CN102421358A - 对冠心病和心血管事件风险的预测 - Google Patents

Abstract

本文公开通过检测来自对象的样品中至少一种代谢物水平来评估其心血管疾病风险的方法。所述代谢物水平表明该对象心血管疾病的风险。所述代谢物可为酰基肉碱、氨基酸、酮、游离脂肪酸或羟基丁酸盐。所述心血管疾病可以是心血管事件，发生冠心病的风险或冠心病发展的风险。

Description

对冠心病和心血管事件风险的预测

相关申请的交叉参考

本申请要求2009年3月10日提交的美国临时专利申请号61/159,077的权益，其通过引用全文纳入本文。

发明背景

冠心病(CAD)是工业国家中的首要致死原因，且其与流行的肥胖症和糖尿病一起作用，正迅速成为发展中国家的首要致死原因。CAD的遗传倾向已充分建立；已证明家族史是CAD的独立风险因子，特别是在早发形式中。尽管这样，CAD的遗传结构仍然基本未知。

许多已接受的CAD风险因子是代谢物。然而，对CAD风险的理解仍是不完整、机械化的，而且同样重要的是需要改进我们鉴别心血管事件最大风险个体的能力。由于CAD的复杂性质，应用更全面的手段评估可改进风险分级并提高我们对疾病过程的理解。

发明概述

一方面，提供评估对象心血管疾病风险的方法。所述风险评估可包括预测随后心血管事件如心肌梗塞的可能性、预测CAD的发展或识别对象中CAD的存在。本方法包括检测来自对象的样品中至少一种代谢物。所述代谢物可为酰基肉碱、氨基酸、酮、游离脂肪酸或β-羟基丁酸盐。然后，将代谢物水平与标准或对照对象作比较并可用于确定对象中心血管事件的风险、CAD发展的风险或CAD的存在。

另一方面，还提供针对患有CAD或有发展风险的对象或面临心血管事件风险的对象开发治疗计划的方法。所述方法包括使用检测的对象代谢物水平开发基于对象心血管疾病风险的治疗计划。所述计划可包括饮食、运动和药物治疗选择。

另一方面，提供评估对象心血管疾病风险的方法，其中样品获自所述对象。所述样品提供给实验室用于检测样品中的代谢物水平。检测的代谢物可为酰基肉碱、氨基酸、酮、脂肪酸或羟基丁酸盐。该试验室返回表明所述样品中代谢物水平的报告，其指示所述对象心血管疾病的风险。

附图简要说明

图1是代谢物因子和CAD的受体操作特性(ROC)曲线的组图。ROC曲线和模型拟合(c统计量)用三种模型表示：包括传统CAD风险因子(糖尿病、高血压、血脂障碍、吸烟、BMI、家族史；而对于重复组，还包括年龄、种族和性别)的临床模型(黑线)；包括所有传统风险因子和代谢物因子4和9的模型(灰线)；和包括所有传统风险因子和所有代谢物因子的模型(黑色虚线)。上图显示初始组，下图显示重复组。

图2显示代谢物因子8预测心血管事件的能力的cox比例危险模型。显示代谢物因子8的未调整(左图)和调整(右图)存活曲线(根据BMI、CAD严重性、高血压、血脂障碍、糖尿病、吸烟、家族史、射血分数、血清肌酸酐、并发CABG、年龄、种族、和性别进行调整)。

图3是所述8个多重GENECARD家族的家谱。黑色实心符号表示受到早期CAD影响；较小的灰色圆圈表示为本研究进行血液概况分析。应注意大多数分析特征的家族成员为最初患病同胞配对的至今未受影响的后代。

图4显示常规代谢物的遗传率。Y轴为-log₁₀(遗传力估值(X轴)的p值)。遗传力点估值周围的误差线为浅灰色。

图5显示氨基酸和游离脂肪酸的遗传力。所示为氨基酸和游离脂肪酸的遗传力。Y轴为-log₁₀(遗传力估值(X轴)的p值)。遗传力点估值周围的误差线为浅灰色。

图6显示酰基肉碱的遗传力。Y轴为-log₁₀(遗传力估值(X轴)的p值)。遗传力点估值周围的误差线为浅灰色。

发明详述

代谢组学研究小分子代谢物，可用于人疾病的诊断。研究已证明植物和小鼠代谢物的遗传力。如实施例所述，代谢物特征在具有早发CAD的人类家族中是可遗传的，说明CAD的已知遗传力可能至少部分通过血液中可测量的代谢组分介导。本实施例描述编入杜克大学(Duke)CATHGEN生物样品库(biorepository)的参与者和选自杜克大学GENECARD研究的家族中69种代谢物的定量概况，包括酰基肉碱种类(线粒体脂肪酸、糖和氨基酸氧化的副产物)、氨基酸和常见代谢物如游离脂肪酸、酮、和β-羟基丁酸盐。本文提供代谢物特性能评估对象的心血管疾病风险。本实施例证明单独或联合作用的具体代谢物的水平可判别发展CAD、CAD存在的可能性和随后的心血管事件的风险。

提供评估或预测对象心血管疾病风险的方法。本方法包括检测来自对象的样品中至少一种代谢物的水平。可检测所述代谢物的含量或相对水平。检测的代谢物可为酰基肉碱、氨基酸、酮、游离脂肪酸(FFA)或羟基丁酸盐。然后用来自对象样品中的代谢物水平和标准作比较以评估心血管疾病的风险。所述标准可为源自经验的各代谢物数量，其表明正常范围和/或指示心血管疾病的范围，或可直接与已知心血管疾病状态的个体的代谢物水平作比较。

提供方法用于通过从对象获取样品并将其提供给实验室以检测样品中代谢物水平来评估对象心血管疾病风险。如上所述，实验室检测的代谢物可包括酰基肉碱、氨基酸、酮、脂肪酸和羟基丁酸盐。然后接受来自实验室的说明样品代谢物水平的报告。所述报告表明对象代谢物水平且所述水平可用于与标准值比较以指示对象心血管疾病风险。

心血管疾病风险包括评估无CAD对象由于遗传因子而随着时间发展出CAD的风险、评估对象是否存在CAD和评估发生心血管事件的风险。心血管事件包括心肌梗塞、中风和死亡。

对象可为任何哺乳动物，对象优选是人。鉴定为患有CAD或有发展CAD风险的对象可用本文所述方法进一步评估以测定其心血管事件的风险。所述方法可用于以非侵入方式协助诊断CAD的存在，和/或用于开发针对鉴定为有CAD风险、患有CAD或有心血管事件风险的对象的治疗计划。所述治疗计划可包括给对象提供饮食、运动和药物治疗。心血管事件包括但不限于心肌梗塞(MI)、中风和死亡。

所述代谢物可用不同样品检测，本领域技术人员了解其中数种。在本实施例中，获取对象的外周血并处理以检测对象代谢物水平。也可用对象的其他组织或液体，包括但不限于血液、血浆、尿液、血清、唾液和组织活检。

可用任何方法检测代谢物。所述方法优选定量从而可测定对象或来自对象的样品中的代谢物水平或含量。在本实施例中，所述代谢物水平用质谱检测。也可用其他测量方法，包括核磁共振(NMR)。检测所述代谢物也可用基于通过如结合或酶实验的代谢物检测的比色或荧光实验。可使用针对代谢物的任何合适的实验方法。本领域技术人员了解这类方法。对象的代谢物水平可以血液或组织中代谢物的ng/ml形式报道，通过血液或组织中代谢物的mM或μM浓度或通过使用任意单位来表示对象中的相对水平。在本实施例中，报道血液中代谢物的mM或μM。

