CN109633063B - 一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法 - Google Patents

一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法，包括如下步骤：(1)标准工作溶液的配制；(2)样品处理；(3)标准曲线制作；(4)定量分析：取试验样品按照步骤(2)的方法处理，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛及其活性代谢产物的浓度。本发明应用高效液相色谱技术(HPLC)测定人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物的浓度，准确定量人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物的浓度，通过色谱柱、前处理方法、流动相、质谱条件等的合理选择，流速、流动相比例、色谱条件等实验条件的优化，经过系列方法学验证，使得整个定量检测方法切实可行，操作简便，重复性高，准确性好，可操作性强，可以直接运用于临床患者血浆样品检测分析及相关药代动力学分析。

Description

一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法
技术领域
本发明涉及一种应用高效液相色谱技术(HPLC)进行人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法，可用于临床药物浓度监测。本发明属于药物分析技术领域。
背景技术
替格瑞洛，又名倍林达，是一种新型、口服、可逆的血小板腺苷二磷酸(ADP)P2Y受体拮抗剂，为非前体药物，无须经肝代谢激活，直接作用于P2Y12受体，同时，替格瑞洛吸收后可快速生成活性代谢产物AR-C124910XX，替格瑞洛本身及其代谢产物均有活性，且药物本身活性较其代谢产物活性更强，因此，可快速强效地抑制ADP介导的血小板聚集。替格瑞洛作为一种血小板抑制剂，广泛用于急性冠脉综合征患者，包括接受药物治疗和经皮冠状动脉介入(PCI)治疗的患者，降低血栓性心血管事件的发生率。目前，多国指南优先推荐替格瑞洛的剂量为：负荷量180mg，维持量90mg，一日两次，口服。而上述指南的数据多来源于外国人群而非中国人，因此其推荐剂量是否适合中国人有待确证。越来越多的研究表明，在亚洲人群中，较低的给药剂量(如，负荷量90mg，维持量90mg，一日一次，口服；维持量60mg，一日两次，口服；维持量45mg，一日两次，口服)可达到与推荐剂量相同的抗血小板聚集效果。对替格瑞洛进行药物浓度监测能够更好的监测治疗效果及不良反应，为临床的个体化治疗提供依据。
目前，综合分析检索到的国内外有关文献，对生物样本中替格瑞洛浓度的测定方法有HPLC-MS/MS法，尽管该方法有灵敏度好，特异性好等优点，但仪器设备价格昂贵实验室覆盖率较小，不利于推广。
故，本发明首次提出了一种应用高效液相色谱技术(HPLC)检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法及其配套试剂盒，使用本发明的检测方法及其配套试剂盒具有操作简单，专属性好，准确度高，易于推广等优点，可同时测定其原型药物及活性代谢产物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用高效液相色谱技术(HPLC)检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法及其配套试剂盒。
本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的；
本发明的一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法，包括如下步骤：
(1)标准工作溶液的配制：精密称取替格瑞洛及AR-C124910XX，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为2000μg/mL的替格瑞洛储备液及1000μg/mL的AR-C124910XX储备液，将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液，将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR-C124910XX工作溶液；将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液，将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液；精密称取伏立康唑，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为50μg/mL的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在4℃下保存，备用；
取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛工作溶液和AR-C124910XX工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，替格瑞洛校正标样的梯度浓度范围为50～1000ng/mL，AR-C124910XX校正标样的梯度浓度范围为20～500ng/mL；取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛质控溶液和AR-C124910XX质控溶液，混匀，配置成相应浓度的质控样品，替格瑞洛质控样品的梯度浓度为：80、300、800ng/mL，AR-C124910XX质控样品的梯度浓度范围为40、150、400ng/mL；
