CN114813986B - 一组用于预测高危型扩张型心肌病的脂质代谢物组 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一组用于预测高危型扩张型心肌病的脂质代谢物组，所述的血清脂质代谢物组包含：二酰基甘油DAG 36:1(18:1/18:0)、三酰基甘油TAG 46:1(16:1)、TAG 52:0(18:0)、胆固醇酯CE 16:1、磷脂酰乙醇胺PE 38:6p、PE 40:5p、神经节苷脂GM3 18:1/18:1、和葡萄糖基神经酰胺GluCerd 18:0/24:1。根据以上8种脂质代谢物和3种临床危险因素(左室射血分数、B型利钠肽、C反应蛋白)构成的联合评分能够预测扩张型心肌病患儿的复合不良事件(全因死亡/心脏移植/因心衰再住院)。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体的，涉及一组用于预测高危型扩张型心肌病的脂质代谢物组。
背景技术
扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)主要表现为左心室扩大及收缩功能的异常，在未成年人患病率约为0.57-1.13/100000(Lipshultz SE,et al.N Engl JMed.2003)(Towbin JA,et al.JAMA,2006)，它是造成儿童发生充血性心力衰竭最为常见的原因之一，也是儿童心脏移植的首要原因(Lipshultz SE,et al.Future Cardiol.2013)。扩张型心肌病的预后普遍不良，美国、澳大利亚及欧洲的注册研究发现DCM患儿五年内的生存率为25％-40％(Lee TM,et al.Circ Res.2017)。
从DCM患儿中识别出可能发生不良事件的“高危”患者，一直是领域中非常棘手的问题(Kantor PF,et al.Expert Rev Cardiovasc Ther 2016)。为了识别处于高危期的DCM患儿，前人对于危险因素的分析结果确认了很多显而易见的预测因子，特别是影像学指标，如射血分数、左室扩大等，更低的射血分数和心室扩张可能提示预后不良(Alexander PM,et al.Circulation 2013)。因此，目前的指南推荐连续的超声心动图监测可以应用于反应扩张型心肌病患儿的病情和预测不良事件(Kantor PF,et al.Can J Cardiol.2013)。除此之外，血清标志物对于评价DCM病情进展和指导疾病的治疗起到了非常重要的作用(LeeTM,et al.Circ Res.2017)。尽管既往的前瞻性队列研究发现BNP升高是DCM患儿不良事件的独立预测因子(Gardner RS,et al.Eur Heart J.2003),但是单独利用BNP监测病情和指导治疗在临床应用中仍有争议，充满了不确定性(Bayes-Genis A,et al.EJIFCC.2016)。这主要是因为BNP在心肌病中作为反映心室容量负荷的指标,其上调有赖于心肌细胞和神经体液调节及免疫系统的相互作用(Cantinotti M,et al.Heart Fail Rev.2014Nov；19(6):727-42)，因此对于心肌细胞早期的病理改变不敏感。因此，基于多个血清标志物对患者进行更为精确的危险分层，从而在早期识别高危患儿，指导下一步的治疗，这对于DCM的二级预防非常重要。虽然诸多血清标志物对成人扩张型心肌病不良事件的发生具有预测价值(Gopal DM,J Cardiovasc Transl Res.2013)，但是目前针对于儿童DCM这一群体的血清标志物研究仍有待进一步探究。
影响扩张型心肌病病理过程的因素十分复杂，包括遗传，环境等因素。尽管这些因素对于机体的影响不尽相同，但最终都会表现出机体代谢的异常，而代谢功能的异常也可以反映心肌病致病因素间的相互作用(Lewis GD,et al.J Am Coll Cardiol.2008)。既往文献报道(Dávila-Román VG,et al.J Am Coll Cardiol.2002)，扩张型心肌病患者存在着能量代谢异常，主要表现在脂代谢功能减弱，糖代谢功能增强。此外，异常表达的脂质代谢产物不仅可以参与心肌细胞的能量代谢(Zhang L,et al.Cardiovascularresearch.2011)，也可以作为信号分子参与调控心肌病引发心衰的其它病理过程,如心肌纤维化(O'Connell TD，et al.J Mol Cell Cardiol.2017)、心脏肥大(Alewijnse AE，etal.Br J Pharmacol.2004)和心肌细胞凋亡(Karliner JS,et al.Biochim BiophysActa.2002)等，这为心肌病的脂质代谢组学研究提供了分子学依据。脂质代谢组学是对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方法。通过脂质代谢组学技术不仅可以筛选出心血管疾病特异性的血清标志物(Fan Y,et al.JAm Coll Cardiol.2016),同时可以筛选出与病理过程相关的潜在治疗靶点(Rhodes CJ,etal.Circulation.2017)。同时，在成人扩心病队列中，已经利用脂质代谢组学研究发现血清脂质标志物不仅与临床事件相关，而且还与中间表型——心脏形状和体积的变化相关，探究了脂质组学与扩心病潜在的病理生理学关联(Sysi-Aho M,et al.PLoS One.2011)。然而，血清脂质标志物在儿童扩张型心肌病中的预测价值尚不得而知。
发明内容
