CN110146620A

CN110146620A - 一种uplc-ms/ms法同时检测血浆中五种抗结核药物的方法

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Publication number: CN110146620A
Application number: CN201910502553.XA
Authority: CN
Inventors: 吴灵洁; 刘景丰; 刘小龙; 郑玲; 叶珍洁; 储楠楠; 刘辉
Original assignee: Mengchao Hepatobiliary Hospital Of Fujian Medical University (fuzhou Hospital For Infectious Diseases)
Current assignee: Mengchao Hepatobiliary Hospital Of Fujian Medical University (fuzhou Hospital For Infectious Diseases)
Priority date: 2019-06-11
Filing date: 2019-06-11
Publication date: 2019-08-20
Anticipated expiration: 2039-06-11
Also published as: CN110146620B

Abstract

本发明公开了一种UPLC‑MS/MS法检测血浆中五种抗结核药物(包括利福平、利福布汀、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、异烟肼)的方法。首先精密量取空白血浆，加入一系列混合标准品标准工作液，加入一一对应的同位素内标标准品工作液，采用蛋白沉淀法前处理后，利用UPLC‑MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，以待测物和其对于的内标峰面积比为横坐标，以待测物浓度为纵坐标建立标准曲线；然后精密量取待测血浆，再加入一一对应的同位素内标标准品工作液，采用蛋白沉淀法前处理后，利用UPLC‑MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，利用标准曲线计算出血浆样本的浓度。本方法操作简便快速、灵敏度、准确度和精密度高，基质效应小，可满足临床应用五种抗结核药物的药物浓度监测的需要。

Description

一种UPLC-MS/MS法同时检测血浆中五种抗结核药物的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种利用超高效液相质谱联用技术进行的检测血浆中五种抗结核药物(利福平、利福布汀、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、异烟肼)的方法，可用于这五种药物的治疗药物浓度监测，属于药物动力学分析技术领域。

(二)背景技术

利福平(甲哌利福霉素，rifampin RFP)、利福布汀(LM427，rifabutinRFB)同属于利福霉素类杀菌剂，通过抑制结核分枝杆菌的RNA聚合酶使菌体无法完成转录过程而死亡；吡嗪酰胺(pyrazinamind PZA)为烟碱胺的衍生物，具有抑菌或杀菌作用，为半效杀菌剂；乙胺丁醇(ethambutolEMB)为抑菌剂，通过减少阿拉伯半乳聚糖的合成，导致结核分枝杆菌细胞壁形成障碍抑制菌体生长；异烟肼(isoniazid INH)通过抑制分枝菌酸的合成导致结核分枝杆菌细胞壁的缺损。目前临床上结核病的治疗方案是多种药物长期联合应用，其中RFP、PZA、EMB和INH为一线抗结核药，RFB因其具有极强的膜穿透力及对利福平耐药的结核杆菌菌株有效，临床上推荐RFB用于耐药结核病例及合并HIV感染病例的治疗。

而结核病患者通常合并其他感染或病症，如肾衰竭、肝衰竭及糖尿病等，此类患者对所用抗结核药物存在体内代谢或排泄减慢等问题，同时此类患者应联合其他药物治疗，又使体内存在多种药物相互作用，从而导致抗结核药物的血药浓度低于或超过治疗窗，引起不良反应或无效治疗。因此有必要检测药物的血药浓度，为抗结核药物的临床合理用药提供关键依据。

目前，超高效液相-串联质谱法是抗结核药物检测的主要方法，然而现有报道的检测方法存在前处理复杂或分析时间长或机制效应较大等问题，文献报道的检测方法仍不能完全满足临床测定需要。

(三)发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，建立一种前处理简单、快速、灵敏、准确度和精密度高的超高效液相色谱质谱联用(UPLC-MS/MS)检测血浆中五种抗结核药物(包括利福平、利福布汀、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、异烟肼)浓度的方法，满足临床应用抗结核药物浓度检测的需要和目的。

本发明的目的是提供一种UPLC-MS/MS法同时检测血浆中五种抗结核药物(包括利福平、利福布汀、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、异烟肼)的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种LC-MS/MS法同时检测血浆中五种抗结核药物的方法，所述抗结核药物为利福平、利福布汀、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和异烟肼，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1.标准工作液配制

