CN110531008B - 一种检测尿液中氧化三甲胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种检测尿液中氧化三甲胺浓度的方法。更具体地说，本发明提出了以同位素内标为校准品，以尿液中肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度差异，结合UPLC‑MS/MS技术检测尿液中TMAO浓度的方法。本发明提供的方法能够在检测尿液中氧化三甲胺浓度的同时检测肌酐浓度，由此可以归一化TMAO浓度，使得尿液中的TMAO能够作为生物标记物来预测并筛查未来心脏病发作、卒中和死亡的风险。本发明快速、灵敏、准确，可满足将TMAO用于无创心血管风险评估检测的要求，具有广阔的应用前景。

Description

一种检测尿液中氧化三甲胺的方法

技术领域

本发明涉及分析化学和医学检测领域，具体地，本发明涉及一种基于高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)的快速检测尿液中氧化三甲胺(Trimethylamine-N-oxide，TMAO)的方法。

背景技术

心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。研究表明，心脑血管疾病的致病机制可能在于血液的病变，其对人体的损害是隐秘的、逐渐的和全身性的，且早期很难发现明显的临床症状。寻找合理、有效的生物标志物来诊断、分级和指导心脑血管疾病的治疗一直是临床检验诊断学科一个重点关注的内容。

目前已有一系列较为成熟、临床普遍开展的生物标志物检测，为心脑血管疾病的诊断与治疗提供了重要的参考依据。除了现有医院的诊断指标，新的科研成果展示，动脉硬化患者与正常人群肠道的菌属差异，提示肠道菌群可能改变一些物质的代谢产物，进而影响动脉硬化。最明显的氧化三甲胺(TMAO)是食物中胆碱的代谢产物，胆碱被肠道内细菌消化后，可以代谢出一种气体，即三甲胺。三甲胺再在肝脏中经黄素加氧酶代谢成TMAO，随之进入血循环。TMAO可用于胆固醇代谢、胰岛素抵抗、促进血小板高聚集、增加血栓形成、促进血管炎症反应及直接导致动脉斑块形成等方面，可能导致动脉粥样硬化、心力衰竭、高血压病、卒中等不良心血管事件发生。研究表明TMAO水平增高与主要心脑血管偶发不良事件危险增加相关，TMAO可在通过传统危险因素和血液检测无法识别的人群中作为预测将来心脏病发作、卒中和死亡风险的一种准确筛查工具。

UPLC-MS/MS的出现给快速精准检测尿液中代谢小分子提供了机遇。目前有关UPLC-MS/MS检测TMAO的国内外研究集中在血液中TMAO及其相关代谢物的检测。人体尿液中的TMAO浓度受个体以及个体环境影响较大，例如人体代谢速度、尿液浓度等因素。

针对上述情况，本领域中需要一种快速精准检测尿液中TMAO的方法，使得尿液中的TMAO能够作为生物标记物来无创预测并筛查未来心脏病发作、卒中和死亡风险。

发明内容

本发明提出了一种检测尿液中TMAO浓度的方法。更具体地说，本发明提出了一种尿液沉淀法结合UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中TMAO浓度的方法。

本发明检测尿液中TMAO浓度的方法以同位素内标为校准品，用尿液中肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，使用UPLC-MS/MS来检测尿液中的TMAO浓度。

在一方面，本发明提供了一种检测尿液中TMAO浓度的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1，配制样品：

1a.配制多个标品溶液，每个所述标品溶液包含一个浓度的TMAO标品和一个浓度的肌酐标品；多个所述标品溶液包含多个浓度的TMAO标品和多个浓度的肌酐标品；

1b.配制同位素内标溶液，所述同位素内标溶液包含TMAO的同位素内标和肌酐的同位素内标；

步骤2，样品预处理，得到含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样，其中，所述样品预处理包括对尿液进行去除蛋白的步骤和向尿液和标品溶液中加入的同位素内标溶液的步骤；

步骤3，构建标准曲线，其中将步骤2的含同位素内标溶液的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；

步骤4，获得经肌酐浓度归一化的TMAO浓度，其中将步骤2的所述含同位素内标溶液的尿样进行UPLC-MS/MS分析，结合步骤3得到的标准曲线获得TMAO浓度和肌酐浓度；获得经肌酐浓度归一化的TMAO浓度。

在一个实施方案中，所述尿液是新鲜的尿液。

在又一个实施方案中，所述尿液是经长期低温冻存的。优选地，在所述低温冻存的尿液中含有叠氮化钠，以防止尿液在低温运输或保存中滋生细菌或发生氧化从而改变TMAO的浓度。优选地，加入叠氮化钠的量为尿液体积的0.05％至5％，优选为0.1％至2.5％，更优选为1％。

在又一个实施方案中，所述尿液来自干尿液样品。可选地，所述干尿液样品经溶剂溶解后。

在一个实施方案中，步骤1a中配制的每个所述标品溶液中包含一个浓度的TMAO标品和一个浓度的肌酐标品，其中TMAO标品和肌酐标品的浓度可以是相同或不同的。优选地，多个标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个。优选地，TMAO标品的浓度可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；肌酐标品的浓度可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个。

在又一个实施方案中，步骤1a中标品溶液的溶剂选自甲醇、甲酸、乙酸或其混合物的水溶液。

在一个实施方案中，步骤1b中配制的同位素内标溶液中的TMAO的同位素内标的浓度和肌酐的同位素内标的浓度可以是相同或不同的，条件是TMAO的同位素内标的浓度落入所配制的标品溶液中TMAO标品的浓度范围，并且肌酐的同位素内标的浓度落入配制的所述标品溶液中肌酐标品的浓度范围。

