti-cancer agent capecitabine and itsmetabolites:5′-deoxy-5-fluorocytidine,5′-deoxy-5-fluorouridine,5-fluorouraciland 5-fluorodihydrouracil,in human.Biomedical Chromatography,2010,24(4):374-386.]。
采用超高效液相串联质谱法进行血药浓度监测，具有检测灵敏度高、特异性高、分析时间短、且不受代谢物或其他药物的干扰等诸多优点，可为临床肿瘤化疗时使用含卡培他滨治疗方案患者实行个体化给药提供依据。但是，由于卡培他滨及其代谢产物物化性质差异较大、血液中含量不一，故而同时检测技术难度较高，目前未有采用超高效液相串联质谱技术同时检测血浆中卡培他滨及其五种代谢产物的文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种利用所述同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒的检测方法。
本发明的再一个目的是提供一种所述同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的一个方面提供了一种同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒。
所述卡培他滨及其代谢产物分别是：卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶。
所述同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒包括以下试剂：
(1)洗脱液。洗脱液A是0.0075％v/v甲酸水溶液；洗脱液B是0.0075％v/v甲酸乙腈溶液；
(2)对照品母液。分别含有卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的甲醇溶液，浓度均为1.00mg·mL-1；
(3)混合内标溶液。含有氟达拉滨、5-氯尿嘧啶的甲醇溶液，浓度均为10.00μg·mL-1；
(4)稀释液。稀释液1是空白血浆基质溶液；稀释液2是浓度为10％的甲醇溶液；
(5)萃取液。异丙醇和乙酸乙酯的溶液，体积比为1:19；
(6)质控液。含有卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的空白血浆基质溶液，分为高中低三个浓度，其中六种待测化合物的对应浓度如表1所示。
表1六种待测化合物指控品对应浓度
所述空白血浆基质为健康人空白血浆。
所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：
(1)洗脱液。洗脱液A：配制0.0075％v/v甲酸水溶液；洗脱液B：配制0.0075％v/v甲酸乙腈溶液。
(2)对照品母液。取适量待测化合物对照品，精密称取卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶均为2.00mg，分别置于2mL容量瓶中，加入少量甲醇溶解(5-氟-5,6-二氢尿嘧啶母液中滴入几滴二甲亚砜)，再加入甲醇定容，得对照品母液为分别含有1.00mg·mL-1卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的甲醇溶液。精密移取上述对照品母液各50μL，混合后加双蒸馏水定容至1mL，配制成混合对照品液A，其中，卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶浓度均为50.00μg·mL-1。
(3)混合内标溶液。取适量内标物对照品，精密称取氟达拉滨、5-氯尿嘧啶均为2.00mg，置于2mL容量瓶中，甲醇定容，得1.00mg·mL-1氟达拉滨、5-氯尿嘧啶的甲醇溶液。精密移取上述溶液各10μL，混合后加双蒸馏水定容至1mL，配制成混合内标液，其中，氟达拉滨、5-氯尿嘧啶浓度均为10.00μg·mL-1。
(4)稀释液。稀释液1为健康人空白血浆；稀释液2为浓度为10％的甲醇溶液，取甲醇10mL，加入双蒸馏水至100mL即得。
(5)萃取液。取异丙醇1mL，加入乙酸乙酯19mL，混匀即得。
(6)质控液。精密吸取上述对照品母液中所述混合对照品液A 10μL，加空白血浆基质990μL，涡旋混匀得中间液，取中间液100μL，加空白血浆基质900μL，涡旋混匀得低浓度质控液；精密吸取混合对照品液A20μL、50μL，分别加空白血浆基质至1000μL，涡旋混匀得中浓度质控液、高浓度质控液。
