CN114324641A - 一种冠心病代谢标志物及在诊断、预后方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种冠心病代谢标志物及在诊断、预后方面的应用。冠心病是目前最为常见的心血管疾病之一，严重威胁我国公众健康。为了实现冠心病的早期诊断，本发明对预警冠心病的生物代谢标志物进行了筛选，通过超高效液相色谱与质谱联用技术平台对冠心病患者和健康人的血浆样本进行分析，获得相应的的质谱指纹图谱，并结合代谢组学模式识别技术筛选出冠心病相关的潜在差异标志物。根据本发明的筛选结果，丙酮酰胺作为标志物能够良好的区别冠心病患者，本发明进一步提供了包含丙酮酰胺在内的六种标志物的组合，有效提高了诊断精确性。

Description

一种冠心病代谢标志物及在诊断、预后方面的应用

技术领域

本发明属于疾病代谢标志物技术领域，具体涉及包括丙酰肉碱在内的冠心病代谢标志物，所述代谢标志物的检测试剂及其在冠心病诊断、预后方面的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

冠状动脉粥样硬化性心脏病，简称冠心病(Coronary artery disease，CHD)已成为当今严重危害人类健康、影响人们生活质量的最常见心血管疾病之一。近年来，冠心病在我国的发病率和死亡率呈迅速上升趋势，已成为威胁我国公众健康的重要疾病。关于冠心病的诊断也越来越受到人们的重视，更早期、准确的诊断，及时、正确的治疗，对改善预后、降低死亡率具有重要意义。从中找出与疾病发展密切相关的标志性代谢物分子，并将这些分子标志物应用于冠心病的临床诊断的早期预测变得尤为重要。

代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后系统生物学的又一个主要的研究平台，并逐渐成为生命科学不可或缺的研究方向。近年来代谢组学在心血管疾病中的应用研究受到很大关注，通过全面定量定性分析心血管疾病患者样本中的小分子物质，来研究体内、外环境刺激后其内源性代谢物质的变化及其规律，以寻找与疾病相关的代谢标记物。代谢组学利用高分离效率、高灵敏度及极低检测限的仪器，以生物体内低分子量物质的动态规律变化来表示生物体的生理病理变化趋势。目前常用的分析技术包括核磁共振(NMR)、液相色谱-质谱连用(LC-MS)和气相色谱-质谱连用(GC-MS)等。代谢紊乱的变化常常会在尿液、血液等体液中的代谢物得到体现。因此应用代谢组学对尿液、血液等生物体液的代谢物进行检测和分析，就可能对疾病发生和发展过程伴随的生物化学变化有全新的认识和了解，进而发现与冠心病早期发生相关的生物标志物，探索冠心病的发病机制及新的治疗靶点，为该病的预后判断、诊断及治疗提供新的思路。

发明内容

基于上述技术背景，本发明目的在于提供一种可用于冠心病的生物代谢标志物，实现冠心病的早期预警。为了实现该技术目的，该发明采用超高效液相色谱与质谱联用技术平台对冠心病患者和健康人的血浆样本进行分析，获得相应的的质谱指纹图谱，并结合代谢组学模式识别技术筛选出冠心病相关的潜在差异标志物。基于本发明的筛选，提供了具有良好区分效果的标志物。因此，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种冠心病的代谢标志物，所述代谢标志物中至少具有丙酰肉碱。

本发明第一方面所称的冠心病，包括稳定性冠心病和急性冠状动脉综合征；即冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变、炎症、栓塞而引起血管腔狭窄或阻塞，其表现包括无症状心肌缺血(隐匿性冠心病)、心绞痛、心肌梗死、缺血性心力衰竭(缺血性心脏病)或猝死。

优选的，本发明第一方面所述代谢标志物，还包括以下标志物中的一种或几种：肌酐、丙酮酸、次黄嘌呤、苹果酸、油酸、棕榈油酸、L-缬氨酸、肉豆蔻酸、丙酰肉碱、牛磺酸肌酸、乳酸、丙酮酸、柠檬酸、溶血磷脂酰胆碱(16:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:0)、溶血磷脂酰胆碱(20:0)。

