CN108020625A - 血浆中花生四烯酸乙醇胺和2-花生四烯甘油含量的检测方法及先兆流产诊断试剂盒 - Google Patents

血浆中花生四烯酸乙醇胺和2-花生四烯甘油含量的检测方法及先兆流产诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种超高效液相色谱‑串联质谱法检测血浆中花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2‑花生四烯甘油(2‑AG)含量的方法及先兆流产诊断试剂盒。将新鲜全血置于EDTA采血管保存，离心取上部血浆；向血浆中加入内标，用硫酸锌的甲醇溶液处理，而后用乙酸乙酯和异丙醇萃取，用流动相重新分散溶解，得到待上样检测样品；对待上样检测样品利用超高效液相色谱‑串联质谱发进行分析，得到血浆样品中AEA和2‑AG的含量。本发明通过对先兆流产患者和正常孕妇血浆中AEA和2‑AG含量的变化进行检测，为先兆流产的诊治以及后期的营养学支持提供重要参考。

Description

血浆中花生四烯酸乙醇胺和2-花生四烯甘油含量的检测方法 及先兆流产诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地涉及血浆中花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)含量的检测方法及先兆流产诊断试剂盒。
背景技术
先兆流产(Threatened abortion)是指妇女妊娠28周以前出现以阴道少量出血，伴小腹疼痛或腰酸胀痛，无妊娠物排出等为主要临床表现的疾病。发生率约占20％，多数为早期流产。先兆流产群体的流产率是正常群体的2.6倍，17％的患者在怀孕后期会产生并发症。先兆流产的发病原因较多，如环境、饮食、情绪等因素以及免疫、内分泌功能异常、生殖器官异常等均会对孕妇的妊娠过程产生影响，从而导致其发生流产。先兆流产对妊娠妇女的健康产生很大的威胁，因此对于先兆流产进行早期筛查和干预十分必要。
目前，先兆流产筛查方法主要是孕酮、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)或雌二醇检测。然而，单独孕酮诊断早期先兆流产的灵敏度、阴性结果预期值、正确诊断率较低，分别为51.1％、65.55％、61.10％；β-HCG随孕周变化波动范围较大，需要连续测定两次或两次以上动态观察β-HCG浓度上升的幅度，况且妊娠早期常无法鉴别β-HCG波动幅度；雌二醇也是妊娠初期分泌的主要激素之一，但其诊断灵敏度和特异度较低，分别为62.7％、21.7％。目前，先兆流产检测项目少，而且要联合B超、孕酮、人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)或雌二醇多种检测技术才能确诊，因此仍需开发新的诊断方法，以提高先兆流产诊断的灵敏度和准确度。
秉承早发现早治疗的原则，及早提示先兆流产风险，对于改善孕妇妊娠健康至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种2-花生四烯甘油(2-AG)或2-花生四烯甘油(2-AG)联合花生四烯酸乙醇胺(AEA)或其检测试剂的用途。
本发明的又一目的在于提供一种非诊断性检测花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)含量的方法。
本发明的又一目的在于提供一种先兆流产诊断试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了2-花生四烯甘油(2-AG)或2-花生四烯甘油(2-AG)联合花生四烯酸乙醇胺(AEA)或其检测试剂的用途，用于制备诊断先兆流产的试剂盒。
在另一优选例中，所述的判断包括预先判断。
在另一优选例中，所述检测试剂盒的检测样本包括血液或组织。
在另一优选例中，所述的组织包括绒毛组织或蜕膜组织。
在另一优选例中，所述的检测试剂包括：甲醇、乙腈、乙酸乙酯、异丙醇、硫酸钠、乙酸铵、甲酸铵、AEA-d8和2-AG-d5。
在本发明的第二方面，提供了一种非诊断性检测花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)含量的方法，包括步骤：
