CN116930352B - 血液中37种常见抗心律失常药物液相色谱-质谱检测方法 - Google Patents

血液中37种常见抗心律失常药物液相色谱-质谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种血液中37种抗心律失常药物液相色谱‑质谱检测方法。采用有机溶剂沉淀蛋白法处理样品，超高效液相色谱‑串联质谱法(UPLC‑MS/MS)的多反应监测(MRM)模式检测，以保留时间、一对母离子/子离子对进行初筛定性检测；对于初筛检测阳性样本进行复核检测，以保留时间、两对母离子/子离子对、以及两对离子对相对丰度比为指标判定。

Description

血液中37种常见抗心律失常药物液相色谱-质谱检测方法
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及血液中37种常见抗心律失常药物液相色谱-质谱检测方法。
背景技术
心率失常是心动频率和节律的异常。当心脏冲动的频率、节律、起源部位、传导速度或激动顺序出现任何异常都会引发心律失常。心律失常的种类分为室上性心律失常、室性心律失常和心脏病及其他疾病引起的心律失常。心律失常可引发心源性猝死(suddencardiac death,SCD)，每年因SCD死亡的患者比脑卒中、肺癌、乳腺癌和艾滋病死亡的总和还多。有约88％的SCD是由心律不齐引发的，而其他心脏病只占了约12％。
中国民用航空局(CAAC)、欧洲航空安全局(EASA)、美国联邦航空管理局(FAA)、日本航空管理局(JCAB)均对患有心律失常各级体检合格证申请人有严格判定标准。其中，CAAC在《空中和空中交通管制员体检鉴定医学标准》(AC-67FS-001)中规定各级体检合格证申请人患有严重的心律失常或伴有器质性病变导致的心律失常及患有伴有阵发性室上性心动过速史的预激综合征为不合格。快速心律失常如房性早搏、心房纤颤等容易引起低血压、从而影响大脑等重要器官血流灌注导致晕厥，尤其在起飞或着陆等飞行的关键阶段，会严重威胁飞行安全。同时，航空飞行中的特殊环境会导致新发或者反复发作的房颤。民航航班在飞行中，机舱内会增压，增压后的高度相当于海拔5000-8000英尺(1524-2438米)，因而在该环境中氧气含量稀少，会增加易感人群发生房颤的概率。文献表明，频发实行早搏、完全右束支传导阻滞，更是造成飞行人员停飞或永久停飞的重要原因之一。除上述航空环境的影响外，不良生活方式如精神紧张，过度劳累，过量烟、酒、咖啡摄入等均可诱发室早。
为了保障民航航空运输安全，需要开发与建立血液中抗心律失常药物的液相色谱质谱法检测方法。相较于100年前Vaughan williams提出的以心肌细胞膜生理学为分类基础的四大类抗心律失常药物，2018年，Lei等学者在circulation杂志上发布了八大类32种新的抗心律失常药物分类方法，全面涵盖了抗心律失常作用药物的作用机制、电生理效应。文献查询，现有的检测方法，仅有某种或者某几种药物的检测方法。同时，由于我国民航受检对象多(除现役飞行员外，还用于招收飞行学生、外籍飞行员和军转民飞行员)，检测时间有限，生物样本量少、检测目标化合物多，现有方法无法满足航空医学检验上的需求。因此，本研究以2018年抗心律失常药物分类方法为基础，结合临床试剂应用，建立了血液中37种抗心律失常药物液相色谱-质谱检测方法。
本发明旨在建立一种样品处理简单、高灵敏、准确性的超高液相色谱质谱联用方法，该方法能够同时测定人血浆中常见的37种抗心律失常药物，用来满足飞行员体内抗心律失常药物的筛查检测需要。
发明内容
为了改善上述技术问题，本发明提供一种血液中37种抗心律失常药物液相色谱-质谱检测方法。采用有机溶剂沉淀蛋白法处理样品，超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式检测，以保留时间、一对母离子/子离子对进行初筛定性检测；对于初筛检测阳性样本进行复核检测，以保留时间、两对母离子/子离子对、以及两对离子对相对丰度比为指标判定。
本发明第一方面提供一种血液中37种抗心律失常药物液相色谱-质谱检测方法，所述方法包括如下步骤：
1)初筛检测：采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，对预处理后的血液样品，以保留时间、一对母离子/子离子对进行初筛检测；
2)任选的，进一步包括对步骤1)中初筛检测阳性的样本进行复核检测，采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，对预处理后的血液样品，以保留时间、两对母离子/子离子对为指标判定；
37种抗心律失常药物为：
