CN109187832A - Lc-ms/ms测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法及样品的前处理方法 - Google Patents

Lc-ms/ms测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法及样品的前处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药检测技术领域，具体涉及一种LC‑MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，包括一次提取：向所述样品中加入内标工作液和提取液，混合均匀后离心分层，收集上层液得第一上清液；衍生反应：将所述第一上清液浓缩干燥后，加入NaHCO3缓冲盐溶解，然后加入丹酰氯的乙腈溶液进行衍生反应；二次提取：向所述衍生反应后的反应液中加入提取液进行二次提取，离心得第二上清液，将第二上清液浓缩干燥后复溶，得到样品溶液；本发明的样品的前处理方法能够最大程度上提高前处理方法对低含量的去氧肾上腺素的提取率，有效去除血浆基质的干扰，提高特异性，最低检测限降低至0.02ng/ml，灵敏度提高至0.1nM，以适应于药物临床研究中对低浓度去氧肾上腺素浓度的检测要求。

Description

LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法及样品的前处 理方法
技术领域
本发明属于医药检测技术领域，具体涉及一种LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，以及适用的生物样品分析的前处理方法。
背景技术
去氧肾上腺素是一种儿茶酚胺类选择性ɑ1受体激动剂，主要用于防治脊椎麻醉、全身麻醉、应用氯丙嗪等原因引起的低血压，也用于室上性心动过速和散瞳检查，去氧肾上腺素是一种可以代替伪麻黄碱的非处方药物。
目前，临床上使用的去氧肾上腺素类鼻粘膜减充血药，由于其中的活性成分去氧肾上腺素在体内的血浆半衰期短，通常需要每隔四小时给药一次以缓解鼻充血。因此，为了延缓释药时间、提高治疗效果和降低毒副作用，药学工作者致力于开发去氧肾上腺素的新剂型和新工艺。但是，在去氧肾上腺素的人体药代动力学研究中发现，由于人体内去氧肾上腺素的给药量很低(每次口服剂量为5-20mg)，导致给药后血浆中去氧肾上腺素的含量也很低(去氧肾上腺素的Cmax不高于5nM)，目前有关低含量的血浆中去氧肾上腺素浓度的测定方法还未见报道，而血浆中去氧肾上腺素的浓度的准确测定是去氧肾上腺素药代动力学研究的基础，这对于去氧肾上腺素的新药开发或者仿制药的研发具有至关重要的意义，因此，如何准确测定血浆中去氧肾上腺素的浓度成为去氧肾上腺素的药代动力学研究的重点和难点。
中国专利文献CN106442837A公开了一种液相色谱串联质谱检测血浆中儿茶酚胺的方法，该方法包括步骤：标准品制备，液相色谱分离，质谱检测并制标准曲线，血浆中儿茶酚胺的检测。该方法采用乙腈进行蛋白沉淀，丹磺酰氯进行衍生反应，提取后使用液相色谱串联三重四级杆进行衍生反应，可以同时定量测定血浆中包括多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素的3种儿茶酚胺，但是，利用该检测方法对血浆中去氧肾上腺素的浓度进行检测时，因样品的前处理过程对去氧肾上腺素和其中含有的杂质分离不彻底，使得该检测方法的灵敏度为2.1nM，仍然不能满足药代动力学对检测方法的灵敏度要求即1/10的Cmax或者1/20的Cmax，且高于部分实际的待测血浆中去氧肾上腺素的浓度，因而无法准确检测血浆中较低含量的去氧肾上腺素的浓度，回收率偏低，测量误差较大，因此，亟需开发出一种新的血浆中去氧肾上腺素的样品的前处理方法，尤其适用于LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素的浓度的方法。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中的浓度检测方法采用的样品的前处理方法对目标化合物和杂质分离不彻底而导致检测方法的定量限较高、灵敏度较低，无法准确测定血浆样品中低含量的去氧肾上腺素的浓度，进而提供一种血浆中去氧肾上腺素的样品的前处理方法，尤其适用于LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素的方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种血浆中去氧肾上腺素的样品的前处理方法，包括，
一次提取：向所述样品中加入内标工作液和提取液，混合均匀后离心分层，收集上层液得第一上清液；
衍生反应：将所述第一上清液浓缩干燥后，加入NaHCO3缓冲盐溶解，然后加入丹酰氯的乙腈溶液进行衍生反应；
二次提取：向所述衍生反应后的反应液中加入提取液进行二次提取，离心得第二上清液，将第二上清液浓缩干燥后复溶，得到样品溶液；
其中，二次提取过程中所述提取液为体积比为2:1的MTBE和正己烷的混合液。
进一步优选地，所述样品为去氧肾上腺素标准样品或待测血浆样品。
进一步优选地，所述去氧肾上腺素标准样品由去氧肾上腺素标准品加入空白血浆制得。
进一步优选地，所述样品的用量为100-200μl。