基于上述现有的临床问题，本发明研究了血清中脂质代谢物水平和扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者风险情况之间的关系，本发明选择138名DCM患者，利用脂质代谢物分析方法对DCM患者血清中的脂质水平进行了定量。统计结果显示，脂质代谢物水平可以用作区分高危期DCM患者的预测指标，相比于现有临床检测产品，脂质代谢物能够更好的区分出发生近远期不良事件的DCM患者。
本发明涉及的脂质代谢物缩写对应的具体脂质成份为：
DAG：二酰基甘油；TAG：三酰基甘油；CE：胆固醇酯；PE：磷脂酰乙醇胺；GM3：神经节苷脂；GluCerd：葡萄糖基神经酰胺。
脂质代谢物命名中的数字注释为XX:Y，其中，
XX＝脂肪酸酰基链上的碳原子数,，Y＝脂肪酸酰基链上的双键个数；
XX:Y/MM:N表示，该脂质的第1条脂肪酸链上有XX个碳原子和Y个双键；第2条脂肪酸链上有MM个碳原子和N个双键。
本发明首先涉及一组血清脂质代谢物组水平在制备区分高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者的检测试剂盒中的应用；
所述的血清脂质代谢物组包含：
DAG(甘油二酰基)36:1(18:1/18:0)、TAG(甘油三酰基)46:1(16:1)、TAG(甘油三酰基)52:0(18:0)、CE(胆甾醇酯)16:1、PE(磷脂酰乙醇胺)38:6p、PE(磷脂酰乙醇胺)40:5p、GM3(神经节苷脂)18:1/18:1、和GluCerd(葡萄糖基神经酰胺)18:0/24:1；
所述的高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为确诊DCM后发生：死亡、心脏移植和因心力衰竭再住院等不良事件的患者；
所述的确诊DCM为：患者至少具有下述2个临床标准：
(1)有症状的心力衰竭；
(2)左心室或双心室收缩功能障碍，所述收缩功能障碍为异常左室缩短分数≤25％；
(3)不能以负荷异常或冠状动脉疾病解释的心室扩张，所述心室扩张为根据体表面积和年龄校正后左室舒张末径(ED)校正值>2倍标准差。
所述的区分高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为：
根据患者的血清脂质代谢物水平进行脂质评分计算，所述的脂质评分的计算方法为：
脂质评分＝[0.226×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.088×TAG 46:1(16:1)]+[0.206×CE 16:1]-[0.031×PE 38:6p]-[0.287×PE 40:5p]-[0.043×PG 36:2(18:0)]-[0.100×GM3 18:1/18:1]-[0.256×GluCer d18:0/24:1]；
或，
根据患者的血清脂质代谢物水平和左室射血分数、B型利钠肽和C反应蛋白数值，组合后联合评分数值大于1.2；
所述的联合评分的计算方法为：
联合评分＝[-0.049×左室射血分数(％)]+[0.389×BNP(pg/mL)]+[0.036×C反应蛋白(umol/L)]+[0.350×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.071×TAG 46:1(16:1)]+[0.055×TAG 52:0(18:0)]+[0.307×CE 16:1]-[0.034×PE 38:6p]-[0.293×PE 40:5p]-[0.206×GM3 18:1/18:1]-[0.294×GluCer d18:0/24:1]；
其中脂质代谢物的值为根据健康儿童脂质代谢物的均值和标准差进行z值转换后的值；
脂质代谢物z值转换计算公式：
脂质代谢物z值＝(脂质代谢物原始检测值-健康对照组代谢物检测均值)/健康对照组代谢物标准差。
所述的血清脂质代谢物水平通过如下方法定量
(1)萃取血清样品中的脂质代谢物；
(2)检测脂质代谢物的含量；
步骤(1)的具体方法为，
1)将氯仿：甲醇＝1:2(v/v)的冰溶剂混合物900ml加入到100ml的血清样品中，涡旋，在暗室冰上搅拌1小时；
2)孵育后，向匀浆中加入0.3ml氯仿，再加入0.35ml冰水；
3)将匀浆涡旋30秒，以9000转/分钟离心2分钟；
4)将下层有机相转移到新的试管中，加入0.5ml冰氯仿进行再提取，并在氮气中干燥。
步骤(2)的具体方法为，
1)极性脂质，使用UPLC超高效液相色谱进行检测和定量分析：
具体方法如下，在Shimadzu Exion UPLC超高效液相色谱系统上，使用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)扫描，并结合Sciex 6500Plus QTRAP系统进行检测和定量分析
使用Phenomenex Luna 3u硅胶柱(i.d.150×2.0mm)进行单个极性脂质分离，条件如下:
流动相A：三氯甲烷:甲醇:氢氧化铵的比例为89.5：10：0.5，
流动相B：三氯甲烷:甲醇:氢氧化铵：水的比例为55：39：0.5：5.5。
单个极性脂质种类的定量参考内标包括：PC-14:0/14:0、PE-14:0/14:0、PS-34:1/d31、PA-17:0/17:0、PG-14:0/14:0、PI-34:1/d31、LPC-C17:0、LPE-C17:0、C8-GluCer、C17-Cer、C14-LBPA、S1P d17:1和C12-SM和GM3 d18:1/17:0分别用于定量极性脂质。
2)中性脂类，采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)对单个脂质代谢物进行鉴定，具体的，
使用高效液相色谱(Agilent 1100,Agilent 1200)系统和4000Q-Trap质谱仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)；