在一个实施方案中，在步骤1b中的TMAO的同位素内标可以选自TMAO的氘代化合物，例如TMAO的一氘代化合物、二氘代化合物、三氘代化合物、四氘代化合物、五氘代化合物、六氘代化合物、七氘代化合物、八氘代化合物或九氘代化合物，优选为九氘代化合物(TMAO-d9)。肌酐的同位素内标可以选自肌酐的氘代化合物，例如肌酐的一氘代化合物、二氘代化合物、或三氘代化合物，优选为三氘代化合物(肌酐-d3)。

在又一个实施方案中，在步骤1b中，所述同位素内标溶液的溶剂选自甲醇、甲酸、乙酸或其混合物的水溶液。

在一个实施方案中，标品溶液的溶剂和同位素内标溶液的溶剂是相同的。在又一个实施方案中，标品溶液的溶剂和同位素内标溶液的溶剂是不同的。

在一个优选实施方案中，样品预处理的步骤包括：首先对尿液进行去除蛋白的步骤，得到尿样；然后向多个标品溶液和尿样中分别加入相同量的同位素内标溶液，分别得到含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样。

在又一个优选实施方案中，样品预处理的步骤包括：首先向尿液和多个标品溶液中分别加入相同量的同位素内标溶液，分别得到含同位素内标的尿液和含同位素内标的标品溶液；然后对含同位素内标的尿液进行去除蛋白的步骤，以得到含同位素内标的尿样。

在一个实施方案中，去除蛋白的步骤采用了有机溶剂沉淀法，即在尿液中加入合适的有机溶剂来沉淀蛋白，然后通过离心加过滤的方式加以去除。优选地，该沉淀缓冲液是1ml/L甲酸的乙腈溶液。

在一个优选实施方案中，所述沉淀包括在低温下沉淀，例如在-15度至-30度、优选在-20度沉淀约20分钟至数小时、优选为20分钟至1小时、更优选为30分钟。在另一个优选实施方案中，所述沉淀包括在加入沉淀缓冲液之后，采用合适的装备如漩涡混合器vortex剧烈震荡混匀一段时间，如10秒至1分钟、优选20秒至45秒、更优选30秒，然后放置在-20度下沉淀约20分钟至数小时、优选为20分钟至1小时、更优选为30分钟。

在一个实施方案中，所述滤除包括先高速离心，再经0.22μm滤膜过滤所述上清液。

在一个实施方案中，在步骤2中，尿样或标品溶液与同位素内标溶液可以是适合后续UPLC-MS/MS分析的任意重量比，例如为100:1至1:1，优选为50:1至5:1，更优选为20:1、15:1、10:1或5:1。

在一个实施方案中，为了使含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样中的同位素内标的浓度相同，在进行UPLC-MS/MS检测之前，含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样经过另外的稀释。稀释所用的试剂是步骤2中使用的沉淀缓冲液，或者是标品溶液或尿样各自使用的溶剂。

在一个实施方案中，得到的含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样的浓度可以是适合后续UPLC-MS/MS分析并且能够构建浓度标准曲线的任意浓度，例如ng/mL级别或μg/mL级别。

在优选的实施方案中，在步骤3中，由含有不同浓度的TMAO和肌酐的多个标品溶液分别构建的TMAO的浓度标准曲线和肌酐的浓度标准曲线，通过拟合能够分别得到线性回归方程，其中浓度标准曲线的纵坐标是标品溶液中的被测组分——TMAO与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比或肌酐与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比，横坐标是TMAO或肌酐的浓度，以ng/mL计。

在优选的实施方案中，在步骤4中，采用标准曲线法，分别将TMAO的离子响应度和肌酐的离子响应度代入步骤3的线性回归方程，分别计算得出TMAO和肌酐各自在尿液中的浓度，然后用TMAO的浓度除以肌酐的浓度，计算出在统一肌酐浓度的情况下TMAO的真实定量。

在另一方面，本发明提供了一种尿液沉淀法结合UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中TMAO浓度的系统，包括：

样品配制模块，所述模块用于配制多个标品溶液，每个所述标品溶液包含一个浓度的TMAO标品和一个浓度的肌酐标品；配制同位素内标溶液，所述同位素内标溶液包含TMAO的同位素内标和肌酐的同位素内标；配制同位素内标溶液，所述同位素内标溶液包含TMAO的同位素内标和肌酐的同位素内标；

样品预处理模块，对样品进行预处理，得到含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样，其中，所述样品预处理包括对尿液进行去除蛋白的步骤和向尿液和标品溶液中加入的同位素内标溶液的步骤；

数据测定模块，将所述含同位素内标溶液的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；将所述含同位素内标溶液的尿样进行UPLC-MS/MS测定；

计算模块，用含同位素内标溶液的标品溶液的UPLC-MS/MS结果构建标准曲线，结合含同位素内标溶液的尿样的UPLC-MS/MS结果获得TMAO浓度和肌酐浓度；进而获得经肌酐浓度归一化的TMAO浓度。

在一个实施方案中，所述尿液是新鲜的尿液。

在又一个实施方案中，所述尿液是经长期低温冻存的。优选地，在所述低温冻存的尿液中含有叠氮化钠，以防止尿液在低温运输或保存中滋生细菌或发生氧化从而改变TMAO的浓度。优选地，加入叠氮化钠的量为尿液体积的0.05％至5％，优选为0.1％至2.5％，更优选为1％。

在又一个实施方案中，所述尿液来自干尿液样品。可选地，所述干尿液样品经溶剂溶解后。

在一个实施方案中，样品配制模块中所配制的每个所述标品溶液中包含一个浓度的TMAO标品和一个浓度的肌酐标品，其中TMAO标品和肌酐标品的浓度可以是相同或不同的。优选地，多个标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个。优选地，TMAO标品的浓度可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个；肌酐标品的浓度可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个。

