CN114994213A - 一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒及测定方法 - Google Patents

一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒及测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒，所述试剂盒包括对照品母液、洗脱液、提取液和稀释液。本发明还涉及利用上述的试剂盒测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的方法。采用本发明提供的测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒，可快速检测药物在血浆中的含量，且特异性强，灵敏度高。前处理过程只需简单蛋白沉淀法，色谱分离和质谱检测过程在6min内即可完成。回收率和基质效应满足检测要求。本发明为快速、准确检测酪氨酸激酶抑制剂提供了一种有效的检测耗材及测定方法。

Description

一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试 剂盒及测定方法
技术领域
本发明涉及血浆定量检测技术领域，特别是一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒及测定方法。
背景技术
小分子酪氨酸激酶抑制在临床上主要应用于各个系统肿瘤疾病的治疗。这类药物治疗窗窄、药动学个体差异较大，需进行治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，TDM)。
小分子酪氨酸激酶抑制剂作用机制是以受体酪氨酸激酶作为靶点，竞争性抑制三磷酸腺苷(ATP)结合激酶域的ATP结合位点，使酪氨酸激酶不能磷酸化，发挥抗肿瘤作用。与传统的化疗放疗相比，口服小分子抑制剂简单方便，且对机体的损害相对较轻，副作用较少，广泛用于治疗CML、乳腺癌、甲状腺癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝细胞癌(HCC)、肾细胞癌(RCC)和胃肠道间质瘤(GIST)等恶性肿瘤的治疗。自上市以来，小分子酪氨酸激酶抑制剂的抗肿瘤效果已经取得了突破性的进展，并在抗肿瘤领域中扮演者着相当重要的地位。但作为新型靶向治疗药物，耐药和不良反应发生成为治疗失败不得不面对的问题。据报道，体内药动学差异性较高，患者饮食摄入、联合化疗、药物间相互作用或其他因素均会影响体内药动学变化，药物暴露浓度的变化(浓度过高/过低)也会导致药物不良反应的产生或治疗疗效下降，因此，监测血药浓度能更好的预测治疗反应。如能对小分子酪氨酸激酶抑制剂的多种药物同时进行监测，可以获得更为完整的治疗用药信息，便于调整个体给药方案。
近年以来，随着分析技术与方法的快速发展，检测药物浓度的方法不断更新进步，许多色谱与免疫测定法广泛应用于TDM方面。目前，免疫测定法主要包括酶联免疫法、放射免疫法以及荧光免疫法等，并且这些有效的检测方法已经广泛应用于临床中抗肿瘤药物、抗生素、抗癫痫药和抗心律失常的定量测定中。但免疫测定法针对性有限，不是所有的药物都可以检测，检测的结果也易出现假阳性的可能。与免疫检测法相比，色谱分析技术具有灵敏度高、准确度好、选择性强的优点。常见的色谱分析技术主要包括高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)以及液相色谱串联质谱联(LC-MS/MS)等。LC-MS/MS以其高特异性的优势，可使目标化合物与干扰杂质不必达到基线分离，显著降低了分析时间及样品纯化过程，成功用于各种领域的生物样品定量和定性分析。目前，国内外报道了多种应用LC-MS/MS技术测定小分子酪氨酸激酶抑制的检测方法进行TDM。然而，质谱临床检验方法均为实验室自行建立的方法(Laboratory developed tests,LDT)，采用的试剂多为非试剂盒产品，检测方法难以标准化，并且检测结果的准确度、重复性、时间可比性有待临床进一步验证。
因鉴于此，特提出此发明。
发明内容
为了解决现有的技术问题，本发明提供了一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒及测定方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒，所述试剂盒包括对照品母液、洗脱液、提取液和稀释液；