匹罗卡品、异丙肾上腺素、索他洛尔、多菲利特、尼可地尔、阿托品、山莨菪碱、纳多洛尔、奎尼丁、腺苷、美托洛尔、阿义马林、丙吡胺、艾司洛尔、美西律、吡那地尔、赛利洛尔、伊伐布雷定、维纳卡兰、普萘洛尔、比索洛尔、伊布利特、雷诺嗪、地尔硫卓、阿普林定、倍他洛尔、卡维地洛、莫雷西嗪、维拉帕米、氟卡尼、普罗帕酮、苄普地尔、决奈达隆、N-(对戊基)邻氨基苯甲酸、胺碘酮、华法林和利伐沙班。
在一些实施方案中，步骤1)中的初筛检测包括以下步骤：
A1)血液样品预处理；
A2)采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，以保留时间、一对母离子/子离子对进行初筛检测。
在一些实施方案中，步骤A1)血液样品预处理采用有机溶剂沉淀蛋白法，有机溶剂优选为甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙醚等，更优选为0.1％甲酸甲醇。
通过考察流动相发现，当有机溶剂为0.1％甲酸甲醇时，分离度好、空白基质无干扰、峰响应值更高。
在一些实施方案中，步骤A1)中血液样品预处理方法为：将待测抗凝血液离心分离上清，将有机溶剂加入上清混合，再离心分离，取上清备检。
在一些实施方案中，血液样品预处理方法为：将待测抗凝血液离心分离上清，加入内标溶液，将有机溶剂加入上清混合，再离心分离，取上清备检。
在一些实施方案中，内标溶液选自美托洛尔-D6溶液、卡维地洛-D3溶液、胺碘酮-D4溶液中的任一种或多种；
和/或，浓度为0.05μg/mL-5.0μg/mL，例如0.5μg/mL；
和/或，加入量为0.5μL-10μL,例如5μL。
在一些实施方案中，血液样品预处理方法为：待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入5μL浓度为0.5μg/mL的内标溶液，混匀，再加入600μL0.1％-甲酸甲醇，涡旋混合1min，14000rpm离心10min，取上清备检。
在一些实施方案中，步骤A2)中超高效液相色谱UPLC的液相色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(C18柱、ODS柱)，例如ACQUITY UPLC HSS C18柱，优选尺寸为1.8μm×2.1mm×150mm；
柱温：30-60℃，例如50℃；
样品室温度：0-20℃，例如10℃；
进样量：1-5μL，例如2μL；
流速：0.1-0.5mL/min，例如0.3mL/min；
流动相A为含0.1-10mmol/mL乙酸胺和0.001％-0.5％甲酸的水溶液，流动相B为含0.001％-0.5％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱。
在一些实施方案中，流动相A为含5mmol/mL乙酸胺和0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的甲醇溶液。
在一些实施方案中，梯度洗脱的条件如表4所示：
表4 37种抗心律失常药物UPLC-MS/MS初筛检测的色谱流动相条件
在一些实施方案中，步骤A2)中串联质谱法的质谱条件为：
离子源：电喷雾电离-正离子模式(ESI+)；
检测模式：多反应监测(MRM)；
锥孔电压(Cone)：10-100V；
碰撞能量Collision：1-100eV。
在一些实施方案中，37种抗心律失常药物的锥孔电压和/或碰撞能量如表A中所示。
在一些实施方案中，初筛检测分时间段检测。
在一些实施方案中，所述初筛检测步骤中的分时间段检测根据化合物的保留时间进行分时间段检测，例如可以分为2个时间段，3个时间段，4个时间段，5个时间段，6个时间段，7个时间段，8个时间段，9个时间段或者10个时间段。
在一些实施方案中，分时间段检测的扫描时间段为0-2.4min、2.4-5.0min、5.0-7.0min、7.0-10.0min、10.0-13.4min、13.4-14.8min、14.8-16.2min、16.2-16.9min、16.9-19.0min。
在一些实施方案中，分时间段检测的扫描时间段如表A中所示。
在一些实施方案中，37种抗心律失常药物在血液中的检出限如表A中所示。
在一些实施方案中，37种抗心律失常药物的保留时间如表A中所示。
在一些实施方案中，37种抗心律失常药物的母离子/子离子对如表A中所示。
在一些实施方案中，步骤2)中的复核检测包括以下步骤：
B1)血液样品预处理；
B2)采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，以保留时间、两对母离子/子离子对为指标判定。
