CN108693268A - 一种用于预测冠心病预后的代谢标记物组合及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了内源性代谢物在作为预测冠心病预后风险的标记物或制备预测冠心病预后风险试剂盒中的应用。本发明提供的代谢标记物可以有效预测冠心病患者的死亡和主要不良心血管事件(MACE)的发生风险以及心功能不全风险，具有特异性、敏感性、高效和无创的特点。本发明提供的代谢标记物单个用于预测冠心病患者的生存预后，AUC均在65%以上；多个联合应用时，AUC比单个更接近于100%，预测效果更好。本发明提供的标记物的检测方法灵敏度高，方便快捷，结果准确可靠。利用本发明提供的标记物构建的预测模型可以用于预测冠心病预后风险，预测效果好、灵敏度高、方便快捷、无创，有重要的临床应用价值。

Description

一种用于预测冠心病预后的代谢标记物组合及其试剂盒
技术领域
本发明涉及冠心病检测技术领域，更具体地，涉及一种用于预测冠心病预后的代谢标记物组合及其试剂盒。
背景技术
冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease)，是指冠状动脉发生粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病，简称冠心病(coronary heart disease，CHD)，也称缺血性心脏病(ischemic heartdisease)。随着我国经济社会发展，冠心病的年死亡率和发病率呈逐年上升的趋势，是威胁人类社会最主要的死亡危险因素之一。据《中国心血管病报告2016》称，心血管疾病死亡率占疾病总死亡率的42～45％，居死亡率之首，我国每年约110万人死于冠心病。预计在1990-2020年，发展中国家因冠心病死亡的男性增长率将达137％、女性将达120％。尽管针对冠心病的一级和二级预防措施正在不断加强，其预后仍然不佳，发病率和死亡率仍呈逐年增高的趋势，严重威胁着人类的健康。冠心病相关的心血管损害(如动脉粥样硬化、左室肥厚和左室功能紊乱等)和心血管事件(如再次心梗、心血管死亡、卒中、猝死等)不仅致残率、致死率高，而且严重消耗医疗和社会资源，给家庭和国家造成沉重负担。近年来，随着基因技术的发展，大规模的全基因组关联性研究(GWAS)已经发现46个危险基因，但仅仅占冠心病遗传因素的10.6％。而临床上传统的心肌损伤标记物如肌红蛋白(Myo)，肌酸激酶(CK)，心肌型肌酸激酶同功酶(CK-MB)，肌钙蛋白I或T(cTnI或cTnT)，仅在斑块破裂和血管事件发生后出现异常，无法提前预知不良心血管事件的发生。因此，迫切需要寻找特异性和敏感性好的生物标记物，进行危险分层，从而指导早期预警与防治，改善冠心病患者的生存预后。
冠心病的发生和发展是多种遗传因素和环境因素相互作用的复杂过程，是一种复杂的代谢性疾病。研究证实，代谢紊乱与心血管疾病的发生和发展有关，是机体内源性物质随内在或外在干扰而随之产生适应性变化的结果。这些内源性代谢物在冠心病的发生和发展中扮演重要角色，包括糖类、氨基酸、有机酸、胆碱和磷脂等相关分子。基因或蛋白质等体内生物信息的生命效应最终响应为体内小分子代谢物的改变，而代谢物的改变亦可进一步直接反映机体最终的生理病理变化。在冠心病疾病状态下，基因-环境的相互作用可能导致各种代谢通路及代谢产物水平的改变，因此对机体内的代谢物进行检测和分析，可以发现与疾病发生发展相关的代谢标记物，由此为冠心病患者生存预后的早期预警开拓新方向。新兴的代谢组学研究利用高效、精准的现代分析技术，对生物样品(血液、尿液、组织液等)中所有相对分子质量低于1500U的小分子代谢物进行定性定量分析，从而监测机体生理病理状态下内源性代谢物的动态改变及其规律。目前常用的分析技术包括核磁共振(NMR)、液相色谱-质谱连用(LC-MS)和气相色谱-质谱连用(GC-MS)等。代谢组学具有动态性、损伤小、适用范围广和易于实时监测等特点，因而成为各个系统性疾病诸如代谢性疾病、心血管疾病和肿瘤等相关标记物发现的新工具，有利于冠心病的早期诊断、疾病进展监测、治疗效果评估和预后评价等。
近年来代谢组学在心血管疾病中的应用研究受到很大关注，通过全面定量定性分析心血管疾病患者及动物模型的生物样本中的小分子物质，来研究生物体受内、外环境刺激后其内源性代谢物质的变化及其规律，以寻找与疾病相关的代谢标记物。心脏是一个重要的能量代谢器官，其中90％的用于维持心脏正常功能的ATP均来自于线粒体脂肪酸的氧化磷酸化。2002年发表于《Nature Medicine》杂志的文章提出基于NMR对血样品的代谢研究可能成为区分冠心病和健康人群的新方法。Shah SH等对2023名患者长约3.1年的随访研究发现，中链乙酰肉毒碱、支链氨基酸、脂肪酸等5个代谢物与冠心病的死亡率明显相关。一项大型的前瞻性队列研究也发现苯丙氨酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸可预测心血管疾病风险。近年来，Wang等研究发现由摄入磷脂酰胆碱产生的三甲胺氧化物(TMAO)，胆碱和甜菜碱等肠道菌群代谢物可用于预测心血管疾病风险。综上所诉，可见体内多种内源性代谢物参与冠心病的发生发展，并且可能影响患者预后，说明代谢组学研究在冠心病风险评估和预测中有重要价值。
尽管人们越来越关注心血管疾病所涉及的代谢异常，但传统的危险因子仅能解释小部分的疾病状态，并且其预测效能有限，亟求新的研究方法和生物标记物。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供27个与死亡发生显著相关的代谢标记物，20个与主要不良心血管事件(MACE)发生显著相关的代谢标记物，以及30个与心功能不全(LVEF<50％)相关的代谢标记物。这些代谢标记物可以有效预测冠心病患者的死亡和主要不良心血管事件(MACE)的发生风险以及心功能不全风险，具有特异性、敏感性、高效和无创的特点。本发明提供的代谢标记物单个用于预测冠心病患者的生存预后，AUC均在65％以上；多个联合应用时，AUC比单个更接近于100％，预测效果更好。本发明提供的标记物的检测方法灵敏度高，方便快捷，结果准确可靠。利用本发明提供的标记物构建的预测模型可以用于预测冠心病预后风险，预测效果好、灵敏度高、方便快捷、无创，有重要的临床应用价值。
本发明的第一个目的是提供内源性代谢物在作为预测冠心病预后风险的标记物或制备预测冠心病预后风险试剂盒中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种预测冠心病预后风险试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明依托一个接受经皮冠状动脉介入治疗的冠心病人群队列的血浆样本进行了前瞻性研究，运用广泛靶向的代谢组学分析方法鉴定了263种内源性代谢物，包括氨基酸、核苷类、有机酸及其衍生物和溶血软磷脂类代谢物。本研究通过生物信息学分析得到与死亡、主要不良心血管事件(MACE)和心功能不全(LVEF<50％)相关的血浆代谢物，并评估该关键性血浆代谢物及基于上述代谢物构建的预测模型对冠心病患者预后的预测价值，以期为冠心病诊断和治疗提供新思路和新靶点。本发明的研究终点为MACE、死亡和心功能不全(LVEF<50％)。主要不良心血管事件(MACE)被定义为全因性死亡，非致死性心肌梗死，冠状动脉血运重建和脑梗塞事件。
本发明中预测预后的生物标记物组合、预测模型和试剂盒可以将无症状或症状不明显的生存风险高的冠心病患者尽早发现并及时干预，并且预测过程无内创性、简洁且快速，这对于冠心病患者的尽早干预、预后的改善及死亡率的降低有非常重要的意义。
