CN115856275B - 用于筛查急性冠脉综合征所致心源性猝死的标志物及其应用 - Google Patents
用于筛查急性冠脉综合征所致心源性猝死的标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用于筛查急性冠脉综合征所致心源性猝死的标志物及其应用。所述标志物包括4‑乙酰氨基丁酸和丙酮酸。该组合可以联合用于急性冠脉综合征致猝死病人的识别；一种筛查急性冠脉综合征所致心源性猝死的标志物的方法，其包括以下步骤，通过OPLS‑DA法鉴定血浆EVs代谢物，确定差异代谢物；筛选P<0.01的蛋白为差异蛋白；将差异代谢物和差异蛋白质引入Metscape和Cytoscape，根据KEGG数据库链接代谢物与蛋白质；统计分析差异代谢物和差异蛋白及各自与发病相关的临床指标之间的相关性，根据统计学结果确定标志物通过本发明涉及的组合标志物，能够对急性冠脉综合征致猝死的诊断具有高灵敏、高特异性特征。
Description
技术领域
本发明属于分析化学及临床医学领域，涉及用于筛查急性冠脉综合征所致心源性猝死的标志物及其应用。
背景技术
急性冠脉综合征（Acute coronary syndrome，ACS）所致的心源性猝死（Suddencardiac death，SCD）已成为全世界死亡的首要原因，其是以冠状动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）斑块破裂，继发完全或不完全血栓形成为病理基础的一组临床综合征，包括心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）和不稳定型心绞痛（Unstableangina，UA）。动脉粥样硬化斑块的进展被认为是动态且复杂的，并且斑块形成、发展和破裂的详细机制至今尚不完全清楚。大部分SCD患者在猝死事件发生前没有明显症状，临床常用于评判猝死风险的大部分生物标志物如肌钙蛋白、肌酸激酶、N端pro-B型利钠肽、循环脑钠肽、高敏C反应蛋白一定程度上可以预测心血管事件的发生率，然而在其他炎症性疾病包括牙周病和类风湿性关节炎中也发现了这些生物标记物水平的增加，缺乏足够的特异性和敏感性。因此寻找标志斑块不稳定和破裂风险的生物标志物，对于预防从AS斑块稳定向不稳定的转变、血栓事件形成，防止猝死的发生非常重要，是对ACS所致猝死风险患者进行早期筛查及分层管理的重要步骤。
细胞外囊泡 (extracellular vesicles，EVs) 是指细胞分泌的脂质双层囊性小泡，根据生物合成或释放途径的不同可以分为外泌体 (exosomes) 、微泡(microvesicles) 、凋亡小体 (apoptoticbody/bleb.等，其作为生物标志物或治疗工具的巨大潜力得到广泛认可。研究显示，冠心病患者心肌缺血缺氧损伤后4 h就可产生一些特殊的心源性外泌体（Exosomes），其中携带蛋白质、脂类、代谢物、核酸（miRNAs、mRNAs）等活性物质。外泌体因为具有脂质双分子层可以保护其内容物免受外部蛋白酶和其他酶的降解，具有高度的稳定性，因此其作为生物标志物具有较大优势。前人关于ACS外泌体标志物的研究大多数是聚焦于核酸标志物或者蛋白质，如hsa-miR-1、hsa- miR-133a、miR-146a和miR-21被证实在急性冠脉综合征患者的血清外泌体中上调。进一步对外泌体蛋白质组学的研究表明，Cyr61、HSP70等大量蛋白质在血管重塑中起调节作用。但由于采用了不同的技术方法，不同细胞的外泌体中鉴定出不同的核酸和蛋白质，且重叠百分比较低。而且外泌体的提取方法也显著影响收集的外泌体中核酸和蛋白质的质量和数量鉴定，因此，能真正转化为临床应用的核酸和蛋白质生物标志物还有待发掘和进一步验证。
近来，由于代谢组学化学“解读”正在发生事情的能力，被越来越多地用于生物医学研宄。炎症、缺氧或高血糖会影响外泌体内的miRNA图谱，mRNA和miRNA进而在靶细胞中转化为蛋白质，在受体细胞中保持其功能，并可能通过激活或抑制多个分子途径导致代谢变化。因此，代谢物可作为与ACS发病机制相关的生化途径改变的读数。
目前关于血浆代谢物参与ACS进展基础的生物学过程和遗传机制领域已经取得了重大进展，但ACS患者血浆外泌体代谢变化的研究鲜有。此外，大多数ACS临床代谢组学研究都是小规模的初步类型研究，样本量有限，缺乏所需的统计稳健性和有效性，难以测量与不同疾病状态或干预相关的代谢物流量的细微差异，因此新标记物/代谢物簇缺乏多样性和可靠性，导致ACS代谢组学的研究结果很少被转化为ACS疾病诊断和风险预测的实际应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于筛查急性冠脉综合征所致心源性猝死的标志物及其应用。由于EVs预计参与ACS-SCD发病机制，我们假设EVs可以提供丰富的代谢物质/脂质来源，反映ACS-SCD患者外周血代谢物质的变化。