在一些实施方式中，单一代谢物的检测足以评估心血管疾病的风险。在一些实施方式中，可检测并在评估心血管疾病风险的方法中使用2、3、4、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或65种代谢物。检测的代谢物可通过对象群体的主要成分分析与因子相关。在下述实施例中描述用于评估CAD遗传力和CAD存在或有心血管事件风险的因子或代谢物组。

对象代谢物水平用于检测对象是否患有CAD、对象发展出CAD的风险和/或对象未来经历心血管事件的风险。风险测定水平可基于血液中代谢物的标准水平。所述标准用于HDL和LDL胆固醇测量之间的关系，其中当禁食后血液中胆固醇水平达到特定水平且HDL与LDL的比例超过标准限制时预测CAD风险。所述标准一般基于大群体研究开发。或者，风险测定可基于直接与一个或更多对照对象相比。例如，无CAD且样品获取后两年内无心血管事件的对照组对象和患有CAD且样品获取后两年内有或没有心血管事件的对照组对象可用作比对。

所述对象心血管疾病的风险可用相对形式表示。例如正常水平的代谢物可用1.0表示对象从低到平均的心血管疾病风险如CAD或心血管事件。任何低于1.0的数值可表明该对象的风险低于普通人群风险。高于1.0的数值表明该对象的风险高于平均风险水平且实际数值可涉及风险水平。例如，代谢物水平为2.0的对象在接下来的两年内经历心血管事件的可能性是平均个体的两倍。

心血管疾病(包括CAD或未来的心血管事件)的风险评估包括但不限于开发风险概况。所述评估或预测可表明所述对象比对照对象有10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、750％或1000％可能性更容易患或发展出心血管疾病如CAD或有心血管事件。对照对象是没有CAD的个体且具有与CAD或心血管事件的风险升高不相关联的代谢物水平。

预测发展出心血管疾病CAD的风险的代谢物包括涉及脂、蛋白质和糖代谢的许多主要途径的代谢物。因此，酰基肉碱包括葡萄糖、脂肪酸和氨基酸代谢副产物乙酰基肉碱(C2)、提供氨基酸分解代谢信息的丙酰基肉碱(C3)和异戊馅肉碱(C5)、报告过氧化物酶脂肪酸代谢的二羧酸盐酰基肉碱、和长链脂肪酸β氧化的中间体中长链酰基肉碱。所述氨基酸在蛋白质周转和分解代谢中作为重要的中间体，而所述酮是脂肪酸β氧化的指标。下述表1显示本实施例中测试的代谢物的缩写名和全名。表2显示各所测代谢物的生物功能(如果有)。

表1.代谢物命名和个体内变化。给出代谢物缩写名、全名和个体内变化测量。

表2.所测代谢物的生物功能。通过测量常规代谢物如脂肪酸、酮和β-羟基丁酸盐以及大量酰基肉碱和15种生物相关的氨基酸，调查的代谢物组报道了脂、蛋白质和糖代谢的主要途径。此表显示测量的各个体代谢物的生物功能(如果有)。

提供通过检测至少一种对象代谢物来预测所述对象心血管事件(死亡或心肌梗塞)风险的方法。预测心血管事件的代谢物可能是过氧化物酶体脂肪酸代谢的产物，特别是短链二羧基酰基肉碱和瓜氨酸。具体代谢物列于实施例的表9且鉴定为因子8。表10显示因子8内的个体代谢物并提供各代谢物因子负荷数据。实施例的数据证明瓜氨酸和所述短链二羧基酰基肉碱预测心血管事件的风险。

个体代谢物也可预测心血管事件的风险。这些代谢物包括Gly、Ala、Ser、Pro、Met、His、Phe、Tyr、Asx、Glx、鸟氨酸、瓜氨酸、arg、C2、C3、C4:C14；C5:1、C5、C4:OH、C14-DC:C4DC、C5-DC、C6-DC、C10:3、C10、C10-OH:C8DC、C12:1、C12、C12-OH:C10DC、C14:1-OH、C14-OH:C12-DC、C16、C16-OH/C14-DC、C18:2、C18-OH/C16-DC、C20、C20:1-OH/C18:1-DC、C20-OH/C18-DC、C8:1-OH/C6:1-DC、C8:1-DC、C16:1、C16:1-OH/C14:1-DC、C20:4、FFA、HBUT、和Ket。特定地，瓜氨酸、C5-DC、C6-DC、C8:1-OH/C6:1-DC和C8:1-DC的水平预测心血管事件。此外，鸟氨酸、瓜氨酸、C5、C14-DC:C4DC、C5-DC、C6-DC、C10-OH:C8DC、C8:1-OH/C6:1-DC、C8:1-DC、C20:4和FFA的水平也用于评估心血管事件的风险。

还提供通过检测来自对象的样品中至少一种代谢物水平来评估其存在CAD和/或CAD程度的方法。用于评估CAD存在的代谢物是中链酰基肉碱、支链氨基酸或相关代谢物、或尿素循环有关的代谢物。

具体代谢物列于实施例的表6、7和8且在表9中鉴定为因子1、4和9。表10显示因子1、4和9内的个体代谢物并提供各代谢物的因子负荷数据。仅因子负荷大于或等于0.04的代谢物包括在所述因子中。

个体代谢物也可预测心血管事件的风险。这些代谢物包括Pro、Leu/Ile、Met、Val、Glx、瓜氨酸、C2、C3、C4:Ci4；C5、C8、C8:1-OH/C6:1-DC、C10:1、C14:2、C14:1-OH、C16:2、C16:1、C16:2、C16:1、C16:1-OH/C14:1-DC、C18-OH/C16-DC、HBUT和Ket.特定地，Leu/Ile、Glx、C2、C14:1-OH和C16:1-OH/C14:1-DC的水平指示对象中CAD的存在。Leu/Ile或Glx水平比正常对照或正常标准升高说明对象患有CAD。C2、C14:1-OH和C16:1-OH/C14:1-DC水平降低说明对象存在CAD。Leu/Ile水平高于165mM、170mM或175mM则指示冠心病。Glx水平高于127mM、128mM、129mM、130mM、132mM、135mM或140mM则指示冠心病。C14:1-OH水平低于0.014μM、0.013μM或0.012μM则指示冠心病。C16:1-OH/C14:1-DC水平低于0.009μM、0.0089μM或0.0088μM则指示冠心病。

还提供通过检测来自对象的样品中至少一种代谢物水平来评估其发展CAD可能性的方法。用于评估CAD发展的可能性的代谢物为短和中链酰基肉碱代谢物、支链氨基酸和尿素循环相关代谢物。

具体代谢物列于实施例的表14。表15显示鉴定的因子内的个体代谢物。仅因子负荷大于或等于0.04的代谢物包括在所述因子中。个体代谢物也可预测心血管事件的风险。这些代谢物包括酮、arg、鸟氨酸、瓜氨酸、glx、ala、val、leu/ile、pro、C2、C14:1、C18:1、C5:1、C4-i4、C18、C10:1和FFA。

下述实施例是示例性的，不对本发明的范围构成限制。

实施例

实施例1：代谢物与CAD和心血管事件风险的关联

方法

研究样品

所述CATHGEN生物样品库由杜克大学医学中心(Duke University MedicalCenter)(北卡罗来纳州，达勒姆)的心导管实验室依次招募的对象组成。知情同意后在通过导管进入动脉时从股动脉获取血液，立即处理以分离血浆并冷冻在-80℃。收集前所有对象最少禁食6小时。临床数据由DDCD提供，DDCD是1969年以来杜克大学接受心导管插入术的患者数据库。收集长期用药即入院用药(住院病人)或之前一个月内的门诊记录中(门诊病人)的用药数据。在导管插入6个月后收集后续数据，包括心肌梗塞(MI)和死亡事件，之后每年收集。通过国家死亡指数确定生命状态。对所有插入导管的对象的医嘱是临床关注缺血性心脏病。排除有严重肺部高血压或器官移植的患者。