(1)提供一样品，所述样品包括来自于孕妇外周血的血液样品；
(2)对步骤(1)中的样品进行提取前处理，得到待上机检测样品；
(3)对步骤(2)中待上机检测样品采用超高效液相色谱-串联质谱法进行分析，从而获得所述待分析样品中花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)含量。
在另一优选例中，所述血液样品选自下组：血液、血浆、血清或其组合。
在另一优选例中，所述血液样品是经预处理的血液样品。
在另一优选例中，所述血液样品是经离心后的血浆。
在另一优选例中，所述预处理包括步骤：对全血进行分离，得到血浆样本。
在另一优选例中，所述血浆样本由EDTA采血管或肝素钠采血管收集后离心分离。
在另一优选例中，所述提取前处理包括步骤：
(a)向血浆加入第一萃取液和10～100ul的内源性大麻素同位素内标，均质后
离心，离心后得到体积为V1的上清液1；
(b)将离心得到的上清液1经氮气吹至体积V2，后用第二萃取剂于室温萃取，然后离心取上清液2并氮气吹干，用复溶剂重新分散，得到待上机检测样品。
在另一优选例中，所述第一萃取剂为含有的0.98～1.98M(w/v)硫酸钠的冰甲醇溶液。
在另一优选例中，所述冰甲醇是指-80℃预冷30min的甲醇(色谱级)。
在另一优选例中，所述全血的体积为0.98-4.98ml，较佳地为2～5ml。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，V1为49.8-999.8ul，较佳地为50～800ul。
在另一优选例中，所述的同位素内标是指含有AEA-d8和2-AG-d5的甲醇溶液，乙腈，49.9％～98.8％甲醇水溶液或49.9％～98.8％乙腈水溶液。
在另一优选例中，所述V2为9.9-299.8ul，较佳地为50～200ul。
在另一优选例中，所述复溶剂的体积为49.5-299.8ul，较佳地为100～200ul。
在另一优选例中，所述涡旋时间t为4.9-79.8s，较佳地为20～60s。
在另一优选例中，所述步骤(a)中，血浆为将全血在EDTA采血管中离心分离。
在另一优选例中，所述检测为超高效液相色谱-串联质谱法检测。
在另一优选例中，所述第二萃取剂选自下组：乙酸乙酯和异丙醇混合溶液，乙酸乙酯，二甲苯，甲苯，氯仿，甲醇和氯仿或其组合。
在另一优选例中，所述乙酸乙酯和异丙醇混合溶液中乙酸乙酯和异丙醇体积比为(6.5～9.0):(1.0～3.5)。
在另一优选例中，所述的超高效液相色谱的工作条件包括：流动相A是乙酸铵水溶液，流动相B是乙酸铵甲醇水溶液，流动相采用梯度流速，初始流速为0.09-0.59ml/min，较佳地为0.32～0.46ml/min；进样量为为1.9-9.9μl，较佳地为3～8μl。
在另一优选例中，所述乙酸铵水溶液的浓度为0.9-9.9mM，较佳地为2.4～3.8mM。
在另一优选例中，所述乙酸铵甲醇水溶液的浓度为0.9-9.9mM，较佳地为1.2～2.6mM。
在另一优选例中，所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(5.0～9.9):(0.1～5.0)，较佳地为(7.5～9.5):(0.5～2.5)。
在另一优选例中，所述的超高效液相色谱的工作条件包括：流动相A是2.4～3.8mM乙酸铵水溶液，流动相B是1.2～2.6mM乙酸铵甲醇水溶液，所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(7.5～9.5):(0.5～2.5)；流动相采用梯度流速，且初始流速为0.32～0.46ml/min；进样量为3～8μl。
所述的质谱工作条件包括：离子源温度为140～180℃；毛细管电压为3.0～3.5kV；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气量：800L/h；锥孔反吹气量:50L/h；锥孔电压:25V；分析模式为MRM模式，目标物AEA母离子为348.2958m/z，子离子为61.9417m/z,目标物2-AG母离子为379.2958m/z，子离子为287.2116m/z。
在本发明的第三方面，提供了一种先兆流产诊断试剂盒，该试剂盒包括：