鉴于此，本研究利用先前开发的从人外周血分离和富集EV的方法（来自文献：L. Hu, J. Wang, D. Lin, Y. Shen, H.Huang, Y. Cao, Y. Li, K. Li, Y. Yu, Y. Yu, C. Chu, L. Qin, X. Wang, H.Zhang,D. Fulton, F. Chen, Mesenchymal Stem Cell-Derived Nanovesicles as a CredibleAgent for Therapy of Pulmonary Hypertension, Am J Respir Cell Mol Biol,(2022)），结合基于半定量超高分辨率和精确质谱(UHPLC-HRMS)的代谢组学分析，我们首次对ACS所致SCD人群进行EVs代谢产物的研究，并与EVs蛋白质组学联合分析，期望发现与ACS所致SCD风险程度相关的EVs差异表达因子及其关键通路，重点挖掘猝死风险高的ACS患者中EVs内多种免疫和代谢组分的失调，筛选出新的具有 ACS所致SCD风险早期诊断潜能的分子标志物。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：用于筛查急性冠脉综合征所致心源性猝死的标志物，所述标志物包括4-乙酰氨基丁酸和丙酮酸。
优选的，所述标志物来源于细胞外囊泡代谢物。
优选的，所述标志物来源于血浆细胞外囊泡代谢物。
本发明还提供一种检测上述标志物的方法，其为：通过OPLS-DA法鉴定血浆EVs代谢物，确定差异代谢物；应用Orbitrap Eclipse三合一超高分辨质谱仪对EVs蛋白质进行定量测定，筛选P<0.01的蛋白为差异蛋白；将差异代谢物和差异蛋白质引入Metscape和Cytoscape，根据KEGG数据库链接代谢物与蛋白质；统计分析差异代谢物和差异蛋白及各自与发病相关的临床指标之间的相关性，根据Omics整合分析结果确定标志物。
优选的，所述标志物为4-乙酰氨基丁酸和丙酮酸。
本发明还提供一种筛查心源性猝死的试剂盒，所述试剂盒含有检测4-乙酰氨基丁酸和/或丙酮酸的试剂。
优选的，所述试剂盒含有检测血浆中4-乙酰氨基丁酸和/或丙酮酸的试剂。
优选的，所述试剂盒含有检测血液中4-乙酰氨基丁酸和/或丙酮酸的试剂。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种细胞外囊泡代谢物组合物及其作为心源性猝死早期筛查及诊断的标志物与应用，血浆细胞外囊泡中代谢物4-乙酰氨基丁酸和丙酮酸，所述组合经ROC诊断曲线（详见图5）判定可以联合用于急性冠脉综合征致猝死病人的识别。通过本发明涉及的组合标志物，能够对急性冠脉综合征致猝死的诊断具有高灵敏、高特异性特征。
附图说明
图1为血浆EV的代谢组分析，其中，A：KEGG途径中代谢物的分布(https://pathways.embl.de/)， B：对照组、UA组、MI组和SCD组的OPLS-DA模型，C：对照组和UA组的OPLS-DA模型，D：MI组和UA组的OPLS-DA模型，E：MI组和SCD组的OPLS-DA模型；
图2为不同EVs代谢物的路径分析，其中，A：对照组和UA组的富集和途径分析，B：MI组和UA组的富集和途径分析，C：MI组和SCD组的富集和途径分析，D：对照组和UA组的网络分析，E：MI组和UA组的网络分析，F：MI组和SCD组的网络分析；
图3为与SCD进展和相关网络相关的关键代谢产物，其中，A ：各组EV中与SCD进展相关的差异代谢物的相对表达，B ：差异代谢物途径的富集，C ：差异代谢物相互作用网络的OPLS-DA分析，D：VIP值；
图4为血浆EVs代谢物水平与临床指标和蛋白质水平之间的相关性，其中，A：27种血浆EVs代谢物与SCD进展相关，159种蛋白质与SCD发展相关，B：血浆EVs代谢物水平与临床指标的相关性；
图5为4-乙酰氨基丁酸和丙酮酸联合诊断MI和SCD的曲线下面积（AUC）；
图6为血浆EVs蛋白质组分析，其中，A：KEGG代谢途径中差异蛋白的分布，柱高是路径中蛋白质的数量，颜色是路径中蛋白的重要百分比；B：代谢途径中与SCD进展相关的差异蛋白的热图；C：各组之间的OPLS-DA模型；
图7为代谢物、蛋白质和临床指标之间的Omics整合分析。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
共有96名SCD、ACS患者和对照组人员，来自中国的两个独立中心（表1），根据诊断指南（不稳定心绞痛和非ST段抬高型急性冠脉综合征诊断标准参见《2020年欧洲心脏病学会( ESC)非ST段抬高型急性冠脉综合征管理指南》;急性ST段抬高型心肌梗死诊断标准参见《急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南( 2019) 》），这些患者进一步分为以下组：对照组（N=41）、不稳定心绞痛组（UA组）（N=18）、心肌梗死组（MI组）（N=21）和心源性猝死组（SCD组）（N=16）。各组的基线特征和实验室数据如表1所示：