分别精密称取五种抗结核药物标准品及其分别对应的同位素内标粉末，分别用甲醇溶解并稀释成标准工作液；所述同位素内标与所述抗结核药物一一对应，包括：利福平-d₃、利福布汀-d₇、吡嗪酰胺-¹⁵N d₃、乙胺丁醇-d₄、异烟肼-d₄；

S2.标准曲线建立

精密量取空白血浆，加入混合抗结核药物标准工作液，以及混合同位素内标标准工作液，采用蛋白沉淀方法前处理，后利用LC-MS/MS进行分析，得到各样本色谱图，以待测物与内标峰面积比为横坐标，以待测物浓度为纵坐标建立标准曲线；

S3.待测样本检测

S31.待测样本血浆前处理：精密量取待测血浆，加入混合同位素内标标准工作液，进行蛋白沉淀方法前处理；

S32.利用LC-MS/MS进行分析，得到各样品的色谱图，利用标准曲线计算出样本血浆中药物浓度；

步骤S2或S32中，所述LC-MS/MS的色谱流动相设定如下：A(水相)：0.05％乙酸水溶液+5mM乙酸铵水溶液，B(有机相)：乙腈；

实验发现只有在该色谱流动相设定条件下，才能达到较好的检测效果。

通常，步骤S2或S31所述蛋白沉淀方法前处理的所用试剂为乙腈。

优选的，步骤S2中所述蛋白沉淀方法前处理的方法为：样本加入混合同位素内标标准工作液，再加入3倍体积的乙腈，涡旋震荡0.8～1.5min后，低温离心，取出部分上清，加入等体积水，涡旋混合，即为供试品溶液，用LC-MS/MS进样分析。

其中，所述涡旋震荡的时间为0.8～1.5(优选为1min)。

所述涡旋混合的时间为20～40s(优选30s)。

优选地，所述离心为12000r/min，离心温度为4℃，离心5min。

具体的，步骤S2中所述混合同位素内标标准工作液的体积为血浆和混合抗结核药物标准工作液总和的1/10。

优选的，步骤S2或S32中所述LC-MS/MS的色谱条件为：流速0.4mL/min；进样量2μL；柱温40℃；进样室温度4℃。

优选的，步骤S2或S32所述LC-MS/MS的色谱柱为Inertsil HILIC(2.1mm×150mm,3μm)。

步骤S1中五种抗结核药物的标准工作液的配制方法具体为：各精密称取五种抗结核药物，用甲醇溶解为高浓度标准储备液，再用甲醇梯度稀释，配制成一系列的标准工作液。标准储备液存于-20℃冰箱。

所述一系列浓度的混合标准工作液的浓度分为8个浓度点(SA-SH)，具体如下：

步骤S1中五种抗结核药物各自对应的同位素内标的标准工作液的配制方法具体为：各精密称取五种同位素内标，用甲醇溶解为高浓度标准储备液，临用时用甲醇稀释，配制成标准工作液。标准储备液存于-20℃冰箱。

所述的质控样本的浓度为4个浓度点(包括QC高浓度-QH、QC中浓度-QM、QC低浓度-QL、定量下限LLOQ)具体浓度如下：

所述的混合同位素内标的标准工作液为：利福平-d₃ 5μg/mL、利福布汀-d₇ 2μg/mL、吡嗪酰胺-¹⁵N d₃ 40μg/mL、乙胺丁醇-d₄ 2μg/mL、异烟肼-d₄5μg/mL。

优选地，在上述UPLC-MS/MS分析方法中，采用ESI源离子化；五种抗结核药物及其对应的内标的分子离子和碎片离子的质谱参数见下表；

更优选地，在步骤S2或S32所述UPLC-MS/MS的色谱柱InertsilHILIC(2.1mm×150mm,3μm)前连接预柱him-pack GIS(G)HILIC,(3μm,30×10)。

本发明所用水溶液均为超纯水，所用有机试剂均为HPUPLC级。

本发明的有益效果在于：

1、本发明建立了一种前处理简单、快速、灵敏度高、准确度和精密度高的超高效液相色谱质谱联用(UPLC-MS/MS)检测血浆中五种抗结核药物(包括利福平、利福布汀、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、异烟肼)浓度的方法，本发明由于对样本前处理进行了合理优化，且采用一一对应同位素内标来克服药物在血浆中的基质效应，提供了高效稳定的血浆样本前处理方法，处理时间短，基质效应小。