经本发明证实，上述用于区分冠心病患者与健康人的标志物中，单独采用丙酰肉碱作为标志物即可表现出良好的特异性和灵敏度，能够有效区分冠心病患者和健康样本。本发明的筛选过程中，还提供了其他差异代谢物，并且经验证，丙酰肉碱与其他差异代谢物的组合能够有效提高诊断的精确性。

进一步的，所述代谢标志物包含上述标志物中的2～8种；更进一步的，所述代谢标志物包含上述标志物中的2～6种，包括油酸、肌酐、柠檬酸、丙酮酸、乳酸中的一种或几种与丙酰肉碱的组合。

一种实施方式中，所述代谢标志物为2种，即丙酰肉碱和油酸的组合。

又一种实施方式中，所述代谢标志物为3种，即丙酰肉碱和油酸、肌酐的组合。

又一种实施方式中，所述代谢标志物为4种，即丙酰肉碱和油酸、肌酐、柠檬酸的组合。

又一种实施方式中，所述代谢标志物为5种，即丙酰肉碱和油酸、肌酐、柠檬酸、丙酮酸的组合。

一种效果较好的实施方式中，所述代谢标志物为6种，即油酸、肌酐、柠檬酸、丙酮酸、乳酸、丙酰肉碱的组合。

本发明第二方面，提供第一方面所述代谢标志物在冠心病诊断或预后方面的应用。

优选的，所述冠心病诊断方面的应用包括冠心病的诊断、早期诊断或病理分期确认等；所述冠心病预后方面的应用包括疾病发展风险或治疗前景评估等。

优选的，第二方面所述应用，包括但不限于以下任意一个方面：

(1)所述代谢标志物的检测制剂在制备冠心病诊断或预后评估产品中的应用；

(2)通过检测上述代谢标志物的含量对受试者的患病情况进行判断；

(3)通过检测上述代谢标志物的含量对患者冠心病的发展风险或治疗前景进行评估。

进一步的，第(1)方面中，所述诊断或预后评估产品的具体实例如试剂盒或检测芯片。

上述(2)或(3)方面中，还包括将受试者样本中上述代谢标志物含量与cot-off值进行比对的步骤，所述cut-off值是本领域技术人员根据试剂盒、表达量计算方法、样本等因素可常规确定的技术内容。当受试者样本中所述丙酰肉碱含量上升时，意味着受试者患有冠心病或冠心病不良预后的可能性更大。

本发明第三方面，提供一种试剂组合物，所述试剂组合物中包括检测第一方面所述代谢标志物的试剂。

本发明第四方面，提供一种冠心病诊断或预后判断试剂盒，所述试剂盒中包括第三方面所述试剂组合物。

所述试剂盒基于受试者样本对上述代谢标志物的含量进行检测，所述受试者样本为受试者的临床生物样本，包括但不限于血清(浆)、全血、分泌物、棉拭子、脓液、体液、组织、器官、石蜡切片中的一种或几种等；本发明提供的一个实施方式中，所述受试者样本为血清或血浆。

试剂盒中的试剂种类可依据本领域技术人员所选择的检测方法进行调整，所述试剂盒可适用的一种检测方式为液质联用方法，所述试剂盒中包括受试者样本预处理试剂、代谢物标准品和/或流动相。

本发明提供的一种实施方式中，所述液质联用检测方法的液相色谱条件如下：流动相A为乙腈，流动相B为氟化铵的水溶液，采用梯度洗脱程序进行分析；所述质谱检测采用正、负模式下全扫描。

具体的实例中，所述液质检测的参数如下：

色谱条件：柱温40℃；流速0.3mL min^-1；

自动进样器温度为4℃；

流动相A为乙腈，流动相B为含有0.5mM氟化铵的水溶液。梯度洗脱程序为2～5min，5％～40％A；5～10min，40％～70％A；10～12min，70％～100％A；12～15min，100％～5％A；每次进样的分析时间为15min；

质谱条件：正、负模式下全扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为70,000FWHM和17,500FWHM；

离子源：HESI源；

离子源参数：离子传输管温度350℃；

喷雾电压：正离子模式3.6kV，负离子模式3.5kV；

鞘气流速：40Arb；

辅助气流速：10Arb；

高能碰撞诱导电压：15、25和35eV；扫描范围为100-1200m/z。

本发明第五方面，提供一种冠心病的诊断或预后评估方法，所述方法包括对待测样本中第一方面所述的代谢标志物含量进行检测。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