本发明的另一个方面提供了一种利用所述同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：首先利用超高效液相串联质谱将六种待测化合物卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶分离，再利用内标定量法建立校正曲线，取待测血浆样本测定，计算待测血浆样本中上述六种待测化合物的浓度。
所述超高效液相色谱条件如下：色谱柱型号：Atlantis T3C18(100mm×2.1mm，3μm)；采用洗脱液为：流动相A：0.0075％v/v甲酸水溶液；流动相B：0.0075％v/v甲酸乙腈溶液；流速为0.3mL·min-1，柱温为35℃，进样体积为5μL；采用梯度洗脱的方式进行色谱分离，梯度洗脱参数如表2所示。
表2流动相梯度洗脱参数
所述质谱条件如下：在电喷雾电离离子源下同时采用正负离子模式，多重反应监测模式同时检测六种待测化合物卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶，干燥气温度为300℃，干燥气流速为10L·min-1，鞘气温度为300℃，鞘气流速为12L·min-1，喷雾器压力为45psi，毛细管电压为±4000V，电子倍增器为600V。各待测化合物的离子模式、检测离子对、F值、CE值参数如表3所示。
表3待测化合物质谱参数
所述校正曲线的建立包括以下步骤：校正曲线的建立包含7个浓度点，分别为：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7；精密吸取100μL混合对照品液A，加入900μL稀释液1，涡旋混匀，得校正曲线最高浓度点标添样本S1；取100μL S1，加入100μL稀释液1，涡旋混匀后得标添样本S2；分别取40μL、20μL S1，分别加入160μL、180μL稀释液1，涡旋混匀得标添样本S3、S4；取S3、S4各20μL，分别加入180μL稀释液1，涡旋混匀得标添样本S5、S6；取40μL S5，加入160μL稀释液1，涡旋混匀得标添样本S7；待测化合物卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的浓度均分别为S1 5000ng·mL-1、S2 2500ng·mL-1、S3 1000ng·mL-1、S4 500ng·mL-1、S5 100ng·mL-1、S6 50ng·mL-1、S720ng·mL-1；按照样本预处理方法对上述7个浓度点的标添样本进行预处理，然后进样测定，以对照品浓度为X轴，对照品积分峰面积与内标积分峰面积的比值为Y轴，建立校正曲线。
所述待测血浆样本测定包括以下步骤：取待测血浆，按照样本预处理方法对血浆样本进行预处理，然后进样测定，将血浆样本检测所得的待测化合物积分峰面积与内标积分峰面积的比值带入上述校正曲线，计算待测血浆样本中上述六种待测化合物卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的浓度。
所述样本预处理方法包括以下步骤：精密吸取血浆样本100μL，置于10mL玻璃离心管中，加入混合内标溶液10μL，涡旋混匀，加入萃取液3mL，涡旋3min，1710×g离心10min，取上清液2.7mL，置于冷冻挥干仪中，于2000rpm、73bar、25℃条件下约30min挥干，残渣加入稀释液2(浓度为10％的甲醇溶液)100μL复溶后进样进行分析。
所述待测血浆为恶性肿瘤患者服用卡培他滨后的血浆。优选的，在服用卡培他滨后30min～300min内抽取患者血浆。
本发明还提供了一种所述同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒在制备恶性肿瘤血液学诊断或筛查试剂盒中的应用。
所述恶性肿瘤为消化道恶性肿瘤。
所述消化道恶性肿瘤为胃癌、结直肠癌、食管癌等。
由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：
采用本发明的同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒，同时检测卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶，灵敏度高、特异性强、准确度高且前处理过程简单，在5min内能够完成卡培他滨及其五种代谢产物的色谱分离和质谱测定；回收率和基质效应满足药典要求。本发明为临床监测恶性肿瘤患者卡培他滨及其五种代谢产物体内暴露量提供了一种有效可靠的监测方法。