HPLC方法为，使用Phenomenex Kinetex 2.6μ-C18柱(i.d.4.6x100mm)进行分离。
高效液相色谱法的条件为：
流动相：三氯甲烷：甲醇：乙酸铵按照100:100:4的比例，
流速为150μl/min，共进行17min；
分离柱温度设定为25℃；
MS方法为，
在正电喷雾电离模式和负电喷雾电离模式下，以质谱扫描方式进行记录，电喷雾电离条件为：
正电喷雾电离模式电压为5000V，
负电喷雾电离模式电压为-4500V；
原温度为250℃；
扫描速率为1000amu/s；
气帘气压力：25；
扫描范围：300–1100da。
本发明还涉及一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒中包括检测血清脂质代谢物组的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂盒用于区分高危期的扩张型心肌病(DilatedCardiomyopathy，DCM)患者；
所述的血清脂质代谢物组包含：
DAG(甘油二酰基)36:1(18:1/18:0)、TAG(甘油三酰基)46:1(16:1)、TAG(甘油三酰基)52:0(18:0)、CE(胆甾醇酯)16:1、PE(磷脂酰乙醇胺)38:6p、PE(磷脂酰乙醇胺)40:5p、GM318:1/18:1、和GluCerd(葡萄糖基神经酰胺)18:0/24:1；
所述的高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为确诊DCM后发生：死亡、心脏移植和因心力衰竭再住院等不良事件的患者；
所述的确诊DCM为：患者至少具有下述2个临床标准：
(1)有症状的心力衰竭；
(2)左心室或双心室收缩功能障碍，所述收缩功能障碍为异常左室缩短分数≤25％；
(3)不能以负荷异常或冠状动脉疾病解释的心室扩张，所述心室扩张为根据体表面积和年龄校正后左室舒张末径(ED)校正值>2倍标准差。
进一步的，所述的检测试剂盒还包括，检测B型利钠肽和C反应蛋白的检测试剂。
所述的区分高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为：
根据患者的血清脂质代谢物水平进行脂质评分计算，所述的脂质评分的计算方法为：
脂质评分＝[0.226×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.088×TAG 46:1(16:1)]+[0.206×CE 16:1]-[0.031×PE38:6p]-[0.287×PE 40:5p]-[0.043×PG 36:2(18:0)]-[0.100×GM3 18:1/18:1]-[0.256×GluCer d18:0/24:1]；
或
根据患者的血清脂质代谢物水平和左室射血分数、B型利钠肽和C反应蛋白数值，组合后联合评分数值大于1.2；
所述的联合评分的计算方法为：
联合评分＝[-0.049×左室射血分数(％)]+[0.389×BNP(pg/mL)]+[0.036×C反应蛋白(umol/L)]+[0.350×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.071×TAG 46:1(16:1)]+[0.055×TAG 52:0(18:0)]+[0.307×CE 16:1]-[0.034×PE38:6p]-[0.293×PE 40:5p]-[0.206×GM3 18:1/18:1]-[0.294×GluCer d18:0/24:1]；
其中脂质代谢物的值为根据健康儿童脂质代谢物的均值和标准差进行z值转换后的值。
本发明还涉及一种区分高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者的方法，所述的方法包括如下步骤：
(1)检测患者的血清脂质代谢物组水平；
(2)检测患者的左室射血分数、B型利钠肽和C反应蛋白；
(3)通过LASSO COX回归模型计算风险评分
所述的血清脂质代谢物组包含：
DAG(甘油二酰基)36:1(18:1/18:0)、TAG(甘油三酰基)46:1(16:1)、TAG(甘油三酰基)52:0(18:0)、CE(胆甾醇酯)16:1、PE(磷脂酰乙醇胺)38:6p、PE(磷脂酰乙醇胺)40:5p、GM3 18:1/18:1、和GluCerd(葡萄糖基神经酰胺)18:0/24:1；
所述的高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为确诊DCM后发生：死亡、心脏移植和因心力衰竭再住院等不良事件的患者；
所述的确诊DCM为：患者至少具有下述2个临床标准：
1)有症状的心力衰竭；
2)左心室或双心室收缩功能障碍，所述收缩功能障碍为异常左室缩短分数≤25％；
3)不能以负荷异常或冠状动脉疾病解释的心室扩张，所述心室扩张为根据体表面积和年龄校正后左室舒张末径(ED)校正值>2倍标准差。
进一步的，所述的方法的步骤(1)中还包括：检测患者的左室射血分数、检测患者的血清B型利钠肽和C反应蛋白水平；
所述的区分高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为：
根据患者的血清脂质代谢物水平进行脂质评分计算，所述的脂质评分的计算方法为：
脂质评分＝[0.226×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.088×TAG 46:1(16:1)]+[0.206×CE 16:1]-[0.031×PE38:6p]-[0.287×PE 40:5p]-[0.043×PG 36:2(18:0)]-[0.100×GM3 18:1/18:1]-[0.256×GluCer d18:0/24:1]；