为了评价代谢物对CAD的辨别能力，建立两种独立的病例-对照组。‘初始’(174个CAD病例和174个无CAD对照)；和‘重复’(140个CAD病例和140个无CAD对照)。对于初始组，选择满足准入标准的连续病例：CAD指数≥32(至少一个冠动脉有≥95％的狭窄)且发作年龄≤55岁。CAD指数是血管造影数据的数值摘要。(Smith等，Circulation 1991；84[增刊5]，III：245-253.)发作年龄定义为首次MI、经皮冠状动脉干预(PCI)、冠状动脉旁路移植(CABG)的年龄，或首次导管插入满足CAD指数阈值的年龄。选择满足以下标准的性别和种族匹配对照：CAD指数≤23；无＞50％狭窄的冠状动脉；插入导管年龄≥61岁；且没有MI、PCI、CABG或移植的历史。考虑到基于这些标准的年龄差异，结果可能会因年龄而混淆。因此，对于重复组，选择满足同一准入标准的连续病例和对照，但去除发作年龄(病例)或插入导管年龄(对照)的标准且病例/对照不匹配。这使得发现普及到涉及导管插入的代表性患者群体中。也通过将CAD病例限定在具有先前MI史的人中进行分析(初始中N＝86个病例，重复中N＝61个病例)。

为了评估代谢物预测随后心血管事件风险的能力，建立包括来自初始和重复组CAD病例的‘事件’组(‘事件’组，N＝314)；其中74个体随后死亡或发生MI。为了证实代谢物与心血管事件风险相关性的发现，在独立心血管事件病例-对照组(‘事件-重复’)中进行分布分析，所述组由来自CATHGEN的满足如下标准的独特个体组成：射血分数＞40％；没有PCI或CABG史；也没有随后的CABG。其中，事件病例(N＝63)在插入导管两年内死亡或患MI或发生有急性冠状动脉综合征的PCI；对照(N＝66)在随后的至少两年内没有发生事件，且与病例在年龄、种族、性别和CAD指数上匹配。

杜克大学审查委员会批准CATHGEN和当前研究的实验方案。从各对象获取知情同意书。

代谢物测量

禁食血浆样品用于定量检测45种酰基肉碱、15种氨基酸、5种常规分析物(总胆固醇、低密度[LDL]和高密度脂蛋白[HDL]胆固醇、甘油三酯和葡萄糖)、酮、β-羟基丁酸盐、总游离脂肪酸和C反应蛋白[CRP]的目标水平(表1)。已报告各试验的方法和变异系数。(Shah等，Mol Syst Biol 2009；5：258和Newgard等，Cell Metab 2009；9(4)：311-26.)上述实验室(Sarah W.Stedman营养和代谢代谢组学/生物标记中心实验室)不了解病例-对照状态且病例/对照为随机分配。

标准临床化学方法用于使用罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)(印第安纳州，印第安纳波利斯市)试剂的常规代谢物和使用瓦克公司(Wako)试剂的游离脂肪酸(总)及酮(总和β-羟基丁酸盐)。。所有试验在Hitachi 911临床化学分析仪上进行。

对质谱(MS)分析的代谢物(酰基肉碱、氨基酸)使用如下实验方案。(An等，Nat Med 2004；10(3)：268-74和Chace等，Clin Chem 1995；41(1)：62-8.)先用甲醇通过沉淀去除蛋白质。干燥等分的上清，然后用热的酸性甲醇(酰基肉碱)或n-丁醇(氨基酸)将其酯化。用具有Quattro Micro装置(沃特斯公司(Waters Corporation)，美国马萨诸塞州密耳佛德)(Waters Corporation，Milford，MA)的串联MS进行分析。通过加入已知量的稳定-同位素内标的混合物促进所述“靶标”中间代谢物的定量(表3)。亮氨酸/异亮氨酸(LEU/ILE)作为单一分析物报告，因为它们不能通过我们的MS/MS法分辨且其包含别异亮氨酸和羟脯氨酸的影响。在正常环境下这些等比重的氨基酸对LEU/ILE引发信号的影响很小。此外，所述用于形成丁基酯的酸性条件导致谷氨酰胺部分水解为谷氨酸和天冬酰氨部分水解为天冬氨酸。因此，报告为GLU/GLN(GLX)或ASP/ASN(ASX)的值并不代表谷氨酰胺和谷氨酸或天冬酰氨和天冬氨酸的摩尔和，而是分别测量谷氨酸或天冬氨酸加上谷氨酰胺和天冬酰氨部分水解反应影响的量。生物学注释包括在上表2中。

表3.用于酰基肉碱和氨基酸测量的内部加标

统计学分析

报告为“0”(即低于量化下限(LOQ))的代谢物水平的值为LOQ/2。大于25％的值为“0”的代谢物不进行分析(5种酰基肉碱)。所有代谢物经自然对数变换近似为正态分布。为了分析CAD状态，采用归一化线性回归模型评估CAD病例和对照之间代谢物水平的差异，未调整和根据不受如下匹配所限制的传统CAD风险因子调整：糖尿病、高血压、血脂障碍、体重指数(BMI)、CAD家族史和吸烟。所述重复组的分析还根据种族、性别和年龄调整。通过对数变换，所有显著的代谢物表现出正态分布(KS(Kolmogorov-Smirnov)检验，P＞0.01)，除了缬氨酸、酮和C8、C8:1-OH/C6:1-DC、C10:1、C14:2、C16:1、C16:1-OH/C14:1-DC和C18-OH/C16-DC酰基肉碱。目测所述分布提示为粗略的正态分布。无论怎样，我们用非参数威扣科森(Wilcoxon)检测进行灵敏度分析，显示与半参数线性模型相似的结果，除了缬氨酸和C14:2酰基肉碱，二者在线性回归中都不显著(分别为p＝0.10和p＝0.06)，但在这些非参数检测中显著(p＝0.05和p＝0.008)。分析还用糖尿病和吸烟分级。

在探索性分析中，多变量模型进一步根据药物类型(β-受体阻断剂、抑制素、糖尿病药物、阿司匹林、血管紧张素转化酶抑制剂、硝酸盐、氯吡格雷(clopidogrel)和利尿剂)、使用程序前镇静和插入导管时连续使用静脉肝素而调整。所述CATHGEN实验方案需要在插入导管期间补充给予肝素前收集样品。因此，插入导管时调整连续使用静脉肝素是针对与肝素相关的差异。仅有66％的个体有药物数据，因此药物治疗编码为离散变量：无药物治疗、丢失、和有药物治疗。

若已知代谢物存在于重叠途径，则预计有代谢物的相关性。我们使用主成分分析(PCA)以将大量相关变量减少为不关联因子。具有较高“特征值”的因子构成数据集内的大量可变性。鉴定特征值≥1.0的因子并进行方差极大旋转以产生可解释的因子。因子负荷≥|0.4|的代谢物报告为包含因子。参见表10。从所述初始组构建得分系数并用于计算个体因子分数(该因子内的标准代谢物的加权总和，对各代谢物在因子负荷上加权)，其还应用于所述重复组。归一化线性回归模型用于评估病例和对照之间的因子分数差异。除因子7-9外，所有因子为正态分布(KS检验P＞0.01)；目测显示出粗略的正态分布。这些因子非参数Wilcoxon检测显示与线性模型一样的结果。

为了进一步评估代谢物分布区分CAD病例和对照的独立能力，建立多变量逻辑回归模型；在这些模型中加入CAD风险因子(BMI、血脂障碍、高血压、糖尿病、家族史、吸烟)，然后加入代谢物因子。构建受体操作曲线并计算模型拟合测量。使用现有方法进行这些曲线下面积比较的非参数分析。(DeLong等，Biometrics 1988；44(3)：837-45.)