因此，本发明要求保护内源性的代谢物在作为预测冠心病预后风险的代谢标记物或制备预测冠心病预后风险试剂盒中的应用，所述代谢标记物包括1,3-二甲基尿酸(1,3-Dimethyluric acid)、2,6-二甲基苯胺(2,6-Dimethylaniline)、3-羟基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、4-胍基丁酸(4-Guanidinobutyric acid)、4-乙酰氨基丁酸(4-Acetamidobutyric acid)、5-甲基尿苷(5-Methyluridine)、5-脱氧-5-甲硫腺苷(5'-Deoxy-5'-(methylthio)adenosine)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、L-胱氨酸(L-Cystine)、L-瓜氨酸(L-Citrulline)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、L-色氨酸(L-Tryptophan)、N-(3-甲基-1-氧代-2-丁烯酸)氨基乙酸(3-Methylcrotonyl glycine)、N6-琥珀酰腺苷(N6-Succinyl Adenosine)、N6-乙酰-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine)、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺(Phenylacetyl-L-glutamine)、N-乙酰-L-酪氨酸(N-Acetyl-L-tyrosine)、N-乙酰基甘氨酸(N-acetylglycine)、N-乙酰基亮氨酸(N-acetyl-l-leucine)、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸(S-(5-Adenosy)-L-homocysteine)、氨茶碱(Aminophylline)、苯乙醛酸(Benzoylformic acid)、对-羟苯基乳酸(DL-P-hydroxyphenyllactic acid)、二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、高香草酸(Homovanillic acid)、肌酸(Creatine)、己二酸(AdipicAcid)、己六醇(Dulcitol)、己酰甘氨酸(Hexanoyl glycine)、甲基丁二酸(2-Methylsuccinic acid)、甲基组氨酸(tau-Methylhistidine)、假尿苷(β-Pseudouridine)、苹果酸盐(Malate)、犬尿酸(Kynurenicacid)、溶血卵磷脂18:0(2n同分异构体)(LysoPC 18:0(2n isomer))、溶血卵磷脂20:1(2n同分异构体)(LysoPC 20:1(2n isomer))、溶血卵磷脂20:0(LysoPC 20:0)、溶血卵磷脂20:1(LysoPC 20:1)、溶血卵磷脂20:2(LysoPC 20:2)、溶血卵磷脂20:2(2n同分异构体)(LysoPC 20:2(2n isomer))、三碘甲状腺原氨酸(3,3',5-Triiodo-L-thyronine)、十二烷二酸(Dodecanedioic aicd)、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物(CyclicAMP)、辛二酸(SubericAcid)、氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide)、异丁苯丙酸(Ibuprofen)、吲哚-3-丁酸(3-Indolebutyric acid)、月桂酸(Lauric Acid(C12:0))、左旋甲状腺素(L-Thyroxine)中的一种或几种的组合。
优选地，所述冠心病预后为冠心病经皮冠状动脉介入治疗预后。
优选地，所述冠心病预后风险为死亡风险、主要不良心血管事件风险和心功能不全风险。
优选地，当冠心病预后风险为死亡风险时，所述代谢标记物为4-乙酰氨基丁酸(4-Acetamidobutyric acid)、假尿苷(β-Pseudouridine)、己六醇(Dulcitol)、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸(S-(5-Adenosy)-L-homocysteine)、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、N6-琥珀酰腺苷(N6-Succinyl Adenosine)、L-胱氨酸(L-Cystine)、犬尿酸(Kynurenic acid)、二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物(Cyclic AMP)、对-羟苯基乳酸(DL-P-hydroxyphenyllactic acid)、异丁苯丙酸(Ibuprofen)、氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide)、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺(Phenylacetyl-L-glutamine)、肌酸(Creatine)、己二酸(AdipicAcid)、N-(3-甲基-1-氧代-2-丁烯酸)氨基乙酸(3-Methylcrotonyl glycine)、N-乙酰-L-酪氨酸(N-Acetyl-L-tyrosine)、5-脱氧-5-甲硫腺苷(5'-Deoxy-5'-(methylthio)adenosine)、N-乙酰基亮氨酸(N-acetyl-l-leucine)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、苯乙醛酸(Benzoylformicacid)、L-瓜氨酸(L-Citrulline)、三碘甲状腺原氨酸(3,3',5-Triiodo-L-thyronine)、N6-乙酰-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine)、L-色氨酸(L-Tryptophan)中的一种或几种的组合。
更优选地，所述代谢标记物为L-色氨酸(L-Tryptophan)、苯乙醛酸(Benzoylformic acid)、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物(CyclicAMP)、异丁苯丙酸(Ibuprofen)、3,3',5-三碘-L-甲状腺素(3,3',5-Triiodo-L-thyronine)、假尿苷(β-Pseudouridine)中的一种或几种的组合。
最优选地，所述代谢标记物为L-色氨酸(L-Tryptophan)、苯乙醛酸(Benzoylformic acid)、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物(Cyclic AMP)、异丁苯丙酸(Ibuprofen)、3,3'，5-三碘-L-甲状腺素(3,3',5-Triiodo-L-thyronine)、假尿苷(β-Pseudouridine)的组合。
优选地，当冠心病预后风险为主要不良心血管事件风险时，所述代谢标记物为溶血卵磷脂20:2(LysoPC 20:2)、溶血卵磷脂20:2(2n同分异构体)(LysoPC20:2(2nisomer))、5-甲基尿苷(5-Methyluridine)、4-乙酰氨基丁酸(4-Acetamidobutyric acid)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、溶血卵磷脂20:1(LysoPC 20:1)、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、己六醇(Dulcitol)、溶血卵磷脂20:0(LysoPC 20:0)、溶血卵磷脂20:1(2n同分异构体)(LysoPC 20:1(2n isomer))、溶血卵磷脂18:0(2n同分异构体)(LysoPC 18:0(2nisomer))、假尿苷(β-Pseudouridine)、L-胱氨酸(L-Cystine)、二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、氨茶碱(Aminophylline)、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸(S-(5-Adenosy)-L-homocysteine)、犬尿酸(Kynurenic acid)、L-色氨酸(L-Tryptophan)、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺(Phenylacetyl-L-glutamine)中的一种或几种的组合。