或
根据患者的血清脂质代谢物水平和左室射血分数、B型利钠肽和C反应蛋白数值，组合后联合评分数值大于1.2；所述的联合评分的计算方法为：
联合评分＝[-0.049×左室射血分数(％)]+[0.389×BNP(pg/mL)]+[0.036×C反应蛋白(umol/L)]+[0.350×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.071×TAG 46:1(16:1)]+[0.055×TAG 52:0(18:0)]+[0.307×CE 16:1]-[0.034×PE38:6p]-[0.293×PE 40:5p]-[0.206×GM3 18:1/18:1]-[0.294×GluCer d18:0/24:1]。
其中脂质代谢物的值为根据健康儿童脂质代谢物的均值和标准差进行z值转换后的值。
本发明的有益效果在于：
(1)发现了一组在儿童扩张型心肌病中具有预测价值的血清脂质标志物，使用该脂质代谢组水平，可以预测高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者；
(2)结合现有临床指标(左室射血分数、B型利钠肽和C反应蛋白水平)后，能够更为精准的预测高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者；
(3)使用本发明的方法，能够更好的预测DCM患者的患病风险，从而在早期进行干预和监控，更好的改善DCM患者的治疗效果。
附图说明
图1.本发明研究流程图：经两轮筛选，其中符合入组标准的DCM患儿共有138名。
图2.发现队列中，临床、脂质和联合评分的时间依赖受试者工作曲线下面积。
图3.验证队列中，临床、脂质和联合评分的时间依赖受试者工作曲线下面积。
图4.验证队列中，Kaplan-Meier曲线估计生存。按联合评分的中位数分高危、低危组。
图5.临床、脂质和联合评分与心功能的相关性。
A.发现队列中，临床、脂质和联合评分与基线左室射血分数的相关性。
B.发现队列中，临床、脂质和联合评分与左室射血分数改变的相关性。
C.验证队列中，临床、脂质和联合评分与基线左室射血分数的相关性。
D.验证队列中，临床、脂质和联合评分与左室射血分数改变的相关性。
左室射血分数改变＝随访左室射血分数-基线左室射血分数。
具体实施方式
实施例1：基于血清脂质组学的风险评分与儿童扩张型心肌病(DCM)不良事件发生的相关性研究
本发明的研究是按照赫尔辛基宣言的原则设计和实施的，并经北京安贞医院伦理委员会批准并获得所有知情同意书。更多细节详见Clinical Trials.gov(NCT03076580)。
图1显示了本发明研究的流程图。AOCC研究(中国心肌病患者诊断和预后研究)是一项双中心，观察性，前瞻性，综合性，多组学的研究。所有儿童(<18岁)于2015年9月至2019年12月在北京安贞医院和阜外医院就诊。所有患者分为发现队列和验证队列。
扩张型心肌病和心力衰竭由至少3名有经验的心脏病专家诊断和鉴定。
扩张型心肌病被定义为：患者至少具有下述2个临床标准：
(1)有症状的心力衰竭；
(2)左心室或双心室收缩功能障碍；
(3)不能以负荷异常或冠状动脉疾病解释的心室扩张。
收缩功能障碍定义为：
异常左室缩短分数(FS≤25％)。并且，心室扩张被定义为根据体表面积(BSA)和年龄校正后左室舒张末径(ED)校正值>2倍标准差(den Boer SL，et al.Am JCardiol.2016)。
排除标准包括：
(1)发热；
(2)免疫性疾病；
(3)风湿热史；
(4)已知心脏损伤的内分泌疾病；
(5)预期生存天数<30天；
(6)具有慢性肝病史或ALT>80U/L；
(7)既往有肾功能不全的病史。
所有患者均每3个月进行一次随访。后续数据通过病历，电话访谈以及病人在门诊诊所对医务人员的定期访问等途径获得。
健康对照儿童由没有心血管疾病证据的体检儿童、或仅诊断为普通发热的儿童组成，通过既往病史、生化检查、体格检查和超声心动图检查排除心血管疾病。
实施例2、样本和数据采集
从入组患者清晨空腹采集血液样品，装入抗凝剂的无菌聚烯烃树脂管中，然后在医院检验中心中以3000rpm离心10分钟。利用一次性滴管迅速吸取上清液，分装后在-80℃下保存。
所有检测样品分析前将在-80℃保存时间均在2年以内。
所有受试者/入组患者数据都来自医院的电子病历系统。
实验室数据、超声心动图、样本定量按照既往已经发表的参考文献以公开的方式进行记录(Jiao M,You HZ,Yang XY,Yuan H,Li YL,Liu WX,Jin M,Du J.Circulatingmicrorna signature for the diagnosis of childhood dilatedcardiomyopathy.Scientific reports.2018；8:724)。
实施例3、血清脂质代谢物水平测定
脂质的提取是从血清样本(20μl)中，使用修改后的Bligh/Dyer萃取过程(双萃取)，具体萃取步骤如下：
(1)将冰溶剂混合物(900ml氯仿:甲醇，1:2v/v)加入到100ml的血清样品中，涡旋，在暗室冰上搅拌1小时。
(2)孵育后，向匀浆中加入0.3ml氯仿，再加入0.35ml冰水。
(3)然后将匀浆涡旋30秒，以9000转/分钟离心2分钟。
(4)将下层有机相转移到新的试管中，加入0.5ml冰氯仿进行再提取，并在氮气中干燥。
脂质代谢物的检测与定量方法如下：