进一步优选地，所述衍生反应的温度为50-80℃，时间5-15min。
进一步优选地，一次提取过程中所述提取液为含0.1％甲酸的甲醇溶液。
进一步优选地，二次提取过程中，所述衍生反应后的反应液与加入的所述提取液体积比为1：(2-4)。
进一步优选地，二次提取过程中采用体积比为1:2-2:1的乙腈和0.1％甲酸水溶液的混合液进行复溶。
进一步优选地，所述衍生反应的具体过程为：将所述第一上清液浓缩干燥后，分别加入50-150mM的NaHCO3缓冲盐溶解，然后加入0.5-2mg/ml丹酰氯的乙腈溶液，涡旋混匀。
进一步优选地，所述样品与步骤(2)中加入的丹酰氯乙腈溶液和NaHCO3缓冲盐的体积比为1：(1-1.5)：(1-1.5)。
进一步优选地，步骤(2)中，加入的所述NaHCO3缓冲盐的pH为8-11。
本发明还提供了一种LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)按照上述的方法制得待测血浆样品的待测液和不同浓度的去氧肾上腺素标准样品的标准溶液；
(b)采用高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述标准曲线样液进行去氧肾上腺素检测，对去氧肾上腺素和内标物的峰面积进行采集并处理，对去氧肾上腺素和内标物的峰面积的比值与去氧肾上腺素的浓度进行线性回归产生标准曲线和拟合方程；
(c)采用高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样液进行去氧肾上腺素检测，得到去氧肾上腺素与内标物的峰面积的比值，将比值代入标准曲线拟合方程，计算得到待测血浆中去氧肾上腺素的浓度。
进一步优选地，所述高效液相色谱的检测条件为：
色谱柱：Phenomenex，Gemini C18，5μm(2.0×50mm)；
流动相A：含0.1％甲酸的水，流动相B：含0.1％甲酸的乙腈；
流速：0.5ml/min；
柱温：室温；
进样体积：5μl；
柱温：室温；
进样器温度：2～8℃；
流动相梯度洗脱程序表：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.5 85 15
1.00 5 95
2.20 5 95
2.21 85 15
3.00 85 15
进一步优选地，所述三重四级杆质谱的检测条件为：
质量分析器：Waters Xevo TQ-S；离子源：ESI；扫描模式：多离子反应监测方式；源温度：550℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流速：150L/h；载气压力：6.0bar；毛细管电压：3.0kV；采样锥：60V；
或者，所述三重四级杆质谱的检测条件为：
质量分析器：AB Sciex API 4000；离子源：ESI；扫描模式：多离子反应监测方式；检测方式：正离子模式；离子喷射电压：5500V；温度：550℃。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
(1)本发明所述的样品的前处理方法，通过丹酰氯衍生反应前后增设的两次提取过程，得到提纯除杂后的精制样液，所述样液再通过液-质联用进行目标化合物的检测，该方法能够显著降低检测限，提高灵敏度，扩大适用范围，而且操作简单、省时，能够快速有效检测；较之现有技术本发明在衍生反应前增设一次提取过程，在一次提取过程中通过添加沉淀试剂能够提高蛋白质的沉淀效果，得到更加纯净的第一上清液，通过使用第一上清液参加衍生反应不仅能够提高衍生反应的活性和产物的稳定性，而且能够减少杂质的衍生化；更重要的是本发明在衍生反应后还增设二次提取过程，并且通过有限多次的实验选用并验证了体积比为2：1的MTBE和正己烷的有机混合液作为二次提取过程中的提取液时，能够最大程度上提高前处理方法对低含量的去氧肾上腺素的提取率，有效去除血浆基质的干扰，提高特异性，进而将该检测方法的最低检测限降低至0.02ng/ml，灵敏度提高至0.1nM，以适应于制剂研究中对低浓度去氧肾上腺素浓度的检测要求，而且该方法的准确度、精密度、灵敏度和重现性均满足要求；
(2)本发明所述的样品的前处理方法，去氧肾上腺素腺素，如分子式(Ⅰ)所示，分子结构中含有三个衍生化结合位点，即酚羟基、醇羟基和亚氨基，实验过程中通过控制反应温度为40-70℃，反应时间为5-10min，能够获得酚羟基和亚氨基两个位置均被衍生化的去氧肾上腺素产物，如分子式(Ⅱ)所示的结构，而且反应过程稳定，具有较高的提取回收率，相对于一个位置被衍生化反应获得的目标产物，显著地提高了的质谱响应，进而提高测定方法的灵敏度。
(3)本发明所述的样品的前处理方法，所述样品与加入的丹酰氯乙腈溶液和NaHCO3缓冲盐的体积比为1：(1-1.5)：(1-1.5)，所述NaHCO3缓冲盐的添加能够保证一个稳定的碱性PH值，促进衍生反应的正向进行，通过所述NaHCO3缓冲盐与样品的体积比为1：(1-1.5)，不仅在保证较高的反应产率的的前提下，减少反应体系中存在过多的水相，从而有利于简化后续的二次提取的步骤，方便实验操作，减少系统误差，而且能够避免NaHCO3缓冲盐的使用量太大，造成二次提取后的样品中含盐而干扰质谱的测定；通过所述丹酰氯乙腈溶液与样品的体积比为1：(1-1.5)，不仅能够避免丹酰氯乙腈溶液用量太小，导致反应不完全而影响测定方法的重复性和稳定性，而且能够避免丹酰氯乙腈溶液用量太大，导致检测材料的浪费，以及检测成本的提高。