在又一个实施方案中，标品溶液的溶剂选自甲醇、甲酸、乙酸或其混合物的水溶液。

在一个实施方案中，样品配制模块中所配制的同位素内标溶液中的TMAO的同位素内标的浓度和肌酐的同位素内标的浓度可以是相同或不同的，条件是TMAO的同位素内标的浓度落入所配制的标品溶液中TMAO标品的浓度范围，并且肌酐的同位素内标的浓度落入配制的所述标品溶液中肌酐标品的浓度范围。

在一个实施方案中，样品预处理模块中的所述TMAO的同位素内标可以选自TMAO的氘代化合物，例如TMAO的一氘代化合物、二氘代化合物、三氘代化合物、四氘代化合物、五氘代化合物、六氘代化合物、七氘代化合物、八氘代化合物或九氘代化合物，优选为九氘代化合物(TMAO-d9)。肌酐的同位素内标可以选自肌酐的氘代化合物，例如肌酐的一氘代化合物、二氘代化合物、或三氘代化合物，优选为三氘代化合物(肌酐-d3)。

在又一个实施方案中，所述同位素内标溶液的溶剂选自甲醇、甲酸、乙酸或其混合物的水溶液。

在一个实施方案中，样品配制模块中的标品溶液的溶剂和同位素内标溶液的溶剂是相同的。在又一个实施方案中，标品溶液的溶剂和同位素内标溶液的溶剂是不同的。

在一个优选实施方案中，样品预处理的步骤包括：首先对尿液进行去除蛋白的步骤，得到尿样；然后向多个标品溶液和尿样中分别加入相同量的同位素内标溶液，分别得到含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样。

在又一个优选实施方案中，样品预处理的步骤包括：首先向尿液和多个标品溶液中分别加入相同量的同位素内标溶液，分别得到含同位素内标的尿液和含同位素内标的标品溶液；然后对含同位素内标的尿液进行去除蛋白的步骤，以得到含同位素内标的尿样。

在一个实施方案中，去除蛋白的步骤采用了有机溶剂沉淀法，即在尿液中加入合适的有机溶剂来沉淀蛋白，然后通过离心加过滤的方式加以去除。优选地，该沉淀缓冲液是1ml/L甲酸的乙腈溶液。

在一个优选实施方案中，所述沉淀包括在低温下沉淀，例如在-15度至-30度、优选在-20度沉淀约20分钟至数小时、优选为20分钟至1小时、更优选为30分钟。在另一个优选实施方案，所述沉淀包括在加入沉淀缓冲液之后，采用合适的装备如漩涡混合器vortex剧烈震荡混匀一段时间，如10秒至1分钟、优选20秒至45秒、更优选30秒，然后放置在-20度下沉淀约20分钟至数小时、优选为20分钟至1小时、更优选为30分钟。

在一个实施方案中，所述滤除包括先高速离心，再经0.22μm滤膜过滤所述上清液。

在一个实施方案中，在样品预处理模块中，尿样或标品溶液与同位素内标溶液可以是适合后续UPLC-MS/MS分析的任意重量比，例如为100:1至1:1，优选为50:1至5:1，更优选为20:1、15:1、10:1或5:1。

在一个实施方案中，得到含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样中的同位素内标的浓度相同，在进行UPLC-MS/MS检测之前，含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样经过另外的稀释。稀释所用的试剂是样品预处理模块中使用的沉淀缓冲液，或者是标品溶液或尿样各自使用的溶剂。

在一个实施方案中，得到的含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样的浓度可以是适合后续UPLC-MS/MS分析并且能够构建浓度标准曲线的任意浓度，例如ng/mL级别或μg/mL级别。

在优选的实施方案中，在计算模块中，由含有不同浓度的TMAO和肌酐的多个标品溶液分别构建的TMAO的浓度标准曲线和肌酐的浓度标准曲线，通过拟合能够分别得到线性回归方程，其中浓度标准曲线的纵坐标是标品溶液中的被测组分——TMAO与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比或肌酐与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比，横坐标是TMAO或肌酐的浓度，以ng/mL计。

在优选的实施方案中，在计算模块中，采用标准曲线法，分别将TMAO的离子响应度和肌酐的离子响应度代入所构建的线性回归方程，分别计算得出TMAO和肌酐各自在尿液中的浓度，然后用TMAO的浓度除以肌酐的浓度，计算出在统一肌酐浓度的情况下TMAO的真实定量。

在又一个方面，本发明提供一种检测尿液中TMAO浓度和肌酐浓度的试剂用于制备诊断或监测心脑血管疾病的试剂盒的用途。

在一个实施方案中，所述试剂包括TMAO标品、肌酐标品、TMAO的同位素内标和肌酐的同位素内标。在又一个实施方案中，所述试剂包括含有TMAO标品和肌酐标品的标品溶液、含有TMAO的同位素内标和肌酐的同位素内标的同位素内标溶液。优选地，所述试剂还可以包括用于沉淀蛋白的沉淀缓冲液。优选地，所述试剂还可以包括用于稀释尿液的溶剂。

附图说明

图1是标品溶液中TMAO及其同位素标品TMAO-d9和肌酐及其同位素标品肌酐-d3的二级质谱图。

图2是由四种浓度的含同位素内标的标品溶液检测得到的TMAO(上)和肌酐(下)的标准曲线图。

图3是含同位素内标的尿样中TMAO(上)和肌酐(下)的MRM质谱图和二级离子质谱图。

具体实施方式

在本发明中，肌酐是肌肉在人体内代谢的产物，主要由肾小球滤过排出体外。每20g肌肉代谢大约可产生1mg肌酐，在肉类食物摄入量稳定时，身体的肌肉代谢又没有大的变化，肌酐的生成就会比较恒定。由此，本发明将肌酐用作尿液浓度均一化的重要指标，以排除尿液浓度本身对TMAO浓度的差异影响。换句话说，人体尿液中的肌酐浓度被应用于人体尿液中TMAO浓度的精准定量，使得人体尿液中TMAO浓度能够成为了解人体的心脑血管疾病的生理过程的生物标记物，为精准诊断及个性化治疗方案提供有效信息和依据。