所述对照品母液包括克唑替尼(Crizotinib)、伊马替尼(Imatinib)、阿法替尼(Afatinib)、吉非替尼(Gefitinib)、威罗菲尼(Vemurafenib)、奥希替尼(Osimertinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、瑞格菲尼(Regorafenib)、色瑞替尼(Ceritinib)、劳拉替尼(Lorlatinib)、达沙替尼(Dasatinib)、厄洛替尼(Erlotinib)、埃克替尼(Icotinib)、阿帕替尼(Apatinib)、阿昔替尼(Axitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、伊布替尼(Ibrutinib)和尼洛替尼(Nilotinib)的储备液；
所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，洗脱液A为甲酸水溶液，洗脱液B为乙腈；
所述提取液为2H3-Regorafeinb和Pazopanib-13C-D3的甲醇溶液；
所述稀释液包括稀释液A、稀释液B和稀释液C，其中稀释液A为空白血浆、稀释液B为10％甲醇溶液、稀释液C为甲醇；
所述质控液为含有小分子酪氨酸激酶抑制剂的空白血浆。
优选或可选的，所述Crizotinib、Imatinib、Afatinib、Gefitinib、Vemurafenib、Osimertinib、Pazopanib、Regorafenib、Ceritinib、Lorlatinib、Dasatinib、Erlotinib、Icotinib、Apatinib、Axitinib、Sorafenib、Ibrutinib和Nilotinib的储备液的浓度均为1mg/mL。
优选或可选的，所述洗脱液A为0.1％甲酸水溶液。
优选或可选的，所述提取液中2H3-Regorafeinb和Pazopanib-13C-D3的浓度均为10ng/mL。
优选或可选的，所示质控液包括浓度分别为25.0、50.0、250.0、1000.0ng/mL的Crizotinib、Imatinib、Afatinib、Gefitinib、Vemurafenib、Lorlatinib、Osimertinib的空白血浆溶液；浓度分别为10.0、20.0、100.0、400.0ng/mLPazopanib、Regorafenib、Ceritinib的空白血浆溶液；浓度分别为2.0、4.0、20.0、80.0ng/mL的Dasatinib、Erlotinib、Icotinib、Apatinib、Axitinib、Sorafenib、Ibrutinib和Nilotinib的空白血浆溶液。
优选或可选的，所述试剂盒还包括质控液，所述质控液为含有小分子酪氨酸激酶抑制剂的空白血浆。
另一方面，本发明还提供了一种利用上述的试剂盒测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的方法，依次按下述步骤进行：
(1)利用提取液预处理人血浆样品，得到待测血浆样品；
(2)利用储备液配置标添样本；
(3)利用标添样本通过液质联用法绘制校正曲线；
(4)将待测血浆样品通过液质连用法得到待测血浆样品中各小分子酪氨酸激酶的抑制峰面积与内标峰面积的比值；
(5)将步骤(4)中得到的比值带入到步骤(3)得到的校正曲线中，计算得到人血浆样品中各小分子酪氨酸激酶的含量。
优选或可选的，步骤(1)中利用提取液预处理人血浆样品的方法为：将100μL血浆置于1.5mL微量离心管中，吸取300μL提取液加入微量离心管内，涡旋10S,以14500r/min离心10min，吸取100μL上清即为待测血浆样品。
优选或可选的，步骤(2)中配置工作溶液的方法为：利用Crizotinib、Imatinib、Dasatinib、Afatinib、Erlotinib、Icotinib、Regorafenib、Ceritinib、Apatinib、Gefitinib、Axitinib、Pazopanib、Sorafenib、Ibrutinib、Vemurafenib、Nilotinib、Osimertinib、Lorlatinib的储备液和稀释液C配置包含浓度25μg/mL的Crizotinib、Imatinib、Afatinib、Gefitinib、Vemurafenib、Lorlatinib、Osimertinib，浓度10μg/mL的Pazopanib、Regorafenib、Ceritinib和浓度为2μg/mL的Dasatinib、Erlotinib、Icotinib、Apatinib、Axitinib、Sorafenib、Ibrutinib、Nilotinib的混合液A；
将混合液A用稀释液B分别稀释1、2.5、5、10、25、50、100倍，制备一系列工作溶液；
将上述各工作溶液分别用稀释液A稀释10倍，得到标添样本。
优选或可选的，步骤(3)中，所述液质联用的色谱条件为：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：乙腈，纯度为质谱级；
采用梯度洗脱方式进行分离杂质，流动相洗脱参数如下表所示：
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 0.35 84 16