(4)本发明所述的样品的前处理方法，采用酸化甲醇作为一次提取过程中使用的有机提取液，由于酸化甲醇不仅能够有效提取血浆中的去氧肾上腺素，同时还具有沉淀蛋白的作用，能够有效减少有机提取液中的杂质；而且由于去氧肾上腺素的分子带有羟基，酸性环境将有利于抑制羟基的离子化，从而增加去氧肾上腺素在有机相中的分配比例，提高去氧肾上腺素的提取效率，具有较高的回收率，因而采用酸化甲醇作为一次提取过程中的提取液；
(5)本发明所述的样品的前处理方法，二次提取过程中，通过使用体积比为2：1的MTBE和正己烷的有机混合液作为二次提取过程中的提取液，并且控制所述衍生反应后的反应液与加入的所述提取液体积比为1：(2-4)，不仅能够提高检测灵敏度，降低最低检测限，扩大适用范围，使得该检测方法可以用于测定血浆样品中低浓度的去氧肾上腺素的准确浓度，可以更加准确的评估口服去氧肾上腺素后去氧肾上腺素在人体内的药代动力学行为；而且能够减少血浆样品的用量至100μL，这在需要连续采样进行监控的实验或者检测中具有重要的意义，能够降低临床的血样采集量，降低临床实验的风险；
(6)本发明所述的样品的前处理方法，所述复溶过程为乙腈和0.1％甲酸水溶液的混合液进行的，优先体积比为1:2-2:1的乙腈和0.1％甲酸水溶液的混合液，使用上述复溶液能够有效溶解管壁上的待测物，避免目标物因未溶解而导致回收率降低，而且少量的甲酸能够有利于去氧肾上腺素在质谱离子源内的离子化，提高待测物的仪器响应值。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明实施例1中标准曲线；
图2是本发明实施例1中衍生化待测血浆样品和衍生化内标物的质谱图；
图3是给药剂量为5mg/人的血药浓度-时间关系曲线图；
图4是给药剂量为10mg/人的血药浓度-时间关系曲线图；
图5是给药剂量为20mg/人的血药浓度-时间关系曲线图；
图6为本发明实施例1中LLOQ(最低定量限)0.02ng/ml的色谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术特点。
1、仪器与试剂
UPLC-Xevo TQ-S型高效液相色谱-串联质谱仪(美国Waters公司)；
氮气吹扫仪(杭州龙杨科学仪器有限公司)；
离心浓缩仪(北京英联创新生物科技公司)；
多管漩涡混合仪(厦门麦凯伦精瑞科仪有限公司)；
色谱柱(Phenomenex，Gemini C18，5μm(2.0×50mm))；
肾素那敏片：(华润三九医药股份有限公司提供，共提供三种规格，其中，批号：20170401，每片含去氧肾上腺素5mg，马来酸氯苯那敏4mg；批号：20170301，每片含去氧肾上腺素10mg，马来酸氯苯那敏4mg；批号：20170402，每片含盐酸去氧肾上腺素20mg，马来酸氯苯那敏4mg)，制备方法也可参见中国专利文献CN104922124。
去氧肾上腺素标准品购自USP，内标物(氘代去氧肾上腺素)购自ISOTOPES INC；丹酰氯购于SIGMA-ALDRICH，纯度≥99.0％，-10～30℃保存；乙腈、甲醇、异丙醇、甲基叔丁基醚和甲酸均为色谱纯，购自Fisher Scientific；正己烷为色谱纯，碳酸氢钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。
空白血浆：个体或混合血浆中(K2EDTA抗凝)：储存条件为-60～-90℃。北京恒翊丰泰国际货运代理冷链运输至军科正源，混合血浆批号为：BRH1167822；实验所用的个体号为：BRH1323603、BRH1323608、BRH1323604、BRH1323615、BRH1323611和BRH1323610；实验所用的高脂血个体号为201705121、201705122和201705123。全血批号为2017072701和201708141。
内标工作液的配制：精密称取氘代去氧肾上腺素标准品，加入适量DMSO，配制成0.841mg/ml的内标储备液，置于-60～-90℃冰箱中保存待用，有效期30天，加入适量乙腈:水(1:1，v/v，0.1％甲酸)，配制成浓度为20.0ng/mL的内标工作溶液。
2、样品的测定
实施例1
待测血浆样品的采集：12位受试者给药前一天空腹过夜至少10小时后，在0min受试者用240ml±10ml温水送服肾素那敏片(批号：20170401，每片含盐酸去氧肾上腺素5mg)，每位受试者送服一片，受试者前臂静脉埋入留置针，受试者分别于给药前(0min)以及给药后10，15，20，25，30，40，60，90，120，240，360，480min不同时间点采血1mL，置于含K2EDTA抗凝剂的真空采血管中，混匀后静置，离心，取上层血浆200μL盖严管盖后，放入-60℃到-90℃的超低温冰箱中保存。
本实施例所述LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，具体包括如下步骤：
(a)样品的前处理
(1)标准曲线样品的制备：精密称取去氧肾上腺素标准品，加入适量DMSO，配制成浓度为约1mg/ml的去氧肾上腺素标准储备液，置于-60～-90℃冰箱中保存待用，有效期30天；取适量上述去氧肾上腺素标准储备液于离心管中，加入一定量的混合人体血浆制备得一系列不同浓度的标准曲线样品，标准曲线样品的浓度为0.0200，0.0400，0.100，0.500，1.00，2.00，5.00，10.0ng/mL，标准曲线样品中还包括一个双空白样品(不含去氧肾上腺素、不含内标的空白血浆)和一个零样品(含内标的空白样品)；