在一些实施方案中，步骤B1)中血液样品预处理方法为：将待测抗凝血液离心分离上清，将有机溶剂加入上清混合，离心分离得上清液，除去上清液中的溶剂，加入复溶剂溶解后备检。
在一些实施方案中，血液样品预处理方法为：将待测抗凝血液离心分离上清，加入内标溶液，将有机溶剂加入上清混合，离心分离取上清液，除去上清液中的溶剂，加入复溶剂溶解后备检。
在一些实施方案中，步骤B1)血液样品预处理采用有机溶剂沉淀蛋白法，有机溶剂优选为甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙醚等，更优选为0.1％甲酸甲醇。
通过考察流动相发现，当有机溶剂为0.1％甲酸甲醇时，分离度好、空白基质无干扰、峰响应值更高。
在一些实施方案中，内标溶液选自美托洛尔-D6溶液、卡维地洛-D3溶液、胺碘酮-D4溶液中的任一种或多种；
和/或，浓度为0.05μg/mL-5.0μg/mL，例如0.5μg/mL；
和/或，加入量为0.5μL-10μL,例如5μL。
在一些实施方案中，采用本领域常规的方法除去上清液中的溶剂，例如恒温水浴吹干(例如65℃)等。
在一些实施方案中，复溶剂选自水、甲醇、乙醇中的一种、两种或多种，优选为水-甲醇，例如体积比为80:20的水-甲醇。
在一些实施方案中，血液样品预处理方法为：待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清200μL至1.5mL离心管中，加入5μL浓度为0.5μg/mL的内标溶液，混匀，再加入600μL0.1％-甲酸甲醇，涡旋混合1min，14000rpm离心10min，取上清液，于65℃恒温水浴吹干，加入200μL复溶剂溶解后备检。
在一些实施方案中，步骤B2)中超高效液相色谱UPLC的液相色谱条件如上述步骤A2)中超高效液相色谱UPLC的液相色谱条件所述。
在一些实施方案中，步骤B2)中串联质谱法的质谱条件为：
离子源：电喷雾电离-正离子模式(ESI+)；
检测模式：多反应监测(MRM)；
锥孔电压(Cone)：10-100V；
碰撞能量Collision：1-100eV。
在一些实施方案中，根据初筛检测的分析参数，将37种抗心律失常药物中同一质谱扫描时间段内的化合物、结构类似的化合物以及保留时间接近的化合物分在不同的复核方法组内。
在一些实施方案中，将37种抗心律失常药物分为如下5组进行复核检测：
第一组：匹罗卡品、尼可地尔、美西律、普萘洛尔、地尔硫卓、华法林、决奈达隆；
第二组：异丙肾上腺素、阿托品、山莨菪碱、吡那地尔、倍他洛尔、氟卡尼、阿普林定；
第三组：腺苷、索他洛尔、纳多洛尔、阿义马林、比索洛尔、普罗帕酮、莫雷西嗪、胺碘酮；
第四组：美托洛尔、奎尼丁、维纳卡兰、赛利洛尔、伊布利特、雷诺嗪、苄普地尔；
第五组：多菲利特、艾司洛尔、丙吡胺、伊伐布雷定、卡维地洛、维拉帕米、N-(对戊基)邻氨基苯甲酸、利伐沙班。
在一些实施方案中，37种抗心律失常药物的锥孔电压和/或碰撞能量如表B1-B5中所示。
在一些实施方案中，37种抗心律失常药物在血液中的检出限如表B1-B5中所示。
在一些实施方案中，37种抗心律失常药物的保留时间如表B1-B5中所示。
在一些实施方案中，37种抗心律失常药物的母离子/子离子对如表B1-B5中所示。
在一些实施方案中，以保留时间、两对母离子/子离子、离子对的相对丰度比为指标判定。
在一些实施方案中，离子对的相对丰度比的最大允许相对误差如表5所示。
表5离子对的相对丰度比的最大允许相对误差(％)
相对离子对丰度比 ≥50 20～50 10～20 ≤10
允许的相对误差 ±20 ±25 ±30 ±50
本发明第二方面提供一种检测血液中37种抗心律失常药物的试剂盒，包括如下组分：
i)沉淀剂；
ii)复溶剂；
iii)对照品储备溶液；
其中，37种抗心律失常药物为：
匹罗卡品、异丙肾上腺素、索他洛尔、多菲利特、尼可地尔、阿托品、山莨菪碱、纳多洛尔、奎尼丁、腺苷、美托洛尔、阿义马林、丙吡胺、艾司洛尔、美西律、吡那地尔、赛利洛尔、伊伐布雷定、维纳卡兰、普萘洛尔、比索洛尔、伊布利特、雷诺嗪、地尔硫卓、阿普林定、倍他洛尔、卡维地洛、莫雷西嗪、维拉帕米、氟卡尼、普罗帕酮、苄普地尔、决奈达隆、N-(对戊基)邻氨基苯甲酸、胺碘酮、华法林和利伐沙班。
在一些实施方案中，步骤i)沉淀剂选自有机溶剂，有机溶剂优选为甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙醚等，优选为0.1％甲酸甲醇。
通过考察流动相发现，当有机溶剂为0.1％甲酸甲醇时，分离度好、空白基质无干扰、峰响应值更高。其中，沉淀剂用于沉淀血液样品中蛋白并选择性提取37种抗心律失常药物。
在一些实施方案中，步骤ii)复溶剂选自水、甲醇、乙醇中的一种、两种或多种，优选为水-甲醇，例如体积比为80:20的水-甲醇。