0.5 0.35 16 84
5.5 0.35 5 95
6 0.35 5 95
。
色谱柱型号：Waters XBridge C18(3.5μm，2.1×100mm)；
流速为0.35mL/min，柱温为35℃，进样量为5μL；
所述质谱条件为：
在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式；HPLC流速250μL/min，鞘气流速11L/min，温度为250℃；喷嘴电压为500V；雾化器压力为45psi；毛细管电压4000V(posi)；干燥气及雾化气为氮气，干燥气流量为5L/min，温度为350℃。
优选或可选的，步骤(4)中，所述液质联用的色谱条件为：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：乙腈，纯度为质谱级；
采用梯度洗脱方式进行分离杂质，流动相洗脱参数如下表所示：
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相8(％)
0 0.35 84 16
0.5 0.35 16 84
5.5 0.35 5 95
6 0.35 5 95
。
色谱柱型号：Waters XBridge C18(3.5μm,2.1×100mm)；
流速为0.35mL/min，柱温为35℃，进样量为5μL；
所述质谱条件为：
在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式；HPLC流速250μL/min，鞘气流速11L/min，温度为250℃；喷嘴电压为500V；雾化器压力为45psi；毛细管电压4000V(posi)；干燥气及雾化气为氮气，干燥气流量为5L/min，温度为350℃。
有益效果
采用本发明提供的测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒，可快速检测药物在血浆中的含量，且特异性强，灵敏度高。前处理过程只需简单蛋白沉淀法，色谱分离和质谱检测过程在6min内即可完成。回收率和基质效应满足检测要求。本发明为快速、准确检测酪氨酸激酶抑制剂提供了一种有效的检测耗材及测定方法。
附图说明
图1为空白血浆样品的专属性色谱图；
图2为添加内标血浆样品专属性色谱图；
图3为标准添加血浆样品专属性色谱图；
图4为实测血浆样品专属性色谱图；
图5为残留效应评价最高浓度点色谱图；
图6为残留效应评价空白样本色谱图；
图7为实施例3中测定的临床血浆样本中的小分子酪氨酸激酶抑制物浓度值。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将结合说明书附图和较佳实验例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
本发明实施例提供了一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的方法。
试验仪器：
安捷伦1200高效液相色谱串联安捷伦6410A三重四级杆质谱仪(AgilentTechnologies，美国)，离子源为ESI源；软件平台为Agilent Mass Hunter B.01.04控制及数据处理系统(Agilent,Santa Clara，美国)。
电子天平，微量移液枪，超声波发生器，涡旋混合仪，高恒速离心机，医用储藏4℃和-20℃冰箱。
试剂耗材：
HPLC级的乙腈及甲醇(Merck，Kenilworth，美国)；
HPLC级二甲亚砜(DMSO)；
乙酸铵(TEDIA，Fairfied，美国)；
HPLC级的异丙醇(Thermo Fisher Scientific，Waltham，美国)；
分析纯甲酸(麦克林，上海，中国)，纯净水(屈臣氏，广州，中国)。
待测化合物对照品及内标对照品：
Crizotinib(Lot：Z24A6Y2627),Afatinib(Lot：S23J10Z90996),Erlotinib(Lot：T03N675433),Icotinib(Lot：X17J10Q90809),Regorafeinb(Lot：Y25S10Y98811),Ceritinib(Lot：S10J10M92649),Apatinib(Lot：Y26S10Y98810),Osimertinib(Lot：E19J10K90808),PF-06463922(Lot：D23011Y128295),Lorlatinib(Lot：D23011Y128295)，上述购买于上海源叶生物科技有限公司(Shanghai Yuanye Bio-Technology Co.，Ltd，上海，中国)。
Imatinib(Lot：M1221AS),Dasatinib(Lot：M0717AS),Gefitinib(Lot：F1102AS),Axitinib(Lot：J1123A),Pazopanib(Lot：S0708A),Sorafenib(Lot：F0301A),Ibrutinib(Lot：O1025A),Vemurafenib(Lot：S0609A),Nilotinib(Lot：D1201A)，上述购买于大连美仑生物技术公司(Dalian Meilun Biotech Co.,Ltd，大连，中国)。