(2)一次提取：取100μL的待测血浆样品分别置于96孔板中，然后分别加入15μL的内标工作液和400μL的含0.1％甲酸的甲醇溶液，其中，所述双空白样品中不加内标工作液，而加入15μL体积比为1:1的乙腈和0.1％甲酸水溶液，然后分别涡旋混匀样品，在4700rpm/min和4℃条件下离心样品15min，然后分别收集上层液得第一上清液。
(3)衍生反应：分别取所述第一上清液300μL到96孔板中，氮气吹至水相，置离心浓缩仪中浓缩至干，加入100μL的NaHCO3缓冲盐(100mM,pH＝10.5)溶解，然后加入100μL的丹酰氯的乙腈溶液(1mg/mL)，涡旋混匀，60℃保温6min。
(4)二次提取：向上述反应液中加入600μL的提取液(MTBE:正己烷＝2:1)，涡旋仪混匀样品，在4700rpm/min和4℃条件下离心样品15min，离心得第二上清液，将440μL的第二上清液转移至96孔板中，氮气吹干后，加入100μL体积比为1:2的乙腈和0.1％甲酸水溶液的混合液复溶涡旋，得到所需的待测样液；
其中所述提取液为体积比为2：1的MTBE和正己烷的混合液。
在处理待测血浆样品的同时，取步骤(1)制得的标准曲线样品100μL，按照上述步骤(2)、(3)和(4)的方法，制得标准品样液。
(b)采用高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述标准曲线样液进行去氧肾上腺素检测
所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：Phenomenex，Gemini C18，5μm(2.0×50mm)；流动相A：含0.1％甲酸的水，流动相B：含0.1％甲酸的乙腈；流速：0.5ml/min；柱温：室温；进样体积：5μl；柱温：室温；进样器温度：2～8℃；流动相梯度洗脱程序如表1所示：
表1流动相梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.5 85 15
1.00 5 95
2.20 5 95
2.21 85 15
3.00 85 15
所述三重四级杆质谱的检测条件为：质量分析器：Waters Xevo TQ-S；离子源：ESI；扫描模式：多离子反应监测方式；源温度：550℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流速：150L/h；载气压力：6.0bar；毛细管电压：3.0kV；采样锥：60V，用于定量分析的离子反应分别为m/z 634.05→537.01(衍生化的去氧肾上腺素)和637.07→540.07(衍生化的氘代去氧肾上腺素)。
去氧肾上腺素和内标氘代去氧肾上腺素的峰面积由Xevo TQ-S和UNIFISoftware,v.1.8采集并处理。使用UNIFI Software,v.1.8对去氧肾上腺素/内标的峰面积比与去氧肾上腺素浓度进行线性回归产生标准曲线。标准曲线见图1所示，典型的拟合方程式：y＝0.0154+0.3862x(R2＝0.9927)，在0.02-10.0ng/mL的浓度范围内，线性关系良好，LLOQ和ULOQ分别为0.02ng/mL和10.0ng/mL。
(c)采用如步骤(b)的高液相色谱-三重四级杆质谱条件对待测样液进行去氧肾上腺素检测，检测结果见图2所示，表明该待测血浆样品中含有去氧肾上腺素，并得到去氧肾上腺素与内标的比值，将比值代入拟合方程式中，计算得到待测血浆样品中去氧肾上腺素的浓度，如下表所示，绘制血浆测得的去氧肾上腺素的浓度与时间的关系曲线见图3。
实施例2
待测血浆样品的采集：12位受试者给药前一天空腹过夜至少10小时后，在0min受试者用240ml±10ml温水送服肾素那敏片(批号：20170301，每片含盐酸去氧肾上腺素10mg)，每位受试者送服一片，受试者分别于给药前(0min)以及给药后10，15，20，25，30，40，60，90，120，240，360，480min不同时间点采血1mL，置于含K2EDTA抗凝剂的真空采血管中，混匀后静置，离心，取上层血浆200μL盖严管盖后，放入-60℃到-90℃的超低温冰箱中保存。
本实施例所述LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，具体包括如下步骤：
(a)样品的前处理
(1)标准曲线样品的制备：精密称取去氧肾上腺素标准品，加入适量DMSO，配制成浓度为0.664mg/ml的去氧肾上腺素标准储备液，置于-60～-90℃冰箱中保存待用，有效期30天；取上述去氧肾上腺素标准储备液于离心管中，加入混合人体血浆制备得一系列标准曲线样品，标准曲线样品的浓度为0.0200，0.0400，0.100，0.500，1.00，2.00，5.00，10.0ng/mL，标准曲线还包括一个双空白样品(不含去氧肾上腺素、不含内标的空白血浆)和一个零样品(含内标的空白样品)；
(2)一次提取：取100μL的待测血浆样品分别置于96孔板中，然后分别加入15μL的内标工作液和400μL的含0.1％甲酸的甲醇溶液，其中，所述双空白样品中不加内标工作液，而加入15μL体积比为1:1的乙腈和0.1％甲酸水溶液，然后分别涡旋混匀样品，在4700rpm/min和4℃条件下离心样品15min，分别收集上层液得第一上清液；