(i)用于提取血浆中花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)的试剂；
(ii)用于制备超高效液相色谱-串联质谱法所需预处理试剂和流动相试剂；以及，
(iii)标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断先兆流产。
在另一优选例中，所述用于提取血浆的试剂选自下组：硫酸钠和甲醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮或其组合。
在另一优选例中，所述预处理试剂包括花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)的同位素内标以及萃取剂。
在另一优选例中，所述萃取剂选自：乙酸乙酯和异丙醇，乙酸乙酯，二甲苯，甲苯，氯仿或其组合。
在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：
当检测对象的血浆2-花生四烯甘油(2-AG)处于9.9～53.02nM，则表明该对象发生先兆流产的几率大于正常人群；和/或
当检测对象的血浆2-花生四烯甘油(2-AG)处于9.9～53.02nM，且血浆花生四烯酸乙醇胺(AEA)处于1.29～19.9nM，则表明该对象发生先兆流产的几率大于正常人群。
在另一优选例中，所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A选自：2.4～3.8mM乙酸铵水溶液，0.1～0.5％甲酸水溶液，1～5mM甲酸铵水溶液，超纯水；所述流动相B选自：1.2～2.6mM乙酸铵甲醇水溶液，0.1～0.5％甲酸甲醇溶液，1～5mM甲酸铵甲醇溶液，纯甲醇溶液。
在另一优选例中，所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(4.9～9.9):(0.1～5.1)，较佳地为(7.5～9.5):(0.5～2.5)。
在另一优选例中，所述该试剂盒包括用于提取血浆中AEA和2-AG的试剂以及用于制备超高效液相色谱-串联质谱法所需预处理试剂和流动相试剂，所述用于提取组织液的试剂包括硫酸钠以及甲醇，所述预处理试剂包括AEA和2-AG同位素内标以及萃取剂乙酸乙酯和异丙醇。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1超高效液相色谱串联质谱法检测AEA和2-AG色谱图。
图2健康组和先兆流产组孕妇血浆中AEA和2-AG的含量(nM)。
图3血浆中AEA和2-AG在先兆流产孕妇血浆以及健康孕妇的ROC曲线图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过检测先兆流产组血浆和健康组血浆中的2-AG或2-AG和AEA含量水平，首次意外地发现，先兆流产组血浆中2-AG或2-AG和AEA含量高于健康组。因此，利用血浆中2-AG或2-AG和AEA含量与先兆流产发生和发展程度的相关性，血浆2-AG或2-AG和AEA可以作为检测先兆流产的标志物。在此基础上完成了本发明。
术语
花生四烯酸乙醇胺(AEA)和花生四烯酸甘油(2-AG)
花生四烯酸乙醇胺(AEA)和花生四烯酸甘油(2-AG)是一类由酰胺、酯类和长链不饱和脂肪酸组成的内源性大麻素类物质。内源性大麻素信号通路传导系统与先兆流产关系密切，内源性大麻素具有胚胎毒性并导致子宫容受性变差，抑制胎生长，从而引发先兆流产。若孕妇患有代谢疾病如肥胖症、胰岛素抵抗症，或者羊水感染，导致AEA和2-AG含量增高，由此可能抑制胎生长导致流产发生。此外，在胎儿大脑发育过程中，附着在Robo受体上的Slit可以调节神经轴突的方向控制，从而引导胎儿大脑回路的形成。内源性大麻素通过受体CB1和CB2调节神经细胞及少突胶质细胞中Slit和Robo的含量。一旦人体的内源性大麻素含量激增，Slit和Robo就会随之大量增多，导致轴突方向控制的改变并影响胎儿大脑回路的形成。因此，通过检测孕妇血浆中AEA和2-AG含量，有助于对早期先兆流产患者进行早期确诊和发病风险评估以及预后效果评估。
目前，AEA和2-AG检测方法包括酶联免疫法、GC-MS法、LC-MS法、LC-MS/MS法。GC-MS法通常将AEA和2-AG衍生为易挥发的甲酯类物质，经过GC分离，而后进行质谱检测。但在衍生过程中的水解、氧化或者异构化等极易造成检测结果不准。
