CN109856271A

CN109856271A - 同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类抗生素残留量的方法

Info

Publication number: CN109856271A
Application number: CN201910090101.5A
Authority: CN
Inventors: 方灵; 傅建炜; 韦航; 苏德森; 吴妙鸿; 刘文静; 黄彪
Original assignee: Institute Of Quality Standard And Testing Technology For Agro-Products Fujian Academy Of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute Of Quality Standard And Testing Technology For Agro-Products Fujian Academy Of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-01-18
Filing date: 2019-01-18
Publication date: 2019-06-07

Abstract

本发明公开了一种QuEChERS‑超高效液相色谱‑串联质谱联用，同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类5类38种抗生素残留量的分析方法。本发明优化了提取溶剂、净化条件及色谱、质谱条件、可实现对多种抗生素的快速、高效及灵敏的检测，可保障我国食品和环境安全。

Description

同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类抗生素残留量的方法

技术领域

本发明属于分析技术领域，具体涉及一种同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类5类38种抗生素残留量的方法。

背景技术

抗生素主要用于预防和治疗细菌性感染类疾病，以提高生产质量和效率，常作为兽药和饲料添加剂应用于畜禽养殖业中。在奶牛养殖中，抗生素主要用于治疗乳牛乳腺炎、腹泻等疾病。而泌乳期乳牛过量使用抗生素或休药期不足，可能导致牛奶中抗生素残留，并通过食物链对人类身体健康造成不良影响，如引起胃肠不适、产生过敏反应、导致肝功能损害等。此外，滥用抗生素或长期摄入含抗生素食品可能会产生细菌耐药性，对人类健康危害更加严重，同时，抗生素残留对环境也产生越来越大的影响。为了保障食品安全，我国农业部第235号公告规定了动物源性食品中抗生素最大残留限量（MRL），许多国家及组织也制定了抗生素最大残留限量，其限量标准也越来越严格。因此，建立一种快速、简便、灵敏的多种抗生素检测方法十分必要。

目前，抗生素的检测方法主要有微生物和生物分析方法、酶联免疫法、液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等。但微生物和生物分析方法、酶联免疫法特异性不高，灵敏度较差，液相色谱法存在检测抗生素种类受限制、检出限高等缺点。超高效液相色谱-串联质谱法成为抗生素残留检测分析的一个重要趋势。由于不同种类抗生素物理性质的差异，以及提取和净化过程的特异性，基质复杂性，以往的研究报道多数是关于单一类别抗生素或少数几个抗生素的检测方法，不能适用于样品快速筛查分析，有一定的局限性。

发明内容

为解决现有牛奶中抗生素多残留检测的难题，本发明提供了一种同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类抗生素残留的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类抗生素残留量的方法，其包括如下步骤：

一、标准溶液的配制

1）准确称取14种磺胺类标准品（磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺异恶唑、苯酰磺胺、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺喹恶啉、磺胺地索辛），15种喹诺酮类标准品（丹诺沙星、氧氟沙星、依诺沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩诺沙星、氟罗沙星、沙拉沙星、司帕沙星、奥比沙星、双氟沙星、恶喹酸、氟甲喹），4种四环素类标准品（强力霉素、四环素、土霉素、金霉素），3种氯霉素类标准品（氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考），2种大环内酯类标准品（红霉素、罗红霉素），分别用甲醇溶解并定容至10mL，得到浓度为1 mg/mL的不同标准品储备液；

2）准确量取不同标准品储备液各0.1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇混匀并定容，配成浓度为10 µg/mL的混合标准品溶液，于-20 ℃密闭下保存；

3）准确移取一定量的混合标准品溶液，配成系列标准品溶液；

二、样品溶液的制备

1）准确称取1.00 g待测牛奶样品至15 mL聚丙烯离心管中，加入5 mL 0.5%（v/v）甲酸乙腈溶液，漩涡震荡后超声10 min，再以5000 r/min离心5 min，取上清液；

2）取2 mL上清液加入QuEChERS试剂盒（包含100 mg PSA、100 mg C18、300 mg MgSO₄）中，漩涡振荡1 min后，以5000 r/min离心5 min，取所得上清液0.5 mL，加入0.5 mL超纯水稀释混匀，经0.22 µm滤膜过滤，得样品溶液；