更优选地，所述代谢标记物为L-色氨酸(L-Tryptophan)、5-甲基尿苷(5-Methyluridine)、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、苯乳酸(phenyllactate(PLA))、溶血卵磷脂20:2(LysoPC 20:2)中的一种或几种的组合。
最优选地，所述代谢标记物为L-色氨酸(L-Tryptophan)、5-甲基尿苷(5-Methyluridine)、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、苯乳酸(phenyllactate(PLA))、溶血卵磷脂20:2(LysoPC 20:2)的组合。
优选地，当冠心病预后风险为心功能不全风险时，所述代谢标记物为二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、肌酸(Creatine)、N6-乙酰-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine)、L-胱氨酸(L-Cystine)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、己酰甘氨酸(Hexanoylglycine)、假尿苷(β-Pseudouridine)、3-羟基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、N6-琥珀酰腺苷(N6-Succinyl Adenosine)、辛二酸(SubericAcid)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、月桂酸(Lauric Acid(C12:0))、甲基丁二酸(2-Methylsuccinic acid)、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物(CyclicAMP)、犬尿酸(Kynurenic acid)、4-乙酰氨基丁酸(4-Acetamidobutyric acid)、N-(3-甲基-1-氧代-2-丁烯酸)氨基乙酸(3-Methylcrotonylglycine)、己六醇(Dulcitol)、2,6-二甲基苯胺(2,6-Dimethylaniline)、1,3-二甲基尿酸(1,3-Dimethyluric acid)、己二酸(AdipicAcid)、高香草酸(Homovanillic acid)、N-乙酰基甘氨酸(N-acetylglycine)、4-胍基丁酸(4-Guanidinobutyric acid)、十二烷二酸(Dodecanedioic aicd)、左旋甲状腺素(L-Thyroxine)、吲哚-3-丁酸(3-Indolebutyricacid)、甲基组氨酸(tau-Methylhistidine)、苹果酸盐(Malate)、对-羟苯基乳酸(HPLA)(DL-P-hydroxyphenyllactic acid)中的一种或几种的组合。
更优选地，所述代谢标记物包括己酰甘氨酸(Hexanoyl glycine)、左旋甲状腺素(L-Thyroxine)、肌酸(Creatine)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、月桂酸(LauricAcid(C12:0))、二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、N6-乙酰-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine)、1,3-二甲基尿酸(1,3-Dimethyluric acid)中的一种或几种的组合。
最优选地，所述代谢标记物包括己酰甘氨酸(Hexanoyl glycine)、左旋甲状腺素(L-Thyroxine)、肌酸(Creatine)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、月桂酸(LauricAcid(C12:0))、二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、N6-乙酰-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine)、1,3-二甲基尿酸(1,3-Dimethyluric acid)的组合。
一种预测冠心病预后风险的试剂盒，包括以上所述代谢物标准品和/或检测以上所述代谢物的检测试剂。
优选地，所述试剂盒是基于液相色谱质谱联用检测方法的。
优选地，所述试剂盒是基于超高效液相超高效液相色谱-三重四级杆/线性离子阱质谱技术(QTRAP-UPLC-MS/MS)。
优选地，所述试剂盒还包括内标L-Kynurenine-d4。
优选地，所述试剂盒还包括血浆代谢物提取溶剂：100％乙腈和100％甲醇(用于QTRAP-UPLC-MS/MS样品制备)；QTRAP-UPLC-MS/MS筛选表征中，100％甲醇可以用作溶解标准品的溶剂。
优选地，所述标准品可以单独封装，也可以制成混合物封装。
优选地，检测样品是血浆或血清或尿液。
所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1.待测样本的采集和预处理；
S2.分析鉴定样本中内源性代谢物；
S3.根据所测的上述可用于预测冠心病预后的代谢标记物水平，应用预测模型以评估冠心病患者的死亡、主要不良心血管事件和心功能不全风险。
优选地，当待测样品为血浆时，步骤S1中，预处理包括以下步骤：
(1)血浆样品于4℃冻融，取血浆50μL，加入150μL甲醇，涡旋3分钟以沉淀蛋白；
(2)然后于4℃12,000rpm离心10分钟；
(3)取上清液于4℃12,000rpm再次离心3分钟；
(4)将步骤(3)的上清液用于UPLC-MS/MS分析。
优选地，步骤S2中，色谱质谱联用的代谢组学分析采用超高效液质联用(UPLC-MS/MS)系统(UPLC，Shim-packUFLC SHIMADZU CBM30A；MS，AppliedBiosystems 4500QTRAP)进行了代谢谱分析，该方法检测限低、灵敏度高，能灵敏地分析检测生物样本中的代谢标记物并对其定量。
优选地，步骤S2中，液相色谱质谱联用测试的质控分析包括：在样品分析前用样品提取物混合制备而成的质量控制(QC)样品进行校准，在仪器分析的过程中，每10个分析样品中插入一个质量控制(QC)样品。
优选地，步骤S2中，液相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：Waters ACQUITYUPLC HSS T3C18色谱柱(孔尺寸1.8μM，长2.1×100mm)，经水(0.04％乙酸)-乙腈(0.04％乙酸)的梯度洗脱。梯度洗脱步骤如下：0分钟水/乙腈95：5V/V，11.0分钟为5:95V/V，12.0分钟为5:95V/V，12.1分钟为95:5V/V，14.0分钟为95：5V/V。流速为0.35mL/min，柱温为40℃，进样量为5μL。质谱条件包括：由ESI离子源Turbo Ion-Spray、线性离子阱和三重四极杆(QQQ)串联组成的ESI-triple quadrupole-linear ion trap(QTRAP)–MS质谱系统，采用电喷雾离子源的正离子和负离子模式采集。电喷雾离子源温度550℃，离子喷雾电压(IS)5500V，帘气(CUR)25.0psi，碰撞诱导电离(CAD)参数设置为高，碰撞气体(氮气)为5psi。代谢物定量是利用三重四级杆(QQQ)扫描的多反应监测模式(MRM)进行的，每个离子对都是根据优化的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)进行扫描检测的。质谱分析的原始数据由Analyst 1.6软件(ABSciex)处理。
同时，本发明提供了可用于预测冠心病预后风险的预测模型，能够快捷高效的预测冠心病患者的生存风险。