本发明提供的方法能够在检测尿液中TMAO浓度的同时检测肌酐浓度，由此可以归一化TMAO浓度。

本发明提供一种检测TMAO浓度和肌酐浓度的试剂用于制备诊断或监测心脑血管疾病的试剂盒的用途。所述心脑血管疾病例如高血压、高血脂、冠心病、脑卒中，包括脑出血、脑血栓形成、脑栓塞、蛛网膜下腔出血等疾病，但不限于此。

在本发明中，所述系统包括用于实现本发明方法的设备和/或试剂，还可以称为装置。

在本发明的方法、用途和系统中，配制样品的步骤包括：1a.配制多个标品溶液，每个所述标品溶液包含一个浓度的TMAO标品和一个浓度的肌酐标品；多个所述标品溶液包含多个浓度的TMAO标品和多个浓度的肌酐标品；1b.配制同位素内标溶液，所述同位素内标溶液包含TMAO的同位素内标和肌酐的同位素内标。

在一个实施方案中，本发明的方法中的步骤1a和1b并无前后顺序的限定。

在一个实施方案中，所述尿液可以是新鲜的尿液。在这种情况下，可以对尿液直接进行检测。在又一个实施方案中，所述尿液是经长期低温冻存的。在优选的实施方案中，在低温冻存前在尿液加入叠氮化钠，以防止尿液在低温运输或保存中滋生细菌或发生氧化从而改变TMAO的浓度。优选地，加入叠氮化钠的量以能够抑制尿样中细菌滋生为准，例如为尿液体积的0.05％至5％，优选为0.1％至2.5％，更优选为1％。在又一个实施方案中，所述尿液可以来自干尿液样品。当需要时，所述干尿液样品经合适的溶剂溶解后应用于本发明的方法。所述合适的溶剂是本领域技术人员根据需要能够确定的，可以与后续步骤中稀释尿液所使用的溶剂相同或不同。

在一个实施方案中，所配制的标品溶液中包含的TMAO标品的浓度和肌酐标品的浓度可以是相同或不同的。不同浓度的标品溶液的数目可以为至少3个，优选为4个至10个，更优选为4个、5个或6个。其中，TMAO标品和肌酐标品是能够商购得到的，例如，本发明所用的TMAO标品和肌酐标品均可购自Sigma-Aldrich公司，但并不限于此。所述TMAO标品的浓度和肌酐标品的浓度需要分布在一个范围内，以便利用它们的测定结果作标准曲线。所述TMAO标品的浓度的范围例如是40ng/ml至5000ng/ml，所述肌酐标品的浓度的范围例如是40ng/ml至5000ng/ml。发明人发现，即使所选择的TMAO标品或肌酐标品的浓度范围很窄，例如40ng/ml至200ng/ml或200ng/ml至1000ng/ml，仍然可以通过标准曲线拟合得到拟合系数如0.9999的线性回归方程。在这种情况下，即使待检测的尿样中TMAO或肌酐浓度并未落入标品溶液的窄范围中，也仍然能够通过所拟合的线性回归方程得到精确的TMAO或肌酐浓度。

在又一个实施方案中，标品溶液的溶剂选自甲醇、甲酸、乙酸或其混合物的水溶液。这些溶剂也是能够商购得到的，例如购自Fisher公司，但并不限于此。

在一个实施方案中，所配制的同位素内标溶液中的TMAO的同位素内标的浓度和肌酐的同位素内标的浓度可以是相同或不同的，条件是TMAO的同位素内标的浓度落入所配制的标品溶液中TMAO标品的浓度范围，并且肌酐的同位素内标的浓度落入配制的所述标品溶液中肌酐标品的浓度范围。

在一个实施方案中，在步骤1b中的TMAO的同位素内标可以选自TMAO的氘代化合物，例如TMAO的一氘代化合物、二氘代化合物、三氘代化合物、四氘代化合物、五氘代化合物、六氘代化合物、七氘代化合物、八氘代化合物或九氘代化合物，优选为九氘代化合物(TMAO-d9)。肌酐的同位素内标可以选自肌酐的氘代化合物，例如肌酐的一氘代化合物、二氘代化合物、或三氘代化合物，优选为三氘代化合物(肌酐-d3)。TMAO的同位素内标和肌酐的同位素内标是能够商购得到的，例如，本发明所用的TMAO的同位素内标商购自上海甄准有限公司，肌酐的同位素内标商购自Toronto Research Chemicals，但并不限于此。

在又一个实施方案中，所述同位素内标溶液的溶剂选自甲醇、甲酸、乙酸或其混合物的水溶液。这些溶剂也是本领域技术人员能够商购得到的，例如购自Fisher公司，但并不限于此。

在一个实施方案中，标品溶液的溶剂和同位素内标溶液的溶剂是相同或不同的。

在本发明的方法和系统中，样品预处理步骤是为了得到含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样，其中，所述样品预处理包括对尿液进行去除蛋白的步骤和向尿液和标品溶液中加入的同位素内标溶液的步骤。

在一个实施方案中，对尿液进行去除蛋白的步骤和向尿液和标品溶液中加入的同位素内标溶液的步骤没有先后顺序，其条件是在进行UPLC-MS/MS测定之前，配制得到的含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样中的同位素内标的浓度相同。