本发明为预警冠心病提供了一种稳定、可靠、快速的方法，与其他方法相比较，该方法样品预处理简单、数据量丰富、具有良好的选择性、灵敏度较高，通过多元统计模型筛选差异标志物能够筛选出用于预警冠心病潜在的差异标志物。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为冠心病患者与健康人的血清样本正、负模式下的总离子流图；

其中，图1A为正离子模式下的总离子流图；图1B为负离子模式下的总离子流图。

图2为肌酐通过标准品的二级质谱数据确证图。

图3为冠心病患者与健康人中代谢物的多元统计分析结果；

其中，图3A为冠心病患者与健康人的PCA模型图；图3B为冠心病患者与健康人的OPLS-DA模型图。

图4为差异标志物诊断冠心病患者与健康的ROC曲线；

其中，图4A为丙酰肉碱与冠心病患病的ROC曲线；

图4B为丙酰肉碱、油酸的组合与冠心病患病的ROC曲线；

图4C为丙酰肉碱、油酸、肌酐的组合与冠心病患病的ROC曲线；

图4D丙酰肉碱、油酸、肌酐、柠檬酸的组合与冠心病患病的ROC曲线；

图4E丙酰肉碱、油酸、肌酐、柠檬酸、丙酮酸的组合与冠心病患病的ROC曲线；

图4F丙酰肉碱、油酸、肌酐、柠檬酸、丙酮酸、乳酸、丙酰肉碱的组合与冠心病患病的ROC曲线。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，冠心病是严重威胁我国公众健康的疾病，并发症多、病情发展复杂且有猝死风险，提供冠心病发展相关的生物标志物，对实现冠心病的早期预警、降低患病风险具有重要意义。为了实现上述技术目的，本发明提供了包括丙酰肉碱在内的代谢标志物在冠心病诊断或预后方面的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1、检测试剂与方法

1.1试剂与仪器

Q-Exactive-Ultimate 3000超高效液相色谱-质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；色谱柱为C18色谱柱(ACQUITY UPLC BEH C18(2.1mm×100mm,1.7μm))；高速离心机(德国eppendorf公司)；涡旋混匀器(美国Scientific Instruments公司)。乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；氟化铵(美国Sigma-Aldrich公司)；肌酐、丙酮酸、油酸、乳酸、柠檬酸购自美国Sigma-Aldrich公司；实验用水由Milli-Q超纯水系统制备。

1.2样本的采集与制备

造影前采集空腹静脉血置于肝素抗凝管中，在4℃下以3000r/min离心20min，取上清液，离心后取上清液1mL再次离心15mins，转速12000rpm。之后过0.22μm微孔滤膜保存在进样小瓶中，所有的样本均储存在-80℃冰箱中集中进样。对于对照组健康人样本排除患有心肌炎、主动脉夹层、高血压、高血脂等心血管疾病的患者。

1.3色谱与质谱工作条件

色谱条件：柱温40℃；流速0.3mL min-1；自动进样器温度为4℃；流动相A为乙腈，流动相B为含有0.5mM氟化铵的水溶液。梯度洗脱程序为2～5min，5％～40％A；5～10min，40％～70％A；10～12min，70％～100％A；12～15min，100％～5％A；每次进样的分析时间为15min。

质谱条件：正、负模式下全扫描和MS/MS扫描的分辨率分别为70,000FWHM和17,500FWHM；离子源：HESI源；离子源参数：离子传输管温度350℃；喷雾电压：正离子模式3.6kV，负离子模式3.5kV；鞘气流速：40Arb；辅助气流速：10Arb；高能碰撞诱导电压：15、25和35eV；扫描范围为100-1200m/z。

