CN109580806A

CN109580806A - 一种用于水产品中利福平药物残留的测定方法

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Publication number: CN109580806A
Application number: CN201811333155.1A
Authority: CN
Inventors: 缪小群; 朱思华; 张玉昆; 刘振先
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2038-11-09
Also published as: CN109580806B

Abstract

本发明公开了一种用于水产品中利福平药物残留的测定方法，采用改进的QuEChERS方法进行样品前处理，对样品进行脱水后再加入提取剂进行提取，提取液经氮吹复溶后，加入吸附净化剂进行基质固相分散净化，在InertSustainSwift C18色谱柱上以含0.05％甲酸的乙酸铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱分离，再采用电喷雾电离正离子多反应监测模式测定，内标法定量分析，通过QuEChERS法和超高效液相色谱串联质谱法的有效结合，建立了一种用于水产品中利福平药物残留的测定方法，该测定方法中的样品前处理方法操作简单，灵敏度高，准确性好，稳定性好，适用于水产品中利福平药物残留的确证和定量分析，为利福平药物违规使用的监管提供便捷、有效的技术支持。

Description

一种用于水产品中利福平药物残留的测定方法

技术领域

本发明属于水产品中利福平的检测技术领域，具体涉及一种用于水产品中利福平药物残留的测定方法。

背景技术

利福平是从利福霉素B中得到的一种半合成抗生素，它通过抑制细菌中DNA转录合成RNA，从而起到杀灭细菌的作用。通常情况下，利福平可用于治疗结核病、肠球菌感染等，特别是作为抗结核药物在全球得到了广泛应用。利福平未批准用于水产动物，但其在实际水产养殖中被广泛使用。据有关研究学者对一些地区中部分水产养殖致病菌进行了耐药分析，发现多种菌株对利福平药物呈现出30％～80％不同程度的耐药率，再加上利福平抗菌谱广，价格低廉，使得其在水产养殖业中可能存在盲目大量投放的情况，以致诱导菌株产生抗性。

然而，如果药物仍残留于食用水产动物机体中，通过食物链在人体内蓄积，对人类健康产生危害，其耐药性也有转移扩散到人体的风险，对消费者的健康构成很大的威胁。

QuEChERS法作为一种快速、简单、便宜、有效、可靠和安全的样品前处理技术，最初应用于农药残留中，而近年来已越来越多的学者研究将其应用于各种抗生素和激素的前处理技术中。其原理与高效液相色谱(HPLC)和固相萃取(SPE)相似，都是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，吸附杂质从而达到除杂净化的目的。

目前，我国尚未建立关于利福平在水产品或相关动物性食品中的检测技术标准。近年来，相关文献报道关于在生物基质中检测利福平的，大多是采用高效液相色谱法或高效液相色谱-串联质谱法检测血浆中利福平的药物浓度。因此，有必要建立一种用于水产品中利福平药物残留的测定方法，为利福平药物违规使用的监管提供便捷、有效的技术支持。

发明内容

本发明的目的在于采用经济、简单、快速、高效的且经改进的QuEChERS样品前处理技术结合超高效液相色谱－串联质谱法，建立一种用于水产品中利福平药物残留的测定方法，为利福平药物违规使用的监管提供便捷、有效的技术支持。

本发明所采取的技术方案是：一种用于水产品中利福平药物残留的测定方法，所述测定方法是采用改进的QuEChERS方法进行样品前处理，对样品进行脱水后再加入提取剂进行提取，提取液经氮吹复溶后，加入吸附净化剂进行基质固相分散净化，在InertSustainSwift C18色谱柱上以含0.05％甲酸的乙酸铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱分离，再采用电喷雾电离正离子多反应监测模式测定，内标法定量分析。