1.极性脂质，包括磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines,PE)、磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)、磷脂酸(phosphatidic acid,PA)、磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol,PG)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol,PI)、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine,LPE)、葡萄糖基神经酰胺(glucosylceramide,GluCer)、神经酰胺(ceramide,Cer)、溶血双磷脂酸(lysobisphosphatidic acid,LBPA)、鞘氨醇-1-磷酸盐(sphingosinol-1-phosphate,S1P)、鞘磷脂(sphingomyelin,SM)和神经节苷脂(ganglioside,GM3)。
极性脂质，使用UPLC超高效液相色谱进行检测和定量分析，具体的，在ShimadzuExion UPLC超高效液相色谱系统上，使用多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)扫描，并结合Sciex 6500Plus QTRAP系统进行检测和定量分析，具体方法如下：
使用Phenomenex Luna 3u硅胶柱(i.d.150×2.0mm)进行单个极性脂质分离，条件如下:
流动相A：三氯甲烷:甲醇:氢氧化铵的比例为89.5：10：0.5，
流动相B：三氯甲烷:甲醇:氢氧化铵：水的比例为55：39：0.5：5.5。
单个极性脂质种类的定量参考内标包括：来自Avanti Polar Lipids(Alabaster,AL,USA)的PC-14:0/14:0、PE-14:0/14:0、PS-34:1/d31、PA-17:0/17:0、PG-14:0/14:0、PI-34:1/d31、LPC-C17:0、LPE-C17:0、C8-GluCer、C17-Cer、C14-LBPA、S1P d17:1和C12-SM和GM3 d18:1/17:0分别用于定量极性脂质。
2.中性脂类，包括三酰基甘油(triacylglycerol,TAG)、二酰基甘油(diacylglycerol,DAG)和胆固醇酯(cholesteryl ester,CE)
中性脂质的检测与定量是使用高效液相色谱-质谱法级联检测，具体的，高效液相色谱(Agilent 1100,Agilent 1200)系统和4000Q-Trap质谱仪(Applied Biosystems,Foster City,CA),以及3200Q-Trap质谱仪。使用Phenomenex Kinetex 2.6μ-C18柱(i.d.4.6x100mm)进行分离。
高效液相色谱法的条件为：
流动相：三氯甲烷：甲醇：乙酸铵按照100:100:4的比例，流速为150μl/min，共进行17min；
分离柱温度设定为25℃。
在正电喷雾电离模式和负电喷雾电离模式下，以质谱扫描方式进行记录，电喷雾电离条件为：
正电喷雾电离模式电压为5000V，
负电喷雾电离模式电压为-4500V；
原温度为250℃；
扫描速率为1000amu/s；
气帘气压力：25；
扫描范围：300–1100da。
接下来，用高效液相色谱流动相重悬干燥的提取物。总运行时间为30分钟，从柱中洗脱极性脂质和非极性脂质。对于脂质的高效液相色谱/选择离子检测分析，采用Q3质谱分析仪，选取除空白对照中所含离子外的主要离子种作为检测离子。采用液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)对单个脂质代谢物进行了鉴定。在高效液相色谱/多反应监测(HPLC/MRM)分析过程中，为了能特异性地检测单个脂质代谢物，设置了多种多反应监测过渡模式。
用于定量血清三酰基甘油水平的内参包括：TAG(14:0)3-d5、TAG(15:0)3-d29和d5-TAG(16:0)3(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL,USA)。用于定量血清二酰基甘油水平的内参包括：d5-DAG16:0/16:0和d5-DAG18:1/18:1(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL,USA)。定量血清游离胆固醇和胆固醇酯的内参分别为d6-cholesterol和d6-C18:0cholesterol ester(Shui G,et al.J Chromatogr A.2011Jul 15；1218(28):4357-65)。
所有定量实验均采用内标校准。在分析过程中，临床血清样本的检测顺序是随机的，并在每30个样本之间穿插一个质控(quality control,QC)样本。在所有主要脂质类别的分析过程中，整个分析队列的所有QC样本的变异系数保持在12％以内。
实施例4、数据统计分析
连续变量和分类数据分别以平均值±SD或百分比表示。
随访资料按计划收集，脱落的患者(drop-outs)被排除在外。在构建预后评分之前，通过对数转换对脂质代谢物进行归一化。如果患者的血清代谢物未被检测到，则用队列中该代谢物的最低检测水平对此样品进行估算。所有代谢物均根据所有健康个体的均值和标准差进行z值转换，便于比较。使用Cox回归分析来确定预先定义的不良事件(死亡/心脏移植/心衰相关再住院)的预测因子和构建临床评分。使用LASSO(least absoluteshrinkage and selection operator)COX回归构建预后评分(脂质评分、综合评分)。时间依赖的受试者工作特性曲线(ROC)用于评价预后评分对于不良事件的判别能力，而Kaplan-Meier分析则用于可视化地评估在随访时间内预后评分与不良事件的相关性。使用SPSS21.0和R3.4.0版完成数据分析。所有统计学检验都是双尾的，P值<0.05被认为是统计学差异显著的。