(3)衍生反应：分别取所述第一上清液300μL到96孔板中，氮气吹至水相，置离心浓缩仪中浓缩至干，加入50μL的NaHCO3缓冲盐(100mM,pH＝10.5)溶解，然后加入200μL的丹酰氯的乙腈溶液(1mg/mL)，涡旋混匀，60℃保温15min；
(4)二次提取：向上述反应液中加入600μL的提取液(MTBE:正己烷＝2:1，v/v)，涡旋仪混匀样品，在4700rpm/min和4℃条件下离心样品15min，离心得第二上清液，将440μL的第二上清液转移至96孔板中，氮气吹干后，加入200μL体积比为1:1的乙腈和0.1％甲酸水溶液的混合液复溶涡旋，分别得到所需的待测样液；
其中所述提取液为体积比为2：1的MTBE和正己烷的混合液。
在处理待测血浆样品的同时，取步骤(1)制得的标准曲线样品100μL，按照上述步骤(2)、(3)和(4)的方法，制得标准品样液。
(b)采用高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述标准曲线样液进行去氧肾上腺素检测
所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：Phenomenex，Gemini C18，5μm(2.0×50mm)；流动相A：含0.1％甲酸的水，流动相B：含0.1％甲酸的乙腈；流速：0.5ml/min；柱温：室温；进样体积：5μl；柱温：室温；进样器温度：2～8℃；流动相梯度洗脱程序，见表1；
所述三重四级杆质谱的检测条件为：质量分析器：Waters Xevo TQ-S；离子源：ESI；扫描模式：多离子反应监测方式；源温度：550℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流速：150L/h；载气压力：6.0bar；毛细管电压：3.0kV；采样锥：60V，用于定量分析的离子反应分别为m/z 634.05→537.01(衍生化的去氧肾上腺素)和637.07→540.07(衍生化的氘代去氧肾上腺素)。
去氧肾上腺素和内标氘代去氧肾上腺素的峰面积Xevo TQ-S和UNIFI Software,v.1.8采集并处理并处理。UNIFI Software,v.1.8对去氧肾上腺素/内标的峰面积比与待测物去氧肾上腺素浓度进行线性回归产生标准曲线。拟合方程式：y＝0.0022+0.386x(R2＝0.9979)，在0.02-10.0ng/mL的浓度范围内，线性关系良好，LLOQ和ULOQ分别为0.02ng/mL和10.0ng/mL。
(c)采用如步骤(b)的高液相色谱-三重四级杆质谱条件对所述待测样液进行去氧肾上腺素检测，得到去氧肾上腺素与内标的比值，将比值代入拟合方程式中，计算得到待测血浆样品中去氧肾上腺素的浓度，如下表所示，绘制血浆测得的去氧肾上腺素的浓度与时间的关系曲线见图4。
实施例3
待测血浆样品的采集：12位受试者给药前一天空腹过夜至少10小时后，在0min受试者用240ml±10ml温水送服肾素那敏片(批号：20170402，每片含盐酸去氧肾上腺素20mg)，每位受试者送服一片，受试者分别于给药前(0min)以及给药后10，15，20，25，30，40，60，90，120，240，360，480min不同时间点采血1mL，置于含K2EDTA抗凝剂的真空采血管中，混匀后静置，离心，取上层血浆200μL盖严管盖后，放入-60℃到-90℃的超低温冰箱中保存。
本实施例所述LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，具体包括如下步骤：
(a)样品的前处理
(1)标准曲线样品的制备：精密称取去氧肾上腺素标准品，加入适量DMSO，配制成浓度为0.664mg/ml的去氧肾上腺素标准储备液，置于-60～-90℃冰箱中保存待用，有效期30天；取上述去氧肾上腺素标准储备液于离心管中，加入混合人体血浆制备得一系列标准曲线样品，标准曲线样品的浓度为0.0200，0.0400，0.100，0.500，1.00，2.00，5.00，10.0ng/mL，标准曲线还包括一个双空白样品(不含去氧肾上腺素、不含内标的空白血浆)和一个零样品(含内标的空白样品)；
(2)一次提取：取100μL的待测血浆样品分别置于96孔板中，然后分别加入25μL的内标工作液和400μL的含0.1％甲酸的甲醇溶液，其中，所述双空白样品中不加内标工作液，而加入25μL体积比为1:1的乙腈和0.1％甲酸水溶液，然后分别涡旋混匀样品，在4700rpm/min和4℃条件下离心样品15min，分别收集上层液得第一上清液；
(3)衍生反应：分别取所述第一上清液300μL到96孔板中，氮气吹至水相，置离心浓缩仪中浓缩至干，加入200μL的NaHCO3缓冲盐(100mM,pH＝10.5)溶解，然后加入300μL的丹酰氯的乙腈溶液(1mg/mL)，涡旋混匀，40℃保温8min；
(4)二次提取：向上述反应液中加入600μL的提取液(MTBE:正己烷＝2:1)，涡旋仪混匀样品，在4700rpm/min和4℃条件下离心样品15min，离心得第二上清液，将440μL的第二上清液转移至96孔板中，氮气吹干后，加入50μL体积比为1:2的乙腈和0.1％甲酸水溶液的混合液复溶涡旋，分别得到所需的待测样液；