(2)样品处理：分别取等体积的校正标样、质控样品、待测样品、空白人正常血浆，分别向校正标样、质控样品、待测样品中加入内标工作溶液，空白人正常血浆中加入等体积水；向上述每个混合液中分别加入乙腈，混匀，离心，取上清液，通过0.22μm滤膜过滤，得到提取物，待测；
(3)标准曲线制作：将步骤(2)得到的校正标样、质控样品的提取物进行HPLC分析测定，分别以替格瑞洛、AR-C124910XX和内标的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度为横坐标制作标准曲线；
(4)定量分析：取待测样品按照步骤(2)的方法处理，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度。
其中，优选的，步骤(3)中HPLC分析测定血浆样品中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度，测定条件如下：
检测器：赛诺菲Thermo Ultimate 3000；
色谱柱：菲罗门SynergiTMPolar-RP phenyl
Figure BDA0001923167060000031
(150x 4.6mm,4μm)；
流动相A：乙腈；
流动相B：水；
等度洗脱，洗脱程序为：A：B＝42：58；
柱温：40℃；
检测波长：300nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：40μL。
其中，优选的，步骤(4)中结果计算具体为：按公式(1)计算样品中替格瑞洛的浓度；按公式(2)计算样品中AR-C124910XX的浓度；
Y＝0.0063X+0.0819(1)
Y＝0.0128X+0.0481(2)
式中：
Y：待测物与内标物质的峰面积之比；
X：待测物的浓度，单位为ng/mL。
进一步的，本发明还提出了一种应用高效液相色谱技术(HPLC)检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测试剂盒，所述的试剂盒中含有以下成分：
(1)梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液
精密称取替格瑞洛，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为2000μg/mL的替格瑞洛储备液，将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液；
(2)梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR-C124910XX工作溶液
精密称取AR-C124910XX，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为1000μg/mL的AR-Cl24910XX储备液，将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR-C124910XX工作溶液；
(3)梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液
将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液；
(4)梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液
将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液；
(5)梯度浓度范围为50～1000ng/mL的替格瑞洛校正标样
取空白人正常血浆，加入所述的替格瑞洛工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，替格瑞洛梯度浓度范围为50～1000ng/mL；
(6)梯度浓度范围为20～500ng/mL的AR-C124910XX校正标样
取空白人正常血浆，加入所述的AR-C124910XX工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，AR-C124910XX梯度浓度范围为20～500ng/mL；
(7)梯度浓度为80、300、800ng/mL的替格瑞洛质控样品
取空白人正常血浆，加入所述的替格瑞洛质控溶液，混匀，配置成相应浓度的质控样品，替格瑞洛的梯度浓度为：80、300、800ng/mL；
(8)梯度浓度范围为40、150、400ng/mL的AR-C124910XX质控样品
取空白人正常血浆，加入所述的AR-C124910XX质控溶液，混匀，配置成相应浓度的质控样品，AR-C124910XX的梯度浓度范围为40、150、400ng/mL；
(9)内标工作溶液
精密称取伏立康唑，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为50μg/mL的内标工作溶液；
(10)空白人正常血浆；
以上溶液均4℃保存，备用。
其中，优选的，使用所述的检测试剂盒进行检测时，样品处理包括以下步骤：取等体积的校正标样、质控样品、待测样品、空白人正常血浆，向校正标样、质控样品、待测样品中加入内标工作溶液，空白人正常血浆中加入等体积水；向上述每个混合液中分别加入乙腈，混匀，离心，取上清液，通过0.22μm滤膜过滤，得到提取物，待测。
其中，优选的，应用高效液相色谱仪检测时，将得到的校正标样、质控样品的提取物进行HPLC分析测定，分别以替格瑞洛、AR-C124910XX和内标的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度为横坐标制作标准曲线；待测样品按照上述相同方法处理，并按所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度。