内标(Internal Standard，IS)化合物对照品包括2H3-Regorafeinb(Lot：Z01A11H118448),Pazopanib-13C-D3(Lot：Z01A11H118549)购买于上海源叶生物科技有限公司(Shanghai Yuanye Bio-Technology Co.,Ltd，上海，中国)。
测试材料：
人血浆样本选取2020年8月-2020年12月期间就诊于上海长征医院服用小分子酪氨酸激酶抑制剂的患者，至少服用对照品中的一种药物。收集患者基本的临床资料包括年龄、性别、给药剂量、疾病类型等。共收集25例住院患者血样，将全血样品离心后提取血浆，得用于测试的人血浆样本。
相关溶液的制备：
洗脱液A：甲酸0.3mL溶于300mL纯净水即得；
洗脱液B：分析纯乙腈300mL；
稀释液A：空白血浆10mL；
稀释液B：10％甲醇水溶液10mL；
稀释液C：分析纯甲醇10mL；
提取液：精密称量2H3-Regorafeinb和Pazopanib-13C-D3各2.00mg,置入容量瓶中，加入稀释液A并定量稀释到2.00mL刻度线处，配制得到每种内标化合物浓度均为1.00mg/mL的提取液储备液；进一步的，通过稀释液C进一步的稀释提取液储备液，得到各内标化合物浓度为10ng/mL的提取液；
对照品母液：分别称取Crizotinib、Imatinib、Dasatinib、Afatinib、Erlotinib、Icotinib、Regorafenib、Ceritinib、Apatinib、Gefitinib、Axitinib、Pazopanib、Sorafenib、Ibrutinib、Vemurafenib、Nilotinib、Osimertinib、Lorlatinib各2.00mg，分别置于容量瓶内，并加入稀释液A定量稀释到2.00mL刻度线处，溶解(若溶解困难，可超声溶解或添加少量DMSO溶液)，得到浓度为1.00mg/mL的各对照品的储备液。
质控液：分别配置浓度为25.0、50.0、250.0、1000.0ng/mL的Crizotinib、Imatinib、Afatinib、Gefitinib、Vemurafenib、Lorlatinib、Osimertinib的空白血浆溶液；
浓度为10.0、20.0、100.0、400.0ng/mL的Pazopanib、Regorafenib、Ceritinib的空白血浆溶液；
浓度为2.0、4.0、20.0、80.0ng/mL的Dasatinib、Erlotinib、Icotinib、Apatinib、Axitinib、Sorafenib、Ibrutinib和Nilotinib的空白血浆溶液。
配置标添样本：
分别取Crizotinib、Imatinib、Dasatinib、Afatinib、Erlotinib、Icotinib、Regorafenib、Ceritinib、Apatinib、Gefitinib、Axitinib、Pazopanib、Sorafenib、Ibrutinib、Vemurafenib、Nilotinib、Osimertinib、Lorlatinib储备液合并，并通过添加稀释液C配制得到1mL的混合液A，混合液A中Crizotinib、Imatinib、Afatinib、Gefitinib、Vemurafenib、Lorlatinib、Osimertinib的浓度为25μg/mL。Pazopanib、Regorafenib、Ceritinib浓度为10μg/mL，Dasatinib、Erlotinib、Icotinib、Apatinib、Axitinib、Sorafenib、Ibrutinib、Nilotinib浓度为2μg/mL。
将混合液A用稀释液B分别稀释1、2.5、5、10、25、50、100倍，制备一系列工作溶液；
将上述各工作溶液分别用稀释液A稀释10倍，得到标添样本。
样品的预处理：
吸取100μL人血浆样品置于1.5mL微量离心管中，精密吸取300μL提取液加入到该离心管内，涡旋10s，用转速14500r/min离心10min后，吸取100μL上清液至进样小瓶内，即为用于后续分析的待测血浆样品，标添样本在通入液相色谱和质谱前同样需要才用该方式进行处理。
建立校正曲线：
吸取经预处理的各标添样本100μL通过液质联用法绘制校正曲线。
其中色谱条件为：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：乙腈，纯度为质谱级；
采用梯度洗脱方式进行分离杂质，流动相洗脱参数如下表所示：
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 0.35 84 16