三、超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定

1）将系列标准品溶液分别进行UPLC-MS/MS测定，然后以各目标组分的浓度与其对应的响应峰面积绘制标准曲线，并计算其线性回归方程；

2）将样品溶液进行UPLC-MS/MS测定，再利用线性回归方程计算样品中残留抗生素的含量。

其中，超高效液相色谱的检测条件为：Waters Acquity UPLC TSS T3色谱柱（100mm×2.1 mm i.d.，1.8 µm）；流速为0.4 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为2 µL；流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱，其洗脱程序为：0.00-0.20min，流动相A的体积为95%，0.20-2.50min，流动相A的体积由95%降低至50%，2.50-4.50min，流动相A的体积由50%降低至5%，4.50-4.51min，流动相A的体积由5%提升至95%，4.51-8.00min，流动相A的体积维持在95%；

质谱的检测条件为：电喷雾离子源；磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类抗生素为正离子模式，毛细管电压：2.5 kV；氯霉素类为负离子模式，毛细管电压：-2.5 kV；多反应监测模式；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：600 ℃；脱溶剂气和锥孔气均为氮气，流速分别为1000 L/h，150 L/h；碰撞气为氩气（Ar纯度>99.999%），流速为0.15 mL/min。

本发明建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定牛奶中5类（磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类和大环内酯类）38种抗生素残留的分析检测方法。其将牛奶样品经酸化乙腈提取后，利用QuEChERS试剂盒进行净化，以有效去除蛋白质及脂肪，然后在多反应监测模式下进行定性定量分析。结果显示，38种抗生素在各自线性范围内具有良好的线性关系，其回收率、精密度及定量限均能满足分析检测的要求。

本发明方法前处理简单、灵敏度高、重现性好，可在8分钟内完成38种抗生素的分析检测。能够满足牛奶中多种抗生素残留分析监测要求。

附图说明

图1为38种抗生素的总离子流图（TIC图）。

图2为不同提取溶剂对38种抗生素回收率的影响。

图3为不同净化方法对38种抗生素回收率的影响。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1

1. 标准溶液的配制

3）准确移取一定量的混合标准品溶液，配成系列标准品溶液（现用现配）；

2. 样品溶液的制备

3. 超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定

其中，超高效液相色谱的检测条件为：Waters Acquity UPLC TSS T3色谱柱（100mm×2.1 mm i.d.，1.8 µm）；流速为0.4 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为2 µL；流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱程序详见表1。

表1 梯度洗脱分离程序

质谱的检测条件为：电喷雾离子源（ESI源）；磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类抗生素为正离子模式，毛细管电压：2.5 kV；氯霉素类为负离子模式，毛细管电压：-2.5 kV；多反应监测模式（MRM）；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：600 ℃；脱溶剂气和锥孔气均为氮气，流速分别为1000 L/h，150 L/h；碰撞气为氩气（Ar纯度＞99.999%），流速为0.15 mL/min。其他质谱信息参详见表2。

表2 38种抗生素质谱信息参数

5类抗生素在不同模式下响应不同，磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类抗生素在正离子模式下响应较强，而氯霉素类在负离子模式下有较强响应。因此，本发明选择正、负离子模式同时监测，以提高效率。

实施例2

为改善峰形和达到更好分离效果，本发明分别考察了Acquity UPLC TSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm i.d., 1.8 µm）和Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mmi.d., 1.7 µm）对38种抗生素的分离效果。结果显示，在相同条件下，综合考虑分离度、峰形等因素，Acquity UPLC TSS T3色谱柱分离效果更佳，目标物的峰形更尖锐。38种抗生素总离子流色谱图见图1。

实施例3

本发明分别考察了纯乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.2%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈五种提取溶剂对目标抗生素的提取效率。其操作方法为：在空白牛奶样品中添加38种抗生素混合标准溶液，进行添加回收试验，结果见图2所示。

从图2可以看出，采用0.5%甲酸乙腈溶剂提取时，平均回收率较高，回收率在76.1%~ 91.0%，结果显著优于其他提取溶剂的回收率，因此采用0.5%甲酸乙腈为提取溶剂。

实施例4

牛奶富含蛋白质及脂肪，使得提取液中含有杂质，未经净化，不仅会干扰目标物的分析，同时也会影响色谱柱寿命，因此需要对样品进行净化处理。本发明分别比较了QuEChERS试剂管和C18固相萃取小柱对目标抗生素的添加回收效果。结果见图3。