花生四烯酸乙醇胺(AEA)和花生四烯酸甘油(2-AG)含量的检测方法
本发明提供了一种非诊断性检测花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)含量的方法，它包括：(a)提供样品；(b)样本上机检测前处理；(c)超高效液相色谱-串联质谱检测，从而获得所述血浆中花生四烯酸乙醇胺(AEA)和花生四烯酸甘油(2-AG)含量的测定结果。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述检测花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)含量的方法，包括以下步骤：
1)将200～800ul血浆用含有的0.98～1.98M(w/v)硫酸钠的冰甲醇斡旋后；
2)向100～800ul上清液中加入10～100ul的AEA和2-AG同位素内标，涡旋20～60s后离心，将离心得到的上清液经氮气吹至50～200ul，后用2～4倍体积的乙酸乙酯和异丙醇混合溶液于室温萃取，其中乙酸乙酯和异丙醇混合溶液体积比为(6.5～9.0):(1.0～3.5)，离心取上清后氮气吹干，用100～200ul流动相重新分散，得到待上机检测样品；
3)对待上机检测样品采用超高效液相色谱-串联质谱法进行分析，得到血浆样本中AEA和2-AG含量。
一个典型的本发明方法包括：
(1)样本前处理：将2～5ml全血在EDTA采血管中离心分离出血浆，将离心得到的200～500ul血浆用含有的0.98～1.98M(w/v)硫酸钠的冰甲醇涡旋后离心，取离心得到的上清液；
萃取：向100～800ul上清液中加入10～100ul的AEA和2-AG同位素内标，涡旋20～60s后离心，将离心得到的上清液经氮气吹至50～200ul，后用2～4倍体积乙酸乙酯和异丙醇混合溶液(乙酸乙酯和异丙醇体积比为(6.5～9.0):(1.0～3.5))于室温萃取，然后离心取上清并氮气吹干；
复溶：用100～200ul复溶剂重新分散，涡旋20～60s后，得到液体样品，待上机检测。
(2)超高效液相色谱-串联质谱法检测，其中采用的是多反应检测MRM扫描方式。
所述色谱条件如下：
流动相A为2.4～3.8mM乙酸铵水溶液，流动相B为1.2～2.6mM乙酸铵甲醇水溶液，所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(7.5～9.5):(0.5～2.5)；柱温45℃；检测时间为3.5min；初始流速为0.32～0.46ml/min；进样量为3～8ul。
采用梯度洗脱方式，梯度洗脱参数见表1；
表1为超高效液相色谱梯度洗脱参数
时间(min) 流速(mL/min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0.00 0.36 30.0 70.0
0.50 0.36 12.0 88.0
2.50 0.36 12.0 88.0
3.50 0.36 34.0 66.0
如图1所示，AEA的保留时间为1.56min；2-AG的保留时间为1.68min；
所述多反应检测MRM质谱参数见表2，
表2为串联质谱参数
化合物名称 驻留时间(s) 锥孔能量(V) 碰撞能量(V)
AEA 0.025 28 16
AEA-d8 0.163 30 14
2-AG 0.025 28 14
2-AG-d5 0.163 32 14
所述内标为AEA-d8和2-AG-d5。
所述质谱条件还包括正离子模式下，采用ESI源，检测离子对m/z分别是：AEA为348.2958→61.9417、AEA-d8为356.3381→62.7901、2-AG为379.2958→287.2116、2-AG-d5为384.3381→287.1902，锥孔电压为3.0KV、脱溶剂气温度为500℃、脱溶剂气量为800L/h、锥孔反吹气量为50L/h、锥孔电压为25V。所述内标浓度为50ng/ml。所述样本前处理中萃取剂为乙酸乙酯和异丙醇体积比为(6.5～9.0):(1.0～3.5)。所属涡旋混匀器的转速为3000rpm。所述血浆样本包括血浆标准曲线样本、质控血浆样本和需要检测的血浆样本。