为了分析随后的心血管事件，收集初始和重复组的病例(‘事件’组)。用Cox比例危险因素(未调整和根据BMI、血脂障碍、高血压、糖尿病、家族史、吸烟、年龄、种族、性别、肌酸酐、射血分数和CAD指数调整)评估代谢物因子和死亡/MI发生时间之间的关系。满足假定的比例危险因素。对于所述‘事件-重复’组的重复，来自在初始CAD组中构建的PCA衍生因子的得分系数用于计算事件-重复组的因子分数；逻辑回归用于评估因子和病例/对照状态之间的关联(未调整和根据BMI、血脂障碍、高血压、糖尿病、家族史、吸烟、肌酸酐和射血分数调整)。

因为所有分析本质上是探索性的且已知代谢物的共线性，所以存在未根据多重比较调整的双侧p值；但是，报道了用Bonferroni校正解释的结果。标称统计显著性定义为P≤0.05。Bonferroni校正的p值为P＜0.0007(个体代谢物)和P＜0.004(因子)。使用SAS 9.1版通过D.R.C.和S.H.S.进行统计分析(美国北卡罗来纳州，卡雷(Cary NC))。

结果

患者群体

所述初始(174个早发CAD病例，174个匹配对照)和重复组(140个CAD病例，140个对照)的群体特征示于表4，且所述事件-重复组示于表5。

表4.初始和重复组的基线临床特征

表5.所述事件重复组的基线临床特征

^*有事件个体和无事件对照之间差异的p值

个体代谢物和CAD的关联

所述初始组中病例和对照之间的数种氨基酸水平有差异(表6)，包括所述支链氨基酸亮氨酸/异亮氨酸(P＜0.0001)和缬氨酸(P＝0.007)，谷氨酸/谷氨酰胺(P＜0.0001)，脯氨酸(P＝0.04)和甲硫氨酸(P＝0.05)。所述初始组中病例和对照之间的数种酰基肉碱水平也有差异，包括C16酰基肉碱(C16:1，P＝0.006；C16:1-OH/C14:1-DC，P＝0.004；C16:2，P＝0.05；和C18-OH/C16-DC，P＝0.003)和C4:Ci4(P＝0.009)、C8(P＝0.009)、C8:1-OH/C6:1-DC(P＝0.003)和C10:1(P＝0.002)酰基肉碱(表6)。对于多数代谢物，这些差异在根据CAD风险因子调整后持续。

表6.个体代谢物和CAD的关联。显示所述初始组中病例和对照之间代谢物均值和标准偏差有显著差异。也显示所述重复组中这些分析物的结果。所有氨基酸的值用毫摩尔表示而酰基肉碱用微摩尔。黑体的分析物表明跨两个数据集的一致关联(具有一致的效应方向)。

^*根据糖尿病、高血压、吸烟、血脂障碍、CAD家族史、BMI调整。

根据年龄、种族、性别、糖尿病、高血压、吸烟、血脂障碍、CAD家族史、BMI调整。

所述重复组中的调整的分析中数种这些代谢物也是显著的(具有相似的效应方向)，其包括氨基酸亮氨酸/异亮氨酸和谷氨酸/谷氨酰胺、和长链酰基肉碱C14:1-OH和C16:1-OH/C14:1-D(表6)。在未调整的分析中，这些代谢物，氨基酸甲硫氨酸和脯氨酸、和C16:2及C16:1酰基肉碱在两组中都显著。

根据脂质(总胆固醇、LDL和HDL胆固醇和甘油三酯)的进一步调整得到相似的结果，尽管所述初始组中LEU/ILE的相关性衰减(表7和8)。用糖尿病分级的分析提示糖尿病关联的某些非均匀性。例如，LEU/ILE和C16:1-OH/C14:1-DC在无糖尿病中表现出较强的关联。用吸烟分级的分析表明吸烟者和不吸烟者没有差异。

表7.初始组中个体代谢物和CAD的关联。显示所有初始组以及CAD分级的所有个体代谢物均值和标准偏差。所有氨基酸的值用毫摩尔表示而酰基肉碱用微摩尔。P值针对未调整和调整分析中代谢物和CAD之间的关联。黑体的分析物表明调整分析中跨两个数据集的一致关联(具有一致的效应倾向)。

^*根据糖尿病、高血压、吸烟、血脂障碍、CAD家族史、BMI调整

根据糖尿病、高血压、吸烟、血脂障碍、CAD家族史、BMI、和总胆固醇、LDL胆固醇、HDL胆固醇和甘油三酯调整。

表8.重复组中个体代谢物和CAD的关联。显示所有重复组以及CAD分级的所有个体代谢物均值和标准偏差。所有氨基酸的值用毫摩尔表示而酰基肉碱用微摩尔。P值针对在未调整和调整分析中代谢物和CAD之间的关联。黑体的分析物表明调整分析中跨两个数据集的一致关联(具有一致的效应方向)。

^*根据年龄、种族、性别、糖尿病、高血压、吸烟、血脂障碍、CAD家族史、BMI调整

根据年龄、种族、性别、糖尿病、高血压、吸烟、血脂障碍、CAD家族史、BMI、和总胆固醇、LDL胆固醇、HDL胆固醇和甘油三酯调整。

无偏主成分分析

PCA鉴定的12因子包括共线的代谢物(表9)，其以生物学上可能的因子分组。所述初始组调整分析中病例和对照之间的三种因子差异显著：因子1(中链酰基肉碱)、因子4(支链氨基酸和相关代谢物)、和因子9(精氨酸、组氨酸、瓜氨酸、Ci4-DC:C4DC)。这些因子中，两种因子(4和9)在所述重复组中保持显著。所述重复组中因子1仅弱显著(未调整的P＝0.15、调整的P＝0.03)。每个代谢物的因子负荷示于表10。

表9.主成分分析。显示无偏主成分分析(PCA)的结果。用所述初始组构建因子；此PCA的得分系数用于计算所述初始和重复组的因子分数。显示所述初始和重复组的病例和对照之间因子均值差异的P值。

^*列出所述因子的因子负荷≥|0.4|的分析物，按所述因子的负荷量级排列；所述因子的因子负荷为负的分析物标记为a(-)。^**所述因子说明的方差比例。

根据糖尿病、高血压、吸烟、血脂障碍、CAD家族史、BMI调整；此外重复组结果根据年龄、种族、性别调整。

表10.个体代谢物在所述初始组PCA鉴定的因子上的因子负荷

根据脂质的进一步调整显示继续与CAD关联，尽管因子4在所述初始组中不显著(初始组：因子1，P＝0.0002；因子4，P＝0.59；因子9，P＝0.02；重复组：因子1，P＝0.01；因子4，P＝0.02；因子9，P＝0.004)。尽管我们根据糖尿病调整，考虑到研究显示代谢物和胰岛素抗性之间的关系，我们进一步根据禁食葡萄糖调整基本多变量模型。这些分析表明与CAD持续显著关联(初始组：因子1，P＝0.02；因子4，P＝0.02；因子9，P＝0.003；重复组：因子1，P＝0.03；因子4，P＝0.05；因子9，P＝0.02)。

