CN109900821A

CN109900821A - 一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的方法和试剂盒

Info

Publication number: CN109900821A
Application number: CN201910146480.5A
Authority: CN
Inventors: 王琼琼; 许玉娇; 肖婷
Original assignee: WUHAN KANGSHENGDA MEDICAL INSTITUTE Co Ltd
Current assignee: WUHAN KANGSHENGDA MEDICAL INSTITUTE Co Ltd
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2019-06-18

Abstract

本发明公开了一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的方法和试剂盒，采用LC‑MS法进行检测，具体检测维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3或E中的任意两种或两种以上脂溶性维生素；色谱条件为，洗脱液A：甲醇溶液，洗脱液B：2mmol/L乙酸铵、0.1％甲酸水溶液；质谱条件为，电喷雾法将维生素分子软电离。本发明通过电喷雾法将维生素分子软电离，形成多种不同质荷比的离子对，通过与已知浓度的维生素内标参比，算出待测维生素浓度，一次进样，同时检测血清中多种脂溶性维生素的含量，采用本发明的方法和试剂盒检测，具有更高的精密度和准确度；本试剂盒的内标液可同时达到加入参比和去蛋白的作用，能节省操作步骤。

Description

一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的方法和试剂盒

技术领域

本发明属于维生素的检测领域，具体涉及一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的方法和试剂盒。

背景技术

维生素(vitamin)是人和动物为维持正常的生理功能而必需从食物中获得的一类有机物质，在人体生长和代谢过程中发挥着极其重要的作用。机体缺乏维生素将引起代谢障碍，并发生各种疾病，这类疾病统称为维生素缺乏症。

目前，根据溶解性可将维生素分为脂溶性维生素和水溶性维生素两大类，水溶性维生素包括B族维生素和维生素C等；脂溶性维生素包括维生素A、D、E和K等。

脂溶性维生素中，维生素A是视网膜中感光细胞的感光物质的主要成分，维生素A缺乏会导致干眼症，对于成人，维生素A缺乏时易导致夜盲症；维生素D(Vit D)对人类健康特别是儿童健康具有重要意义，Vit D缺乏性佝偻病是我国儿童重点防治的四病之一，临床发现Vit D缺乏性佝偻病除骨骼病变外，同时可影响神经、肌肉、造血及免疫等组织器官的功能；维生素E有抗氧化的作用，能防止不饱和脂肪酸的自身氧化，因而有保护生物膜的功能，使生物膜中的不饱和脂肪酞不致于因氧化变硬，使膜遭到破坏；维生素K对正常的血液凝结有重要作用，缺乏维生素K会出现血凝缓慢，甚至可导致大出血。

现有技术中，常用的维生素检测方法主要包括酶联免疫分析法、化学免疫发光法、高效液相色谱法(HPLC)和超高效液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)等。免疫法检测时所用的抗体，也可识别其它维生素衍生物，且抗体抗原反应通常不足100，因此结果差异较大，特异性较差，应用于临床检测可靠性不高，尤其是对于检测含量较低的维生素；液相色谱法由于检出限有限，主要用于维生素含量较高的样品测定，一般只能进行单组份或含量较高的几个组分的同时测定；目前的液相色谱-质谱法只能对一种或两种维生素做定性分析，由于血浆/血清成分复杂，且维生素含量较低，在进行定量分析时，杂质严重影响检测结果的准确性，因此，为了降低检测时的基质效应，使用者都是对不同的维生素逐个检测分析，因此，存在检测成本高、操作复杂、耗费时间长和检测需要的血量多等缺陷。

迄今为止，尚未见到一种能够同时检测血液中多种脂溶性维生素的有效方法。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中存在的无法同时检测血液中多种脂溶性维生素的问题，提供一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的方法和试剂盒。

本发明采用如下技术方案：

一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的方法，采用LC-MS法进行检测。

在上述技术方案中，所述多种脂溶性维生素为维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3或E中的任意两种或两种以上。

在上述技术方案中，所述血液为血清。

在上述技术方案中，所述LC-MS法的条件为：

色谱条件：洗脱液A：甲醇溶液，洗脱液B：2mmol/L乙酸铵、0.1％甲酸水溶液；

质谱条件：电喷雾法将维生素分子软电离。

进一步地，在上述技术方案中，在所述LC-MS法中，

色谱条件如下：

色谱柱：Shim-pack GIST C18 2.1*50mm，3μm柱温：40℃；洗脱液A：甲醇溶液，洗脱液B：2mmol/L乙酸铵、0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱条件：0-3.5min，70％A，3.5-5min，100％A，5-5.1min，100％A，5.1-6min，70％A，流速0.40mL/min，进样量10μL；

质谱条件：

电喷雾法将维生素分子软电离，雾化气：62.5kPa，加热气：50kPa，气帘气：22kPa，喷雾电压：5000V，去溶剂温度：550℃。

优选地，在上述技术方案中，所述检测方法，具体步骤包括：

S1、样品处理：将待测血液与内标液混匀后离心，取上清液层，并加入萃取剂混匀后离心，再次取上清液层，吹干，加入稀释剂混匀后采用串联质谱法进行检测，通过比较维生素和维生素内标的离子强度来得出待测血清中脂溶性维生素的含量；

S2、标准工作液的配制：使用甲醇进行配制；

S3、LC-MS检测：通过电喷雾法将维生素分子软电离，形成多种不同质荷比的离子对，通过与已知浓度的维生素内标参比，算出待测维生素浓度，对待测物质进行定性与定量检测。