其中所述提取液为体积比为2：1的MTBE和正己烷的混合液。
在处理待测血浆样品的同时，取步骤(1)制得的标准曲线样品100μL，按照上述步骤(2)、(3)和(4)的方法，制得标准品样液。
(b)采用高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述标准曲线样液进行去氧肾上腺素检测
所述高效液相色谱的检测条件为：色谱柱：Phenomenex，Gemini C18，5μm(2.0×50mm)；流动相A：含0.1％甲酸的水，流动相B：含0.1％甲酸的乙腈；流速：0.5ml/min；柱温：室温；进样体积：5μl；柱温：室温；进样器温度：2～8℃；流动相梯度洗脱程序，见表1；
所述三重四级杆质谱的检测条件为：质量分析器：AB Sciex API 4000；离子源：ESI；扫描模式：多离子反应监测方式；检测方式：正离子模式；离子喷射电压：5500V；温度：550℃，用于定量分析的离子反应分别为m/z 634.406→537.000(衍生化的去氧肾上腺素)和637.408→540.100(衍生化的氘代去氧肾上腺素)。
去氧肾上腺素和内标氘代去氧肾上腺素的峰面积由API4000和Analyst软件1.6.2采集并处理。Watson LIMSTM 7.3.0.01对去氧肾上腺素/内标的峰面积比与待测物去氧肾上腺素浓度进行线性回归产生标准曲线。拟合方程式：y＝0.0026+0.327x(R2＝0.9981)，在0.0200-10.0ng/mL的浓度范围内，线性关系良好，LLOQ和ULOQ分别为0.0200ng/mL和10.0ng/mL。
(c)采用如步骤(b)的高液相色谱-三重四级杆质谱条件对所述待测样液进行去氧肾上腺素检测，得到去氧肾上腺素与内标的比值，将比值代入拟合方程式中，计算得到待测血浆样品中去氧肾上腺素的浓度，如下表所示，绘制血浆测得的去氧肾上腺素的浓度与时间的关系曲线见图5。
3.方法学的验证
3.1准确度和精密度
按照本发明实施例1所述方法精密称定去氧肾上腺素标准品加入适量血浆样品分别配制3个分析批，每个分析批包含6套验证样品，每套验证样品均包含4个浓度(0.0200，0.0600，0.600，8.00)，准确度和精密度验证由1个分析员在3天内，按照实施例1所述方法对样品进行前处理和浓度检测。方法的准确度用相对误差的百分数表示(％Bias＝[(平均测定浓度-理论浓度)/理论浓度]×100％)，方法的精密度用变异系数的百分数表示(％CV＝[(标准偏差/平均值)x 100％])。
准确度和精密度可接受标准为：每个浓度水平批内和批间精密度应在15％以内，定量下限应在20％以内；每个浓度水平批内和批间的准确度偏差％应在理论值的±15％以内，定量下限在±20％以内。
(1)批内准确度和精密度
分析结果见表2所示，分析批10用于批内准确度精密度考察，4个浓度水平(0.0200，0.0600，0.600，8.00)的批内准确度范围为-4.8％～5.3％，精密度范围为1.1％～5.0％，批内准确度和精密度满足可接受标准。
(2)批间准确度和精密度
分析结果见表2所示，分析批10、11、14用于批间准确度精密度考察，4个浓度水平(0.0200，0.0600，0.600，8.00)的批间准确度范围为-5.0％～3.8％，精密度范围为1.3％～5.3％，批间准确度和精密度满足可接受标准。
表2批内、批间样品检测的精密度和准确度结果表
3.2提取回收率
质控样品的配制：精密称取去氧肾上腺素标准品或者内标物氘代去氧肾上腺素标准品，加入适量DMSO，配制成浓度为0.966mg/ml的去氧肾上腺素质控储备液和氘代去氧肾上腺素储备液，分别置于-60～-90℃冰箱中保存待用，有效期30天；然后分别取适量上述去氧肾上腺素标准储备液和氘代去氧肾上腺素储备液于离心管中，加入一定量的100％混合人体血浆制备得去氧肾上腺素和氘代去氧肾上腺素储备液质控样品，质控样品的浓度均为0.0600ng/mL、0.600ng/mL和8.00ng/mL；分别编号LQC、MQC和HQC，按照实施例1所述方法对样品进行前处理和浓度检测，对所述LQC、MQC和HQC进行平行测定。对于去氧肾上腺素和氘代去氧肾上腺素来说，提取回收率(R)应通过对去氧肾上腺素和氘代去氧肾上腺素提取与未对去氧肾上腺素和氘代去氧肾上腺素提取样品峰面积的比例来进行计算。
提取回收率的可接受标准：测定需评价低中高三个水平质控样品的提取回收率。三个浓度水平质控样品(低，中，高)和内标样品的提取回收率％CV≤15％。
结果见表3所示，去氧肾上腺素在三个浓度的提取回收率总体均值为67.0％，％CV为10.0％。内标氘代去氧肾上腺素在三个浓度的提取回收率总体均值为68.5％，％CV为8.2％。提取回收率满足可接受标准。
表3回收率考察结果表
3.3基质效应
对于去氧肾上腺素和内标来说，基质效应通过有基质存在与无基质存在时峰面积的比来进行计算。基质因子＝有生物基质的单独个体峰面积/无生物基质的峰面积的平均值。基质效应的可接受标准：由6批血浆计算得到的用于评价基质因子的内标归一化基质因子，每个浓度水平的变异系数不得大于15％。
按照实施例1所述的方法，取6个不同个体的空白血浆，分别加入不同浓度的去氧肾上腺素标准品，每一个空白血浆分别制备得HQC和LQC浓度(8.00ng/mL和0.0600ng/mL)的两个样品，然后按照实施例1所述的方法对样品进行前处理和浓度测定，