分级分析表明无糖尿病与有糖尿病相比，因子4和9与CAD之间有较强的关联(表11)，糖尿病中信号最小或不可辨别，但用吸烟分级与CAD的关联无一致差异(表12)。

表11.PCA衍生代谢组学因子和CAD的关联，用糖尿病分级。显示PCA衍生代谢组学因子和CAD的关联的P值，用糖尿病医疗史分级。显示未调整p值和根据高血压、吸烟、血脂障碍、家族史和BMI(在重复组中也根据年龄、种族和性别)调整的p值。

表12.PCA衍生代谢组学因子和CAD的关联，用吸烟分级。显示PCA衍生代谢组学因子和CAD的关联的P值，用吸烟(当前是否吸烟)分级。显示未调整p值和根据糖尿病、高血压、血脂障碍、家族史和BMI(在重复组中也根据年龄、种族和性别)调整的p值。

根据10类药物治疗的其他调整对所述初始组中的因子和CAD之间关系有很小的影响(因子1，调整的P＝0.009；因子4，P＝0.03；因子9，P＝0.003)，但所述重复组中不再显著(因子1，P＝0.02；因子4，P＝0.19；因子9，P＝0.14)。我们还限制在可获得药物治疗数据的个体中进行相似分析，其在结合的数据集中以优化功效(N＝416)。这些结果显示因子4和9与CAD之间持续关联，尽管是减弱的(因子4：未调整模型p＝0.0009；根据CAD风险因子调整的模型，P＝0.03；根据CAD风险因子和药物治疗调整的模型，P＝0.05；因子9：未调整模型P＝0.0003；根据CAD风险因子调整的模型，P＝0.002；根据CAD风险因子和药物治疗调整的模型，P＝0.007)。

显示的结果为未调整的多重比较。我们用PCA解释代谢物的共线性。个体代谢物中，仅谷氨酸/谷氨酰胺通过Bonferroni校正。因子4和9在因子水平上通过Bonferroni校正(P＜0.004)。

代谢物分布和流行心肌梗塞的关联

为了检测这些代谢物和更多严重表型的关联，我们评估了与无CAD对照相比病例中所述PCA衍生因子和MI先前史的关系(初始组N＝86个MI病例，重复组N＝61个MI病例)。两组中所述与CAD关联的二因子(4和9)也和先前MI相关联(表9)。

评价CAD的模型拟合和ROC曲线

为了进一步量化代谢物因子与CAD的独立关联，构建逻辑回归模型：(1)临床模型；(2)临床模型加因子4和9；和(3)临床模型加所有代谢物因子。在初始组(因子4：让步比[OR]1.42；95％CI，1.09-1.84，P＝0.01；因子9：OR 0.69，95％CI，0.53to 0.90，P＝0.006)和重复组(因子4：OR 1.42；95％CI 1.06-1.89，P＝0.02；因子9：OR 0.67；95％CI 0.48-0.92，P＝0.01)中因子4和9与CAD独立关联。初始组中测量模型拟合和ROC曲线显示包含因子4和9的模型的辨别能力略高(c-统计0.778)，加入所有因子的有一些改善(c-统计0.804)，高于仅含临床变量的模型(c-统计0.756；临床模型与临床模型加因子4和9相比的P＝0.06；临床模型与临床模型加所有因子相比的P＝0.003)。在所述重复组，加入因子4和9的所述临床模型比所述单一临床模型(c-统计0.743)有稍高的c-统计(c-统计0.773)，但加入所有因子有更显著的改善(c-统计0.874；临床模型与临床模型加因子4和9相比的P＝0.04；和临床模型与临床模型加所有因子相比的P＜0.0001)

已知测量认为诊断有CAD的患者脂质是标准方案，且所述CRP是心血管疾病的公认生物标记，我们重构了包括脂和CRP的这些模型。这些分析表明初始和重复组的临床模型拟合较高(c-统计分别为0.842和0.778)。包括脂和CRP的所述临床模型中加入因子4和9在初始组模型的辨别能力上没有改善(c-统计0.848，与临床模型相比的P＝0.31)，加入所有因子则有一些改善(c-统计0.865，与临床模型相比的P＝0.01)。然而，加入代谢物因子的临床模型的改善程度在所述重复组保持相似且较大(c-统计：包括脂和CRP的临床模型，0.778；临床模型+因子4和9，0.799，P＝0.08；临床模型+所有代谢因子，0.900，与临床模型相比的P＝0.0001)。

代谢物因子和随后心血管事件的风险

随后的2.72年中间，314个CAD病例中有74个有伴随的心血管事件。在未调整的比较中，因子8(短链二羧基酰基肉碱)与死亡或MI的发生高度关联(图2；最高比最低组的危险比例[HR]为2.50；95％CI，1.47-4.17；P＝0.0008；最高比中间组的HR为2.33；95％CI，1.39-3.85；P＝0.002)。此关联的强度在根据CAD风险因子、CAD指数、年龄、种族、性别、射血分数、肌酸酐和插入导管后的CABG处理进行调整后有些减弱(最高比最低组：HR 1.67；95％CI，0.88-3.13；P＝0.11；最高比中间组：HR 1.89；95％CI 1.09-3.33；P＝0.03)。在未调整对比中因子1也与死亡/MI的发生相关联(最高比最低组HR 1.85；95％CI，1.06-3.23；P＝0.03；最高比中间组HR 1.79；95％CI，1.02-3.03；P＝0.04)，但调整后不再显著(分别为P＝0.14和0.05)。

为了验证这些发现，我们在独立病例-对照数据集(‘事件-重复’组)中进行代谢组学分布分析。在该组中，因子8与心血管事件相关联(未调整的OR1.52；95％CI，1.08-2.14；P＝0.01；调整的OR 1.82；95％CI，1.08-3.50；P＝0.03)，随后遭受心血管事件的病例与无事件对照相比具有较高的分数。病例和对照之间因子内的个体代谢物也有显著差异(P＜0.05)，与所述原始‘事件’数据集中的观察具有相似的效应方向。

此实施例证明外周血代谢物分布与CAD的存在独立关联，且与仅含临床变量的模型相比其增加了CAD的辨别能力。此外，我们报告了具体的代谢物群，其独立预测患有CAD的个体中随后的心血管事件。

实施例2：CAD的遗传力

材料和方法

研究群体所述GENECARD研究征集920个家族以进行患病同胞配对链接用于鉴定早发CAD的基因(男性早于51岁，女性56岁)(Hauser等，2003，Am heart J.145，602-613)。招募具有至少两个各满足早发CAD标准(男性早于51岁，女性56岁)的同胞的家族。未患病家族成员定义为无CAD临床证据且男性年龄大于55岁(女性大于60岁)。我们从这个群体中选择我们认为特别有信息量的8个代表性家族，这是基于可获得的相当大量的家族成员以及先证者和附近几代饱受CAD负担(图3)。这些家族经重新联系；无论有无CAD，所述患病同胞配对和之前没有征召的家族成员都要查明，集中于所述患病同胞配对的后代。此调查策略基于这一假说：如果这些家族中代谢物分布不正常先于CAD发展，则家族的代谢物水平的显著一致性可为证据，即使所述后代没有明显的CAD。给定家族的样品收集由单个有经验的静脉切开医师在数个不同时间和不同地点进行。通过外周血静脉切开术收集血样后立即加以处理(数分钟内)，之后尽快冷冻(1-2小时内的收集后最多12小时内冷冻大部分样品)，并作为血浆样品在-80℃存放于EDTA处理的试管中。在禁食状态下，尽量多次收集样品；但是不能确定其一致性。审查委员会批准研究实验方案；从各对象获得知情同意书。