2、同时，本发明对色谱条件进行了合理调整，使得采用本发明的方法所得的待测物和内标色谱图稳定可靠，本发明提供的检测技术灵敏度高，分析时间短且准确度和精密度高，可更好的达到五种抗结核药物临床治疗药物检测的目的。

(四)附图说明

图1为本发明实施例1利用Shim-pack XR-ODSⅢ色谱柱，在设定的色谱条件下的五种抗结核药物的色谱图。

图2～6为本发明实施例1利用Inertsil HILIC色谱柱，在不同的色谱条件下的五种抗结核药物及其对应的同位素内标的色谱图。

图7为本发明实施例1建立的测定人血浆中五种抗结核药物(包括利福平、利福布汀、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、异烟肼)的标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

文中所述的UPLC-MS/MS为超高效液相色谱质谱联用技术的简称。

实施例1：

分别采用不同的色谱柱、流动相配比以及梯度洗脱方式对所检测的标准品进行分析。

(1)采用色谱柱Shim-pack XR-ODSⅢ(2.0mm i.d×50mm，1.6μm)；预柱Shim-packGIST-HP(G)(2μm C18，2.1×10mm)对标准品进行分离分析。流动相AB采用不同配比及梯度洗脱方式，待测物中的异烟肼及乙胺丁醇均在0.5min左右出峰，以上两个待测物在此色谱柱上不保留。其中色谱流动相设定如下：A(水相)：0.01％(w/w)甲酸水溶液，B(有机相)：甲酸浓度0.01％(w/w)的乙腈溶液。

所测五种标准品的色谱峰如图1，由图1可见，乙胺丁醇及异烟肼几乎不保留，0.5min前即出峰，更改流动相或梯度洗脱方式乙胺丁醇及异烟肼仍不保留，不能满足分离分析要求。

(2)由于色谱柱Shim-pack XR-ODSⅢ不能满足分离分析要求，改用InertsilHILIC(2.1mm×150mm,3μm)；预柱Shim-pack GIS(G)HILIC(3μm，30×10)。流动相AB采用不同配比及梯度洗脱方式，具体如下：

a.色谱流动相设定如下：A(水相)：水，B(有机相)：乙腈。

所测五种标准品的色谱峰如图2，由图可见异烟肼峰形严重拖尾，不能满足分离分析要求。

b.色谱流动相设定如下：A(水相)：0.01％(w/w)乙酸水溶液，B(有机相)：乙腈。

所测五种标准品的色谱峰如图3，由图可见吡嗪酰胺出现裂峰，不能满足分离分析要求。

c.色谱流动相设定如下：A(水相)：0.01％乙酸水溶液+5mM乙酸铵水溶液，B(有机相)：乙腈。

所测五种标准品的色谱峰如图4，由图可见利福平有肩峰，乙胺丁醇有前沿峰，仍不能满足分离分析要求。

d.A(水相)：0.05％乙酸水溶液+5mM乙酸铵水溶液，B(有机相)：50mM乙酸铵水溶液/乙腈(1/9，v/v)。

所测五种标准品的色谱峰如图5，由图可见乙胺丁醇峰不稳定，随着检测样本量增加峰往移动，仍不能满足分离分析要求。

e.色谱流动相设定如下：A(水相)：0.05％乙酸水溶液+5mM乙酸铵水溶液，B(有机相)：50mM乙酸铵水溶液/乙腈(1/9,v/v)。

所测五种标准品的色谱峰如图6，由图可见，五种分析物及其对应的内标均有较好的峰形，且峰形稳定，出峰时间约在1～1.5min之间，可实现快速高效检测血浆药物的要求。

此方法的流动相配比以及梯度洗脱方式能很好的分离分析五种标准品及其对应的同位素内标，为本发明的最优选色谱方法。

实施例2：

分别采集3份来自感染结核杆菌的患者血浆样本，命名为样品1、样品2、样品3。

(1)a.标准品处理：

取90μL空白血浆，加10μL不同浓度混合标准溶液，涡旋混匀后，加10μL混合同位素内标工作液，再加入300μL乙腈，涡旋1min，12000r/min离心5min；吸取上清液300μL于另一干净1.5mL离心管中，再加入300μL超纯水，涡旋30s，0.45μm过滤器过滤得供试品溶液；取上清2μL进行分析，记录色谱图；