0.5 0.35 16 84
5.5 0.35 5 95
6 0.35 5 95
。
色谱柱型号：Waters XBridge C18(3.5μm,2.1×100mm)；
流速为0.35mL/min，柱温为35℃，进样量为5μL。
质谱条件为：
在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式；HPLC流速250μL/min，鞘气流速11L/min，温度为250℃；喷嘴电压为500V；雾化器压力为45psi；毛细管电压4000V(posi)；干燥气及雾化气为氮气，干燥气流量为5L/min，温度为350℃。
以标添样本中各对照品同内标的峰面积比值作为Y轴，对照品浓度作为X轴，建立校正曲线。
待测血浆样品的测定
吸取100μL待测血浆样品通过液质联用法得到待测血浆样品中各小分子酪氨酸激酶的抑制峰面积与内标峰面积的比值。
其中色谱条件为：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：乙腈，纯度为质谱级；
采用梯度洗脱方式进行分离杂质，流动相洗脱参数如下表所示：
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0 0.35 84 16
0.5 0.35 16 84
5.5 0.35 5 95
6 0.35 5 95
色谱柱型号：Waters XBridge C18(3.5μm,2.1×100mm)；
流速为0.35mL/min，柱温为35℃，进样量为5μL。
质谱条件为：
在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式；HPLC流速250μL/min，鞘气流速11L/min，温度为250℃；喷嘴电压为500V；雾化器压力为45psi；毛细管电压4000V(posi)；干燥气及雾化气为氮气，干燥气流量为5L/min，温度为350℃。
计算：
将步骤(4)中得到的比值带入到步骤(3)得到的校正曲线中，计算得到人血浆样品中各小分子酪氨酸激酶的含量。
效果实施例
对实施例1中所述的方法的各种性能进行方法学的相关验证。
选择性：
待测化合物和内标化合物相应的保留时间上杂质的响应不超过化合物最低定量下限响应的20％和内标响应的5％即为合格。
实施例1中小分子酪氨酸激酶抑制及内标的专属性色谱图如图1-4所示，图1为空白血浆样品，图2为添加内标血浆样品，图3为标准添加血浆样品，图4为实测血浆样品。
如图1-4所示，本发明实施例1中所述的方法的符合上述的对于专属性的相关规定。
校正曲线：
本申请实施例1的线性回归采用7个线性点的内标校正的峰面积同响应浓度的比值获得，权重系数使用1/x2，最低定量下限浓度即为线性的最低点。《中国药典2020》中规定，对于每一个浓度点，回算偏移应当在±15％内，最低定量下限浓度应当在±20％内。
实施例1中测得的各目标分析物的校正曲线回归方程如表1所示：
表1各目标分析物校正曲线回归方程
Figure BDA0003718573390000101
由上表可知，实施例1中各目标分析物的校正曲线回归方程的回算偏移均符合药典中的相关规定。
最低定量下限为每个目标化合物的最低检测限度。采用实施例1中的技术方案连续三天测定3批，每批测定6次。结果如表2所示。
表2各目标分析物最低定量下限数据结果
Figure BDA0003718573390000111
由上表结果可知，各目标分析物在最低定量下限的浓度响应良好，并且检测结果稳定，信噪比(S/N)≥10，批内、批件精密度最低定量下限RSD％不超过15％，批内、批间准确度均在±20％范围内，符合药典中的相关规定。
精密度和准确度：
选取各目标分析物标准曲线中低、中、高三个浓度点，每个浓度点样品各3个批次，每个批次各个5重复样品采用实施例1中的方法进行测定考察，结果如表3所示。
表3各目标分析物批内、批间准确度与精密度数据结果
Figure BDA0003718573390000131
Figure BDA0003718573390000141
由上表可见，所有目标分析物批内、批间准确度均值一般在标示浓度值的±15％范围内，即RE％在85％-115％之间。批内、批间精密度相对标准差不超过15％，即RSD％<15％。即实施例1中所述的方法在精密度与准确度方面也符合药典中的相关规定。
基质效应与提取回收率：
抑制质谱检测目标分析化合物响应程度的因素主要源自生物样品中内源性物质，包括磷脂类、蛋白类、小分子极性化合物等。
采用实施例1中提取液的溶剂——甲醇作为蛋白沉淀剂，对低、高两个浓度点的目标分析物进行基质效应和提取回收率的相关测定。
测定结果如表4所示。
表4各目标分析物的基质效应与提取回收率数据结果
Figure BDA0003718573390000161
Figure BDA0003718573390000171
由上表结果显示，所有目标分析物的基质效应在67.04％-117.57％之间，提取回收率在51.41％-113.91％之间，内标校正后的基质因子与提取回收率因子RSD％<15％，符合药典中的相关规定。