生物化学检测。冷冻的血浆样品用于定量测量目标代谢物，包括37种酰基肉碱、15种氨基酸、9种游离脂肪酸和常规分析物、酮和C-反应蛋白(CRP)。已报道样品制备和变异系数(Haqq等，2005 Contemp Clin Trials，26，616-625)。所述实验室不知道家族鉴定人和病例-对照状态，试验范围为0.05-40微摩尔(μM)(酰基肉碱)；5-1000μM(氨基酸)；和1-1000mmol/L(脂肪酸)。为简单起见，使用代谢物的临床简写(表1)。对来自五个体的样品评估个体内变化，在5个独立的日子里对同一样品进行重复分布分析。变异系数和相关性证实最小的试验内变化(表1)。

常规代谢物分析。标准临床化学法用于常规代谢物，包括葡萄糖、总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、和甘油三酯，用来自罗氏诊断公司(印第安纳州，印第安纳波利斯市)的试剂；和游离脂肪酸(总)和酮(总和3-羟基丁酸盐)，用来自瓦克公司(美国弗吉尼亚州，里士满)的试剂。所有试验在Hitachi 911临床化学分析仪上进行。

酰基肉碱和氨基酸。先用甲醇通过沉淀去除蛋白质。干燥等分上清，然后用热的酸性甲醇(酰基肉碱)或n-丁醇(氨基酸)将其酯化。用具有Quattro Micro装置(沃特斯公司，美国马萨诸塞州密耳佛德)的串联质谱进行分析。通过我们先前描述的方法(Millington等.，1990，J Inherit Metab Dis，13，321-324；An等，2004，Nat Med，10，268-274；Wu等2004，J Clin Invest，113，434-440)检测血浆中37种酰基肉碱和15种氨基酸。亮氨酸/异亮氨酸(LEU/ILE)作为单一分析物报告，因为它们不能通过我们的MS/MS法分辨且其包含别异亮氨酸和羟脯氨酸的影响。在正常环境下这些等比重的氨基酸对LEU/ILE引发信号的影响很小。此外，所述用于形成丁基酯的酸性条件导致谷氨酰胺部分水解为谷氨酸和天冬酰氨部分水解为天冬氨酸。因此，报告为GLU/GLN(GLX)或ASP/ASN(ASX)的值并不代表谷氨酰胺和谷氨酸或天冬酰氨和天冬氨酸的摩尔和，而是分别测量谷氨酸或天冬氨酸加上谷氨酰胺和天冬酰氨部分水解反应影响的量。

游离脂肪酸。用碘甲烷将游离脂肪酸温和甲基化并用固相萃取纯化(Patterson等，1999，J Lipid Res，40，2118-2124)。用Trace DSQ仪器(赛默电子公司(Thermo Electron Corporation)，美国德克萨斯州，奥斯丁)通过毛细管气相色谱/质谱(GC/MS)分析衍生脂肪酸。由于考虑样品体积，117个体中仅80个(八分之五的家族)进行游离脂肪酸检测。

所有质谱分析使用稳定同位素稀释法。通过在来自依士泰公司(Isotec，密苏里州圣路易斯)、剑桥同位素实验室(麻萨诸塞州安多弗)和CDN同位素公司(加拿大魁北克市潘特克莱尔)的样品中加入已知量的稳定-同位素内标的混合物来促进前述“靶标”中间代谢物的定量(表3)。

遗传力分析使用序贯性寡基因连锁分析程序(SOLAR)软件4.0.7版(Almasy和Blangero，1998，Am J Hum Genet，62，1198-1211)计算遗传力，所述软件用最大似然法估计方差组分，使已知协变量的固定效应和遗传效应的方差组分合并。此方法合理解释所有家族成员之间的相互关系且合并如本研究所示的延伸家谱。总变化分为加性遗传方差和环境方差、以及剩余(未解释的)变化的组分。所述程序用家谱协变量矩阵

$\mathrm{\Ω}=2\mathrm{\Φ}{\mathrm{\σ}}_g^2+1{\mathrm{\σ}}_r^2$

其中Ω是所述协变量矩阵，Φ为亲属关系值矩阵，

是加性遗传方差，I代表单位矩阵，且

是所述随机环境方差(Almasy等，1998，见上)。此模型可用于复杂的家谱数据(即超过亲本-后代配对)，因此所得遗传力估值比仅用核心家族成员所获结果更加准确。对于本研究，所述家谱中所有取样个体都加入变异组分模型，包括未患病后代、堂兄弟姐妹和结婚进入家族的成员。并入因结婚进入家族的成员(即遗传上无关但共享环境)可更好的评估家族内特征分类的环境组分。

考虑为异常值的数值从遗传力分析中去除，其定义为落在均值±4SD以外的值(24个所述代谢物各有1-2个异常值)。低于量化下限(LOQ)的代谢物测量的值为LOQ/2。大于25％的样品低于LOQ的四种代谢物(C6、C5-OH:C3-DC、C4DC和C10:2酰基肉碱)没有进一步分析。所有测量在分析前经自然对数变换，结果为多数代谢物近似为正态分布，这是方差组分分析的一个重要考量。18种代谢物不满足此标准，因此对这些代谢物各建立根据体重指数(BMI)、年龄、性别、CAD、糖尿病(DM(是/否)、高血压(是/否)和血脂障碍(是/否)调整的线性回归模型，且剩余误差用于遗传力评估。考虑到代谢物的偶然低特性标准偏差(＜0.5)，分析前所有对数变换的代谢物乘以因子4.7。

然后构建多基因的遗传力模型。对于正态分布的代谢物(所述大多数代谢物)，根据年龄、性别、BMI、DM、血脂障碍、高血压和CAD调整，用所述对数变换值计算多基因遗传模型。未基于任何代谢物值选择所述先证者和家族成员；但是可能存在测量偏倚。因此，基于所述家族成员(先证者)中谁是用于确认该家族早发CAD的指数成员而校正分析。为了解释因子如饮食(其在家庭中共享但推测是非遗传)，在各模型中加入与关联常见家庭影响(通过居住地址标记而包括在模型中)的方差部分相应的额外方差组分参数。除了两种氨基酸(丝氨酸和苯丙氨酸)、11种酰基肉碱(C5、C10、C10:1、C10:3、C12:1、C14、C14-OH:C12-DC、C16-OH:C14-DC、C18:1-OH、C18:1-DC和C18-DC:C20-OH)和三种游离脂肪酸(FAC14:0、FAC16:1、FAC18:1)外，用于所述最终多基因模型的所有剩余的峰度都在正常范围内(即＜0.8)。对于这些代谢物需要移除1-4个极值，之后形成正常剩余峰度。两种酰基肉碱需要移除大量异常值以实现正常的剩余峰度(C16-OH:C14-DC和C12-OH:C10-DC)，因此这些结果应相应解释。对于18种非正态分布的代谢物，来自调整的回归模型的标准化剩余误差用于评估使用SOLAR的遗传力，而由于归一化的偏差已根据相关协变量调整，因而用这些剩余误差的遗传力模型不再调整。针对这些非正态分布代谢物所报道临床协变量解释的变异比例评估，用构建自所述对数变换原始数值的调整多基因模型进行评估。