结果见表4显示，HQC和LQC浓度下，内标归一化基质因子的变异系数均为1.0％，表明选定的质谱和色谱条件有效地避免了基质效应，满足体内分析的要求，充分验证所建立方法的可操作性。
表4基质效应考察结果表
备注-：不适用
面积比计算方法：生物基质相峰面积/溶剂相峰面积。
归一化基质效应因子计算方法：待测物峰面积比/内标峰面积比。
3.4灵敏度
灵敏度的可接受标准：方法灵敏度的测定是通过进样六个定量下限样品来确定其准确度和精密度，要求6个定量下限样品中至少4/6样品浓度的准确度偏差％应为理论值的±20％以内，精密度应≤20％；定量下限的信噪比值至少应为5。
按照实施例1所述的方法，取6个空白血浆，分别加入去氧肾上腺素标准品，制备得6个LLOQ浓度(0.0200ng/mL)的样品，然后按照实施例1所述的方法对样品进行前处理和浓度测定，按照实施例1所述方法对样品进行前处理制得待测样品，然后按照实施例1所述的液-质联用检测方法进样，测定6个定量下限样品的浓度，并计算其准确度和精密度。
灵敏度的结果见表5显示，6个LLOQ样品的准确度偏差％为-5.0％～0.0％，精密度为5.3％，信噪比值大于5，结果满足灵敏度的可接受标准。
表5灵敏度考察结果表
备注-：不适用；
3.5选择性
选择性验证主要考察6个个体基质。评估在双空白样品中，待测物和内标保留时间处干扰峰的影响。选用6个不同来源的基质(编号见下表)不加去氧肾上腺素标准品和内标物，制得双空白样品，其余与实施例1所述的样品的前处理方法均一致，制得待测样液，然后按照实施例1所述的液-质联用检测方法进样，考察6个不同来源的基质对去氧肾上腺素标准品和内标物的干扰。
选择性结果显示，6个个体中每个个体配制的双空白样品，在去氧肾上腺素保留时间处的干扰均小于定量下限峰面积的20％；在氘代去氧肾上腺素的保留时间处的干扰均小于定量下限峰面积的5％。
表6选择性考察结果表
综上所示，方法学验证结果表明，标准曲线的定量范围为：0.0200-10.0ng/mL范围内，LLOQ和ULOQ分别为0.0200ng/mL和10.0ng/mL；准确度和精密度验证结果表明该方法的精密度、准确度和重复性均在可接受范围之内；选择性、提取回收率、灵敏度均满足可接受标准。
对比例1
本实施例测定如实施例1相同的待测血浆样品，本实施例所述LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，采用与实施例1完全相同的高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测血浆样品中去氧肾上腺素的浓度进行检测，区别在于，一方面，对样品进行前处理的步骤(2)和(3)未收集第一上清液，具体步骤为“(2)取100μL的标准曲线样品和100μL的待测血浆样品分别置于96孔板中，然后分别加入15μL的内标工作液，其中，所述双空白样品中不加内标工作液，而加入15μL体积比为1:1的乙腈和0.1％甲酸水溶液，然后分别涡旋混匀样品；(3)将上述混合液置离心浓缩仪中浓缩至干，其余与实施例1相同”；另一方面，步骤(4)中没有体积比为2：1的MTBE和正己烷的加入提取液提取；而是“将步骤(3)得到的反应液直接在4700rpm/min和4℃条件下离心样品15min，离心得第二上清液”，其余操作均与实施例1相同。
按照与上述3项方法学验证所示的方法，测得去氧肾上腺素和内标的回收率不到10％，灵敏度在100ng/mL以上，因此，采用上述样品的前处理方法，将会导致回收率偏低，测量误差较大。
对比例2
本实施例测定如实施例1相同的待测血浆样品，本实施例所述LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，采用与实施例1完全相同的高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测血浆样品中去氧肾上腺素的浓度进行检测，区别仅在于对样品进行前处理的步骤(4)中，没有经体积比为2：1的MTBE和正己烷的加入提取液提取，而是直接“在4700rpm/min和4℃条件下离心样品15min，离心得第二上清液，”其余操作均与实施例1相同。
按照与上述3项所示的方法学验证相同的方法，测得方法的灵敏度不到50pg/mL,因此，采用上述样品的前处理方法，将会导致基质干扰较大，有明显的基质基质，对测量影响较大，灵敏度也不够。
对比例3
本实施例所述的待测血浆样品为实施例1中待测血浆样品，本实施例所述LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，采用与实施例1完全相同的高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测血浆样品中去氧肾上腺素的浓度进行检测，区别仅在于对样品进行前处理的步骤(4)中，加入体积比为3：1的MTBE和正己烷的混合液代替实施例1中加入体积比为2：1的MTBE和正己烷作为提取液提取，其余操作均与实施例1相同。
按照与上述3项所示的方法学验证相同的方法，测得去氧肾上腺素方法的回收率不到7％，灵敏度不能满足要求，因此，采用上述样品的前处理方法，将会导致回收率偏低，测量误差较大。