利福平的定量系列浓度为：0.039，0.078，0.156，0.313，0.625，1.25，2.5，5μg/mL，

利福布汀的定量系列浓度为：0.016，0.031，0.063，0.125，0.25，0.5，1，2μg/mL，

吡嗪酰胺的定量系列浓度为：0.313，0.625，1.25，2.5，5，10，20，40μg/mL，

乙胺丁醇的定量系列浓度为：0.016，0.031，0.063，0.125，0.25，0.5，1，2μg/mL，

异烟肼的定量系列浓度为：0.078，0.156，0.313，0.625，1.25，2.5，5，10μg/mL

b.标准曲线的制备

以待测物浓度为横坐标，待测物的峰面积比值为纵坐标，用加权(W＝1/x2)最小二乘法进行回归运算，求得的直线回归方程，即为定量标准曲线，见图7，相关的线性方程、相关系数、定量下限LLOQ见表1。

(2)按以下相同的处理方法处理2份样品：取20μL血浆样品加入空白血浆80μL，将血浆样品稀释5倍后，取100μL稀释后的样品加10μL混合同位素内标工作液，再加入300μL乙腈，涡旋1min，12000r/min离心5min；吸取上清液300μL于另一干净1.5mL离心管中，再加入300μL超纯水，涡旋30s，0.45μm过滤器过滤得供试品溶液；取上清2μL进行分析。按照发明内容中的条件对样品中的利福平、利福布汀、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、异烟肼上样检测，根据图7的标准曲线和表1中的线性范围计算各成分的含量，结果见表2。

表2：血浆样品中个成分含量测定

实施例3：

(1)基质效应检测

取90μL空白血浆，加10μL不同浓度混合标准溶液，涡旋混匀后，加10μL混合同位素内标工作液，再加入300μL乙腈，涡旋1min，12000r/min离心5min；吸取上清液300μL于另一干净1.5mL离心管中，再加入300μL超纯水，涡旋30s，0.45μm过滤器过滤得供试品溶液；平行配置6份，取上清2μL进行分析。

用40％乙腈水溶液配制低、高两个浓度的工作液(即同发明内容中质控样本中各化合物对应的浓度)，平行配置6份，取2μL进行分析，结果见表3。

表3：蛋白沉淀实验方法的基质效应

表3可以看出，由于使用了一一对应的同位素内标进行校正，各分析物在本研究的最佳分离分析方法下，内标校正基质效应均约为100％，且变异系数也在FDA对此类分析方法规定的±15％的范围之内。

(2)提取回收率检测

取90μL空白血浆，加入300μL乙腈，涡旋1min，12000r/min离心5min；吸取全部上清液于另一干净1.5mL离心管中，再加入10μL不同浓度混合标准溶液和10μL混合同位素内标工作液，涡旋混匀后，取300μL溶液于另一干净1.5mL离心管中，再加入300μL超纯水，涡旋30s，0.45μm过滤器过滤得提取后工作液；平行配置6份，取上清2μL进行分析。结果见表4。

表4：蛋白沉淀实验方法的回收率

由表4可以看到，各分析物在本研究的最佳分离分析方法下，提取回收率均约为100％，且稳定。能很好的满足临床样本的分析。

以上对本发明3个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围，凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围内。

Claims

1.一种LC-MS/MS法同时检测血浆中五种抗结核药物的方法，所述抗结核药物为利福平、利福布汀、吡嗪酰胺、乙胺丁醇和异烟肼，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1.标准工作液配制

S2.标准曲线建立

S3.待测样本检测

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2或S31所述蛋白沉淀方法前处理的所用试剂为乙腈。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述蛋白沉淀方法前处理的方法为：样本加入混合同位素内标标准工作液，再加入3倍体积的乙腈，涡旋震荡0.8～1.5min后，低温离心，取出部分上清，加入等体积水，涡旋混合，即为供试品溶液，用LC-MS/MS进样分析。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述混合同位素内标标准工作液的体积为血浆和混合抗结核药物标准工作液总和的1/10。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2或S32中所述LC-MS/MS的色谱条件为：流速0.4mL/min；进样量2μL；柱温40℃；进样室温度4℃。

6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S2或S32所述LC-MS/MS的色谱柱为Inertsil HILIC(2.1mm×150mm，3μm)。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述的混合同位素内标的标准工作液为：利福平-d₃ 5μg/mL、利福布汀-d₇ 2μg/mL、吡嗪酰胺-¹⁵N d₃ 40μg/mL、乙胺丁醇-d₄ 2μg/mL、异烟肼-d₄ 5μg/mL。