附图说明
图1为六种待测化合物及两种内标的多重反应监测色谱图；图中从上至下依次是：5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5′-脱氧-5-氟胞苷、氟达拉滨、卡培他滨。
图2为六种待测化合物的专属性色谱图，图中A为空白血浆样品，B为内标添加血浆样品，C为标准添加血浆样品，D为患者实测血浆样品。
图3为六种待测化合物的残留效应图，图中从上至下依次是：5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5′-脱氧-5-氟胞苷、氟达拉滨、卡培他滨。A为最高浓度点色谱图，B为最高浓度点之后的空白点色谱图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例所用试剂除另有注明，均可以从销售公司获得。
实施例1
1.实验材料
所用血浆样本来自于上海长征医院2016年10月-11月结直肠癌患者服用卡培他滨后的血浆。
(1)仪器。Agilent 6460A三重四级杆质谱仪；Agilent 1290Series超高效液相色谱仪；可调移液器(Eppendorf公司，0.5～10μL、10～100μL、100～1000μL)；十万分之一天平(Sartorius公司，CPA255D型)；涡漩混合仪(Labnet公司，VX-200型)；离心机(北利公司，DT-5型)；冷冻挥干仪(基因公司，Scanspeed Mari Vac Alpha型)。
(2)试剂耗材。色谱纯甲醇、分析纯乙腈(默克公司)；色谱纯甲酸(天地公司)；双蒸馏水(屈臣氏公司)；乙酸乙酯(卡列登公司)；异丙醇(赛默飞公司)。
(3)待测化合物对照品及内标对照品。卡培他滨(批号J0713AS)、5′-脱氧-5-氟胞苷(批号J1112AS)、5′-脱氧-5-氟尿苷(批号J0713A)、2′-脱氧-5-氟尿苷(批号J0620A)、5-氟尿嘧啶(批号A0930AS)、氟达拉滨(批号M0501AS)、5-氯尿嘧啶(批号J1204A)，均购于美仑生物科技有限公司。5-氟-5,6-二氢尿嘧啶(批号5-PTR-167-1)购于多伦多化学公司。
2.方法
(1)超高效液相色谱条件。色谱柱型号：Atlantis T3C18(100mm×2.1mm，3μm)；采用洗脱液为：流动相A：0.0075％v/v甲酸水溶液；流动相B：0.0075％v/v甲酸乙腈溶液；流速为0.3mL·min-1，柱温为35℃，进样体积为5μL；采用梯度洗脱的方式进行色谱分离，梯度洗脱参数见表2。
(2)质谱条件如下。在电喷雾电离离子源下同时采用正负离子模式，多重反应监测模式同时检测六种待测化合物卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶，干燥气温度为300℃，干燥气流速为10L·min-1，鞘气温度为300℃，鞘气流速为12L·min-1，喷雾器压力为45psi，毛细管电压为±4000V，电子倍增器为600V。各待测化合物的离子模式、检测离子对、F值、CE值参数见表3。
(3)洗脱液的配制。洗脱液A：配制0.0075％v/v甲酸水溶液；洗脱液B：配制0.0075％v/v甲酸乙腈溶液。
(4)对照品溶液的配制。取适量待测化合物对照品，精密称定为2.04mg卡培他滨、2.00mg 5′-脱氧-5-氟胞苷、2.04mg 5′-脱氧-5-氟尿苷、2.20mg 2′-脱氧-5-氟尿苷、2.02mg 5-氟尿嘧啶、2.06mg5-氟-5,6-二氢尿嘧啶，分别置于2mL容量瓶中，加入少量甲醇溶解(5-氟-5,6-二氢尿嘧啶母液中滴入几滴二甲亚砜)，再加入甲醇定容，得对照品母液为分别含有1.02mg·mL-1卡培他滨、1.00mg·mL-1 5′-脱氧-5-氟胞苷、1.02mg·mL-15′-脱氧-5-氟尿苷、1.10mg·mL-1 2′-脱氧-5-氟尿苷、1.03mg·mL-1 5-氟尿嘧啶、1.01mg·mL-15-氟-5,6-二氢尿嘧啶的甲醇溶液。精密移取上述对照品母液各50μL，混合后加双蒸馏水定容至1mL，配制成混合对照品液A，其中，卡培他滨、5′-脱氧-5-氟尿苷浓度为51μg·mL-1，5′-脱氧-5-氟胞苷浓度为50μg·mL-1，2′-脱氧-5-氟尿苷浓度为55μg·mL-1，5-氟尿嘧啶浓度为51.5μg·mL-1，5-氟-5,6-二氢尿嘧啶浓度为50.5μg·mL-1。