在一个优选实施方案中，样品预处理的步骤包括：首先对尿液进行去除蛋白的步骤，得到尿样；然后向多个标品溶液和尿样中分别加入相同量的同位素内标溶液，分别得到含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样。

在又一个优选实施方案中，样品预处理的步骤包括：首先向尿液和多个标品溶液中分别加入相同量的同位素内标溶液，分别得到含同位素内标的尿液和含同位素内标的标品溶液；然后对含同位素内标的尿液进行去除蛋白的步骤，以得到含同位素内标的尿样。

尿液中含有的蛋白质等大分子化合物需要进行去除蛋白的步骤来除去。去除蛋白的步骤包括使尿液或含同位素内标溶液的尿液先进行沉淀得到上清液，然后对所述上清液滤除而过滤上清液。

在一个实施方案中，去除蛋白的步骤采用了有机溶剂沉淀法，即在尿液中加入合适的有机溶剂来沉淀蛋白，然后通过离心加过滤的方式加以去除。这里使用的有机溶剂起着沉淀缓冲液的作用。优选地，该沉淀缓冲液是1ml/L甲酸的乙腈溶液。在此沉淀溶液中，乙腈可以用于沉淀尿液中的蛋白质等大分子化合物。当尿液中含有同位素内标时，甲酸可以调节同位素内标的溶解性。

在优选实施方案中，所述沉淀包括在低温下沉淀，例如在-15度至-30度、优选在-20度沉淀约20分钟至数小时、优选为20分钟至1小时、更优选为30分钟。在另一个优选实施方案中，所述沉淀包括在加入沉淀缓冲液之后，采用合适的装备如漩涡混合器vortex剧烈震荡混匀一段时间，如10秒至1分钟、优选20秒至45秒、更优选30秒，然后放置在-20度下沉淀约20分钟至数小时、优选为20分钟至1小时、更优选为30分钟。

在一个实施方案中，所述滤除包括先高速离心，再经0.22μm滤膜过滤所述上清液，以防止残渣堵塞后续使用的色谱柱。在一些实施方案中，通过离心机的离心作用，能够有效沉降尿液中的变性蛋白质，而使小分子待测物TMAO和肌酐保留在上清液中。

在一个实施方案中，尿样或标品溶液与同位素内标溶液可以是适合后续UPLC-MS/MS分析的任意重量比，例如为100:1至1:1，优选为50:1至5:1，更优选为20:1、15:1、10:1或5:1。

在一个实施方案中，得到的含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样的浓度可以是适合后续UPLC-MS/MS分析并且能够构建浓度标准曲线的任意浓度，例如ng/mL级别或μg/mL级别。

在一个实施方案中，为了使含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样中的同位素内标的浓度相同，在进行UPLC-MS/MS检测之前，含同位素内标的标品溶液和含同位素内标的尿样可以经过另外的稀释。稀释所用的试剂可以是沉淀中使用的沉淀缓冲液，也可以是标品溶液或尿样各自使用的溶剂。进一步稀释的原因是尿液中肌酐浓度很高，可以达到0.3mg/ml至2mg/ml，同时尿液中TMAO经沉淀取上清液后的离子响应度也可以到10⁶级别，所以需要共同稀释20至100倍，优选50倍或100倍，得到μg/ml的浓度，以得到更精准的质谱结果。

高效液相色谱-串联质谱联用被用来分析含同位素内标的标品溶液，其中含同位素内标的标品溶液中TMAO或肌酐的浓度与最终得到的质谱的离子响应度成正比，该质谱的离子响应度对应于TMAO或肌酐与其各自的同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比。在已知含同位素内标的标品溶液中TMAO、肌酐、TMAO的同位素内标和肌酐的同位素内标的浓度的情况下，多个标品溶液通过质谱得到的离子响应度能够用来构建标准曲线(TMAO浓度v.s.离子响应度，或者肌酐浓度v.s.离子响应度)。

在本发明的方法、用途和系统中，构建标准曲线的步骤是将经过样品预处理步骤的含同位素内标溶液的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定。含同位素内标的标品溶液的浓度是适合UPLC-MS/MS分析并且能够构建浓度标准曲线的任意浓度，例如ng/mL级别或μg/mL级别。

在样品预处理步骤中，由含有不同浓度的TMAO和肌酐的多个标品溶液分别构建的TMAO的浓度标准曲线和肌酐的浓度标准曲线，通过拟合能够分别得到线性回归方程。其中浓度标准曲线的纵坐标是标品溶液中的被测组分——TMAO与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比或肌酐与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比，横坐标是TMAO或肌酐的浓度，以ng/mL计。

在本发明的方法、用途和系统中，获得经肌酐浓度归一化的TMAO浓度的步骤包括：将样品预处理步骤的所述含同位素内标溶液的尿样进行UPLC-MS/MS分析，结合所构建标准曲线获得TMAO浓度和肌酐浓度；获得经肌酐浓度归一化的TMAO浓度。

使用高效液相色谱-串联质谱联用来分析含同位素内标的尿样，得到的离子响应度对应于TMAO与其同位素内标的色谱峰的峰面积之比或肌酐与其同位素内标的色谱峰的峰面积之比。在获得经肌酐浓度归一化的TMAO浓度的步骤中，采用标准曲线法，分别将TMAO的离子响应度和肌酐的离子响应度代入得到线性回归方程中，分别计算得出TMAO和肌酐各自在尿液中的浓度。然后，用TMAO的浓度除以肌酐的浓度，计算出在统一肌酐浓度的情况下TMAO的真实定量。