实施例5、患者的基本描述
AOCC队列中共有581名心肌病患儿，其中符合入组标准的DCM患儿中共有138名(图1)。其中发现队列中共87人，30名健康对照儿童；验证队列中共51名DCM患儿，15名健康对照儿童。患儿的诊断结合症状、影像学检测结果和实验室检查，经由至少三位以上的心内科医生通过症状及超声心动图结果进行确认。
发现队列(入组时间2015-2017)中的87名DCM心肌病患儿的中位年龄为22.0(IQR:12.0-82.0)月，43.7％为男性。
验证队列(入组时间2017-2019)中的51名DCM心肌病患儿的中位年龄为19.6(IQR：11.7-108.0)月，47.1％为男性。
根据是否发生不良事件分组，表1-1、1-2分别对发现队列和验证队列患儿的基线资料进行描述。
表1-1.小儿扩张型心肌病患者的基线特征(发现队列)
表1-2.小儿扩张型心肌病患者的基线特征(验证队列)
本发明定义不良事件为死亡、心脏移植和因心力衰竭再住院的复合事件。
发现队列中，经过中位32个月的随访，37.9％(33/87)的DCM患儿发生了不良事件。
验证队列中，经过中位23个月的随访，29.4％(15/51)的DCM患儿发生了不良事件。
与未发生不良事件的患儿相比，发生不良事件患儿的BNP水平明显高于未发生事件的患儿。超声结果部分，不良事件组患儿表现为校正后的左室舒张末期直径和左室射血分数明显大于未发生事件组。
实施例6、筛选与不良事件相关的脂质代谢物
在发现队列检测到的540种靶向脂质代谢物中，代表7类的24种不同脂质代谢物被确定为与不良事件显著相关(FDR<0.10定义为显著)。这些脂质包括两个甘油二酰基(DAG)，12个甘油三酰基(TAG)，一个胆甾醇酯(CE)，6个磷脂酰乙醇胺(PE)，一个磷脂酰甘油(PG)，一个神经节苷脂(GM3)和一个葡萄糖基神经酰胺(GluCer)(表2-1、2-2)。在多变量Cox回归分析中，23个脂质代谢物在调整临床协变量后仍与不良事件相关(P<0.05，表2-1、2-2)。其中，DAG、TAG和CE为不良事件的危险因素，PEs、PG、GM3、GluCer为不良事件的保护因素。验证队列中，上述筛的23个脂质代谢物在与不良事件的相关性方面显示出一致的趋势，其中12个脂质代谢物有显著的统计学差异(表3)。
表2-1.发现队列中与不良结局相关的脂质代谢物筛选
用于校正的临床协变量为年龄、左室射血分数、左室舒张末期直径z评分、B型利钠肽、尿酸和C反应蛋白。
表2-2.发现队列中与不良结局相关的脂质代谢物筛选
用于校正的临床协变量为年龄、左室射血分数、左室舒张末期直径z评分、B型利钠肽、尿酸和C反应蛋白。
表3.验证队列中与不良结局相关的脂质代谢物验证
用于校正的临床协变量为年龄、左室射血分数、左室舒张末期直径z评分、B型利钠肽、尿酸和C反应蛋白。
实施例7、构建并验证基于血清脂质组学的预测儿童扩心病不良结局的风险评分
在发现队列中，我们一共建立了3个预测不良事件的危险评分。第一个评分命名为临床评分，我们将基线表中不良事件组和无事件组间有显著差异的或有既往报道证据6个临床危险因素(年龄、左室射血分数、左室缩短分数、左室舒张末期内径z评分、B型利钠肽、尿酸、尿素和C反应蛋白)纳入多因素COX回归模型中，最终仅左室射血分数、B型利钠肽和C反应蛋白仍与不良结局有显著相关。第二个评分命名为脂质评分，我们将上一步筛选出的23个与不良事件显著相关的脂质代谢物纳入LASSO COX回归模型中进行降维。最终脂质模型中包含的脂质代谢物有：DAG 36:1(18:1/18:0)、TAG 46:1(16:1)、CE 16:1、PE 38:6p、PE40:5p、PG 36:2(18:0)、GM3 18:1/18:1和GluCer d18:0/24:1。第三个评分命名为联合评分，我们将临床危险因素(左室射血分数、B型利钠肽和C反应蛋白)和上一步筛选出的23个与不良事件显著相关的脂质代谢物纳入LASSO COX回归模型中进行降维。
最终联合模型中包含的危险因子有：左室射血分数、B型利钠肽和C反应蛋白、DAG36:1(18:1/18:0)、TAG 46:1(16:1)、TAG 52:0(18:0)、CE 16:1、PE 38:6p、PE 40:5p、GM318:1/18:1、和GluCerd 18:0/24:1(表4)。评分的计算基于各危险因子的血清水平与回归系数乘积的总和，回归系数见表4。
根据3个评分的回归系数，分别构建临床评分、脂质评分和联合评分的计算公式：
临床评分＝[-0.076×左室射血分数(％)]+[0.372×BNP(pg/mL)]+[0.077×C反应蛋白(umol/L)]
脂质评分＝[0.226×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.088×TAG 46:1(16:1)]+[0.206×CE 16:1]-[0.031×PE38:6p]-[0.287×PE 40:5p]-[0.043×PG 36:2(18:0)]-[0.100×GM3 18:1/18:1]-[0.256×GluCer d18:0/24:1]
联合评分＝[-0.049×左室射血分数(％)]+[0.389×BNP(pg/mL)]+[0.036×C反应蛋白(umol/L)]+[0.350×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.071×TAG 46:1(16:1)]+[0.055×TAG 52:0(18:0)]+[0.307×CE 16:1]-[0.034×PE38:6p]-[0.293×PE 40:5p]-[0.206×GM3 18:1/18:1]-[0.294×GluCer d18:0/24:1]