(5)混合内标液的配制。取适量内标物对照品，精密称定为2.32mg氟达拉滨、1.84mg 5-氯尿嘧啶，置于2mL容量瓶中，甲醇定容，得1.16mg·mL-1氟达拉滨、0.92mg·mL-15-氯尿嘧啶的甲醇溶液。精密移取上述溶液各10μL，混合后加双蒸馏水定容至1mL，配制成混合内标液，其中，氟达拉滨浓度为11.6μg·mL-1、5-氯尿嘧啶浓度为9.2μg·mL-1。
(6)稀释液的配制。稀释液1为健康人空白血浆；稀释液2为10％甲醇溶液，取甲醇10mL，加入蒸馏水至100mL即得。
(7)萃取液的配制。取异丙醇1mL，加入乙酸乙酯19mL，混匀即得。
(8)质控液的配制。精密吸取上述对照品母液中所述混合对照品液A 10μL，加空白血浆基质990μL，涡旋混匀得中间液，取中间液100μL，加空白血浆基质900μL，涡旋混匀得低浓度质控液。精密吸取混合对照品液A 20μL、50μL，分别加空白血浆基质至1000μL，涡旋混匀得中浓度质控液、高浓度质控液。
(9)样本预处理方法。精密吸取结直肠癌患者血浆样本20例各100μL，分别置于10mL玻璃离心管中，分别加入混合内标溶液10μL，涡旋混匀，加入萃取液3mL，涡旋3min，1710×g离心10min，分别取上清液2.7mL，置于冷冻挥干仪中，于2000rpm、73bar、25℃条件下约30min挥干，残渣加入稀释液2复溶后分别进样进行分析。
(10)校正曲线的建立。校正曲线的建立包含7个浓度点，分别为：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7。精密吸取混合对照品液A 100μL，加入稀释液1 900μL，涡旋混匀，得校正曲线最高浓度点标添样本S1；取S1 100μL，加入稀释液1 100μL，涡旋混匀后得标添样本S2；取S1 40μL、20μL，分别加入稀释液1 160μL、180μL，涡旋混匀得标添样本S3、S4；取S3、S4各20μL，分别加入稀释液1 180μL，涡旋混匀得标添样本S5、S6；取S5 40μL，加入稀释液1 160μL，涡旋混匀得标添样本S7。在S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7中，待测化合物卡培他滨浓度分别为5100ng·mL-1、2550ng·mL-1、1020ng·mL-1、510ng·mL-1、101ng·mL-1、50.5ng·mL-1、20.2ng·mL-1，5′-脱氧-5-氟胞苷浓度分别为5000ng·mL-1、2500ng·mL-1、1000ng·mL-1、500ng·mL-1、100ng·mL-1、50ng·mL-1、20ng·mL-1，5′-脱氧-5-氟尿苷浓度分别为5100ng·mL-1、2550ng·mL-1、1020ng·mL-1、510ng·mL-1、101ng·mL-1、50.5ng·mL-1、20.2ng·mL-1，2′-脱氧-5-氟尿苷浓度分别为5500ng·mL-1、2750ng·mL-1、1100ng·mL-1、550ng·mL-1、110ng·mL-1、55ng·mL-1、22ng·mL-1，5-氟尿嘧啶浓度分别为5150ng·mL-1、2575ng·mL-1、1030ng·mL-1、515ng·mL-1、103ng·mL-1、51.5ng·mL-1、20.6ng·mL-1，5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的浓度分别为5050ng·mL-1、2525ng·mL-1、1010ng·mL-1、505ng·mL-1、101ng·mL-1、50.5ng·mL-1、20.2ng·mL-1。按照上述样本预处理方法对上述7个浓度点标添样本进行预处理，然后进样测定。以对照品浓度为X轴，对照品积分峰面积与内标积分峰面积的比值为Y轴，建立校正曲线。卡培他滨及其五种代谢产物试剂盒的组成如表4所示。
表4卡培他滨及其五种代谢产物试剂盒的组成
3.方法的建立及优化
为了建立一种具有良好响应及稳定性的方法，首先对待测化合物进行全扫(MS2Scan)，选择合适的离子模式，然后针对单个化合物的F值、CE值进行摸索，优化离子监测参数及合适的离子对(Q1/Q3)，然后针对整组化合物进行离子源参数的调整，如干燥气、鞘气等，记录优化后的参数，优化参数如表4。六种待测化合物及两种内标的多重反应监测色谱图如图1所示，图1为六种待测化合物及两种内标的多重反应监测色谱图；图中从上至下依次是：5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5′-脱氧-5-氟胞苷、氟达拉滨、卡培他滨。