为了了解家族间代谢物的定量差异，根据性别、年龄、BMI、CAD、DM、血脂障碍和高血压调整的多变量广义线性模型用于比较家族间平均代谢物水平。

无监督的主成分分析。已知许多代谢物定位于重叠途径，预期代谢物具有相关性。为了了解所述相关性，我们采用主成分分析(PCA)以将大量相关变量减少为较少不相关因子群，使用原始代谢物值而不移除异常值。具有最高“特征值”的所述因子构成数据集内的最大量变化。从根据年龄、性别、BMI、DM和CAD调整的线性回归模型中计算的各代谢物的标准化剩余误差用作PCA的输入。当各变量单元的量级显著不同时(如本案例)推荐使用剩余误差的PCA(Johnson和Wichern D.W.，1988，Applied Multivariate Statistical Analysis.(多变量统计应用分析)普恩替斯豪出版社，美国新泽西州，伊勾伍德克里夫(PrenticeHall，Englewood Cliffs，New Jersey))。基于常用凯瑟标准鉴定特征值≥1.0的因子(Kaiser，1960，Educational and Psychological Measurement，20，141-151)。然后进行方差极大旋转以生成可解释的因子。因子负荷≥|0.4|的代谢物报告为包含给定因子，这常用做任意阈值(Lawlor等，2004，Am J Epidemiol，159，1013-1018)。然后用得分系数计算各个体的因子分数(由该因子内标准化的代谢物值的加权和数(各个体代谢物计算的因子负荷的加权)组成)。之后通过上面详述的SOLAR将这些因子分数用于计算各因子的遗传力，使用不再根据协变量调整的多基因模型。需要移除数个所述因子的1-4个极值以实现正态剩余峰度。

因为所有分析本质上是探索性的且已知代谢物的共线性，显示未根据多重比较调整的标称双侧p值，但是报道了用保守的Bonferroni校正解释的结果。标称统计显著性定义为p值≤0.05。用SAS 9.1版进行统计分析(SAS研究所，美国北卡罗来纳州，卡雷)，除了遗传力估值是用SOLAR(Almasy等，1998，见上)。

结果和讨论

遗传力分析在来自早发CAD的GENECARD研究的8个多重高加索家族中117个体上进行代谢分布分析(图3)。应注意，为本研究采样的多数家族成员是原始患病同胞配对的至今未患病后代，但他们作为这些家族的成员都有发展早发CAD的高风险。如预期，有高CAD风险因子负担，尽管家族之间的流行程度不同(表13)。

表13.GENECARD家族的临床特征。显示所述GENECARD群体的总体基线临床特征以及各家族内的基线特征。

HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；BMI：体重指数

我们发现常规风险因子如脂质和BMI有高遗传力(图4).在用基于非质谱的方法分析的代谢物中总酮(h²0.75，p＝3.8x10^-8)有最高的遗传力，个体酮β-羟基丁酸盐有相近的高遗传力(h²0.51，p＝0.004)。质谱测量的代谢物中，数种氨基酸有高遗传力(图5，表14)。精氨酸(ARG)有最高分数(h²0.80，p＝1.9x10^-16)，而谷氨酸/谷氨酰胺(GLX；h²0.73，p＝0.00006)，丙氨酸(ALA；h²0.55，p＝0.00002)，脯氨酸(PRO；h²0.52，p＝0.00004)，鸟氨酸(ORN，h²0.48，p＝0.000005)，苯丙氨酸(PHE；h²0.46，p＝0.0001)，和所述支链氨基酸亮氨酸/异亮氨酸(LEU/ILE；h²0.39，p＝0.00005)和缬氨酸(VAL；h²0.44，p＝0.00006)也有强遗传力。所述游离脂肪酸(图5)中，FA-C20:4(花生四烯酸，炎症途径中关键组分)有最高的遗传能力(h²0.59，p＝0.00005)，以及FA-C18:2(亚油酸，花生四烯酸前体，h²0.48，p＝0.002)也较高。许多酰基肉碱也有高遗传力(图6，表14)，最高的是C18酰基肉碱(C18，C18:1，和C18:2，h²0.39-0.82，p＝0.0000007-0.004)；C14:1(h²0.79，p＝0.0000002)；C5:1(h²0.67，p＝0.000003)；C10s(C10-OH:C8-DC，C10和C10:1，h²0.35-0.57，p＝0.00003-0.02)；C16(h²0.57，(p＝0.0002)；C4:Ci4(h²0.56，p＝0.00003)；短链二羧基酰基肉碱(C5-DC，C6-DC，h²0.45-0.51，p＝0.003-0.004)；和C2酰基肉碱(h²0.50，p＝0.00008)。有趣的是，各代谢物变化的遗传组分评估经常超过临床协变量解释的方差比例(表14)。

表14.个体代谢物的遗传力、临床协变量和家庭影响。显示个体代谢物的结果，包括：遗传力点估值、所述遗传力估值的标准误差，在所述多遗传模型中发现显著的临床协变量、家庭影响解释的变异比例、家庭影响的p值、那些临床协变量解释的代谢物中的变异比例、和遗传力的p值。

^*多遗传模型中显著的临床协变量(年龄、性别、BMI、高血压、糖尿病、血脂障碍、CAD状态)。

由所述模型中显著的临床协变量构成的代谢物水平中的变异比例。

^**遗传力估值的P值。

DM：糖尿病；HTN：高血压；BMI：体重指数；CAD：患有早发CAD；DYS：血脂障碍

家族内的代谢组学分布。根据这些有力的发现，我们寻求理解家族间代谢物的定量差异。用多变量线性模型测试家族间代谢物的差异。所述氨基酸中，谷氨酸、鸟氨酸、精氨酸、脯氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和甲硫氨酸(所有p＜0.0001)、亮氨酸/异亮氨酸(P＜0.0001)和缬氨酸(P＝0.003)可最好地区分家族。在所述酰基肉碱中，所述C18(C18、C18:1和C18:2)和所述C14酰基肉碱(C14，C14:1)(所有p＜0.0001)，和C5:1(p＜0.0001)和C2(p＜0.0001)酰基肉碱可最好地区分家族。许多游离脂肪酸区分家族，最强的是花生四烯酸和棕榈酸(都是p＜0.0001)。在所述常规代谢物中，酮(p＜0.0001)和β-羟基丁酸盐(p＝0.0001)可最好地区分家族。

主成分分析。给定生物途径中的代谢物相关性，我们进行PCA以了解哪组代谢物是相关的并鉴定最可能遗传的因子。鉴定15种因子，证明生物上的一致关系(表15)。所述数据集中构成最大量变异的因子是因子1(短和中链酰基肉碱)；因子2(长链游离脂肪酸)；因子3(长链酰基肉碱和可能报告线粒体功能的氨基酸[精氨酸、谷氨酸/谷氨酰胺和鸟氨酸])；因子4(酮、β-羟基丁酸盐、C2和C4-OH[β-羟基丁酰]酰基肉碱；脂肪酸氧化最终步骤的所有标记)；和因子5(氨基酸，包括支链氨基酸、和C3和C5酰基肉碱[支链氨基酸分解代谢的副产物])。如所预期，根据个体代谢物的结果，许多因子是可遗传的。

表15.GENECARD的主成分分析。显示数据集中PCA的结果，包括各因子内的关键代谢物(即其因子负荷≥|0.4|)；各因子内关键代谢物的总体生化描述；和各因子遗传力点估值的特征值、总体和累积的方差、遗传力和p值。