1.4数据处理和差异标志物的鉴定

使用美国Thermo Fisher公司推出的小分子数据处理软件Compound Discoverer3.1软件进行数据预处理、代谢鉴定及结构分析、数据统计分析、代谢通路分析等在内的数据分析工作。数据预处理主要包括滤燥、峰检测、峰比对、峰面积归一化、保留时间对齐、m/z校正等。代谢物鉴定是建立标准品谱图数据库，通过谱图对比的方式，对未知化合物进行分子式预测和结构鉴定。使用空白样本去除背景离子，QC样本用作归一化。从CompoundDiscoverer 3.1软件鉴定的结果中筛选P<0.05的化合物导入Simca-P(14.1)进行多元统计分析。PCA和OPLS-DA用来揭示冠心病患者和健康人代谢轮廓的变化，相应的变量重要性(Variable importance in the projection,VIP)通过OPLS-DA模型计算出来，选取VIP＞1及P＜0.05为筛选差异标志物条件。

2、结果与讨论

2.1冠心病患者与健康人代谢物谱图轮廓分析

通过高通量、高灵敏度的UPLC-MS技术同时对正、负离子模式下的冠心病患者与健康人的血浆样本进行数据采集，生成总离子流图，共检测到546个代谢物。可以发现冠心病患者与健康人在正、负离子模式下的总离子流图存在明显差异。

2.2主成分分析

首先建立主成分分析(PCA)用于区分冠心病患者和健康人，其R²为85.9％，预测能力(Q²)为90.5％，PCA表明冠心病患者与健康人有良好的区分。此外，为了验证冠心病患者与健康人之间的数据差异是由代谢物变化产生的，而不是在数据采集过程中由于仪器的偏差产生，将QC样本进行聚类分析。本实施例研究结果显示，QC样本紧密的聚集在一起，说明数据在分析过程中仪器设备是稳定，数据是可靠的，可以用于差异标志物的筛选。

2.3差异标志物的鉴定与筛选

对于有标准品的内源性代谢物，通过与标准品的保留时间和一、二级质谱信息对比进行定性分析；没有标准品的内源性代谢物，则通过搜索mzCloud、HMDB和Massbank等数据库所提供的一、二级质谱信息进行对比定性分析。例如，m/z114.06620的碎片离子分别为m/z 96.08921、m/z 79.05481、m/z 70.06531、m/z55.01834，通过搜索mz Cloud数据库最佳匹配结果为肌酐，进一步地，通过标准品进行验证，可以看出标准品二级谱图数据与目标化合物的二级质谱数据相匹配，目标化合物得以确证。

为了有效地寻找导致冠心病患者和正常人代谢表型差异的特征代谢物，将预处理好的数据建立OPLS-DA模型。OPLS-DA分析方法是通过去除无关分类信息，更好的提取对分类贡献大的变量。OPLS-DA是一种常用的监督性学习方法，可以有效减少模型的复杂性并且增强模型的解释能力，并且不降低模型预测能力，因此可最大程度的观察组间差异。R²Y(cum)代表模型对Y变量的解释性，Q²(cum)代表模型的预测能力，一般情况下，R²Y(cum)和Q²(cum)大于0.5时，说明模型较好。R²Y(cum)为0.883，Q²(cum)为0.994表明所建立的OPLS-DA模型具有良好的预测能力，可以用于筛选差异标志物。通常认为OPLS-DA模型计算的VIP及单变量分析P值为筛选差异标志物的指标，选取VIP＞1及P＜0.05为筛选差异标志物条件，如表1所示，肌酐、丙酮酸、次黄嘌呤、苹果酸、油酸、棕榈油酸、L-缬氨酸、肉豆蔻酸、丙酰肉碱、牛磺酸肌酸、乳酸、丙酮酸、柠檬酸、溶血磷脂酰胆碱(16:0)、溶血磷脂酰胆碱(18:0)、溶血磷脂酰胆碱(20:0)17种差异标志物。

表1冠心病患者与健康人差异标志物VIP值和P值

2.4代谢通路分析

肌酐是从肌肉中分解的代谢产物，其来源于肌酸、精氨酸和甘氨酸，在医学中作为检测指标广泛使用，肌酸可以通过不可逆的非酶脱水反应形成肌酐，再释放到血液中。肌酐紊乱表明能量代谢的波动，肌酐在正常人体中通常以相对恒定的速率产生。与健康人组相比，冠心病患者中观察到血液中肌酐显著增加，这表明肌酐紊乱具有引起冠心病的潜在风险。乳酸、丙酮酸、柠檬酸主要涉及三羧酸循环。三羧酸循环是有氧代谢供能的主要途径，乙酰辅酶A与草酰乙酸作用下形成柠檬酸。丙酮酸作为乳酸被摄取后糖酵解的代谢物，是糖类代谢和脂类代谢进入三羧酸循环的中间产物，可以调节三羧酸循环。本发明中冠心病患者血浆中乳酸、丙酮酸水平均明显下降，说明冠心病患者有严重能量代谢异常。