(1)洗脱液浓度的优化。洗脱液浓度的优化情况见表5所示。
表5洗脱液浓度的优化情况
(2)萃取液组分的优化。萃取液组分的优化情况见表6所示。
表6萃取液组分的优化情况
(3)重要液相、质谱参数条件的优化。重要液相、质谱参数条件的优化情况见表7所示。
表7重要液相、质谱参数条件的优化情况
4.方法学验证
(1)专属性验证。在待测化合物和内标化合物相应的保留时间上杂质的响应不超过化合物最低定量下限响应的20％和内标响应的5％即为合格。六种待测化合物的专属性色谱图如图2所示，图2为六种待测化合物的专属性色谱图，图中A为空白血浆样品，B为内标添加血浆样品，C为标准添加血浆样品，D为患者实测血浆样品；结果表明本方法的专属性符合药典规定。
(2)校正曲线。线性回归采用7个线性点的内标校正的峰面积同响应浓度的比值获得，权重系数使用1/x2，最低定量限浓度即为线性的最低点，对于每一个浓度点，回算偏移在±15％之内视为合格，最低定量限浓度在±20％之内视为合格。结果如表8所示，表明显示每一浓度点汇算偏移均在±15％之内，符合药典要求。
表8六种待测化合物的线性回归参数
(3)基质效应和提取回收率。基质效应和提取回收率采用高浓度和低浓度(高2500ng·mL-1，低50ng·mL-1)的6个不同来源样本进行评价。基质效应为提取后添加样本的化合物响应同浓度一致的水标的化合物比值，提取回收率为浓度一致的前添加样本化合物响应同后添加样本化合物浓度响应的比值。结果如表9所示，表明本预处理方法在既定线性范围内提取回收率和基质效应稳定，符合药典要求。
表9六种待测化合物的稳定性和基质效应、提取回收率(％)
注：*采用内标归一化的基质和提取回收因子计算。
(4)稳定性。稳定性包括长期稳定性(3月)、短期稳定性(进样器24h)及冻融三次的稳定性。采用高、低两个浓度进行评价并且每次评价均采用建立校正曲线。相对于理论浓度，偏移在±15％之内视为合格。结果如表9所示，显示待测化合物在血浆中3个月，预处理后24h，三次冻融后可保持稳定。
(5)日内日间精密度和准确性。日内日间精密度准确性分别在四个浓度水平评价(最低定量下限浓度、低浓度、中浓度、高浓度)，每个浓度水平分别测定5次。随同线性的评价完成，对于精密度，低浓度、中浓度、高浓度的相对标准偏差(relative standarddeviation，RSD)不超过15％，最低定量下限浓度的相对标准偏差不超过20％视为合格。对于准确性，低浓度、中浓度、高浓度的相对误差(relative error，RE)在±15％之内，最低定量下限浓度的相对误差在±20％之内即视为合格。结果如表10所示，表明本方法的日内日间精密度和准确性符合药典要求。
表10六种待测化合物的日内日间精密度和准确度
(6)残留效应。残留效应的评价采用先进样最高浓度点样本，后进空白样本的形式，重复循环三次，干扰杂质的响应小于最低定量下限待测化合物响应的20％和内标响应的5％即为合格。六种待测化合物的残留效应图如图3所示，图3为六种待测化合物的残留效应图，图中从上至下依次是：5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5′-脱氧-5-氟胞苷、氟达拉滨、卡培他滨；结果表明本方法中最高浓度的残留符合药典要求。
5.结直肠癌患者血浆样本检测
取结直肠癌患者服用卡培他滨后的血浆20例，按照样本预处理方法对血浆样本进行预处理，然后进行测定。将血浆样本检测所得的待测化合物积分面积与内标峰积分面积的比值带入上述校正曲线，计算血浆样本中上述六种待测化合物的浓度。测定结果如表11所示，表明本方法准确定量了结直肠癌患者服用卡培他滨后血浆中卡培他滨及其代谢产物的浓度，具有临床可行性。
表11结直肠癌患者血浆样本六种待测化合物检测结果(ng·mL-1)
注：*采血时间指从患者服用卡培他滨后开始计时的时间。ND低于定量下限。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (1)
1.一种同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的方法，利用同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒，其特征在于：
所述同时检测血浆中卡培他滨及其代谢产物的试剂盒，所述卡培他滨及其代谢产物分别为卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶和5-氟-5,6-二氢尿嘧啶；
所述试剂盒包括以下试剂：
(1)洗脱液，洗脱液A是0.0075％v/v甲酸水溶液；洗脱液B是0.0075％v/v甲酸乙腈溶液；