如本文所用，术语“TMAO”是指氧化三甲胺，其结构如下所示。

如本文所用，术语“TMAO-d9”是指九氘代氧化三甲胺，其结构如下所示。

如本文所用，术语“肌酐”是指2-亚氨基-1-甲基咪唑啉-4-酮，其结构如下所示。

如本文所用，术语“肌酐-d3”是指2-亚氨基-1-三氘代甲基咪唑啉-4-酮，其结构如下所示。

不希望被理论所束缚，本发明的方法步骤中列出的顺序并非将本发明的方法限定于只能采用以上顺序。本领域技术人员可以在理解了本发明的构思和精神之后，对本发明进行修改，在不影响本发明的整体构思的前提下，修改后的技术方案也同样在本发明权利要求的保护范围内。

以下将结合具体实施例来进一步说明本发明中的技术方案。除非特殊说明，下列实施例中所使用的仪器、试剂及材料均可通过常规商业手段获得。

1、材料和仪器

材料：肌酐标品，白色粉末，纯度≥98％，购自Sigama公司；TMAO标品，白色粉末，纯度≥99％，购自sigma公司；TMAO-d9，白色粉末，纯度≥98％，购自上海甄准有限公司；肌酐-d3，白色粉末，纯度≥98％，购自Toronto Research Chemicals；超纯水，自制；甲酸，色谱纯，购自Fisher公司；乙酸，色谱纯，购自Fisher公司；甲醇，色谱纯，购自Fisher公司；乙腈，色谱纯，购自Merke公司。

仪器：1290Infinity II型超高效液相色谱仪(UPLC)，购自Agilent公司；6470三重四级杆质谱仪，购自Agilent公司；MS105DU型分析天平，购自Mettler-Toledo公司；明澈D24UV型纯水仪，购自Merck Millipore公司；台式离心机，购自Eppendrof公司。

2、检测条件

液相色谱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，色谱柱的规格：100mm×2.1mm，粒径：1.7μm；柱温：30℃；进样量：5μL～10μL；流动相：流动相A：水(含有10mmol/L的甲酸铵)/流动相B：乙腈；流速：0.2mL/min～0.5mL/min；流动相B的比例如下述表1所示(百分数均以体积百分比计算)。

本发明的方法中的液相色谱分离采用二元梯度洗脱方式，具体使用如表1所示的洗脱程序的二元梯度洗脱方式。

表1.液相色谱的洗脱参数

洗脱时间(min)	流动相B比例(％)
		0	3
5	25
		8	90
8.1	3
		13	3

在本发明的一个实施方式中，流动相中的流动相A也可以是0.2％(v/v)甲酸水溶液。

质谱：离子源：电喷雾离子源；离子源温度：200度～600度；离子源电压：4000V～5000V；喷嘴电压：500V～1000V；氮气流速：3L/min～5L/min；鞘气温度：200度～300度；鞘气流速：5L/min～15L/min；Nebulizer压力：45psi；检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式。

本发明的术语“多重反应监测”(multiple reaction monitoring，MRM)是指一种基于已知信息或假定信息来设定质谱检测规则，对符合规则的离子进行信号记录，同时去除大量不符合规则的离子信号的干扰，从而得到所需质谱信息的数据监测及获取方式。多重反应监测涉及小分子生物标志物和内标以及各自对应的监测离子对、去簇电压和碰撞能量。

质谱检测方法中的离子源为电喷雾离子源。该类型离子源可以支持正离子及负离子两种检测模式。由于本发明的TMAO和肌酐容易结合质子，因此上述方法中的检测方式采用正离子检测。

本发明对TMAO和肌酐以及相应的标品进行质谱检测的参数见下表2，其包括分子量(MW)，保留时间(RT)，前体离子(Q1)和用于定性和定量的产物离子(Q3)，裂解电压(CE)。

表2.TMAO、TMAO-d9、肌酐、肌酐-d3的质谱参数

3、实施例

3.1样品预处理

同位素内标溶液的配制：将购买的TMAO-d9和肌酐-d3各称取1mg，分别加入50％甲醇和10％甲醇，混匀溶解并定容到5ml，分别配制成浓度为浓度200μg/ml的TMAO-d9内标溶液和浓度为200μg/ml的肌酐-d3内标溶液，然后各取500μl，混匀为1ml，配制成含有浓度为100μg/ml的TMAO-d9和浓度为100μg/ml的肌酐-d3的同位素内标溶液，以备用。

处理尿样：取六个不同的尿液样品各100μl，加入以上配制的10μl同位素内标溶液，充分混匀。加入390μl沉淀缓冲液(1ml/L甲酸的乙腈溶液)，混匀，-20度沉淀30分钟；在12000g下高速离心10分钟，取上清500μl，经0.22μm滤膜滤过滤；得到六个待测的尿样。

含同位素内标的标品溶液的配制：分别精密称取相同量的待测的TMAO标品和肌酐标品，分别用50％甲醇和10％甲醇溶解后配制成浓度为1mg/ml的TMAO标品储备液和肌酐标品储备液。混合标品储备液，并用50％甲醇将浓度稀释为一系列标准曲线浓度：4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL和500μg/mL。每个浓度的标品溶液各取100μl，加入上述配制的包括TMAO-d9和肌酐-d3的10μl同位素内标，充分混匀。加入390μl沉淀缓冲液(1ml/L甲酸的乙腈溶液)，再次混匀。

3.2构建标准曲线

取3.1节得到的含同位素内标的标品溶液的4个浓度点SD1至SD4各50μl，浓度分别为4μg/mL、20μg/mL、100μg/mL和500μg/mL，分别加入950μl 50％甲醇稀释，取100μl等待UPLC-MS/MS进样分析，这里相当于一共稀释100倍。也就是说，含同位素内标的标品溶液的最终检测浓度分别为0.04μg/mL、0.2μg/mL、1μg/mL和5μg/mL，如表3所示。对4种浓度的含同位素内标的标品溶液进行液相色谱分离。