2.6受试者工作曲线(ROC)法验证

采用ROC比较17个差异代谢物诊断区分冠心病患者和健康人的能力。结果表明，丙酰肉碱单独用于诊断区分冠心病患者与健康人的能力较强，如图4所示，ROC曲线下面积(AUC)为0.884，其特异性均为0.875,灵敏度为0.878，丙酰肉碱与油酸组合用于诊断时，ROC曲线下面积(AUC)为0.972，其特异性为0.944,灵敏度为0.951；丙酰肉碱与油酸、肌酐组合用于诊断时，ROC曲线下面积(AUC)为0.977，其特异性为0.931,灵敏度为0.976；丙酰肉碱与油酸、肌酐与柠檬酸组合用于诊断时，ROC曲线下面积(AUC)为0.982，其特异性为0.944,灵敏度为0.976；丙酰肉碱与油酸、肌酐、柠檬酸、丙酮酸组合用于诊断时，ROC曲线下面积(AUC)为0.982，其特异性为0.958,灵敏度为0.951；丙酰肉碱与油酸、肌酐、柠檬酸、丙酮酸、乳酸组合用于诊断时，ROC曲线下面积(AUC)为0.986，其特异性为0.958,灵敏度为0.976，诊断能力极好，具有临床诊断意义。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种冠心病的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物中至少具有丙酰肉碱。

2.如权利要求1所述冠心病的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物为丙酰肉碱。

3.如权利要求1所述冠心病的代谢标志物，其特征在于，所述代谢标志物为油酸、肌酐、柠檬酸、丙酮酸、乳酸中的一种或几种与丙酰肉碱的组合；

优选的，代谢标志物为2种，即丙酰肉碱和油酸的组合；

优选的，所述代谢标志物为3种，即丙酰肉碱和油酸、肌酐的组合；

优选的，所述代谢标志物为4种，即丙酰肉碱和油酸、肌酐、柠檬酸的组合；

优选的，所述代谢标志物为5种，即丙酰肉碱和油酸、肌酐、柠檬酸、丙酮酸的组合；

优选的，所述代谢标志物为6种，即油酸、肌酐、柠檬酸、丙酮酸、乳酸、丙酰肉碱的组合。

4.权利要求1-3任一项所述代谢标志物在冠心病诊断或预后方面的应用。

5.如权利要求4所述的代谢标志物在冠心病诊断或预后方面的应用，其特征在于，所述代谢标志物在冠心病诊断或预后方面的应用为以下任意一个方面：

(1)所述代谢标志物的检测制剂在制备冠心病诊断或预后评估产品中的应用；

(2)通过检测上述代谢标志物的含量对受试者的患病情况进行判断；

(3)通过检测上述代谢标志物的含量对患者冠心病的发展风险或治疗前景进行评估。

6.如权利要求5所述代谢标志物在冠心病诊断或预后方面的应用，其特征在于，第(1)方面中，所述诊断或预后评估产品为试剂盒或检测芯片。

7.一种试剂组合物，其特征在于，所述试剂组合物中包括检测权利要求1-3任一项所述代谢标志物的试剂。

8.一种冠心病诊断或预后判断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求7所述试剂组合物；

所述试剂盒基于受试者样本对上述代谢标志物的含量进行检测，所述受试者样本为受试者的血清或血浆样本。

9.如权利要求7所述冠心病诊断或预后判断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒适用于液质联用方法。

10.如权利要求7所述冠心病诊断或预后判断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括受试者样本预处理试剂、代谢物标准品或流动相；

所述液质联用检测方法的液相色谱条件如下：流动相A为乙腈，流动相B为氟化铵的水溶液，采用梯度洗脱程序进行分析；所述质谱检测采用正、负模式下全扫描。

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