其中，优选的，应用高效液相色谱仪检测时，测定条件如下：
检测器：赛诺菲Thermo Ultimate 3000；
色谱柱：菲罗门SynergiTMPolar-RP phenyl
Figure BDA0001923167060000051
(150x 4.6mm,4μm)；
流动相A：乙腈；
流动相B：水；
等度洗脱，洗脱程序为：A：B＝42：58；
柱温：40℃；
检测波长：300nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：40μL。
其中，优选的，使用所述的检测试剂盒进行检测时，按公式(1)计算样品中替格瑞洛的浓度；按公式(2)计算样品中AR-C124910XX的浓度；
Y＝0.0063X+0.0819(1)
Y＝0.0128X+0.0481(2)
式中：
Y：待测物与内标物质的峰面积之比；
X：待测物的浓度，单位为ng/mL。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的HPLC方法，专属性好、准确度高、稳定性好，同时配备的DAD检测器可进行目标物紫外吸收的全波长扫描，具有定性功能。
2、采用本发明的检测方法及配套试剂盒对人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度进行检测，检测过程快速、操作方便简单，可实现临床生物样品中替格瑞洛及其活性代谢产物的快速检测，可为临床个体化调整给药剂量提供参考。
附图说明
图1为人空白血浆和替格瑞洛给药后的患者血浆中替格瑞洛(TI)、AR-C124910XX(AX)、内标物(VOR)的高效液相色谱图(a：空白血浆色谱图；b：空白血浆中加入内标物对照品；c：空白血浆中加入内标物和AR-C124910XX对照品；d：空白血浆中加入内标物和替格瑞洛对照品；e：空白血浆中加入内标物、AR-C124910XX和替格瑞洛对照品；f：患者血浆中加入内标物对照品)。其中：VOR为内标物的色谱峰，TI为替格瑞洛的色谱峰，AX为活性代谢产物AR-C124910XX的色谱峰。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1：人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物AR-C124910XX浓度的检测
1.仪器
U3000高效液相色谱仪(德国Thermo Fisher)；
D-37520高速离心机(美国Abbott公司)；
Vortex Genius 3漩涡混合器(德国IKA公司)；
XS205DU电子天平(中国梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；
KQ-600数控超声波清洗器(中国昆山市超声仪器有限公司)。
2.试剂
标准品：替格瑞洛(麦克林)、AR-C124910XX(Toronto Research Chemicals)、伏立康唑(中国食品药品检定研究院)；
乙腈(色谱纯，Thermo Fisher Scientific)；
超纯水：自制。
3.检测方法
包括如下步骤：
(1)标准工作溶液的配制：精密称取替格瑞洛及AR-C124910XX，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为2000μg/mL的替格瑞洛储备液及1000μg/mL的AR-C124910XX储备液，将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液，将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR-C124910XX工作溶液；将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液，将AR-Cl24910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液；精密称取伏立康唑，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为50μg/mL的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在4℃下保存，备用；
取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛工作溶液和AR-C124910XX工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，替格瑞洛校正标样的梯度浓度范围为50～1000ng/mL，AR-C124910XX校正标样的梯度浓度范围为20～500ng/mL；取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛质控溶液和AR-C124910XX质控溶液，混匀，配置成相应浓度的质控样品，替格瑞洛质控样品的梯度浓度为：80、300、800ng/mL，AR-C124910XX质控样品的梯度浓度范围为40、150、400ng/mL；
(2)样品处理：分别取等体积(200μl)的校正标样、质控样品、待测样品、空白人正常血浆，分别向校正标样、质控样品、待测样品中加入内标工作溶液20μl，空白人正常血浆中加入等体积水；向上述每个混合液中分别加入乙腈600μl，混匀，离心，取上清液，通过0.22μm滤膜过滤，得到提取物，待测；
(3)标准曲线制作：将步骤(2)得到的校正标样、质控样品的提取物进行HPLC分析测定，分别以替格瑞洛、AR-C124910XX和内标的色谱峰面积比为纵坐标，以人血浆中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度为横坐标制作标准曲线；
色谱条件：
色谱柱：菲罗门SynergiTMPolar-RP phenyl