稳定性：
稳定性考察的是各样品经过室温(24℃)放置6h、进样室(4℃)24h、冻融3次以及长期(1month)放置后的稳定性情况，上述各情况考察是根据实际试验操作中遇到的情况作出的。
6个批次的高、低浓度目标分析分析物在经过上述处理后，结果如表5和6所示。
表5各目标分析物室温放置6h与进样室24h稳定性数据结果
Figure BDA0003718573390000172
Figure BDA0003718573390000181
表6各目标分析物冻融3次稳定性与长期(1month)稳定性数据结果
Figure BDA0003718573390000191
Figure BDA0003718573390000201
由上表结果可得，实施例1中的技术方案测定的目标分析物在室温(24℃)放置6h稳定性RE％在87.20％-114.50％之间，RSD％<15％，进样室(4℃)放置24h稳定性RE％在85.20％-114.99％之间，RSD％<15％，冻融3次稳定性RE％在85.63％-115.81％之间，RSD％<15％，长期(1month)稳定性RE％在86.55％-115.35％，符合药典中的要求。
残留效应：
残留效应的评价采用先进样最高浓度点样本，后进空白样本的形式，重复循环三次，干扰杂质的响应小于最低定量下限待测化合物响应的20％和内标响应的5％即为合格。
采用实施例1中所述方法测定各目标分析物的残留效应，结果如图5-6所示，其中，图5为最高浓度点色谱图，图6为空白样本色谱图。。
上述结果看出，实施例1中提供的测定方法，在残留效应上也符合药典的要求。
综上所述，本发明实施例1中所述的测定方法，在专属性、回算偏移、最低定量下限、精密度与准确度、基质效应与提取回收率、稳定性以及残留效应上都具备良好的性能，为快速、准确检测酪氨酸激酶抑制剂提供了一种有效的测定方法。
实施例2
根据实施例1中提供的测定方法，本发明实施例提供了一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒。通过该试剂盒，可以采用实施例1中所述的方法对人血浆样品中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度进行快速的测定。
该试剂盒中包含的内容如下表所示：
Figure BDA0003718573390000211
实施例3
采用实施例2中试剂盒对前述的临床血浆样本进行测定，方法与实施例1中相同。
试验结果如图7所示。
由图7可看出，采用实施例2中的试剂盒准确测量了临床血浆样本中的小分子酪氨酸激酶抑制剂浓度值，对临床实际有指导性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括对照品母液、洗脱液、提取液和稀释液；
所述对照品母液包括克唑替尼、伊马替尼、阿法替尼、吉非替尼、威罗菲尼、奥希替尼、帕唑帕尼、瑞格菲尼、色瑞替尼、劳拉替尼、达沙替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿帕替尼、阿昔替尼、索拉非尼、伊布替尼和尼洛替尼的储备液；
所述洗脱液包括洗脱液A和洗脱液B，洗脱液A为0.1％甲酸水溶液，洗脱液B为乙腈；
所述提取液为2H3-瑞格菲尼和帕唑帕尼-13C-D3的甲醇溶液；
所述稀释液包括稀释液A、稀释液B和稀释液C，其中稀释液A为空白血浆、稀释液B为10％甲醇溶液、稀释液C为甲醇。
2.根据权利要求1所述的测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒，其特征在于，所述克唑替尼、伊马替尼、阿法替尼、吉非替尼、威罗菲尼、奥希替尼、帕唑帕尼、瑞格菲尼、色瑞替尼、劳拉替尼、达沙替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿帕替尼、阿昔替尼、索拉非尼、伊布替尼和尼洛替尼的储备液的浓度均为1mg/mL。
3.根据权利要求1所述的测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒，其特征在于，所述提取液中2H3-瑞格菲尼和帕唑帕尼-13C-D3的浓度均为10ng/mL。
4.根据权利要求1所述的测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒，其特征在于，所示质控液包括浓度分别为25.0、50.0、250.0、1000.0ng/mL的克唑替尼、伊马替尼、阿法替尼、吉非替尼、威罗菲尼、劳拉替尼、奥希替尼的空白血浆溶液；浓度分别为10.0、20.0、100.0、400.0ng/mL帕唑帕尼、瑞格菲尼、色瑞替尼的空白血浆溶液；浓度分别为2.0、4.0、20.0、80.0ng/mL的达沙替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿帕替尼、阿昔替尼、索拉非尼、伊布替尼和尼洛替尼的空白血浆溶液。