其中，复溶剂用于复溶血液样品，优选是复核检测时用于复溶血液样品。
在一些实施方案中，对照品储备溶液中各对照品的浓度为10.mg/mL。
在一些实施方案中，可将对照品储备溶液进一步配制为对照品混合储备液，优选地对照品混合储备液中各对照品的浓度如表1中所述。
在一些实施方案中，可将对照品混合储备液进一步配制为对照品混合中间溶液，优选地对照品混合中间溶液中各对照品的浓度如表2中所述。
在一些实施方案中，所述试剂盒中还任选包括内标溶液，所述内标溶液选自美托洛尔-D6溶液、卡维地洛-D3溶液、胺碘酮-D4溶液中的任一种或多种；
和/或，浓度为0.05μg/mL-5.0μg/mL，例如0.5μg/mL。在一些实施方案中，可由对照品混合中间溶液与内标溶液配制成质控QC工作液。
在一些实施方案中，质控QC工作液中各对照品的浓度如表3所示。
本发明第三方面提供上述方法或试剂盒在检测血液样品中抗心律失常药物中的应用。
本发明第四方面提供上述试剂盒在制备产品中的应用，所述产品用于检测血液样品中抗心律失常药物。
本发明具有如下技术效果：
1.本发明通过超高效液相色谱-串联质谱仪对上述37种化合物进行研究，对保留时间、分子离子峰(母离子/子离子对)参数进行确认后，能够实现37种药物的同时检测，提高准确性，大大节约检测时间。
2.本发明采用超高效液相色谱-串联质谱仪对以上37种化合物进行研究，建立了《血液中37种常见抗心律失常药物液相色谱-质谱检测方法研究液相色谱-质谱检测方法》。
3.为提高检测效率，并解决实际检测中存在的问题，本发明方法将整个检测工作分成初筛检测步骤，和任选的对初筛检测阳性样本的复核检测步骤。
其中初筛检测步骤中，血液样品预处理方法简便、快速、灵敏，UPLC-MS/MS的检测条件能在短时间内一次性地同时灵敏、准确的对上述37种化合物进行检测，满足实际检测的时效性要求。如果实际工作中，通过初筛检测就足以满足检测目的所需，无需再进行复核检测步骤。
如果为了避免假阳性的检测结果，可以增加复核检测步骤。本发明的复核检测步骤，在充分研究了37种化合物的理化性质之后，调整了血液样品的复溶溶剂的类型，并将37种化合物按照保留时间相近的化合物或者理化性质相似的化合物分为5组进行检测，避免了化合物间相互影响，提高检测的准确度和灵敏度；进一步，在复核检测步骤中以保留时间、两对母离子/子离子对、分子离子丰度比为判别指标，提高了检测结果准确性。
4.本发明方法快速易行，灵敏可靠，具有良好的特异性、检出限低、基质效应低、提取回收率高、精密度良好、良好的稳定性，可作为实验室检测标准执行，用于空勤人员的违禁药物使用情况检测。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例1标准对照品溶液与试剂
1.1对照品溶液及试剂
匹罗卡品、异丙肾上腺素、索他洛尔、多菲利特、尼可地尔、阿托品、山莨菪碱、纳多洛尔、奎尼丁、腺苷、美托洛尔、阿义马林、丙吡胺、艾司洛尔、美西律、吡那地尔、赛利洛尔、伊伐布雷定、维纳卡兰、普萘洛尔、比索洛尔、伊布利特、雷诺嗪、地尔硫卓、阿普林定、倍他洛尔、卡维地洛、莫雷西嗪、维拉帕米、氟卡尼、普罗帕酮、苄普地尔、决奈达隆、N-(对戊基)邻氨基苯甲酸、胺碘酮，华法林和利伐沙班对照品，纯度均≥97％。
内标化合物美托洛尔-D6(浓度：1mg/mL，有效期3年)，卡维地洛-D3(浓度：1mg/mL，有效期2年)，胺碘酮-D4(100μg/mL，有效期2年)，纯度均≥97％。
除另有规定外，试剂均为色谱纯，甲醇(GR)，甲酸(优级纯)；水为GB/T6682规定的二级水，去离子水由超纯水仪(Millipore纯水系统)制备。
1.2对照品溶液的制备
分别精密称量匹罗卡品、异丙肾上腺素、索他洛尔、多菲利特、尼可地尔、阿托品、山莨菪碱、纳多洛尔、奎尼丁、腺苷、美托洛尔、阿义马林、丙吡胺、艾司洛尔、美西律、吡那地尔、赛利洛尔、伊伐布雷定、维纳卡兰、普萘洛尔、比索洛尔、伊布利特、雷诺嗪、地尔硫卓、阿普林定、倍他洛尔、卡维地洛、莫雷西嗪、维拉帕米、氟卡尼、普罗帕酮、苄普地尔、决奈达隆、N-(对戊基)邻氨基苯甲酸、胺碘酮、华法林和利伐沙班的对照品各10.0mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，得约1.0mg/mL的对照品储备溶液，置-18℃冰箱低温保存，保存期2年；对照品均购自于中国食品药品检定研究院。
分别精密量取上述各目标化合物对照品储备溶液于10mL容量瓶中，甲醇稀释至刻度，得37种化合物的对照品混合储备液，浓度见表1，保存期1年。
1.3内标溶液的配置
精密量取内标化合物美托洛尔-D6、卡维地洛-D3和胺碘酮-D4，于10mL容量瓶中，配置成为浓度约为500ng/mL的内标工作液，置于-18℃低温冰箱保存，保存期2年。