综上所述，本发明所述的样品的前处理方法，通过丹酰氯衍生反应前后增设的两次提取过程，得到提纯除杂后的精制样液，所述样液可通过液-质联用进行检测进行目标化合物的检测，该方法显著降低检测限，扩大适用范围，而且操作简单、省时，能够快速有效检测；较之现有技术本发明在衍生反应前后增设一次提取过程，通过添加沉淀试剂能够提高蛋白质的沉淀的效果，得到更加纯净的第一上清液，通过使用第一上清液参加衍生反应不仅能够提高衍生反应的活性和产物的稳定性，而且能够减少杂质的衍生化；更重要的是本发明在衍生反应后还增设二次提取过程，并且通过有限多次的实验选用并验证体积比为2：1的MTBE和正己烷的有机混合液作为二次提取过程中的提取液时，能够最大程度上提高前处理方法对低浓度的去氧肾上腺素的提取率，有效去除血浆基质的干扰，提高特异性，进而将该检测方法的最低检测限降低至0.02ng/ml，以适应于制剂研究中对低浓度去氧肾上腺素浓度的检测，而且该方法的准确度、精密度、回收率、重复性和灵敏度均满足要求。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的样品的前处理方法，其特征在于，包括，
一次提取：向所述样品中加入内标工作液和提取液，混合均匀后离心分层，收集上层液得第一上清液；
衍生反应：将所述第一上清液浓缩干燥后，加入NaHCO3缓冲盐溶解，然后加入丹酰氯的乙腈溶液进行衍生反应；
二次提取：向所述衍生反应后的反应液中加入提取液进行二次提取，离心得第二上清液，将第二上清液浓缩干燥后复溶，得到样品溶液；
其中，二次提取过程中所述提取液为体积比为2:1的MTBE和正己烷的混合液。
2.根据权利要求1所述的LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的样品的前处理方法，其特征在于，所述样品为去氧肾上腺素标准样品或待测血浆样品，所述去氧肾上腺素标准样品由去氧肾上腺素标准品加入空白血浆中制得。
3.根据权利要求1或者2所述的LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的样品的前处理方法，其特征在于，所述样品的用量为100-200μl。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的样品的前处理方法，其特征在于，所述衍生反应的温度为50-70℃，时间5-15min。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的样品的前处理方法，其特征在于，一次提取过程中所述提取液为含0.1％甲酸的甲醇溶液。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的样品的前处理方法，其特征在于，二次提取过程中，所述衍生反应后的反应液与加入的所述提取液体积比为1：(2-4)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的样品的前处理方法，其特征在于，二次提取过程中采用体积比为1:2-2:1的乙腈和0.1％甲酸水溶液的混合液进行复溶。
8.一种LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)按照权利要求1-7中任一项所述的方法制得待测血浆样品的待测液和不同浓度的去氧肾上腺素标准样品的标准溶液；
(b)采用高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述标准曲线样液进行去氧肾上腺素检测，对去氧肾上腺素和内标物的峰面积进行采集并处理，对去氧肾上腺素和内标物的峰面积的比值与去氧肾上腺素的浓度进行线性回归产生标准曲线和拟合方程；
(c)采用高液相色谱-三重四级杆质谱联用仪对所述待测样液进行去氧肾上腺素检测，得到去氧肾上腺素与内标物的峰面积的比值，将比值代入标准曲线拟合方程，计算得到待测血浆中去氧肾上腺素的浓度。
9.根据权利要求8所述的LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，其特征在于，
所述高效液相色谱的检测条件为：
色谱柱：Phenomenex，Gemini C18，5μm(2.0×50mm)；
流动相A：含0.1％甲酸的水，流动相B：含0.1％甲酸的乙腈；
流速：0.5ml/min；
柱温：室温；
进样体积：5μl；
柱温：室温；
进样器温度：2～8℃；
流动相梯度洗脱程序表：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0.5 85 15 1.00 5 95 2.20 5 95 2.21 85 15 3.00 85 15
10.根据权利要求8或者9所述的LC-MS/MS测定血浆中去氧肾上腺素浓度的方法，其特征在于，
所述三重四级杆质谱的检测条件为：
质量分析器：Waters Xevo TQ-S；离子源：ESI；扫描模式：多离子反应监测方式；源温度：550℃；脱溶剂气温度：500℃；锥孔气流速：150L/h；载气压力：6.0bar；毛细管电压：3.0kV；采样锥：60V；
或者，所述三重四级杆质谱的检测条件为：
质量分析器：AB Sciex API 4000；离子源：ESI；扫描模式：多离子反应监测方式；检测方式：正离子模式；离子喷射电压：5500V；温度：550℃。
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