5.根据权利要求1所述的测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括质控液，所述质控液为含有小分子酪氨酸激酶抑制剂的空白血浆。
6.一种利用权利要求1-5任一所述的试剂盒测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的方法，其特征在于，依次按下述步骤进行：
(1)利用提取液预处理人血浆样品，得到待测血浆样品；
(2)利用储备液配置标添样本；
(3)利用标添样本通过液质联用法绘制校正曲线；
(4)将待测血浆样品通过液质连用法得到待测血浆样品中各小分子酪氨酸激酶的抑制峰面积与内标峰面积的比值；
(5)将步骤(4)中得到的比值带入到步骤(3)得到的校正曲线中，计算得到人血浆样品中各小分子酪氨酸激酶的含量。
7.根据权利要求6所述的测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的方法，其特征在于，步骤(1)中利用提取液预处理人血浆样品的方法为：将100μL血浆置于1.5mL微量离心管中，吸取300μL提取液加入微量离心管内，涡旋10S,以14500r/min离心10min，吸取100μL上清即为待测血浆样品。
8.根据权利要求6所述的测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的方法，其特征在于，步骤(2)中配置工作溶液的方法为：利用克唑替尼、伊马替尼、达沙替尼、阿法替尼、厄洛替尼、埃克替尼、瑞格菲尼、色瑞替尼、阿帕替尼、吉非替尼、阿昔替尼、帕唑帕尼、索拉非尼、伊布替尼、威罗菲尼、尼洛替尼、奥希替尼、劳拉替尼的储备液和稀释液C配置包含浓度25μg/mL的克唑替尼、伊马替尼、阿法替尼、吉非替尼、威罗菲尼、劳拉替尼、奥希替尼，浓度10μg/mL的帕唑帕尼、瑞格菲尼、色瑞替尼和浓度为2μg/mL的达沙替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿帕替尼、阿昔替尼、索拉非尼、伊布替尼、尼洛替尼的混合液A；
将混合液A用稀释液B分别稀释1、2.5、5、10、25、50、100倍，制备一系列工作溶液；
将上述各工作溶液分别用稀释液A稀释10倍，得到标添样本。
9.根据权利要求6所述的测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述液质联用的色谱条件为：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：乙腈，纯度为质谱级；
采用梯度洗脱方式进行分离杂质，流动相洗脱参数如下表所示：
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 0.35 84 16 0.5 0.35 16 84 5.5 0.35 5 95 6 0.35 5 95
色谱柱型号：Waters XBridge C18(3.5μm，2.1×100mm)；
流速为0.35mL/min，柱温为35℃，进样量为5μL；
所述质谱条件为：
在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式；HPLC流速250μL/min，鞘气流速11L/min，温度为250℃；喷嘴电压为500V；雾化器压力为45psi；毛细管电压4000V(posi)；干燥气及雾化气为氮气，干燥气流量为5L/min，温度为350℃。
10.根据权利要求6所述的测定人血浆中抗肿瘤药物酪氨酸激酶抑制血药浓度的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述液质联用的色谱条件为：
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：乙腈，纯度为质谱级；
采用梯度洗脱方式进行分离杂质，流动相洗脱参数如下表所示：
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0 0.35 84 16 0.5 0.35 16 84 5.5 0.35 5 95 6 0.35 5 95
色谱柱型号：Waters XBridge C18(3.5μm，2.1×100mm)；
流速为0.35mL/min，柱温为35℃，进样量为5μL；
所述质谱条件为：
在电喷雾电离、正离子解离模式下，采用多重反应监测的质谱扫描模式；HPLC流速250μL/min，鞘气流速11L/min，温度为250℃；喷嘴电压为500V；雾化器压力为45psi；毛细管电压4000V(posi)；干燥气及雾化气为氮气，干燥气流量为5L/min，温度为350℃。
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