(2)对照品母液，分别含有卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的甲醇溶液；
所述对照品母液中，分别含有卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的甲醇溶液的浓度均为1.00mg·mL-1；
(3)混合内标溶液，含有氟达拉滨、5-氯尿嘧啶的甲醇溶液；
所述混合内标溶液中，含有氟达拉滨、5-氯尿嘧啶的甲醇溶液的浓度均为10.00μg·mL-1；
(4)稀释液，稀释液1是空白血浆基质溶液；稀释液2是浓度为10％的甲醇溶液；
(5)萃取液，异丙醇和乙酸乙酯的溶液，体积比为1:19；
(6)质控液，含有卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的空白血浆基质溶液，分为高中低三个浓度；
所述质控液中，含有卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的空白血浆基质溶液，分为高中低三个浓度，低浓度质控液均为50.0ng·mL-1，中浓度质控液均为1000.0ng·mL-1，高浓度质控液均为2500.0ng·mL-1；所述空白血浆基质为健康人空白血浆；
所述的检测方法包括以下步骤：先利用超高效液相色谱串联质谱将六种待测化合物卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶分离；再利用内标定量法建立校正曲线，取待测血浆样本测定，计算待测血浆样本中上述六种待测化合物的浓度；
所述超高效液相色谱条件如下：色谱柱型号：AtlantisT3C18；采用洗脱液为：流动相A：0.0075％v/v甲酸水溶液；流动相B：0.0075％v/v甲酸乙腈溶液；流速为0.3mL·min-1，柱温为35℃，进样体积为5μL；采用梯度洗脱的方式进行色谱分离；
所述梯度洗脱参数如下：
所述质谱条件如下：在电喷雾电离离子源下同时采用正负离子模式，多重反应监测模式同时检测六种待测化合物卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶，干燥气温度为300℃，干燥气流速为10L·min-1，鞘气温度为300℃，鞘气流速为12L·min-1，喷雾器压力为45psi，毛细管电压为±4000V，电子倍增器为600V；
所述校正曲线的建立包括以下步骤：校正曲线的建立包含7个浓度点，分别为：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7；精密吸取100μL混合对照品液A，加入900μL稀释液1，涡旋混匀，得校正曲线最高浓度点标添样本S1；取100μLS1，加入100μL稀释液1，涡旋混匀后得标添样本S2；分别取40μL、20μLS1，分别加入160μL、180μL稀释液1，涡旋混匀得标添样本S3、S4；取S3、S4各20μL，分别加入180μL稀释液1，涡旋混匀得标添样本S5、S6；取40μLS5，加入160μL稀释液1，涡旋混匀得标添样本S7；待测化合物卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的浓度均分别为S15000ng·mL-1、S22500ng·mL-1、S31000ng·mL-1、S4500ng·mL-1、S5100ng·mL-1、S650ng·mL-1、S720ng·mL-1；按照样本预处理方法对上述7个浓度点的标添样本进行预处理，然后进样测定，以对照品浓度为X轴，对照品积分峰面积与内标积分峰面积的比值为Y轴，建立校正曲线；
所述待测血浆样本测定包括以下步骤：取待测血浆，按照样本预处理方法对血浆样本进行预处理，然后进样测定，将血浆样本检测所得的对照品积分峰面积与内标积分峰面积的比值带入上述校正曲线，计算待测血浆样本中上述六种待测化合物卡培他滨、5′-脱氧-5-氟胞苷、5′-脱氧-5-氟尿苷、2′-脱氧-5-氟尿苷、5-氟尿嘧啶、5-氟-5,6-二氢尿嘧啶的浓度；
所述样本预处理方法包括以下步骤：精密吸取血浆样本100μL，置于10mL玻璃离心管中，加入混合内标溶液10μL，涡旋混匀，加入萃取液3mL，涡旋3min，1710×g离心10min，取上清液2.7mL，置于冷冻挥干仪中，于2000rpm、73bar、25℃条件下约30min挥干，残渣加入稀释液2100μL复溶。
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