进一步地，在上述技术方案中，所述萃取剂为正己烷。

进一步地，在上述技术方案中，所述稀释剂为70％v/v的甲醇水溶液。

本发明另一方面还提供了一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的试剂盒，包括：具有不同浓度梯度的混合标准品溶液，无水乙醇，正己烷，70％甲醇水溶液，甲醇，2mmol/L乙酸铵、0.1％甲酸水溶液，质控。

在上述试剂盒中，所述多种脂溶性维生素为维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3和E。

本发明的优点：

(1)本发明的方法通过电喷雾法将维生素分子软电离，形成多种不同质荷比的离子对，通过与已知浓度的维生素内标参比，算出待测维生素浓度，一次进样，同时检测血清中多种脂溶性维生素的含量，对于定性和定量分析来说，采用本发明的方法和试剂盒检测，具有更高的精密度和准确度；

(2)本试剂盒的内标液可以同时达到加入参比和去蛋白的作用，能够节省操作步骤。

附图说明

图1是本发明实施例1的维生素A的色谱图；

图2是本发明实施例1的维生素25(OH)D2的色谱图；

图3是本发明实施例1的维生素25(OH)D3的色谱图；

图4是本发明实施例1的维生素E的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合附图和实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的方法

一、实验步骤

(1)前处理过程

1、将充分凝固的全血离心，3000转/分钟离心3分钟，提取上层血清；

2、取400微升血清加入到含有400微升稀释液3的离心管中，再加入内标混合液200微升，涡旋充分后4℃离心，13000转/分钟离心5分钟，提取上清液800微升；

3、将上层清液加入到含有600微升正己烷的离心管中，涡旋充分后4℃离心，13000转/分钟离心10分钟，提取上清液500微升，使用氮气吹干；

4、将上述吹干的离心管中加入100微升稀释液4，涡旋充分后加入96孔微孔板，覆上封板膜减少挥发；

5、将96孔微孔板放入串联质谱系统自动进样器中，启动应用软件，建立样品列表，选择正确的采集方法，以检测血清中维生素A、维生素E、维生素D2和维生素D3的含量。

其中，标准溶液与标本血清的前处理方法相同。

(2)结果计算

通过比较分析物和内标的离子强度来进行计算，给出各维生素的浓度并生成数据报告。

测试过程中，标准品用完之后应立即放入-20℃冰箱保存，同时，如果试剂已经从试剂瓶倒出，则不能再次使用。

二、主要试剂

本实施例用到的试剂包括标准内标液，流动相和探针洗液，本实施例中的具体试剂配方为：

(1)标准混合溶液：

该部分分为两个步骤，具体如下：

1、标准工作液的配制：使用甲醇进行配制；

2、标准混合液的配制：标准工作液按一定比例混合，使用空白血清基质溶液稀释定容得到六个标准浓度梯度的校正点ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。

(2)内标液：选用美国sigma和加拿大TRC公司提供的各维生素的同位素标记物及浓度，采用乙腈做溶剂，如下表所示：

名称	浓度ng/mL
		维生素A内标	200
维生素E内标	200
		维生素D2内标	200
维生素D3内标	100

质谱条件：

根据配方，在串联质谱仪器waters TQ-S上设置参考用质谱条件：

定量离子对：

项目	母离子	子离子
			维生素A	251.3	75.1
维生素E	386.4	92.1
			维生素D2	395.2	269.3
维生素D3	383.3	365.3

定性离子对：

项目	母离子	子离子
			维生素A	269.3	75.1
维生素E	386.4	55.1
			维生素D2	395.2	337.2
维生素D3	383.3	159.1

如图1-4分别为本发明实施例1的维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3和E的色谱图。

计算可知，在本发明实施例1中，待测血清样本中，维生素A的含量为0.42μg/mL；维生素25(OH)D2的含量为12.86ng/mL；维生素25(OH)D3的含量为13.75ng/mL；维生素E的含量为8.74μg/mL。

本发明实施例的方法通过电喷雾法将维生素分子软电离，形成多种不同质荷比的离子对，通过与已知浓度的维生素内标参比，算出待测维生素浓度，一次进样，同时检测血清中多种脂溶性维生素的含量，对于定性和定量分析来说，采用本发明的方法和试剂盒检测，具有更高的精密度和准确度；本发明实施例的试剂盒的内标液可以同时达到加入参比和去蛋白的作用，能够节省操作步骤。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于，采用LC-MS法进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多种脂溶性维生素为维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3或E中的任意两种或两种以上。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液为血清。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述LC-MS法的条件为：

质谱条件：电喷雾法将维生素分子软电离。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述LC-MS法中，

色谱条件如下：

色谱柱：Shim-pack GIST C18 2.1*50mm，3μm，柱温：40℃；洗脱液A：甲醇溶液，洗脱液B：2mmol/L乙酸铵、0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱条件：0-3.5min，70％A，3.5-5min，100％A，5-5.1min，100％A，5.1-6min，70％A，流速0.40mL/min，进样量10μL；

质谱条件：

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，具体步骤包括：

S2、标准工作液的配制：使用甲醇进行配制；

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述萃取剂为正己烷。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述稀释剂为70％v/v的甲醇水溶液。

9.一种同时检测血液中多种脂溶性维生素的试剂盒，其特征在于，包括：具有不同浓度梯度的混合标准品溶液，无水乙醇，正己烷，70％甲醇水溶液，甲醇，2mmol/L乙酸铵、0.1％甲酸水溶液，质控。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述多种脂溶性维生素为维生素A、25(OH)D2、25(OH)D3和E。