优选地，用于预测冠心病死亡风险的预测模型方程为y＝0.044×age+0.024×AST-0.524×L-Tryptophan-0.281×Benzoylformic acid+0.385×D-Sorbitol+0.522×L-Kynurenine+0.481×Cyclic AMP-1.551×Ibuprofen-0.838×3,3',5-Triiodo-L-thyronine+0.425×β-Pseudouridine。
优选地，所述预测模型阈值cut-off为0.1160。
优选地，该预测模型的预测效能AUC＝84.32％。
优选地，用于预测冠心病主要不良心血管事件风险的预测模型方程为y＝0.318×DM+0.241×CCB+0.475×PPI+0.012×AST+0.013×SYNTAX-0.374×L-Tryptophan+0.343×5-Methyluridine+0.115×D-Sorbitol+0.404×L-Kynurenine+0.143×phenyllactate-0.819×LysoPC 20:02。
优选地，所述预测模型阈值cut-off为0.2021。
优选地，该预测模型的预测效能AUC＝73.56％。
优选地，用于预测冠心病心功能不全风险的预测模型方程为y＝1.127×SEX+1.326×arrhythmia-0.681×HyperT+1.058×BB–0.783×CCB+0.025×AST+0.046×SYNTAX+0.222×Hexanoyl glycine+0.390×L-Thyroxine+0.618×Creatine+0.318×phenyllactate+0.323×Lauric Acid+0.523×2-(dimethylamino)guanosine+0.496×N6-Acetyl-L-lysine+0.099×1,3-Dimethyluric acid-4.741。
优选地，所述预测模型阈值cut-off为1.1044。
优选地，该预测模型的预测效能AUC＝80.92％。
所述预测模型的构建方法为：
步骤1，采用单因素和多因素Cox回归分析上述代谢标记物组合对PCI(经皮冠状动脉介入治疗)术后出现死亡和不良心血管事件(MACE)的危险度，用单因素和多因素logistics回归分析上述代谢标记物组合对PCI(经皮冠状动脉介入治疗)术后出现心功能不全(LVEF<50％)的危险度；
步骤2，用多元Cox回归模型/logistics回归模型建立基于临床特征和代谢标记物组合的生存预后模型；
步骤3，用多元Cox回归模型/logistics回归模型求算变量的回归系数，并以此系数作为权重对进入模型的变量赋整系数值(integer coefficient)；
步骤4，应用AUC曲线下面积对模型诊断的准确性进行评价。
优选地，所述步骤1中，采用自助重采样法(bootstrap)对其加以验证，以避免过度拟合(overfitting)。
优选地，所述步骤2中，采用逐步法移除P值大于0.05的变量。如果在1000次重自助重采样法中，超过800次该变量被选中，则该变量进入最终模型。
优选地，所述步骤3中，累加每一个危险因素相应的整系数值获得最后的危险值。根据每个危险值所预测的危险事件发生率对危险性分组。
优选地，所述步骤4中，评分系统的模型拟合准确性用Hosmer-Lemeshow拟合检验评价。
虽然，主要不良心血管事件(MACE)包括全因性死亡、非致死性心梗和紧急目标血管血运重建，同时在本专利中认为“冠心病预后风险为死亡风险、主要不良心血管事件风险和心功能不全风险”，这样范围有重合。
这是由于，在心血管疾病队列常用临床终点事件中，MACE包括死亡事件，但是由于死亡事件是冠心病患者复杂且最重要的终点事件，因此在本发明中考察MACE前有针对性地单独考察了对死亡有较强预测能力的特异性标记物，因为这样发现的代谢物更特异，预测效能更高。由于冠心病患者除了出现死亡事件以外，其他相关心血管不良反应的风险评价也很重要，因此我们也建立了预测心血管疾病硬终点事件MACE的预测模型。如果患者出现死亡了，分类到死亡风险里更有针对性，但同时分类到MACE模型中也可以，因为本发明中对预测死亡和MACE发生风险的两个模型均评估过其准确性和预测价值，AUC值均较传统的预测因子高，都具有可应用性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用血浆代谢组学技术以及数据统计分析技术得到了适合于预测冠心病生存预后的代谢标记物组合和预测模型，并应用所述代谢标记物制备了预测冠心病生存预后的试剂盒。
(2)本发明提供的代谢标记物可以有效预测冠心病患者的死亡和MACE事件的发生风险以及心功能不全(LVEF<50％)风险，具有特异性、敏感性、高效和无创的特点。
(3)本发明提供的分析检测所述代谢标记物的方法灵敏度高，方便快捷，结果准确可靠。
(4)本发明提供的代谢标记物单个用于预测冠心病患者的生存预后，AUC均在65％以上；多个联合应用时，AUC比单个更接近于100％，预测效果更好。
(5)本发明提供的预测模型可以用于预测冠心病患者死亡和MACE事件的发生风险，具有预测效果好、灵敏度高、方便快捷、无创等特点，对于降低患者死亡率有重要的临床应用价值。
(6)本发明中预测预后的生物标记物组合、预测模型和试剂盒可以将无症状或症状不明显的生存风险高的冠心病患者尽早发现并及时干预，并且预测过程无内创性、简洁且快速，这对于冠心病患者的尽早干预、预后的改善及死亡率的降低有非常重要的意义。
附图说明
图1为实施例1中所描述的8个代谢标记物组合预测死亡准确性的ROC曲线。
图2为实施例2中所描述的6个代谢标记物组合预测主要心血管不良事件(MACE)准确性的ROC曲线。
图3为实施例3中所描述的8个代谢标记物组合预测心功能不全(LVEF<50％)准确性的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1死亡风险的代谢标记物组合分析
一、实验操作
1、病例来源
本研究招募了1040名冠心病患者，所有入选患者均签署了知情同意书。所有患者都是根据相同的纳入和排除标准在2010年1月至2013年12月期间顺序入选。研究对象的平均年龄为63.03±10.04岁，平均BMI为24.28±4.79kg/m2，约80％为男性。患者的临床资料包括人口统计学资料、既往病史、实验室检查和既往用药史。在随访5年期间，1040例冠心病患者中分别有63例死亡患者和183例发生MACE的患者。
采血时间均为清晨空腹状态。
随访信息是在住院和医院门诊访问的基础上，对所有入选患者或其家属进行电话随访收集的。在每个随访评估(每6个月)中，询问入选对象的新的不良心血管事件或其他恶性事件，并记录入选患者的基线危险因素和用药情况。
2、研究终点
(1)主要研究终点：主要不良心血管事件(MACE)包括全因性死亡，非致死性心肌梗死，冠状动脉血运重建和脑梗塞事件；死亡。
(2)次要研究终点：心功能不全，定义为左室射血分数(LVEF<50)。
3、心脏彩超检查
采用Philips iE33系统(Philips Medical Systems，Bothell，WA，USA)对入选患者进行心脏彩超检查，并根据欧洲和美国超声心动图指南评估左心室(LV)结构和功能。应用改良的Simpson法测量左室射血分数(左室射血分数)。
4、冠状动脉造影术
采用SYNTAX评分系统，评估冠心病患者病变的复杂程度、严重程度以及动脉粥样硬化负荷。SYNTAX评分已被证实可以独立预测进行血运重建的稳定型冠心病患者的主要不良心血管事件和长期预后风险。
冠状动脉造影图通过Syngo Dynamics心血管成像软件(Siemens MedicalSolutions USA，Inc.，Malvern，Pennsylvania)获得。根据冠状动脉造影结果，运用从SYNTAX官方网站(http://www.syntaxscore.com/)所下载的SYNTAX评分计算器(2.11版本)，计算每位患者的SYNTAX评分。
5、样本制备
入选的患者均禁食至少8小时，以尽量减少营养物对代谢物水平的影响。采集患者的血样并用乙二胺四乙酸二钾(EDTA)抗凝，全血样品在2小时内经3,000rpm于4℃离心10分钟，分装成血浆和血细胞，统一编号，冻存于-80℃冰箱备用。
6、血浆样本前处理