作为上述方案的进一步改进，所述样品包括罗非鱼、南美对白虾、中华鳖、濑尿虾、乌鳢、草鱼。

作为上述方案的进一步改进，所述对样品进行脱水时用到的脱水剂包括无水硫酸钠和无水硫酸镁中的一种或两种。

作为上述方案的进一步改进，所述提取剂包括乙腈和二氯甲烷的混合溶液，所述混合液中的二氯甲烷的体积占比为20％～60％。

作为上述方案的进一步改进，所述吸附净化剂为C18与PSA的混合物。

作为上述方案的进一步改进，所述C18的用量为80mg～160mg。

作为上述方案的进一步改进，所述PSA的用量为50mg～120mg。

作为上述方案的进一步改进，所述乙酸铵的摩尔浓度为2mmol/L～6mmol/L。

作为上述方案的进一步改进，所述内标法定量分析选用的内标物为利福喷丁。

所述测定方法具体包括如下步骤：

S1.提取：准确称取匀质的样品5.00g，精确至0.01g，于50mL聚丙烯塑料离心管中，加入100μL1μg/mL的利福喷丁内标工作液，加入10mL提取剂乙腈-二氯甲烷(6：4，V/V)，同时加入5.0g无水硫酸钠，涡旋振荡3min，超声提取10min，8000r/min离心5min，取上清移至干净的20ml试管中；

S2.残渣中加入5mL提取剂重复提取1次，合并上清液，于40℃水浴氮吹至近干；

S3.净化：用初始流动相定容至2mL，涡旋混匀，使残渣充分溶解后，取1mL复溶液于装有100mgC18、100mgPSA吸附剂的5mL离心管中，充分漩涡振荡2min，在4℃、10000r/min离心5min后，取上清液过0.22μm过滤膜后上机测定；

S4.配制流动相含0.05％甲酸的乙酸铵水溶液：准确称取0.23g乙酸铵于1L容量瓶中，加入0.5mL甲酸，用超纯水定容至1L；

S5.准备标准工作液：分别称取利福平标准品适量，用乙腈溶解并配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液，用乙腈将标准储备液稀释，配成含利福平为10.0μg/mL的标准中间液，再用乙腈将标准中间液稀释，配成浓度为100ng/mL的标准工作溶液，-20℃保存待用；

S6.内标溶液的配制：准确称取适量利福喷丁标准品，用乙腈逐级溶解分别配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液、10.0μg/mL的标准中间液和1.0μg/mL的标准工作溶液，-20℃保存待用；

S7.准备系列基质匹配标准溶液：称取相同质量的空白基质样品，分别加入适量利福平标准工作溶液和100μL内标工作液，按上述前处理方式处理后，得到浓度为0.1μg/kg、0.4μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg系列基质匹配标准溶液；

S8.准备基质加标测试样

称取相同质量的空白基质样品，分别加入适量利福平标准工作溶液和100μL内标工作液，按相同的前处理方式处理，配制成加标浓度为1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg且每个加标浓度设6个平行的基质加标测试样；

S9.采用超高效液相色谱串联质谱法，以待测物定量离子质量色谱峰面积与对应内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，以标准溶液浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，并以此标准曲线来计算样品中利福平的残留量；

采用的色谱条件为：采用色谱柱为InertSustainSwift C18(3μm 2.1×100mm)，流动相：A为含0.05％甲酸的乙酸铵水溶液(2mmol/L～6mmol/L)，流动相B为乙腈相，流速：0.3mL/min；梯度洗脱程序：0～0.20min，20％B；0.2～1.00min，20％～80％B；1.00～5.00min，80％B；5.01～8.00min，20％B，柱温30℃，进样量为10μL；

采用的质谱条件为：电喷雾正离子电离ESI+，质谱扫描模式：多反应监测(MRM)模式；气帘气(CUR)压力为10psi；碰撞气(CAD)为4psi；电喷雾电压为5500kV；离子源温度为500℃；雾化器(GS1)压力为30psi；辅助气(GS2)压力为40psi；其他质谱参数见表1。

表1利福平及内标利福喷丁在多反应监测模式下的质谱参数

*为定量离子。

本发明的有益效果是：本发明采用改进的QuEChERS方法进行样品前处理，采用选择性好、抗干扰能力强的超高效液相色谱串联质谱法进行检测，通过QuEChERS法和超高效液相色谱串联质谱法的有效结合，建立了一种用于水产品中利福平药物残留的测定方法，该测定方法中的样品前处理方法操作简单，灵敏度高，准确性好，稳定性好，准确度和精密度均符合多残留分析方法的要求，适用于水产品中利福平药物残留的确证和定量分析，本发明是一种有效的用于测定水产品中利福平药物残留的测定方法，为利福平药物违规使用的监管提供便捷、有效的技术支持。