表1 37种化合物对照品混合储备液
1.4试剂
1.4.1乙腈(GR)
1.4.2乙酸铵(GR)
1.4.3甲酸(优级纯)
1.4.4流动相缓冲液
5.0mmol/L乙酸铵和甲酸缓冲液：精密称取192mg乙酸铵、500μL甲酸加至500mL超纯水中，pH值约为3。
甲醇和甲酸缓冲液：量取500μL甲酸加至500mL色谱纯的甲醇中。
实施例2.仪器
2.1超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱联用仪(UPLC-MS/MS)
2.2分析天平(感量0.1mg)
2.3 漩涡混匀器
2.4 离心机
2.5 移液器
2.6 1.5mL离心管
实施例3.UPLC-MS/MS初筛检测分析
3.1样品预处理
取待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清液200μL至1.5mL离心管中，加入内标溶液(美托洛尔-D6，卡维地洛-D3，胺碘酮-D4，浓度0.5μg/mL，5μL)，涡旋混合0.5min后，再加入600μL 0.1％-甲酸甲醇，涡旋混合1min，14000rpm离心10min，取上清备检。
3.2空白样本制备
取空白血浆200μL至1.5mL离心管中，加入沉淀试剂(0.1％-甲酸甲醇)600μL，涡旋混合1min，14000rpm离心10min，取上清备检。
3.3QC样本制备
取空白血浆200μL至1.5mL离心管中，添加37种对照品混合中间溶液5μL浓度见表2和5μL内标溶液(美托洛尔-D6、卡维地洛-D3和胺碘酮-D4，浓度为0.5μg/mL)，配制成血浆中被测物浓度如表3所示的QC样品，加入沉淀试剂(0.1％-甲酸甲醇)600μL，涡旋混合1min，14000rpm离心10min，取上清备检。
表2：37种对照品混合中间溶液
表3：血浆中(QC样品)中37种化合物浓度
/>
在液相条件优化条件时，曾选择乙腈-水，甲醇-水分别考察，结果表明甲醇-水分离效果好，锋型好且独立互不干扰；后考察酸浓度，分别考察0.1％的甲酸水-0.1％甲酸的甲醇、0.1％的甲酸水-甲醇、5mM乙酸铵水溶液-0.1％甲酸甲醇、5mM乙酸铵、0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸的甲醇和20mM乙酸铵作为流动相，实验结果表明5mM乙酸铵-0.1％甲酸水溶液为流动相一，0.1％甲酸-甲醇为流动相二时，溶剂效应影响小，待测化合物分离度和峰型佳。
最终确定液相条件为：
3.4液相色谱条件
3.4.1色谱柱：ACQUITY UPLC HSS C18，2.1mm×150mm，1.8μm；
3.4.2柱温：50℃；
3.4.3样品室温度：10℃；
3.4.4进样量：2μL；
3.4.5流动相组成和梯度洗脱程序见表4。
表4流动相组成和梯度洗脱表
/>
每个化合物在质谱方法优化时采用仪器自带的软件进行优化出具体条件，样品室温度为10℃；离子源ESI+，离子源温度120℃；去溶剂化温度350℃；正离子方式检测；扫描方式：多反应监测(MRM)，具体参数如下：
3.5质谱条件
3.5.1离子源：电喷雾电离-正离子模式(ESI+)；
3.5.2检测模式：多反应监测(MRM)；
3.5.3锥孔电压(Cone)、碰撞能量(Collision)等参数见附录A。
实施例4.UPLC-MS/MS复核检测分析
4.1样品预处理
待测抗凝血液5000rpm离心3min，取上清液200μL至1.5mL离心管中，加入内标溶液(美托洛尔-D6，卡维地洛-D3，胺碘酮-D4，浓度0.5μg/mL，5μL)，涡旋混合0.5min后，再加入600μL 0.1％-甲酸甲醇，涡旋混合1min，14000rpm离心10min，取上清液，于65℃恒温水浴中吹干，加入200μL复溶剂(水-甲醇80:20(V/V))备检。
4.2空白样本制备
取空白血浆200μL至1.5mL离心管中，加入沉淀试剂(0.1％-甲酸甲醇)600μL，涡旋混合1min，14000rpm离心10min，取上清，于65℃恒温水浴中吹干，加入200μL复溶剂(水-甲醇80:20(V/V))，备检。
4.3QC样本制备
取空白血浆200μL至1.5mL离心管中，添加37种对照品混合中间溶液5μL浓度见表2和5μL内标溶液(美托洛尔-D6、卡维地洛-D3和胺碘酮-D4，浓度为0.5μg/mL)，配制成血浆中被测物浓度如表3所示的QC样品，加入600μL(0.1％-甲酸甲醇)涡旋混合1min，14000rpm离心10min，取上清，于65℃中恒温水浴中吹干，加入200μL复溶剂(水-甲醇80:20(V/V))，备检。
4.4液相色谱条件
液相色谱条件同初筛检测，见3.4。
4.5质谱条件