Figure BDA0001923167060000071
(150x 4.6mm,4μm)；
流动相A：乙腈；
流动相B：水；
等度洗脱，洗脱程序为：A：B＝42：58；
柱温：40℃；
检测波长：300nm；
流速：1.0mL/min；
进样量：40μL。
(4)定量分析：取待测样品按照步骤(2)的方法处理，并按步骤(3)所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度。
按公式(1)计算样品中替格瑞洛的浓度；按公式(2)计算样品中AR-C124910XX的浓度；
Y＝0.0063X+0.0819(1)
Y＝0.0128X+0.0481(2)
式中：
Y：待测物与内标物质的峰面积之比；
X：待测物的浓度，单位为ng/mL。
4.方法学验证
(1)专属性
为了证明本发明方法的专属性，本发明设定了以下实验组：(a)空白人正常血浆；(b)向空白人正常血浆中加入内标物对照品；(c)向空白人正常血浆中加入内标物和AR-C124910XX对照品；(d)向空白人正常血浆中加入内标物和替格瑞洛对照品；(e)向空白人正常血浆中加入空白血浆中加入内标物、AR-C124910XX和替格瑞洛对照品；(f)患者血浆中加入内标物对照品)。
按照上述替格瑞洛和AR-C124910XX的测定方法，对上述实验组样品进行测定，结果如图1所示，在空白血浆的色谱图中，在待测物的保留时间处，未见峰(图1a)，在向空白人正常血浆中加入内标物对照品中，在内标物(VOR)的保留时间处，有专属峰(图1b)，在向空白人正常血浆中加入内标物和AR-C124910XX对照品中，在内标物(VOR)和AR-C124910XX(AX)的保留时间处，有内标物(VOR)和AR-C124910XX(AX)的专属峰(图1c)，在向空白人正常血浆中加入内标物和替格瑞洛对照品中，在内标物(VOR)和替格瑞洛(TI)的保留时间处，有内标物(VOR)和替格瑞洛(TI)的专属峰(图1d)，在向空白人正常血浆中加入空白血浆中加入内标物、AR-C124910XX和替格瑞洛对照品中，在内标物(VOR)、替格瑞洛(TI)和AR-C124910XX(AX)的保留时间处，有内标物(VOR)、替格瑞洛(TI)和AR-C124910XX(AX)的专属峰(图1e)，在患者血浆中加入内标物对照品中，在内标物(VOR)、替格瑞洛(TI)和AR-C124910XX(AX)的保留时间处，有内标物(VOR)、替格瑞洛(TI)和AR-C124910XX(AX)的专属峰(图1f)，表明此方法具有良好的专属性。
(2)线性和灵敏度
替格瑞洛和AR-C124910XX在上述测定条件下制作的标准曲线表明在广泛浓度内(50,100,200,500,750,1000ng/mL和20,50,100,200,300,500ng/mL)和峰面积比有线性关系(R≥0.996)。替格瑞洛和AR-C124910XX的保留时间和线性范围，回归方程见表1(定量限信噪比＞10)。
表1 2种分析物的保留时间及线性回归方程
Figure BDA0001923167060000091
(3)精密度和回收率
精密度通过测定向空白血浆中加入已知量的标准品得出。
回收率通过测定向空白血浆中加入已知量的标准品得出。
取替格瑞洛(80，300，800ng/mL)和AR-C124910XX(40，150，400ng/mL)三个浓度的质控溶液，每个浓度5份平行，在一天内按上述检测方法中步骤(2)处理后测定，带入上述检测方法中步骤(4)的公式中，所得的结果用于计算回收率和日内精密度。连续测定5天，所得的结果用于计算日间精密度。用相对标准偏差来表示精密度。空白血浆中添加三个浓度质控溶液的回收率和精密度见表2。
表2血浆样品加标的回收率和精密度(RSD)
Figure BDA0001923167060000092
(4)稳定性
稳定性通过测定向空白血浆中加入已知量的标准品得出。
取替格瑞洛(80，300，800ng/mL)和AR-C124910XX(40，150，400ng/mL)三个浓度的质控溶液，每个浓度5份平行，分别于进样室中室温放置8h，反复冻融3次，保存30天后按上述检测方法中步骤(2)处理后测定，带入上述检测方法中步骤(4)的公式中，当所得结果的RSD小于15％时，可认为样品稳定。空白血浆中添加三个浓度质控溶液的稳定性见表3。
表3血浆样品加标的稳定性(RSD％)
Figure BDA0001923167060000101
由以上实例可以看出，本发明实施例通过对空白血浆中替格瑞洛和AR-C124910XX进行了检测，证明本发明方法有较高的灵敏度、准确度和精密度。
实施例2一种应用高效液相色谱技术(HPLC)检测人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测试剂盒
1、试剂盒的组装
所述的试剂盒中含有以下成分：
(1)梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液
精密称取替格瑞洛，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为2000μg/mL的替格瑞洛储备液，将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000ng/mL的替格瑞洛工作溶液；
(2)梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR-C124910XX工作溶液
精密称取AR-C124910XX，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为1000μg/mL的AR-C124910XX储备液，将AR-Cl24910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000ng/mL的AR-C124910XX工作溶液；