所述血浆标准曲线样本的制备：取5ml处理过的血浆分别与1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、50ng、100ng、500ng的AEA和2-AG混合干粉涡旋混匀，即得0.2～100ng/ml的血浆标准曲线样本。所述质控血浆样本的制备：取5ml处理过的血浆分别与3ng、50ng、300ng的AEA和2-AG混合干粉涡旋混匀，即得0.6ng/ml(Q1)、10ng/ml(Q2)、60ng/ml(Q3)的血浆质控样本。所述处理过的血浆将全血离心，取上层血浆，将活性炭加入后吸附3次，与生理盐水1:1混匀即得。
先兆流产诊断试剂盒
本发明还提供了一种先兆流产诊断试剂盒。通常，本发明试剂盒包括：
(i)用于提取血浆中花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)的试剂；
(ii)用于制备超高效液相色谱-串联质谱法所需预处理试剂和流动相试剂；以及，
(iii)标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断先兆流产。
一个典型的本发明先兆流产诊断试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：
(1)流动相：
流动相A：是0.1～0.5％(w/v)乙酸铵水溶液；
流动相B：是0.1～0.5％(w/v)乙酸铵甲醇水溶液，所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(7.5～9.5):(0.5～2.5)；
(2)血浆标准曲线样品：含AEA和2-AG的血浆标准样本，浓度为0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0ng/ml；
(3)内标溶液：含有50ng/ml的AEA-d8和2-AG-d5甲醇溶液；
(4)萃取剂1：含有的0.98～1.98M(w/v)硫酸钠的甲醇溶液；
(5)萃取剂2：乙酸乙酯和异丙醇混合溶液(乙酸乙酯和异丙醇体积比为(6.5～9.0):(1.0～3.5)；
(6)复溶剂：0.1～0.5％(w/v)乙酸铵甲醇水溶液，所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(7.5～9.5):(0.5～2.5)；
(7)质控血浆样品：含AEA和2-AG的血浆样品，浓度为0.6ng/ml(Q1)、10ng/ml(Q2)、60ng/ml(Q3)。
流动相A是2.4～3.8mM乙酸铵水溶液，流动相B是1.2～2.6mM乙酸铵甲醇水溶液。
所述试剂盒的组分见表3：
本发明的主要优点包括：
1)UPLC液相分离能力更强，样品前处理简单，无需衍生化；仪器连续可操作时间长；检测速度快，通量大；专属性强、灵敏度高、精密度和准确度高；
2)UPLC-MS/MS分析对血浆样本中的AEA和2-AG含量进行快速、准确、可靠的检测，分析样品前处理简单有效，可用于血浆样本的AEA和2-AG含量分析；
3)本发明方法为比较疑似先兆流产患者血浆和先兆流产患者血浆的内源性大麻素含量差异提供便利的途径，为先兆流产的诊治以及预后效果评估提供重要依据；
4)本发明所述试剂盒，可以用于对疑似先兆流产患者血浆样本AEA和2-AG含量变化，从而达到快速、准确、可靠诊断先兆流产的目的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
1、血浆基质制备
将全血离心，取上层血浆，将活性炭加入后吸附3次，与生理盐水1:1混匀即得。
血浆标准曲线样品及质控血浆样本(QC血浆)的制备
所述血浆标准曲线样品的制备：取5ml处理过的血浆分别与1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、50ng、100ng的AEA和2-AG混合干粉涡旋混匀，即得0.2～20ng/ml的血浆标准曲线样本。
所述质控血浆样本的制备：取5ml处理过的血浆分别与3ng、50ng、300ng的AEA和2-AG混合干粉涡旋混匀，即得0.6ng/ml(Q1)、10ng/ml(Q2)、60ng/ml(Q3)的血浆质控样本。
2、样本前处理