复核检测的离子源、检测模式同初筛检测，将37个代谢化合物分为5组，化合物分组、锥孔电压(Cone)、碰撞能量(Collision)等参数见附录B，表B1～B5。
实施例5结果判定
5.1阴性结果判定
如果空白血浆样品中内标检出，且目标化合物(附录A表中药物成分)未检出，质控QC样品中所有化合物和内标均检出，而待测样品中仅检出内标未检出目标物，则阴性结果可靠；如果待测样品中未检出内标，则阴性结果不可靠。
另外，如果空白血浆样品中内标检出，且目标物未检出，质控样品中所有化合物和内标均检出，待测样品中检出内标和目标物，但若检出的目标物色谱峰保留时间与质控样品的色谱峰保留时间比较，偏差大于±0.1min或相对误差在±2％外，或在扣除背景后的样品质谱图中，未出现所选择的离子对(见附录A)，或目标物所选择的两对离子对相对丰度比与质控样品的离子对相对丰度比之相对误差超过表5规定的范围，则判断该样本检测结果为阴性。
记录空白添加﹑空白和样品提取物中目标化合物色谱峰的保留时间及一对母离子/子离子，并将相关图谱﹑数据及时打印或作为电子版本保存。空白样品无干扰，如果检出的色谱峰保留时间与空白样品添加对照品的色谱峰保留时间比较，经内标矫正后的相对误差在±2.0％，绝对误差在±0.1min；并且在扣除背景后的样品质谱图中，均出现所选择的离子对，则可判断样品中存在这种化合物，该样本初筛结果为阳性。
5.2阳性结果判定
如果空白血浆样品内标检出且目标物未检出，质控样品中所有化合物和内标均检出，而待测样品中检出内标和目标物，且检出的目标物色谱峰保留时间与质控样品的色谱峰保留时间比较，偏差小于±0.1min或相对误差在±2％内，并且在扣除背景后的样品质谱图中，均出现所选择的离子对(见附录A表)，则可判断样品初筛结果阳性，须再进行复核检测。如果复核检测的空白血浆样品内标检出且目标物未检出，质控样品中目标化合物和内标均检出，而待测样品中检出内标和目标物，且检出的目标物色谱峰保留时间与质控样品的色谱峰保留时间比较，偏差小于±0.1min或相对误差在±2％内，且在扣除背景后的样品质谱图中，均出现所选择的离子对(见附录B表B1-B5)，所选择的两对离子对相对丰度比与质控样品的离子对相对丰度比之相对误差不超过表5规定的范围，则判断该样本复核检测结果为阳性，阳性检测结果可靠。如果待测样品检出药物成分且空白样品亦呈阳性，则阳性结果不可靠。
表5相对离子丰度比的最大允许相对误差(％)
相对离子对丰度比 ≥50 20～50 10～20 ≤10
允许的相对误差 ±20 ±25 ±30 ±50
实施例6方法学考察
6.1特异性
取6个不同来源的人空白血浆样品(抗凝剂为肝素钠)200μL，按1-3项下处理样本后，按4-5项下进行UPLC-MS/MS检测，得到人空白血浆样品总离子流图。结果与空白添加QC图谱比较，未发现内源性物质对目标化合物检测有干扰。
6.2检出限
取6份空白血浆200μL，添加37种化合物对照品工作液，分别制备成质量浓度为40、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05ng/mL的质控样品(n＝10)，按“1-3项样品预处理方法”处理样品后，按“4-5项下进行UPLC-MS/MS方法”检测。按信噪比S/N≥3计，并计算待测化合物峰面积的变异系数(RSD％)值，化合物峰面积小于25％的浓度值作为本方法的检出限，检出限结果见表6。
表6 37种化合物检出限测定结果(n＝10)
6.3基质效应
MB：取12份不同来源的人空白血浆样品(抗凝剂为肝素钠)200μL，加入600μL0.1％甲酸-甲醇溶液，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，用移液器各移取680μL该提取液，6份提取液分别加入对照品混合中间溶液(见表2)5μL和内标液5μL，另外6份提取液分别加入混合对照品溶液(见表3)5μL和内标液5μL，混合均匀后，按4-5项下进行UPLC-MS/MS方法检测。记录待测化合物和内标峰面积，并计算待测化合物和内标峰面积比。
MC：取12份水溶液80μL加入600μL0.1％甲酸-甲醇溶液，6份提取液分别加入对照品混合中间溶液(见表2)5μL和内标液5μL，另外6份提取液分别加入混合对照品溶液(见表3)5μL和内标液5μL，混合均匀后，按4-5项下进行UPLC-MS/MS方法检测。记录待测化合物和内标峰面积，并计算待测化合物和内标峰面积比。
分别计算低浓度和高浓度的基质效应和RSD，结果表明待测化合物基质效应在之间83.47～116.44％之间，变异系数小于13.39％，结果见表7。
表7.37种化合物基质效应测定结果
/>
6.4提取回收率