样本提取的步骤如下：血浆样品于4℃冻融，取血浆50μL，加入150μL甲醇，涡旋3分钟以沉淀蛋白，4℃12,000rpm离心10分钟，取上清液于4℃12,000rpm再次离心3分钟。最后，将所得上清液用于UPLC-MS/MS分析。
7、分析仪器检测
本研究使用超高效液质联用(UPLC-MS/MS)系统(UPLC，Shim-packUFLC SHIMADZUCBM30A；MS，Applied Biosystems 4500QTRAP)进行了广泛靶向的代谢谱分析，鉴定了263种内源性代谢物，包括氨基酸、核苷类、有机酸及其衍生物和溶血卵磷脂类代谢物。在样品分析前，用样品提取物混合制备而成的质量控制(QC)样品的进行校准，在仪器分析的过程中，每10个分析样品中插入一个质量控制(QC)样品。质控标准以保留时间(+/-0.05分钟)，信号强度(<25％相对标准偏差)和质量准确度(<3ppm)评估，从而监测分析的稳定性和可重复性。
色谱分离采用WatersACQUITYUPLC HSS T3C18色谱柱(孔尺寸1.8μM，长2.1×100mm)，经水(0.04％乙酸)-乙腈(0.04％乙酸)的梯度洗脱。梯度洗脱步骤如下：0分钟水/乙腈95：5V/V，11.0分钟为5:95V/V，12.0分钟为5:95V/V，12.1分钟为95:5V/V，14.0分钟为95：5V/V。运行过程中流速设定为0.35mL/min，柱温为40℃，进样量为5μL。
流出物被注入由ESI离子源Turbo Ion-Spray、线性离子阱和三重四极杆(QQQ)串联组成的ESI-triple quadrupole-linear ion trap(QTRAP)–MS质谱系统，并采用正离子和负离子模式采集。电喷雾离子源温度550℃，离子喷雾电压(IS)5500V，帘气(CUR)25.0psi，碰撞诱导电离(CAD)参数设置为高，碰撞气体(氮气)为5psi。代谢物定量是利用三重四级杆(QQQ)扫描的多反应监测模式(MRM)进行的，在MRM模式下进一步对去簇电压(DP)和碰撞能(CE)进行优化，每个离子对是根据优化的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)进行扫描检测的。质谱分析的原始数据由Analyst 1.6软件(AB Sciex)处理。
8、数据处理和生物标记物分析
为了校正批次间误差，不同检测批次的代谢物水平经过QC-RLSC(qualitycontrol–based robust LOESS signal correction)算法进行校正。校正后数据采用Pareto Scaling的方法进行转换，即将变量进行平均中心化及方差取平方根转换。未被检测到代谢物的样品则根据代谢物的最低检测水平进行估算。连续变量以平均值±标准差表示，分类变量以百分比表示。
采用Cox回归分析，在校正了包括年龄、性别、BMI、SYNTAX评分、并发症、肝肾功能和药物治疗在内的潜在混杂因素后，鉴别出与死亡和MACE风险独立相关的代谢标记物，并估计其风险比(HR)和95％可信区间(CI)。采用logistics回归分析以鉴别对心功能不全(LVEF<50％)有贡献的代谢标记物，这些代谢标记物对心功能不全(LVEF<50％)的影响与年龄、性别、体重指数、合并症、药物以及肾和肝功能障碍无关。将P<0.05的变量纳入到多元回归分析模型中，并且只有p<0.05的变量最后能保留在模型中。
采用受试者工作特征曲线(ROC)分别评估代谢标记物对冠心病预后风险的预测效能。
使用SAS 9.4(SAS Inst，Cary，NC，USA)和R语言(版本3.2.3，http://www.R-project.org/)进行统计分析。
二、实验结果
研究发现，平均SYNTAX分值为16.43±10.74。本研究通过高通量的QTRAP-UPLC-MS/MS分析检测到了263种代谢物。
在校正了包括年龄、性别、BMI、SYNTAX评分、并发症、肝肾功能和药物治疗在内的潜在混杂因素后，多因素Cox回归分析结果显示有27种血浆代谢物与死亡风险有关(P<0.05，表1)，包括4-乙酰氨基丁酸(4-Acetamidobutyric acid)、假尿苷(β-Pseudouridine)、己六醇(Dulcitol)、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸(S-(5-Adenosy)-L-homocysteine)、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、N6-琥珀酰腺苷(N6-Succinyl Adenosine)、L-胱氨酸(L-Cystine)、犬尿酸(Kynurenic acid)、二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物(Cyclic AMP)、对-羟苯基乳酸(DL-P-hydroxyphenyllactic acid)、异丁苯丙酸(Ibuprofen)、氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide)、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺(Phenylacetyl-L-glutamine)、肌酸(Creatine)、己二酸(AdipicAcid)、N-(3-甲基-1-氧代-2-丁烯酸)氨基乙酸(3-Methylcrotonyl glycine)、N-乙酰-L-酪氨酸(N-Acetyl-L-tyrosine)、5-脱氧-5-甲硫腺苷(5'-Deoxy-5'-(methylthio)adenosine)、N-乙酰基亮氨酸(N-acetyl-l-leucine)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、苯乙醛酸(Benzoylformic acid)、L-瓜氨酸(L-Citrulline)、三碘甲状腺原氨酸(3,3',5-Triiodo-L-thyronine)、N6-乙酰-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine)、L-色氨酸(L-Tryptophan)。
ROC曲线(receiver operation characteristic curve)是衡量一个代谢物或一组代谢物作为分类器衡量其性能高低的重要工具。ROC曲线最重要的属性是曲线下面积(Area under the curve,AUC)。本研究采用ROC曲线分析，根据AUC大小进一步评价上述27种代谢标记物联合临床资料对冠心病患者死亡风险的预测效能，AUC越高，表明预测效能越好(表1)。在27个代谢物中，每个代谢标记物单独与临床资料构建预测模型，所得的ROC曲线区分冠心病患者出现死亡的预测效能AUC均大于75％，具有临床应用价值。
联合27个代谢标记物和临床资料以筛选出最优的预测模型，并进一步通过该多元COX回归模型鉴定这些代谢物是否为死亡的独立危险因素。结果显示(表2)，降低的苯乙醛酸(Benzoylformic acid，HR(95％CI):0.76(0.58-0.99)；P＝0.0431)、异丁苯丙酸(Ibuprofen，HR(95％CI):0.21(0.09-0.48)；P＝0.0002)、3,3'，5-三碘-L-甲状腺素(3,3',5-Triiodo-L-thyronine，HR(95％CI):0.43(0.21-0.91)；P＝0.0275)和增加的D-山梨糖醇(D-Sorbitol，(HR(95％CI):1.47(1.19-1.81)；P＝0.0004))、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine，HR(95％CI):1.69(1.07-2.65)；P＝0.0233)、假尿苷(β-Pseudouridine，HR(95％CI):1.53(1.10-2.13)；P＝0.0114)是死亡的独立危险因素。