样本前处理：将2～5ml全血在EDTA采血管中离心分离出血浆，将离心得到的200～500ul血浆用含有的0.98～1.98M(w/v)硫酸钠的冰甲醇涡旋后离心，取离心得到的上清液；
萃取：向100～800ul上清液中加入内源性大麻素同位素内标，涡旋20～60s后离心，将离心得到的上清液经氮气吹至50～200ul，后用2～4倍体积乙酸乙酯和异丙醇混合溶液(乙酸乙酯和异丙醇体积比为(6.5～9.0):(1.0～3.5))于室温萃取，然后离心取上清并氮气吹干；
复溶：用100～200ul流动相B重新分散，涡旋20～60s后，得到液体样品，待上机检测。
3、色谱条件
所述的超高效液相色谱的工作条件包括：流动相A是2.4～3.8mM乙酸铵水溶液，流动相B是1.2～2.6mM乙酸铵甲醇水溶液，所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(7.5～9.5):(0.5～2.5)；流动相采用梯度流速，且初始流速为0.32～0.46ml/min；进样量为3～8ul。
4、质谱条件
所述的质谱工作条件包括：离子源温度为140～180℃；毛细管电压为3.0～3.5kV；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气量：800L/h；锥孔反吹气量:50L/h；锥孔电压:25V；分析模式为MRM模式，目标物AEA母离子为348.2958m/z，子离子为61.9417m/z,目标物2-AG母离子为379.2958m/z，子离子为287.2116m/z。
5、数据处理：
由Masslynx软件对数据进行分析计算，采用内标标准曲线法，根据代谢物与相应内标丰度比值代入标准曲线中进行计算，得出样品中AEA和2-AG的浓度。
6、检验方法验证：
方法学验证样本：采用美国Cambridge Isotope Labs公司提供的加入已知浓度标准品的样品进行检测，包括四个浓度等级，分别为：基质、低加标浓度、中加标浓度、高加标浓度。
方法准确性测定结果：所测得结果均在检测结果95％可信区间内。
方法精确性测定：采用在1天内1次测定5个样本，计算这5个样本中AEA和2-AG的变异系数作为批内变异：每天一次测定5个样本，连续5天，计算这5天AEA和2-AG的变异系数作为批间变异，用变异系数(CV)表示精确性，CV(％)＝100*均值/标准差，结果显示变异系数均小于5％。
提取回收率：不同浓度水平的回收率在95.8％～98.2％范围内，总回收率为97.2％。
如图1，通过UPLC-MS/MS的方法快速对先兆流产患者血浆样本进行AEA和2-AG检测，比传统的高效液相色谱法、气相色谱法简便快捷，检测限更低，分析时间更短。
如图2所示，经检测，先兆流产患者血浆中AEA和2-AG含量显著升高。
本发明首先对先兆流产患者和健康孕妇血浆中AEA和2-AG含量进行检测，而后对数据进行t检验分析，发现先兆流产患者血浆中AEA和2-AG显著高于健康孕妇血浆中AEA和2-AG水平。因此，推测AEA和2-AG与先兆流产的发生和发展密切相关，提示AEA和2-AG可能是先兆流产代谢中的重要生物标志物。
实施例2：
本发明通过监测331例8～28周孕妇血浆中AEA和2-AG含量，其中先兆流产患者35例，健康孕妇295例。先兆流产患者组血浆中AEA和2-AG含量分别为3.23±2.55nM、26.19±18.43nM显著高于健康组孕妇(AEA和2-AG含量分别为1.07±0.78nM、11.60±11.42nM)(P＜0.01)(图2)。经ROC曲线下面积的检验，AEA检验、2-AG检验和AEA+2-AG联合检验曲线下面积分别为0.812、0.675、0.870，P值均小于0.01(图3和表4)，有统计学意义，说明AEA检验和AEA+2-AG联合检验对先兆流产的诊断均有意义。而AEA+2-AG联合检验的曲线下面积大于AEA单独检验，说明AEA+2-AG联合检验的诊断效能优于AEA单独检验。虽然AEA单纯检测特异度达到93.6％，但是其敏感度只有65.7％；2-AG单纯检测特异度达到86.8％，但是其敏感度只有57.1％。AEA+2-AG联合检验则能够将敏感度提升到85.7％,特异度依然保持较高水平，AEA+2-AG联合诊断点P＝0.06。本发明首次发现了AEA和2-AG联合诊断对先兆流产的预测作用。