RA：取12份混合人空白血浆样品(抗凝剂为肝素钠)200μL，6份加入混合对照品溶液(见表2)5μL，另外6份分别加入混合对照品溶液(见表3)5μL，加入600μL 0.1％甲酸-甲醇溶液，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，用移液器各移取680μL该提取液，后分别加入5μL甲醇，混合均匀后，按4-5项下进行UPLC-MS/MS方法检测，记录待测化合物面积。
RB：取12份混合人空白血浆样品(抗凝剂为肝素钠)200μL，分别加入5μL甲醇，加入600μL 0.1％甲酸-甲醇溶液，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，用移液器分别精密移取680μL该提取液，6份加入混合对照品溶液(见表2)5μL，另6份加入混合对照品溶液(见表3)5μL，混合均匀后，按4-5项下进行UPLC-MS/MS方法检测，记录待测化合物面积。
分别计算低浓度和高浓度的提取回收率和RSD，结果表明，提取回收率大于64.66％，变异系数小于15％，结果见表8。
表8.37种化合物提取回收率测定结果
/>
6.5精密度
取6份混合人空白血浆样品(抗凝剂为肝素钠)200μL。共分为3个批次，连续2天内测定，每批次含低浓度组和高浓度组，每组样本各6份。低浓度组加入6份混合对照品溶液(见表2)5μL和5μL内标溶液，高浓度组加入6份混合对照品溶液(见表3)5μL和5μL内标溶液，加入600μL 0.1％甲酸-甲醇溶液，涡旋混合1min，12000rpm离心10min，按2.5项下进行UPLC-MS/MS方法检测。记录待测化合物和内标峰面积，并计算待测化合物和内标峰面积比。结果表明，37种化合物的批内、批间精密度均良好，RSD<15％，满足方法学要求，结果见表9。
6.6稳定性
配置多份低浓度组和高浓度组质控样本。配置过程如下：低浓度组，每200μL空白血浆添加5μL低浓度对照品溶液(见表2)混合均匀；高浓度组，每200μL空白血浆添加5μL高浓度对照品溶液(见表3)混合均匀。将配置好的质控样本分别置于室温22～25℃放置3小时，冰箱4℃冷藏8h，冰箱-20℃冷冻15天，低温冰箱-80℃冷冻30天，低温冰箱-80℃冻融3次和处理后的样本放置于进样室(10℃)放置16h的稳定性。用化合物的峰面积与内标峰面积比值计算，与0小时的初始值比较，计算37种化合物的相对误差，RE(％)和变异系数，RSD(％)。结果表明，37种化合物在上述不同温度环境储存下均能检测出，相对且重复性良好，相对误差RE％均小于20％，结果见表10-11。
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
附录A
表A.血液中常见抗心律失常药物的UPLC-MS/MS初筛检测分析参数
/>
/>
附录B
附录B1：质谱方法A化合物的检测离子对及保留时间(参考值)
附录B2：质谱方法B化合物的检测离子对及保留时间(参考值)
附录B3：质谱方法C化合物的检测离子对及保留时间(参考值)
/>
附录B4：质谱方法D化合物的检测离子对及保留时间(参考值)
附录B5：质谱方法E化合物的检测离子对及保留时间(参考值)
/>
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种血液中37种抗心律失常药物液相色谱-质谱检测方法，所述方法包括如下步骤：
1)初筛检测：采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，对预处理后的血液样品，以保留时间、一对母离子/子离子对进行初筛检测；
2)对步骤1)中初筛检测阳性的样本进行复核检测，采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，对预处理后的血液样品，以保留时间、两对母离子/子离子对为指标判定；
37种抗心律失常药物为：
匹罗卡品、异丙肾上腺素、索他洛尔、多菲利特、尼可地尔、阿托品、山莨菪碱、纳多洛尔、奎尼丁、腺苷、美托洛尔、阿义马林、丙吡胺、艾司洛尔、美西律、吡那地尔、赛利洛尔、伊伐布雷定、维纳卡兰、普萘洛尔、比索洛尔、伊布利特、雷诺嗪、地尔硫卓、阿普林定、倍他洛尔、卡维地洛、莫雷西嗪、维拉帕米、氟卡尼、普罗帕酮、苄普地尔、决奈达隆、N-(对戊基)邻氨基苯甲酸、胺碘酮、华法林和利伐沙班；
步骤1)中的初筛检测包括以下步骤：
A1)血液样品预处理；步骤A1)血液样品预处理采用有机溶剂沉淀蛋白法；
A2)采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，以保留时间、一对母离子/子离子对进行初筛检测；