(注：评分中的脂质代谢物为根据健康儿童脂质代谢物的均值和标准差进行z值转换后的值)
表4.脂质评分与联合评分的参数
联合评分的时间依赖的受试者工作曲线下面积是3个评分中最高的(图2)。此外，联合评分的预测效能也显著高于临床评分，与临床评分相比，联合评分的NRI为0.516(95％置信区间：0.291-0.785)、IDI为0.283(95％置信区间：0.156-0.429)(表5)。
表5.3个评分在发现队列中对不良结局的预测效能
在验证队列中，与临床评分相比，联合评分的AUC从0.687(0.483-0.890)上升至0.839(0.693-0.985)。同时，联合评分对不良事件的预测效能也有中等程度的改善(图3，表6)。
表6.3个评分在验证队列中对不良结局的预测效能
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利用3个评分预测生存概率时，并根据评分的中位数区分高危组和低危组，我们发现联合评分＞1.2时能够有效地区分出易发生不良事件的高危患儿(log-rank P<0.0001；图4)。
综上，本发明证实在DCM患儿中，基于血清脂质组学的联合评分与不良事件(死亡/心脏移植/因心衰再住院)的发生具有显著的相关性，并且优于临床评分和脂质评分，可作为儿童扩张型心肌病不良事件发生的独立预测因子应用于临床。
实施例8：基于血清脂质组学的风险评分可用于监测DCM患儿的疾病进展
我们构建的联合评分不仅能预测不良结局的发生，同时也与左室射血分数的动态改变相关。我们在收集不良结局信息的同时，也收集了随访期间的左室射血分数指标。无论是在发现队列还是在验证队列中，仅联合评分能够同时与入院时的疾病严重程度(基线左室射血分数)和疾病的进展(射血分数的改变，即随访期间左室射血分数与基线射血分数的差值)相关(图5)。
综上，上述结果支持基于血清脂质组学的预后评分可用于监测DCM患儿的疾病进展，帮助医生及时进行临床决策。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一组血清脂质代谢物组水平在制备区分高危期的扩张型心肌病(DilatedCardiomyopathy，DCM)患者的检测试剂盒中的应用；
所述的血清脂质代谢物组包含：
DAG(甘油二酰基)36:1(18:1/18:0)、TAG(甘油三酰基)46:1(16:1)、TAG(甘油三酰基)52:0(18:0)、CE(胆甾醇酯)16:1、PE(磷脂酰乙醇胺)38:6p、PE(磷脂酰乙醇胺)40:5p、GM3(神经节苷脂)18:1/18:1、和GluCerd(葡萄糖基神经酰胺)18:0/24:1；
所述的高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为确诊DCM后发生：死亡、心脏移植和因心力衰竭再住院等不良事件的患者；
所述的确诊DCM为：患者至少具有下述2个临床标准：
(1)有症状的心力衰竭；
(2)左心室或双心室收缩功能障碍，所述收缩功能障碍为异常左室缩短分数≤25％；
(3)不能以负荷异常或冠状动脉疾病解释的心室扩张，所述心室扩张为根据体表面积和年龄校正后左室舒张末径(ED)校正值>2倍标准差。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的区分高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为：
根据患者的血清脂质代谢物水平进行脂质评分计算，所述的脂质评分的计算方法为：
脂质评分＝[0.226×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.088×TAG 46:1(16:1)]+[0.206×CE16:1]-[0.031×PE 38:6p]-[0.287×PE 40:5p]-[0.043×PG 36:2(18:0)]-[0.100×GM318:1/18:1]-[0.256×GluCer d18:0/24:1]；
其中脂质代谢物的值为根据健康儿童脂质代谢物的均值和标准差进行z值转换后的值。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的区分高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为：
根据患者的血清脂质代谢物水平和左室射血分数、B型利钠肽和C反应蛋白数值，组合后联合评分数值大于1.2；
所述的联合评分的计算方法为：
联合评分＝[-0.049×左室射血分数(％)]+[0.389×BNP(pg/mL)]+[0.036×C反应蛋白(umol/L)]+[0.350×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.071×TAG 46:1(16:1)]+[0.055×TAG52:0(18:0)]+[0.307×CE 16:1]-[0.034×PE 38:6p]-[0.293×PE 40:5p]-[0.206×GM318:1/18:1]-[0.294×GluCer d18:0/24:1]；
其中脂质代谢物的值为根据健康儿童脂质代谢物的均值和标准差进行z值转换后的值。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的血清脂质代谢物水平通过如下方法定量
(1)萃取血清样品中的脂质代谢物；