液相色谱的条件为：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，色谱柱的规格：100mm×2.1mm，粒径：1.7μm；柱温：30℃；进样量：10μL；流动相：流动相A：水(含有10mmol/L的甲酸铵)/流动相B：乙腈；流速：0.4mL/min；流动相B的组成比例如上述表1所示。

表3.标准曲线溶液的浓度

标准曲线点	配制溶液浓度(μg/ml)	最终检测浓度(ng/ml)
			SD1	4	40
SD2	20	200
			SD3	100	1000
SD4	500	5000

经过色谱法分离过程之后，被分离的标品TMAO和肌酐及其同位素内标进入质谱检测步骤。质谱检测的条件为：离子源：电喷雾离子源；离子源温度：300度；离子源电压：4000V；喷嘴电压：1000V；氮气流速：5L/min；鞘气温度：250度；鞘气流速：10L/min；Nebulizer压力：45psi；检测方式：正离子检测；扫描模式：多重反应监测模式。得到的二级质谱数据如图1所示。

根据UPLC-MS/MS得到的TMAO和肌酐标品溶液的质谱响应度，以被测TMAO的浓度为横坐标，以标品溶液中TMAO与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比为纵坐标，绘制TMAO的标准曲线，并拟合得到线性回归方程。类似地，以被测肌酐的浓度为横坐标，以标品溶液中肌酐与其同位素内标的定量色谱峰的峰面积之比为纵坐标，绘制肌酐的标准曲线，并拟合得到线性回归方程。TMAO的标准曲线和肌酐的标准曲线分别如图2所示。所得到的线性回归方程的具体参数如表4所列。

表4.本方法的实施例中TMAO和肌酐线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限

y：被测组分与内标定量色谱峰峰面积之比；

x：被测组分TMAO和肌酐的浓度，ng/mL。

3.3尿样的检测

取3.1节得到的六个尿样各5μL，通过UPLC-MS/MS联用方法进行测定，并分析各自的检测结果。液相色谱与质谱的条件与含同位素内标的标品溶液的条件相同。图3是尿样中TMAO和肌酐的MRM质谱图和二级离子质谱图。

采用标准曲线法，根据3.2节构建的浓度标准曲线，将TMAO与其同位素内标的色谱峰面积的比值代入相应的线性回归方程，计算得出TMAO在尿液中的浓度。类似地得到肌酐在尿液中的浓度。然后，用TMAO的浓度除以肌酐的浓度，计算出在统一肌酐浓度的情况下TMAO的真实定量。表5示出了六个尿样和四个标品溶液中的TMAO和肌酐浓度结果。

表5.尿样和标品中的TMAO和肌酐浓度结果。

定量结果

TMAO

数据文件	化合物	ISTD	样品类型	RT	响应	ISTD响应	响应比	最终浓度	预期的浓度	准确度
											SAM1.d	TMAO	d9-TMAO	Sample	0.678	35580	69862	0.5093	70.3202
SAM2.d	TMAO	d9-TMAO	Sample	0.658	114014	58517	1.9484	266.3389
											SAM3.d	TMAO	d9-TMAO	Sample	0.658	217586	53100	4.0977	559.0927
SAM4.d	TMAO	d9-TMAO	Sample	0.658	730153	34012	21.4673	2925.0264
											SAM5.d	TMAO	d9-TMAO	Sample	0.658	233299	47782	4.8825	666.0025
SAM6.d	TMAO	d9-TMAO	Sample	0.652	78977	88359	0.8938	122.6978
											SD-1.d	TMAO	d9-TMAO	Calibration	0.652	62874	203782	0.3085	42.9756	40.0000	107.4
SD-2.d	TMAO	d9-TMAO	Calibration	0.652	267049	182010	1.4672	200.8006	200.0000	100.4
											SD-3.d	TMAO	d9-TMAO	Calibration	0.652	795941	109026	7.3005	995.3495	1000.0000	99.5
SD-4.d	TMAO	d9-TMAO	Calibration	0.652	1890750	51509	36.7073	5000.8743	5000.0000	100.0

CRE

数据文件	化合物	ISTD	样品类型	RT	响应	ISTD响应	响应比	最终浓度	预期的浓度	准确度
											SAM1.d	CRE	13-CRE	Sample	0.691	19938	335	59.4581	2494.7159
SAM2.d	CRE	13-CRE	Sample	0.660	96817	244	396.8351	16624.0526
											SAM3.d	CRE	13-CRE	Sample	0.655	99093	247	401.5154	16820.0620
SAM4.d	CRE	13-CRE	Sample	0.655	33198	261	126.9545	5321.4615
											SAM5.d	CRE	13-CRE	Sample	0.655	77337	229	337.3653	14133.4595
SAM6.d	CRE	13-CRE	Sample	0.655	24370	381	63.9832	2684.2290
											SD-1.d	CRE	13-CRE	Calibration	0.660	5113	6123	0.8351	39.5871	40.0000	99.0
SD-2.d	CRE	13-CRE	Calibration	0.660	22239	4912	4.5274	194.2203	200.0000	97.1
											SD-3.d	CRE	13-CRE	Calibration	0.660	72815	3041	23.9454	1007.4477	1000.0000	100.7
SD-4.d	CRE	13-CRE	Calibration	0.655	195838	1642	119.2487	4998.7450	5000.0000	100.0

上述UPLC-MS/MS技术快速精准检测尿液中TMAO和肌酐的方法，以3倍基线噪声所对应的浓度为检出限时，检出限为0.1ng/mL至1.0ng/mL；以10倍基线噪声所对应的浓度为定量限时，其定量限为0.3ng/mL至3.0ng/mL。