(3)梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液
将替格瑞洛储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为800、3000、8000ng/mL的替格瑞洛质控溶液；
(4)梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液
将AR-C124910XX储备液用50v/v％乙腈溶液稀释成梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液；
(5)梯度浓度范围为50～1000ng/mL的替格瑞洛校正标样
取空白人正常血浆，加入所述的替格瑞洛工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，替格瑞洛梯度浓度范围为50～1000ng/mL；
(6)梯度浓度范围为20～500ng/mL的AR-C124910XX校正标样
取空白人正常血浆，加入所述的AR-C124910XX工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，AR-C124910XX梯度浓度范围为20～500ng/mL；
(7)梯度浓度为80、300、800ng/mL的替格瑞洛质控样品
取空白人正常血浆，加入所述的替格瑞洛质控溶液，混匀，配置成相应浓度的质控样品，替格瑞洛的梯度浓度为：80、300、800ng/mL；
(8)梯度浓度范围为40、150、400ng/mL的AR-C124910XX质控样品
取空白人正常血浆，加入所述的AR-C124910XX质控溶液，混匀，配置成相应浓度的质控样品，AR-C124910XX的梯度浓度范围为40、150、400ng/mL；
(9)内标工作溶液
精密称取伏立康唑，加入50v/v％乙腈溶液，配制成浓度为50μg/mL的内标工作溶液；
(10)空白人正常血浆；
以上溶液均4℃保存，备用。
2、使用方法
同实施例1。

Claims (2)

1.一种人血浆中替格瑞洛及其活性代谢产物浓度的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）标准工作溶液的配制：精密称取替格瑞洛及其活性代谢产物AR-C124910XX，加入50v/v%乙腈溶液，配制成浓度为2000 μg/mL的替格瑞洛储备液及1000 μg/mL的AR-C124910XX储备液，将替格瑞洛储备液用50v/v%乙腈溶液稀释成梯度浓度为500、1000、2000、5000、7500、10000 ng/mL的替格瑞洛工作溶液，将AR-C124910XX储备液用50v/v%乙腈溶液稀释成梯度浓度为200、500、1000、2000、3000、5000 ng/mL的AR-C124910XX工作溶液；将替格瑞洛储备液用50v/v%乙腈溶液稀释成梯度浓度为800、3000、8000 ng/mL的替格瑞洛质控溶液，将AR-C124910XX储备液用50v/v%乙腈溶液稀释成梯度浓度为400、1500、4000ng/mL的AR-C124910XX质控溶液；精密称取伏立康唑，加入50v/v%乙腈溶液，配制成浓度为50 μg/mL的内标工作溶液；所有储备液及工作溶液在4℃下保存，备用；
取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛工作溶液和AR-C124910XX工作溶液，混匀，配置成相应梯度的校正标样，替格瑞洛校正标样的梯度浓度范围为50～1000 ng/mL，AR-C124910XX校正标样的梯度浓度范围为20～500 ng/mL；取空白人正常血浆，分别加入所述的替格瑞洛质控溶液和AR-C124910XX质控溶液，混匀，配置成相应浓度的质控样品，替格瑞洛质控样品的梯度浓度为：80、300、800 ng/mL，AR-C124910XX质控样品的梯度浓度范围为40、150、400 ng/mL；
（2）样品处理：分别取等体积的校正标样、质控样品、待测样品、空白人正常血浆，分别向校正标样、质控样品、待测样品中加入内标工作溶液，空白人正常血浆中加入等体积水；向上述每个混合液中分别加入乙腈，混匀，离心，取上清液，通过0.22μm滤膜过滤，得到提取物，待测；
（3）标准曲线制作：将步骤（2）得到的校正标样的提取物进行HPLC分析测定，分别以替格瑞洛、AR-C124910XX和内标的色谱峰面积比为纵坐标，以替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度为横坐标制作标准曲线；
（4）定量分析：取待测样品按照步骤（2）的方法处理，并进行HPLC分析测定，并按步骤（3）所得的标准曲线方程计算，得到待测样品中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度；
其中，HPLC分析测定血浆样品中替格瑞洛、AR-C124910XX的浓度，测定条件如下：
检测器：赛诺菲Thermo Ultimate 3000；
色谱柱：菲罗门Synergi™ Polar-RP phenyl 80 Å，150 x 4.6 mm, 4 µm；
流动相A：乙腈；
流动相B：水；
等度洗脱，洗脱程序为：A：B＝42：58；
柱温：40℃；
检测波长：300 nm；
流速：1.0 mL/min；
进样量：40μL。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（4）中结果计算具体为：按公式(1)计算样品中替格瑞洛的浓度；按公式(2)计算样品中AR-C124910XX的浓度；
Y＝0.0063X+0.0819 (1)
Y＝0.0128X+0.0481 (2)
式中：
Y：待测物与内标物质的峰面积之比；
X：待测物的浓度，单位为ng/mL。
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