由图3可见，经QuEChERS试剂管净化后，大部分目标组分回收率高于C18柱，对5类抗生素都有较好的回收率和重现性。QuEChERS试剂管主要采用PSA、C18、MgSO₄等，PSA是弱阴离子交换吸附剂，可以去除样品基质中的脂肪酸、有机酸等，C18填料对脂类和非极性干扰物有较大吸附，无水MgSO4能吸收水分。因此本发明选择QuEChERS试剂管（100 mg PSA /100 mg C18 / 300mg MgSO₄）净化样品，可以达到比较满意的净化结果，且其方法相对简便快捷。

实施例5

根据每种抗生素响应值，配制系列标准品溶液，外标法定量。以10倍信噪比（S/N≥10）得到定量限（LOQ）。

在空白基质中分别添加低、中、高三个水平标准溶液，进行添加回收试验。每个水平重复测定6次，进行精密度试验。按照相同提取、净化方法处理后进行UPLC-MS/MS测定，计算回收率及相对标准偏差（RSD）。

方法的线性范围、定量限及加标回收试验结果见表3。

表3 牛奶中38种抗生素添加回收率、定量限及RSD (n=6)

由表3结果显示，38种抗生素在各自线性范围内呈良好的线性关系，线性方程相关系数（r²）均大于0.99，定量限在0.10~1.00 µg/kg范围内。在加标水平为1.0~10.0 µg/kg时，平均回收率范围为70.5 %~95.5 %，相对标准偏差范围为3.0 %~7.9 %。结果表明该方法能满足牛奶中38种抗生素残留的日常分析检测的要求。

实施例6

采用所建立的检测方法对养殖场及市场，共15个牛奶样品进行抗生素残留分析，结果见表4。

表4 牛奶样品中抗生素的含量（n=3）

表4结果可见，共检出8种抗生素，主要为磺胺嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、恶喹酸、丹诺沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、奥比沙星，质量浓度分别在0.13~3.37 µg/kg，0.12~8.60 µg/kg，0.14~4.71 µg/kg，0.32 ~ 0.99 µg/kg，0.45~0.86 µg/kg，0.13~1.91 µg/kg，0.12~3.08 µg/kg，0.10 ~ 0.13 µg/kg范围之间，未超过我国兽药残留最高限量标准。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1. 一种同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类抗生素残留量的方法，其特征在于：包括如下步骤：

一、标准溶液的配制

1）准确称取14种磺胺类标准品、15种喹诺酮类标准品、4种四环素类标准品、3种氯霉素类标准品、2种大环内酯类标准品，分别用甲醇溶解并定容至10mL，得到浓度为1 mg/mL的不同标准品储备液；

2）准确量取不同标准品储备液各0.1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇混匀并定容，配成浓度为10 µg/mL的混合标准品溶液；

二、样品溶液的制备

1）准确称取1.00 g待测牛奶样品，加入5 mL 0.5%（v/v）甲酸乙腈溶液，漩涡震荡后超声10 min，再以5000 r/min离心5 min，取上清液；

2）取2 mL上清液加入QuEChERS试剂盒中，漩涡振荡1 min后，以5000 r/min离心5 min，取所得上清液0.5 mL，加入0.5 mL超纯水稀释混匀，经0.22 µm滤膜过滤，得样品溶液；

三、超高效液相色谱-串联质谱测定

1）将系列标准品溶液分别进行UPLC-MS/MS测定，然后以各目标组分的浓度与其对应的响应峰面积绘制标准曲线，并计算得到线性回归方程；

2. 根据权利要求1所述同时测定牛奶中磺胺类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类抗生素残留量的方法，其特征在于：超高效液相色谱的检测条件为：Waters AcquityUPLC TSS T3色谱柱，规格为100 mm×2.1 mm，1.8 µm；流速为0.4 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为2 µL；流动相A为0.1%（v/v）甲酸水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱，其洗脱程序为：0.00-0.20min，流动相A的体积为95%，0.20-2.50min，流动相A的体积由95%降低至50%，2.50-4.50min，流动相A的体积由50%降低至5%，4.50-4.51min，流动相A的体积由5%提升至95%，4.51-8.00min，流动相A的体积维持在95%；

质谱的检测条件为：电喷雾离子源；磺胺类、喹诺酮类、四环素类、大环内酯类抗生素为正离子模式，毛细管电压：2.5 kV；氯霉素类为负离子模式，毛细管电压：-2.5 kV；多反应监测模式；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：600 ℃；脱溶剂气和锥孔气均为氮气，流速分别为1000 L/h，150 L/h；碰撞气为氩气（纯度>99.999%），流速为0.15 mL/min。