^*因子负荷≥|0.4|；FFA：游离脂肪酸；Tot Var：总体方差；Cum Var：累积方差

应用综合分析工具以更好地理解心血管疾病的生化和生理学基础结构，以及代谢组学分布与CAD风险已知的遗传组分如何关联。在遭受早发CAD的多重家族中进行靶向的定量代谢分布分析，其大部分代表患病世代的后代中尚未发展出CAD的那些，但如果分布是可遗传的，则我们假设他们与其患病家族成员有相似的代谢分布。许多代谢物发现有高遗传力，许多具有比常规风险因子更高的遗传力。这些高遗传力表明基因型和表型之间有较强关联，意味着强遗传组分使遭受CAD的家族中的这些代谢标志聚集。

此外，数种个体代谢物区分家族，所述氨基酸中最显著的是精氨酸、鸟氨酸、和谷氨酸/谷氨酰胺；所述脂衍生代谢物中是长链酰基肉碱C18:0、C18:1、和C18:2。这些发现表明所述家族中线粒体功能存在根本区别，与表明受损的线粒体功能和胰岛素抗性之间关系的先前研究相一致。

由于我们的研究是假说产生的，我们不根据多重比较调整。然而，根据在所述因子水平的Bonferroni校正，9种因子保持显著(p＜0.003)。我们不解释饮食模式(对代谢的影响已知)、肾功能、或药物治疗(影响未知)。为了有助于最小化这些“非遗传”效应，我们并入家庭效应并包含了结婚进入的个体，特别控制了共享营养和其他环境影响。尽管经过调整，家庭影响的测量显示出对高遗传力的遗传力估值影响很小。因此，我们认为我们的结果反映了遗传和环境下的影响，与传统胆固醇参数相似。因此，我们发现对LDL胆固醇显著的家庭影响(由于家庭的变异比例0.11，p＝0.02)，尽管根据此环境影响进行调整但仍具有显著的遗传力(h²0.37，p＝0.004)。

相似地，结果可反映必需和非必需代谢物的差异。然而，我们发现当作为组分析时，所述必需(h²＝0.40，p＝0.0004)和非必需(h²＝0.63，p＝0.00002)氨基酸有相似的遗传率，以及所述必需(h²＝0.50，p＝0.003)和非必需(h²＝0.33，p＝0.03)脂肪酸相比也类似。尽管这些分析难以为之，我们仍检测与这些组相关的年龄和遗传力的关系。对于必需(缬氨酸)和非必需(脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸)氨基酸，年龄在遗传力检测中是显著协变量(表14)。对于所述游离脂肪酸，年龄仅对非必需脂肪酸(棕榈油酸、油酸和硬脂酸)是协变量。我们还检测了代谢物和年龄的关联并发现必需(酪氨酸、亚油酸)和非必需(谷氨酰胺、鸟氨酸、瓜氨酸)代谢物都与年龄显著关联(数据未显示)。因此，基于必需/非必需组，代谢物和年龄似乎没有一致的变异，其和遗传力估值也没有。这可表明基础和遗传控制的代谢过程(如线粒体或微粒体分解代谢途径)影响必需和非必需代谢物水平，所述代谢过程利用所述代谢机制的这些常见要素。

可影响遗传力估值的其他因素包括样品收集和处理中的变化。我们使用标准实验方案以限制这种变化，在一组重复试验中降低个体内变化，且在不同地点和时间收集家族成员。

本研究主要优势是使用非常精确的、靶向的、定量方法进行代谢组学分布分析，使我们能解开CAD病理生理学下的生物机制除了促进对CAD病理生理学的理解，这些结果还对风险预测有重要的提示。

本文引用的各参考文献通过引用全文纳入本文。

Claims (26)

1.一种评估对象心血管疾病风险的方法，所述方法包括：

a)检测所述对象的样品中至少一种代谢物，其中所述代谢物选自由以下组成的组：酰基肉碱、氨基酸、酮、游离脂肪酸和羟基丁酸盐；和

b)将所述样品中的代谢物水平与标准作比较，其中所述对象的代谢物水平表明所述对象的心血管疾病风险。

2.一种评估对象心血管疾病风险的方法，所述方法包括：

从所述对象获取样品；

将所述样品提供给实验室以检测所述样品中代谢物水平，其中所述代谢物选自酰基肉碱、氨基酸、酮、游离脂肪酸和羟基丁酸盐；和

从所述试验室接收表明所述样品中代谢物水平的报告，其中所述代谢物水平表明所述对象心血管疾病的风险。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病是心血管事件且所述对象的代谢物水平表明所述对象中心血管事件的风险。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)检测的代谢物是短链二羧基酰基肉碱代谢物。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)检测的代谢物选自由以下组成的组：Gly、Ala、Ser、Pro、Met、His、Phe、Tyr、Asx、Glx、鸟氨酸、瓜氨酸、arg、C2、C3、C4:C14；C5:1、C5、C4:OH、C14-DC:C4DC、C5-DC、C6-DC、C10:3、C10、C10-OH:C8DC、C12:1、C12、C12-OH:C10DC、C14:1-OH、C14-OH:C12-DC、C16、C16-OH/C14-DC、C18:2、C18-OH/C16-DC、C20、C20:1-OH/C18:1-DC、C20-OH/C18-DC、C8:1-OH/C6:1-DC、C8:1-DC、C16:1、C16:1-OH/C14:1-DC、C20:4、FFA、HBUT、和Ket。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)检测的代谢物包括因子8的代谢物。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)检测的代谢物包括瓜氨酸、C5-DC、C6-DC、C8:1-OH/C6:1-DC、和C8:1-DC。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)检测的代谢物包括鸟氨酸、瓜氨酸、C5、C14-DC:C4DC、C5-DC、C6-DC、C10-OH:C8DC、C8:1-OH/C6:1-DC、C8:1-DC、C20:4和FFA。

9.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病是冠心病且所述对象的代谢物水平表明所述对象存在冠心病。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)检测的代谢物是中链酰基肉碱、支链氨基酸或相关代谢物、或尿素循环相关代谢物。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)检测的代谢物选自由以下组成的组：Pro、Leu/Ile、Met、Val、Glx、瓜氨酸、C2、C3、C4:Ci4；C5、C8、C8:1-OH/C6:1-DC、C10:1、C14:2、C14:1-OH、C16:2、C16:1、C16:2、C16:1、C16:1-OH/C14:1-DC、C18-OH/C16-DC、HBUT和Ket。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)检测的代谢物包括因子1、因子4或因子9中至少一个的代谢物。

13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)检测的代谢物包括Leu/Ile、Glx、C14:1-OH和C16:1-OH/C14:1-DC。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，Leu/Ile水平高于170mM指示冠心病。

15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，GLx水平高于128mM指示冠心病。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，C14:1-OH水平低于0.013μM指示冠心病。

17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，C16:1-OH/C14:1-DC水平低于0.0089μM指示冠心病。

18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述步骤(a)检测的代谢物还包括C2，C5和C18-OH/C16-DC。

19.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述心血管疾病是冠心病且所述对象的代谢物水平表明所述对象发展出冠心病的风险。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述测量的代谢物包括短和中链酰基肉碱代谢物、支链氨基酸和尿素循环相关代谢物。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述测量的代谢物包括酮、arg、鸟氨酸、瓜氨酸、glx、ala、val、leu/ile、pro、C2、C14:1、C18:1、C5:1、C4-i4、C18、C10:1和FFA。

22.如权利要求1-5、9-11或19-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述至少两种代谢物的水平在步骤(a)中检测。

23.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述样品是血液。

24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述代谢物水平用质谱检测。

25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述代谢物水平用比色或荧光实验检测。

26.一种开发用于对象的治疗计划的方法，所述方法包括用前述权利要求中任一项所述步骤(b)的所述比较来开发基于所述对象的心血管疾病风险的治疗计划。

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