基于代谢标记物组合和临床资料构建最优的多元COX风险比例模型，该模型包括8个代谢标记物，包括L-色氨酸(L-Tryptophan)、苯乙醛酸(Benzoylformic acid)、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物(CyclicAMP)、异丁苯丙酸(Ibuprofen)、3,3'，5-三碘-L-甲状腺素(3,3',5-Triiodo-L-thyronine)、假尿苷(β-Pseudouridine)(表2)，该预测模型的方程为y＝0.044×age+0.024×AST-0.524×L-Tryptophan-0.281×Benzoylformic acid+0.385×D-Sorbitol+0.522×L-Kynurenine+0.481×Cyclic AMP-1.551×Ibuprofen-0.838×3,3',5-Triiodo-L-thyronine+0.425×β-Pseudouridine，其阈值cut-off为0.1160。采用ROC曲线评价该多元COX风险比例模型用以区分冠心病患者出现死亡的预测效能AUC＝84.32％，比氧化三甲胺(TMAO)与传统危险因素的预测效能更好，具有更高的临床应用价值，见图1。
实施例2MACE分析的代谢标记物组合分析
一、实验操作
为了鉴定与MACE风险相关的代谢标记物组合，采用COX回归分析代谢物与MACE风险的相关性。具体操作同实施例1。
二、实验结果
在校正了包括年龄、性别、BMI、SYNTAX评分、并发症、肝肾功能和药物治疗在内的潜在混杂因素后，多因素COX回归分析结果显示，仍有20个代谢物与MACE风险有关(P<0.05，表3)，包括溶血卵磷脂20:2(LysoPC 20:2)、溶血卵磷脂20:2(2n同分异构体)(LysoPC 20:2(2n isomer))、5-甲基尿苷(5-Methyluridine)、4-乙酰氨基丁酸(4-Acetamidobutyricacid)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、溶血卵磷脂20:1(LysoPC 20:1)、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、己六醇(Dulcitol)、溶血卵磷脂20:0(LysoPC 20:0)、溶血卵磷脂20:1(2n同分异构体)(LysoPC 20:1(2n isomer))、溶血卵磷脂18:0(2n同分异构体)(LysoPC 18:0(2nisomer))、假尿苷(β-Pseudouridine)、L-胱氨酸(L-Cystine)、二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、氨茶碱(Aminophylline)、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸(S-(5-Adenosy)-L-homocysteine)、犬尿酸(Kynurenic acid)、L-色氨酸(L-Tryptophan)、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺(Phenylacetyl-L-glutamine)。
本研究采用ROC曲线分析，根据AUC大小进一步评价上述20种代谢标记物联合临床资料对冠心病患者MACE风险的预测效能，AUC越高，表明预测效能越好(表3)。在20个代谢物中，每个代谢物单独与临床资料构建预测模型，所得的ROC曲线区分冠心病患者出现MACE的效能AUC均大于65％，具有临床应用意义。
联合20个代谢标记物和临床资料以筛选出最优的预测模型，并进一步通过该多元COX回归模型鉴定这些代谢物是否为MACE的独立危险因素。结果显示，降低的L-色氨酸(L-Tryptophan，HR(95％CI):0.69(0.50-0.94),P＝0.0182)和溶血卵磷脂20:2(LysoPC 20:2，HR(95％CI):0.44(0.30-0.65),P<0.0001)以及增加的5-甲基尿苷(5-Methyluridine，HR(95％CI):1.41(1.19-1.67),P<0.0001)和L-犬尿氨酸(L-Kynurenine，HR(95％CI):1.50(1.16-1.93),P＝0.0018)是MACE的独立危险因素(表4)。
基于代谢标记物组合和临床资料构建最优的多元COX风险比例模型，该模型包括6个代谢标记物，包括L-色氨酸(L-Tryptophan)、5-甲基尿苷(5-Methyluridine)、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、苯乳酸(phenyllactate(PLA))、溶血卵磷脂20:2(LysoPC 20:2)(表4)，该预测模型的方程为y＝DM×0.318+0.241×CCB+0.475×PPI+0.012×AST+0.013×SYNTAX-0.374×L-Tryptophan+0.343×5-Methyluridine+0.115×D-Sorbitol+0.404×L-Kynurenine+0.143×phenyllactate-0.819×LysoPC 20:02，其阈值cut-off为0.2021。采用ROC曲线评价该多元COX风险比例模型用以区分冠心病患者出现MACE的预测效能AUC＝73.56％，比氧化三甲胺(TMAO)与传统危险因素的预测效能更好，具有更高的临床应用价值，见图2。
实施例3心功能不全(LVEF<50％)的代谢标记物组合分析
一、实验操作
为了鉴定与心功能不全相关的血浆代谢物，用Logistic回归分析血浆代谢物与心功能不全(LVEF<50％)的相关性。根据LVEF值的大小将833例有LVEF资料的患者分为两组，LVEF<50％(病例)152例，LVEF≥50％(对照)681例。
具体步骤如实施例1。
二、实验结果
在对包括人口统计学、临床测量、普遍存在的合并症和伴随使用药物在内的几种潜在混杂因素进行校正后，多因素Logistic回归分析分析结果显示32个代谢物与LVEF的关系具有统计学意义(P<0.05，表5)，包括二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、肌酸(Creatine)、N6-乙酰-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine)、L-胱氨酸(L-Cystine)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、己酰甘氨酸(Hexanoyl glycine)、假尿苷(β-Pseudouridine)、3-羟基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、N6-琥珀酰腺苷(N6-Succinyl Adenosine)、辛二酸(SubericAcid)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、月桂酸(Lauric Acid(C12:0))、甲基丁二酸(2-Methylsuccinic acid)、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物(CyclicAMP)、犬尿酸(Kynurenic acid)、4-乙酰氨基丁酸(4-Acetamidobutyric acid)、N-(3-甲基-1-氧代-2-丁烯酸)氨基乙酸(3-Methylcrotonyl glycine)、己六醇(Dulcitol)、2,6-二甲基苯胺(2,6-Dimethylaniline)、1,3-二甲基尿酸(1,3-Dimethyluric acid)、己二酸(AdipicAcid)、高香草酸(Homovanillic acid)、N-乙酰基甘氨酸(N-acetylglycine)、4-胍基丁酸(4-Guanidinobutyric acid)、十二烷二酸(Dodecanedioic aicd)、左旋甲状腺素(L-Thyroxine)、吲哚-3-丁酸(3-Indolebutyric acid)、甲基组氨酸(tau-Methylhistidine)、苹果酸盐(Malate)、对-羟苯基乳酸(HPLA)(DL-P-hydroxyphenyllactic acid)。