3.4测定回收率

分别配制低(LQC)、中(MQC)、高(HQC)浓度的混合有TMAO和肌酐的标品溶液，其中：LQC浓度为标准曲线的定量下限，即40ng/mL，MQC浓度和HQC浓度分别为200ng/mL和1000ng/mL。HQC浓度的上限为标准曲线的定量上限的75％。按照前处理步骤处理，平均回收率和相对标准偏差的结果如表6所示。

表6.TMAO和肌酐的平均回收率和相对标准偏差

被测组分	浓度(ng/ml)	平均回收率(％)	相对标准偏差(％)
				TMAO	40，200，1000	92.8，97.1，103.5	8.7，6.2，7.9
肌酐	40，200，1000	109.6，96.7，89.3	9.8，7.5，8.1

由上述实验结果可知，本发明所采用的方法检出限为0.1ng/mL～1.0ng/mL，定量限为0.3ng/mL～3.0ng/mL。本发明所采用的方法TMAO的平均回收率为92.8％～103.5％，相对标准偏差为6.2％～8.7％；肌酐的平均回收率为：89.3％～109.6％，相对标准偏差为7.5％～9.8％。

因此，本发明具有如下优点或者有益效果：

1)本发明所采用的尿液沉淀法，操作简单，价格低廉，较现有的液液萃取或者固液萃取技术快速。

2)本发明检测尿液样本中TMAO的方法能够同时检测尿液中的肌酐浓度，由此能够更好的排除尿液浓度差异和不同时间取样造成的TMAO浓度变化。

3)本发明所采用的方法检出限和定量限均在ng/mL级别，具有灵敏度高、特异性好、精密度高、准确性高等特点。

因此，本发明的检测方法快速、准确、灵敏度高、专属性好、操作简便，为精准测定尿液样本中的TMAO浓度提供了一种新方法。该方法不仅适合于测定尿液样本，也适合于测定干尿片样品，适用范围得到进一步扩展。利用本发明的检测方法可以有效地了解尿液中TMAO的实时浓度水平，进而可以为心脑血管疾病的诊断和治疗提供重要的参考依据。

Claims (13)

1.一种检测尿液中TMAO的方法，其特征在于，以同位素内标为校准品，以尿液中的肌酐含量来均一化不同个体的尿液浓度的差异，结合UPLC-MS/MS技术检测尿液中TMAO的浓度，所述方法包括：

步骤1，配制样品：

1a. 配制多个标品溶液，每个所述标品溶液包含一个浓度的TMAO标品和一个浓度的肌酐标品；多个所述标品溶液包含多个浓度的TMAO标品和多个浓度的肌酐标品；

1b. 配制同位素内标溶液，所述同位素内标溶液包含TMAO的同位素内标和肌酐的同位素内标；所述TMAO的同位素内标为TMAO的氘代化合物；所述肌酐的同位素内标为肌酐的氘代化合物；所述同位素内标溶液的溶剂为甲醇水溶液或甲醇和甲酸的混合物的水溶液；

步骤2，样品预处理，得到含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样，其中，所述样品预处理包括对尿液进行去除蛋白的步骤和向尿液和标品溶液中加入的同位素内标溶液的步骤；所述去除蛋白的步骤包括在所述尿液中加入有机溶剂进行沉淀得到上清液，然后对所述上清液进行滤除；在进行UPLC-MS/MS检测之前，对在步骤2中得到的含同位素内标溶液的标品溶液和含同位素内标溶液的尿样进行稀释；

步骤3，构建标准曲线，其中将步骤2的含同位素内标溶液的标品溶液进行UPLC-MS/MS测定；

其中液相色谱的检测条件为：采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱，柱温为30℃；进样量为5μL-10μL；流动相A为含有10 mmol/L甲酸铵的水或0.2％ v/v甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速为0.2 mL/min至0.5 mL/min；液相色谱分离采用二元梯度洗脱，具体洗脱参数为：0 min-5 min，3%流动相B；5 min-8 min，25%流动相B；8 min-8.1 min，90%流动相B；8.1 min-13 min，3%流动相B；

其中质谱的检测条件为：采用电喷雾离子源；离子源温度为200度-600度；离子源电压为4000V-5000V；喷嘴电压为500V-1000V；氮气流速为3 L/min-5 L/min；鞘气温度为200度-300度；鞘气流速为5 L/min-15 L/min；Nebulizer压力为45psi；检测方式为正离子检测；扫描模式为多重反应监测模式；

步骤4，获得经肌酐浓度归一化的TMAO浓度，其中将步骤2的所述含同位素内标溶液的尿样进行UPLC-MS/MS分析，结合步骤3得到的标准曲线获得TMAO浓度和肌酐浓度；获得经肌酐浓度归一化的TMAO浓度；

其中所述方法用于非诊断的目的。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述尿液选自新鲜尿液、经长期低温冻存的尿液、或干尿液；所述新鲜尿液直接进行检测；经长期低温冻存的尿液在低温冻存前在尿液中加入叠氮化钠。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2中，所述沉淀包括在尿液中加入1ml/L甲酸的乙腈溶液；或者，所述沉淀包括在-15度至-30度，沉淀20分钟至数小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多个标品溶液的数目为至少3个。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述多个标品溶液的数目为4个至10个。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述多个标品溶液的数目为4个、5个或6个。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述TMAO的同位素内标为TMAO-d9；所述肌酐的同位素内标为肌酐-d3。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2中的所述滤除包括先高速离心，再经0.22μm滤膜过滤所述上清液。

9.根据权利要求2所述的方法，其中，在尿液中加入叠氮化钠的量为尿液体积的0.05%至5%。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，在尿液中加入叠氮化钠的量为尿液体积的0.1%至2.5%。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，在尿液中加入叠氮化钠的量为尿液体积的1%。

12.根据权利要求3所述的方法，其中，所述沉淀包括在-20度，沉淀20分钟至1小时。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述沉淀包括在-20度，沉淀30分钟。

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