本测定方法的线性关系、方法检出限与定量限

本发明的标准曲线采用基质加标法进行，称取相同质量的空白基质样品，分别加入适量利福平标准工作溶液和100μL内标工作液，按上述前处理方式处理后，得到浓度为0.1μg/kg、0.4μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg系列基质匹配标准溶液,在上述色谱条件和质谱条件节所示的条件下上机测定，以待测物定量离子质量色谱峰面积与对应的内标峰面积比值为纵坐标(Y)，标准溶液浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得到线性方程，利福平药物在0.1～20.0μg/kg的系列基质标液浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数(R²)在0.9973～0.9987。以信噪比(S/N)≧3确定化合物的方法检出限，以信噪比(S/N)≧10确定化合物的方法定量限，3种样品基质中方法的线性回归方程、相关系数(R²)、检出限和定量限如下表2所示。

表2 3种样品基质中方法的线性回归方程、相关系数(R²)、检出限和定量限

由表2可知，利福平在上述3种不同样品基质的方法检出限为0.2～0.3μg/kg，定量限为1μg/kg，满足定量分析的要求，本测定方法具有较高的检测灵敏度。

本测定方法的回收率与精密度

对3种样品基质空白样罗非鱼、南美对白虾和以及中华鳖3种水产品的肌肉组织进行空白加标实验，添加低、中、高3个浓度水平(分别为1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg)，每个加标浓度设6个平行的基质加标测试样，按本发明的方法进行样品处理和测定并采用基质匹配标准曲线进行定量分析，结果见表3。

表3样品基质中利福平(MF)的回收率和精密度(n＝6)

由表3可知，利福平药物的平均加标回收率在90.17％～101.07％之间，相对标准偏差(RSD)在3.11％～7.66％之间，可见，本测定方法具有较好的回收率和重现性，能满足对水产品中的利福平残留检测的要求。

附图说明

图1为利福平的二级质谱图；

图2为内标物利福喷丁的二级质谱图；

图3为空白罗非鱼的MRM谱图；

图4为空白罗非鱼基质加标(5μg/kg)样品中利福平的MRM色谱图；

图5为空白罗非鱼基质加标(5μg/kg)样品中利福喷丁的MRM色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。

实施例1

以罗非鱼样品为样本，采用本发明的测定方法进行样品前处理，采用超高效液相色谱-串联质谱法进行测定。方法如下：

1.仪器和试剂

仪器：API 4000超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪(美国AB Sciex公司)；高速冷冻离心机(安徽嘉文)；高速分散均质机(上海本昂)；HSC水浴氮吹仪(天津恒奥科技)；涡旋混合器(德国IKA公司)；

标准品：利福平(CAS号:13292-46-1，含量以利福平(C₄₃H₅₈N₄O₁₂)计)、利福喷丁(CAS号:61379-65-5，含量以利福喷丁(C₄₇H₆₄N₄O₁₂)计)均购自中国食品药品检定研究院；

试剂：乙二胺-N-丙基硅烷PSA(40-63μm)、十八烷基硅烷键合硅胶C18吸附剂(上海安谱公司)；乙腈、二氯甲烷皆为色谱纯(SccBayer)；甲酸、乙酸铵(色谱纯，天津科密欧)、无水硫酸钠(分析纯，天津科密欧)。

2.溶液配制

1)流动相(B)3mmol乙酸铵水溶液(含0.05％甲酸)：准确称取0.23g乙酸铵于1L容量瓶中，加入0.5mL甲酸，用超纯水定容至1L；

2)标准溶液的配制：称取适量利福平标准品，用乙腈溶解并配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液。用乙腈将标准储备液稀释，配成含利福平为10.0μg/mL的标准中间液。再用乙腈将标准中间液稀释，配成浓度为100ng/mL的标准工作溶液，-20℃保存待用；

3)内标溶液的配制：准确称取适量利福喷丁标准品，用乙腈逐级溶解分别配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液、10.0μg/mL的标准中间液和1.0μg/mL的标准工作溶液，-20℃保存待用。