本研究采用ROC曲线分析，根据AUC大小进一步评价上述30种代谢标记物联合临床资料对冠心病患者心功能不全风险的预测效能，AUC越高，表明预测效能越好(表5)。在30个代谢物中，每个代谢物单独与临床资料构建预测模型，所得的ROC曲线区分冠心病患者出现心功能不全的效能AUC均大于70％，具有临床应用意义。
联合30个代谢标记物和临床资料筛选最优的预测模型，并进一步通过该多元COX回归模型鉴定这些代谢物是否为心功能不全的独立危险因素。结果显示，左旋甲状腺素(L-Thyroxine,OR(95％CI):1.48(1.00-2.18),P＝0.050)、肌酸(Creatine,OR(95％CI):1.85(1.14-3.01),P＝0.012)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA),OR(95％CI):1.37(1.04-1.81),P＝0.024)、月桂酸(Lauric Acid(C12:0),OR(95％CI):1.38(1.09-1.76),P＝0.008)、二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine,OR(95％CI):1.69(1.14-2.49),P＝0.009)、N6-乙酰-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine,OR(95％CI):1.64(1.13-2.39),P＝0.010)、1,3-二甲基尿酸(1,3-Dimethyluric acid,OR(95％CI):1.10(1.02-1.19),P＝0.010)是心功能不全的独立危险因素(表6)。
基于代谢标记物组合和临床资料构建最优的多元COX风险比例模型，该模型包括8个代谢标记物，包括己酰甘氨酸(Hexanoyl glycine)、左旋甲状腺素(L-Thyroxine)、肌酸(Creatine)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、月桂酸(Lauric Acid(C12:0))、二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、N6-乙酰-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine)、1,3-二甲基尿酸(1,3-Dimethyluric acid)(表6)，该预测模型的方程为y＝1.127×SEX+1.326×arrhythmia-0.681×HyperT+1.058×BB–0.783×CCB+0.025×AST+0.046×SYNTAX+0.222×Hexanoyl glycine+0.390×L-Thyroxine+0.618×Creatine+0.318×phenyllactate+0.323×Lauric Acid+0.523×2-(dimethylamino)guanosine+0.496×N6-Acetyl-L-lysine+0.099×1,3-Dimethyluric acid-4.741，其阈值cut-off为0.2021。采用ROC曲线评价该多元COX风险比例模型用以区分冠心病患者出现心功能不全的预测效能AUC＝80.92％，具有临床应用价值，见图3。
实施例4一种预测冠心病预后风险试剂盒
一、一种预测冠心病预后风险试剂盒
试剂盒包括代谢标记物的标准品：1,3-二甲基尿酸(1,3-Dimethyluric acid)、2,6-二甲基苯胺(2,6-Dimethylaniline)、3-羟基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、4-胍基丁酸(4-Guanidinobutyric acid)、4-乙酰氨基丁酸(4-Acetamidobutyric acid)、5-甲基尿苷(5-Methyluridine)、5-脱氧-5-甲硫腺苷(5'-Deoxy-5'-(methylthio)adenosine)、DL-3-苯基乳酸(phenyllactate(PLA))、D-山梨糖醇(D-Sorbitol)、L-胱氨酸(L-Cystine)、L-瓜氨酸(L-Citrulline)、L-犬尿氨酸(L-Kynurenine)、L-色氨酸(L-Tryptophan)、N-(3-甲基-1-氧代-2-丁烯酸)氨基乙酸(3-Methylcrotonyl glycine)、N6-琥珀酰腺苷(N6-SuccinylAdenosine)、N6-乙酰-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine)、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺(Phenylacetyl-L-glutamine)、N-乙酰-L-酪氨酸(N-Acetyl-L-tyrosine)、N-乙酰基甘氨酸(N-acetylglycine)、N-乙酰基亮氨酸(N-acetyl-l-leucine)、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸(S-(5-Adenosy)-L-homocysteine)、氨茶碱(Aminophylline)、苯乙醛酸(Benzoylformicacid)、对-羟苯基乳酸(DL-P-hydroxyphenyllactic acid)、二甲基鸟苷(2-(dimethylamino)guanosine)、高香草酸(Homovanillic acid)、肌酸(Creatine)、己二酸(AdipicAcid)、己六醇(Dulcitol)、己酰甘氨酸(Hexanoyl glycine)、甲基丁二酸(2-Methylsuccinic acid)、甲基组氨酸(tau-Methylhistidine)、假尿苷(β-Pseudouridine)、苹果酸盐(Malate)、犬尿酸(Kynurenic acid)、溶血卵磷脂18:0(2n同分异构体)(LysoPC18:0(2n isomer))、溶血卵磷脂20:1(2n同分异构体)(LysoPC 20:1(2n isomer))、溶血卵磷脂20:0(LysoPC 20:0)、溶血卵磷脂20:1(LysoPC 20:1)、溶血卵磷脂20:2(LysoPC 20:2)、溶血卵磷脂20:2(2n同分异构体)(LysoPC 20:2(2n isomer))、三碘甲状腺原氨酸(3,3',5-Triiodo-L-thyronine)、十二烷二酸(Dodecanedioic aicd)、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物(CyclicAMP)、辛二酸(SubericAcid)、氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide)、异丁苯丙酸(Ibuprofen)、吲哚-3-丁酸(3-Indolebutyric acid)、月桂酸(LauricAcid(C12:0))、左旋甲状腺素(L-Thyroxine)，各标准品分别封装。
血浆代谢物提取溶剂：100％乙腈和100％甲醇(用于QTRAP-UPLC-MS/MS样品制备)；QTRAP-UPLC-MS/MS筛选表征中，100％甲醇可以用作溶解标准品的溶剂。
内标：L-Kynurenine-d4
本检测试剂盒，并不需要完全包含上述50个代谢标记物的标准品，可以仅使用其中几个进行组合。这些标准品可以单独封装，也可以制成混合物封装。
该试剂盒是基于本发明提供的代谢标记物而设计的，可以用于筛选无症状或症状不明显但生存风险高的冠心病患者。二、试剂盒的使用方法
所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
S1.待测样本的采集和预处理；
S2.通过色谱质谱联用的代谢组学分析方法分析鉴定样本中内源性代谢物；
S3.根据所测的上述可用于预测冠心病预后的代谢标记物水平，应用预测模型以评估冠心病患者的死亡、主要不良心血管事件和心功能不全风险。
当待测样品为血浆时，步骤S1中，预处理包括以下步骤：
(1)血浆样品于4℃冻融，取血浆50μL，加入150μL甲醇，涡旋3分钟以沉淀蛋白；
(2)然后于4℃12,000rpm离心10分钟；