步骤A2)中超高效液相色谱UPLC的液相色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；
柱温：50℃；
样品室温度：10℃；
进样量：2μL；
流速：0.3mL/min；
流动相A为含5mmol/mL乙酸胺和0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含0.1％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱；
梯度洗脱的条件如表4所示：
表4
步骤A2)中串联质谱法的质谱条件为：
离子源：电喷雾电离-正离子模式(ESI+)；
检测模式：多反应监测(MRM)；
37种抗心律失常药物的锥孔电压和/或碰撞能量如表A中所示；
初筛检测分时间段检测，分时间段检测的扫描时间段如表A中所示；
37种抗心律失常药物在血液中的检出限如表A中所示；
37种抗心律失常药物的保留时间如表A中所示；
37种抗心律失常药物的母离子/子离子对如表A中所示；
表A
步骤2)中的复核检测包括以下步骤：
B1)血液样品预处理；步骤B1)中血液样品预处理方法为：将待测抗凝血液离心分离上清，将有机溶剂加入上清混合，离心分离得上清液，除去上清液中的溶剂，加入复溶剂溶解后备检；
B2)采用超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)模式，以保留时间、两对母离子/子离子对为指标判定；
步骤B2)中超高效液相色谱UPLC的液相色谱条件如步骤A2)超高效液相色谱UPLC的液相色谱条件所述；
步骤B2)中串联质谱法的质谱条件为：
离子源：电喷雾电离-正离子模式(ESI+)；
检测模式：多反应监测(MRM)；
根据初筛检测的分析参数，将37种抗心律失常药物分为如下5组进行复核检测：
第一组：匹罗卡品、尼可地尔、美西律、普萘洛尔、地尔硫卓、华法林、决奈达隆；
第二组：异丙肾上腺素、阿托品、山莨菪碱、吡那地尔、倍他洛尔、氟卡尼、阿普林定；
第三组：腺苷、索他洛尔、纳多洛尔、阿义马林、比索洛尔、普罗帕酮、莫雷西嗪、胺碘酮；
第四组：美托洛尔、奎尼丁、维纳卡兰、赛利洛尔、伊布利特、雷诺嗪、苄普地尔；
第五组：多菲利特、艾司洛尔、丙吡胺、伊伐布雷定、卡维地洛、维拉帕米、N-(对戊基)邻氨基苯甲酸、利伐沙班；
37种抗心律失常药物的锥孔电压和/或碰撞能量如表B1-B5中所示；
37种抗心律失常药物在血液中的检出限如表B1-B5中所示；37种抗心律失常药物的保留时间如表B1-B5中所示；
37种抗心律失常药物的母离子/子离子对如表B1-B5中所示；
表B1
表B2
表B3
表B4
表B5
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤A1)中，有机溶剂为甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙醚。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤A1)中，有机溶剂为0.1％甲酸甲醇。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤B1)中，有机溶剂为甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙醚。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤B1)中，有机溶剂为0.1％甲酸甲醇。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤2)中，以保留时间、两对母离子/子离子、离子对的相对丰度比为指标判定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，
离子对的相对丰度比的最大允许相对误差如表5所示：
表5
相对离子对丰度比％ ≥50 20～50 10～20 ≤10 允许的相对误差％ ±20 ±25 ±30 ±50
。
8.权利要求1-7任一项所述的方法在检测血液样品中37种抗心律失常药物中的应用；
37种抗心律失常药物为：
匹罗卡品、异丙肾上腺素、索他洛尔、多菲利特、尼可地尔、阿托品、山莨菪碱、纳多洛尔、奎尼丁、腺苷、美托洛尔、阿义马林、丙吡胺、艾司洛尔、美西律、吡那地尔、赛利洛尔、伊伐布雷定、维纳卡兰、普萘洛尔、比索洛尔、伊布利特、雷诺嗪、地尔硫卓、阿普林定、倍他洛尔、卡维地洛、莫雷西嗪、维拉帕米、氟卡尼、普罗帕酮、苄普地尔、决奈达隆、N-(对戊基)邻氨基苯甲酸、胺碘酮、华法林和利伐沙班。
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