(2)检测脂质代谢物的含量。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，
步骤(1)的具体方法为，
1)将氯仿：甲醇＝1:2(v/v)的冰溶剂混合物900ml加入到100ml的血清样品中，涡旋，在暗室冰上搅拌1小时；
2)孵育后，向匀浆中加入0.3ml氯仿，再加入0.35ml冰水；
3)将匀浆涡旋30秒，以9000转/分钟离心2分钟；
4)将下层有机相转移到新的试管中，加入0.5ml冰氯仿进行再提取，并在氮气中干燥；
步骤(2)的具体方法为，
1)极性脂质，使用UPLC超高效液相色谱进行检测和定量分析，具体方法为：
在Shimadzu Exion UPLC超高效液相色谱系统上，使用多反应监测(multiplereaction monitoring,MRM)扫描，并结合Sciex 6500Plus QTRAP系统进行检测和定量分析；
使用Phenomenex Luna 3u硅胶柱，进行单个极性脂质分离，条件如下:
流动相A：三氯甲烷:甲醇:氢氧化铵的比例为89.5：10：0.5，
流动相B：三氯甲烷:甲醇:氢氧化铵：水的比例为55：39：0.5：5.5，
单个极性脂质种类的定量参考内标包括：PC-14:0/14:0、PE-14:0/14:0、PS-34:1/d31、PA-17:0/17:0、PG-14:0/14:0、PI-34:1/d31、LPC-C17:0、LPE-C17:0、C8-GluCer、C17-Cer、C14-LBPA、S1Pd17:1和C12-SM和GM3d18:1/17:0分别用于定量极性脂质；
2)中性脂类，采用液相色谱-质谱联用技术对单个脂质代谢物进行鉴定，具体方法为：
使用高效液相色谱系统和4000Q-Trap质谱仪；
Ⅰ、HPLC方法为，使用Phenomenex Kinetex 2.6μ-C18柱进行分离，
高效液相色谱法的条件为：
流动相：三氯甲烷：甲醇：乙酸铵按照100:100:4的比例，
流速为150μl/min，共进行17min；
分离柱温度设定为25℃；
Ⅱ、MS方法为，
在正电喷雾电离模式和负电喷雾电离模式下，以质谱扫描方式进行记录，电喷雾电离条件为：
正电喷雾电离模式电压为5000V，
负电喷雾电离模式电压为-4500V；
原温度为250℃；
扫描速率为1000amu/s；
气帘气压力：25；
扫描范围：300–1100da。
6.一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒中包括检测血清脂质代谢物组的检测试剂，其特征在于，所述的检测试剂盒用于区分高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者；
所述的血清脂质代谢物组包含：
DAG(甘油二酰基)36:1(18:1/18:0)、TAG(甘油三酰基)46:1(16:1)、TAG(甘油三酰基)52:0(18:0)、CE(胆甾醇酯)16:1、PE(磷脂酰乙醇胺)38:6p、PE(磷脂酰乙醇胺)40:5p、GM318:1/18:1、和GluCerd(葡萄糖基神经酰胺)18:0/24:1；
所述的高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为确诊DCM后发生：死亡、心脏移植和因心力衰竭再住院等不良事件的患者；
所述的确诊DCM为：患者至少具有下述2个临床标准：
(1)有症状的心力衰竭；
(2)左心室或双心室收缩功能障碍，所述收缩功能障碍为异常左室缩短分数≤25％；
(3)不能以负荷异常或冠状动脉疾病解释的心室扩张，所述心室扩张为根据体表面积和年龄校正后左室舒张末径(ED)校正值>2倍标准差；
所述的区分高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为：
根据患者的血清脂质代谢物水平进行脂质评分计算，所述的脂质评分的计算方法为：
脂质评分＝[0.226×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.088×TAG 46:1(16:1)]+[0.206×CE16:1]-[0.031×PE 38:6p]-[0.287×PE 40:5p]-[0.043×PG 36:2(18:0)]-[0.100×GM318:1/18:1]-[0.256×GluCer d18:0/24:1]；
其中脂质代谢物的值为根据健康儿童脂质代谢物的均值和标准差进行z值转换后的值。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒还包括，检测B型利钠肽和C反应蛋白的检测试剂；
所述的区分高危期的扩张型心肌病(Dilated Cardiomyopathy，DCM)患者为：
根据患者的血清脂质代谢物水平和左室射血分数、B型利钠肽和C反应蛋白数值，组合后联合评分数值大于1.2；
所述的联合评分的计算方法为：
联合评分＝[-0.049×左室射血分数(％)]+[0.389×BNP(pg/mL)]+[0.036×C反应蛋白(umol/L)]+[0.350×DAG 36:1(18:1/18:0)]+[0.071×TAG 46:1(16:1)]+[0.055×TAG52:0(18:0)]+[0.307×CE 16:1]-[0.034×PE 38:6p]-[0.293×PE 40:5p]-[0.206×GM318:1/18:1]-[0.294×GluCer d18:0/24:1]；
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2022
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