(3)取上清液于4℃12,000rpm再次离心3分钟；
(4)将步骤(3)的上清液用于UPLC-MS/MS分析。
步骤S2中，色谱质谱联用的代谢组学分析采用超高效液质联用(UPLC-MS/MS)系统(UPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A；MS，Applied Biosystems 4500QTRAP)进行了广泛靶向的代谢谱分析，该方法检测限低、灵敏度高，能灵敏地分析检测生物样本中的代谢标记物并对其定量。
步骤S2中，液相色谱质谱联用测试的质控分析包括：在样品分析前用样品提取物混合制备而成的质量控制(QC)样品的进行校准，在仪器分析的过程中，每10个分析样品中插入一个质量控制(QC)样品。
步骤S2中，液相色谱质谱联用测试的色谱条件包括：Waters ACQUITYUPLC HSST3C18色谱柱(孔尺寸1.8μM，长2.1×100mm)，经水(0.04％乙酸)-乙腈(0.04％乙酸)的梯度洗脱。梯度洗脱步骤如下：0分钟水/乙腈95：5V/V，11.0分钟为5:95V/V，12.0分钟为5:95V/V，12.1分钟为95:5V/V，14.0分钟为95：5V/V。流速为0.35mL/min，柱温为40℃，进样量为5μL。质谱条件包括：由ESI离子源Turbo Ion-Spray、线性离子阱和三重四极杆(QQQ)串联组成的ESI-triple quadrupole-linear ion trap(QTRAP)–MS质谱系统，采用电喷雾离子源的正离子和负离子模式采集。电喷雾离子源温度550℃，离子喷雾电压(IS)5500V，帘气(CUR)25.0psi，碰撞诱导电离(CAD)参数设置为高，碰撞气体(氮气)为5psi。代谢物定量是利用三重四级杆(QQQ)扫描的多反应监测模式(MRM)进行的，每个离子对都是根据优化的去簇电压(DP)和碰撞能(CE)进行扫描检测的。质谱分析的原始数据由Analyst 1.6软件(AB Sciex)处理。
表1为实施例1中预测冠心病死亡风险的血浆代谢标记物及单个差异代谢标记物对死亡风险的预测效能AUC：
AUC为ROC曲线下面积；HR(95％CI)为风险比(95％置信限)；P值<0.05为有显著意义。
表2可独立预测死亡风险的多元COX风险比例模型参数
表3为实施例2中预测冠心病MACE风险的血浆代谢标记物及单个差异代谢标记物对MACE风险的预测效能AUC：
AUC为ROC曲线下面积；HR(95％CI)为风险比(95％置信限)；P值<0.05为有显著意义。
表4可独立预测MACE风险的多元COX风险比例模型参数：
表5为实施例3中与心功能不全相关的代谢标记物的Logistics回归分析结果及单个差异代谢标记物对心功能不全风险的预测效能AUC：
AUC为ROC曲线下面积；OR(95％CI)为比值比(95％置信限)；P值<0.05为有显著意义。
表6可独立预测心功能不全风险的多元logistics回归模型参数：

Claims (9)

1.内源性代谢物在作为预测冠心病预后风险的标记物或制备预测冠心病预后风险试剂盒中的应用，其特征在于，所述内源性代谢物为1,3-二甲基尿酸、2,6-二甲基苯胺、3-羟基丁酸、4-胍基丁酸、4-乙酰氨基丁酸、5-甲基尿苷、5-脱氧-5-甲硫腺苷、DL-3-苯基乳酸、D-山梨糖醇、L-胱氨酸、L-瓜氨酸、L-犬尿氨酸、L-色氨酸、N-(3-甲基-1-氧代-2-丁烯酸)氨基乙酸、N6-琥珀酰腺苷、N6-乙酰-L-赖氨酸、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、N-乙酰-L-酪氨酸、N-乙酰基甘氨酸、N-乙酰基亮氨酸、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸、氨茶碱、苯乙醛酸、对-羟苯基乳酸、二甲基鸟苷、高香草酸、肌酸、己二酸、己六醇、己酰甘氨酸、甲基丁二酸、甲基组氨酸、假尿苷、苹果酸盐、犬尿酸、溶血卵磷脂 18:0（2n 同分异构体）、溶血卵磷脂 20:1（2n同分异构体）、溶血卵磷脂20:0、溶血卵磷脂20:1、溶血卵磷脂20:2、溶血卵磷脂20:2（2n同分异构体）、三碘甲状腺原氨酸、十二烷二酸、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物、辛二酸、氧化三甲胺、异丁苯丙酸、吲哚-3-丁酸、月桂酸、左旋甲状腺素中的一种或几种的组合。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述冠心病预后风险为死亡风险、主要不良心血管事件风险和心功能不全风险。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，当冠心病预后风险为死亡风险时，所述代谢标记物为4-乙酰氨基丁酸、假尿苷、己六醇、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸、D-山梨糖醇、L-犬尿氨酸、N6-琥珀酰腺苷、L-胱氨酸、犬尿酸、二甲基鸟苷、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物、对-羟苯基乳酸、异丁苯丙酸、氧化三甲胺、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、肌酸、己二酸、N-(3-甲基-1-氧代-2-丁烯酸)氨基乙酸、N-乙酰-L-酪氨酸、5-脱氧-5-甲硫腺苷、N-乙酰基亮氨酸、DL-3-苯基乳酸、苯乙醛酸、L-瓜氨酸、三碘甲状腺原氨酸、N6-乙酰-L-赖氨酸、L-色氨酸中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述代谢标记物为L-色氨酸、苯乙醛酸、D-山梨糖醇、L-犬尿氨酸、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物、异丁苯丙酸、3,3',5-三碘-L-甲状腺素、假尿苷中的一种或几种的组合。
5.根据权利要求2所述应用，其特征在于，当冠心病预后风险为主要不良心血管事件风险时，所述代谢标记物为溶血卵磷脂20:2、溶血卵磷脂20:2（2n同分异构体）、5-甲基尿苷、4-乙酰氨基丁酸、L-犬尿氨酸、溶血卵磷脂20:1、D-山梨糖醇、己六醇、溶血卵磷脂20:0、溶血卵磷脂 20:1（2n 同分异构体）、溶血卵磷脂 18:0（2n 同分异构体）、假尿苷、L-胱氨酸、二甲基鸟苷、DL-3-苯基乳酸、氨茶碱、S-(5-腺苷)-L-高半胱氨酸、犬尿酸、L-色氨酸、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺中的一种或几种的组合。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述代谢标记物为L-色氨酸、5-甲基尿苷、D-山梨糖醇、L-犬尿氨酸、苯乳酸、溶血卵磷脂20:2中的一种或几种的组合。
7.根据权利要求2所述应用，其特征在于，当冠心病预后风险为心功能不全风险时，所述代谢标记物为二甲基鸟苷、肌酸、N6-乙酰-L-赖氨酸、L-胱氨酸、L-犬尿氨酸、己酰甘氨酸、假尿苷、3-羟基丁酸、N6-琥珀酰腺苷、辛二酸、DL-3-苯基乳酸、月桂酸、甲基丁二酸、腺苷-3'-5'-环单磷酸水合物、犬尿酸、4-乙酰氨基丁酸、N-(3-甲基-1-氧代-2-丁烯酸)氨基乙酸、己六醇、2,6-二甲基苯胺、1,3-二甲基尿酸、己二酸、高香草酸、N-乙酰基甘氨酸、4-胍基丁酸、十二烷二酸、左旋甲状腺素、吲哚-3-丁酸、甲基组氨酸、苹果酸盐、对-羟苯基乳酸中的一种或几种的组合。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述代谢标记物为己酰甘氨酸、左旋甲状腺素、肌酸、DL-3-苯基乳酸、月桂酸、二甲基鸟苷、N6-乙酰-L-赖氨酸、1,3-二甲基尿酸中的一种或几种的组合。
9.一种预测冠心病预后风险试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述内源性代谢物的标准品和/或检测权利要求1所述内源性代谢物的检测试剂。
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