表4 AEA和2-AG联合检验在先兆流产孕妇血浆以及健康孕妇血浆的ROC结果分析
a.在非参数式假设下
b.空值假设：true 区域＝0.5
通过以上质谱检测方法以AEA和2-AG作为先兆流产患者的生物标记物，实现在医院中检测呢，首先将取来的血浆样本进行UPLC-MS/MS快速检测，以确定活检组织中AEA和2-AG的含量。通过对先兆流产患者的血浆组织中AEA和2-AG含量变化进行检测，为先兆流产的诊治以及后期营养学支持提供重要参考。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.2-花生四烯甘油(2-AG)或2-花生四烯甘油(2-AG)联合花生四烯酸乙醇胺(AEA)或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备诊断先兆流产的试剂盒。
2.一种非诊断性检测花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)含量的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提供一样品，所述样品包括来自于孕妇外周血的血液样品；
(2)对步骤(1)中的样品进行提取前处理，得到待上机检测样品；
(3)对步骤(2)中待上机检测样品采用超高效液相色谱-串联质谱法进行分析，从而获得所述待分析样品中花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)含量。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取前处理包括步骤：
(a)向血浆加入第一萃取液和10～100ul的内源性大麻素同位素内标，均质后离心，离心后得到体积为V1的上清液1；
(b)将离心得到的上清液1经氮气吹至体积V2，后用第二萃取剂于室温萃取，然后离心取上清液2并氮气吹干，用复溶剂重新分散，得到待上机检测样品。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述检测为超高效液相色谱-串联质谱法检测。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述第二萃取剂选自下组：乙酸乙酯和异丙醇混合溶液，乙酸乙酯，二甲苯，甲苯，氯仿，甲醇和氯仿或其组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述乙酸乙酯和异丙醇混合溶液中乙酸乙酯和异丙醇体积比为(6.5～9.0):(1.0～3.5)。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的超高效液相色谱的工作条件包括：流动相A是乙酸铵水溶液，流动相B是乙酸铵甲醇水溶液，流动相采用梯度流速，初始流速为0.09-0.59ml/min，较佳地为0.32～0.46ml/min；进样量为为1.9-9.9μl，较佳地为3～8μl。
8.一种先兆流产诊断试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：
(i)用于提取血浆中花生四烯酸乙醇胺(AEA)和2-花生四烯甘油(2-AG)的试剂；
(ii)用于制备超高效液相色谱-串联质谱法所需预处理试剂和流动相试剂；以及，
(iii)标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断先兆流产。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A选自：2.4～3.8mM乙酸铵水溶液，0.1～0.5％甲酸水溶液，1～5mM甲酸铵水溶液，超纯水；所述流动相B选自：1.2～2.6mM乙酸铵甲醇水溶液，0.1～0.5％甲酸甲醇溶液，1～5mM甲酸铵甲醇溶液，纯甲醇溶液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述的甲醇水溶液中甲醇与水的体积比为(4.9～9.9):(0.1～5.1)，较佳地为(7.5～9.5):(0.5～2.5)。
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