3.样品前处理

1)提取：准确称取5g均质样品(精确至0.01g)于50mL具塞塑料离心管中，加入100μL1μg/mL利福喷丁内标工作液，加入10mL提取剂乙腈-二氯甲烷(6︰4，V/V)，同时加入5.0g无水硫酸钠，涡旋振荡3min，超声提取10min，8000r/min离心5min，取上清移至干净的20ml试管中，加入5mL提取剂重复提取1次，合并上清液，于40℃水浴氮吹至近干。

2)净化：用初始流动相定容至2mL，涡旋混匀，使残渣充分溶解后，取1mL复溶液于装有100mgC18、100mgPSA吸附剂的5mL离心管中，充分漩涡振荡2min，4℃下10000r/min离心5min后，取上清液过0.22μm过滤膜后上机测定。

4.准备基质匹配标准溶液：

准备系列基质匹配标准溶液：称取相同质量的空白基质样品，分别加入适量利福平标准工作溶液和100μL内标工作液，按上述前处理方式处理后，得到浓度为0.1μg/kg、0.4μg/kg、1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg系列基质匹配标准溶液；

5.测定方法

对系列浓度的基质匹配标准溶液进行测定，以待测物定量离子质量色谱峰面积与对应内标峰面积的比值为纵坐标(Y)，以标准溶液浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。然后对罗非鱼样品进行测定，得到其定量离子质量色谱的峰面积，代入标准曲线，计算得利福平的残留量见表4。

在用超高效液相色谱串联质谱法测定时采用的色谱条件为：色谱柱：InertSustainSwift C18(3μm 2.1×100mm)；流动相：A为含0.05％甲酸的乙酸铵水溶液(3mmol/L)，流动相B为乙腈相；梯度洗脱程序：0～0.20min，20％B；0.2～1.00min，20％～80％B；1.00～5.00min，80％B；5.01～8.00min，20％B，柱温30℃，进样量为10μL；

利福平的二级质谱图见图1；内标物利福喷丁的二级质谱图见图2；罗非鱼空白MRM谱图见图3；空白罗非鱼基质加标(5μg/kg)样品中利福平的MRM色谱图见图4；空白罗非鱼基质加标(5μg/kg)样品中利福喷丁的MRM色谱图见图5。

实施例2

如实施例1所述的测定方法，对南美对白虾样品进行测定，测得南美对白虾样品中利福平的残留量见表4。

实施例3

如实施例1所述的测定方法，对中华鳖样品进行测定，测得中华鳖样品中利福平的残留量见表4。

实施例4

如实施例1所述的测定方法，对濑尿虾样品进行测定，测得濑尿虾样品中利福平的残留量见表4。

实施例5

如实施例1所述的测定方法，对乌鳢样品进行测定，测得乌鳢样品中利福平的残留量见表4。

实施例6

如实施例1所述的测定方法，对草鱼样品进行测定，测得草鱼样品中利福平的残留量见表4。

表4实施例1-6的实测样品中利福平的残留量

序号	实测样品名称	利福平药物残留量(μg/kg)
			实施例1	罗非鱼	ND
实施例2	南美对白虾	ND
			实施例3	中华鳖	ND
实施例4	濑尿虾	ND
			实施例5	乌鳢	21.6
实施例6	草鱼	ND

备注：ND表示未检出。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于水产品中利福平药物残留的测定方法，其特征在于，所述测定方法是采用改进的QuEChERS方法进行样品前处理，对样品进行脱水后再加入提取剂进行提取，提取液经氮吹复溶后，加入吸附净化剂进行基质固相分散净化，在InertSustainSwift C18色谱柱上以含0.05％甲酸的乙酸铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱分离，再采用电喷雾电离正离子多反应监测模式测定，内标法定量分析。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述样品包括罗非鱼、南美对白虾、中华鳖、濑尿虾、乌鳢、草鱼。

3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述对样品进行脱水时用到的脱水剂包括无水硫酸钠和无水硫酸镁中的一种或两种。

4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述提取剂包括乙腈和二氯甲烷的混合溶液。

5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述混合液中的二氯甲烷的体积占比为20％～60％。

6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述吸附净化剂为C18与PSA的混合物。

7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述C18的用量为80mg～160mg。

8.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于，所述PSA的用量为50mg～120mg。

9.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述含0.05％甲酸的乙酸铵水溶液的摩尔浓度为2mmol/L～6mmol/L。

10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述内标法定量分析选用的内标物为利福喷丁。