*平均值±标准差, #n (%)
采用单因素方差分析分析四组之间的连续正态分布变量，Kruskal-Wallis H检验用于非正态分布数据，Student t检验用于两组之间的连续正态分布变量，Mann-Whitney U检验用于非正态分布数据，χ2检验比较类别变量。N/A：不可用。饮酒史定义为≥每天50克酒精。a：不稳定心绞痛组与对照组之间的差异P＜0.05；b：心肌梗死组与对照组之间的差异P＜0.05；C：心源性猝死组与对照组之间的差异P＜0.05；d：不稳定心绞痛组与心源性猝死组之间的差异P<0.05；e：心肌梗死组与心源性猝死组之间的差异P<0.05；f：心肌梗死组与不稳定心绞痛组之间的差异P<0.05。
从表1基线特征和临床指标中看出，随着疾病从对照组转移到SCD，观察到快速血糖（FBG）和低密度脂蛋白（LDL）升高，总胆固醇（TC）和高密度脂蛋白降低。同时，炎症状态增加，因为MI组和SCD组患者之间hs-CRP水平存在显著差异（P=0.0031）。使用GRACE评分系统确定缺血性损伤的风险分层和预后预测，GRACE得分在UA组、MI组和SCD组患者与对照组之间，以及MI组与SCD组患者之间（P<0.001）和UA组与MI组患者之间（P<0.001）显示出显著差异。
实施例2
用OPLS-DA法进行各组患者血浆EVs代谢组分析，通过LC/MS色谱图的反褶积，鉴定出155种代谢物。
基于KEGG数据库，进行了代谢途径富集分析。使用MetaboAnalyst 5.0进行代谢途径分析和关联网络分析 (https://www.metaboanalyst.ca/)。P<0.05被认为是不同代谢途径的标准。此外，生成ROC曲线以评估血浆EVs代谢物作为生物标记物的潜力，以区分SCD组患者和最接近SCD的进展阶段MI组。
将上述155种代谢物投影在KEGG的代谢通路图上，KEGG途径中代谢物的分布如图1中A所示。代谢组数据的OPLS-DA显示了四组之间的明显区别，Q2=0.438（图1中B所示）。四组之间的差异也很明显（图1中B-E所示）。这些结果表明，血浆EV的代谢组分析为进一步发现差异代谢物提供了足够的信息。
两两成对，对155种代谢物中的每对进行检测，筛选出诊断能力最强的代谢物组合。Spearman相关性用于分析不同代谢物与临床指标之间的关系。所有统计分析均由SIMCA（瑞典Umea Umetrics）、RStudio（3.6.3版）和GraphPad Prism 9.0软件进行。P<0.05被认为具有统计学意义。
实施例3：ACS所致SCD患者外周血EVs的差异蛋白质组学研究
应用Orbitrap Eclipse三合一超高分辨质谱仪对EVs蛋白质进行定量测定。然后针对数据进行深入分析，蛋白定量结果经过t-检验或者ANOVA检验，筛选adj p-value<0.01的蛋白为差异蛋白，以火山图，聚类图，PCA图形的方式展示结果。对差异蛋白功能注释，并利用ROC曲线分析筛选潜在生物标记物，并利用Western blotting实验对相应差异蛋白进行验证。结果如图2所示。
采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）和Student t检验对差异代谢物和蛋白质进行鉴定。通过t检验和OPLS-DA比较SCD组和对照组的蛋白质和代谢物水平，OPLS-DA也用于解释多重比较，以筛选关键的差异代谢物和蛋白质，Spearman根据疾病的多个进展阶段（对照组、UA组、MI组和SCD组）与下一步筛选与SCD进展相关的关键代谢产物进行相关性分析。
筛选标准如下：（1）SCD患者与对照组的Student t检验和spearman相关检验均P<0.05，（2）SCD与对照组相比，VIP值的变量重要性>1。
实施例4：代谢组学及蛋白质组学联合分析
整合分析强调了KEGG途径中的代谢物(https://pathways.embl.de/)，基于差异蛋白质和差异代谢物的统计和生物学联系，我们对代谢组和蛋白质组信息进行了组学整合。代谢物和蛋白质、代谢物以及与发病相关的临床指标的统计关联被整合到代谢网络中，以从组学整合的角度探索与SCD进展相关的生物标记物和分子事件。
对于生物链接，差异代谢物和差异蛋白质被引入Metscape（3.1.3版）和Cytoscape（3.9.0版），用于根据KEGG数据库链接代谢物与蛋白质(https://www.kegg.jp/）。对于统计相关性，采用Pearson相关检验分析差异代谢物和差异蛋白/与发病相关的临床指标之间的相关性。
结果如图3-7所示。其中，图7显示了代谢物、蛋白质和临床指标之间的Omics整合分析结果。图中方框代表临床指标，六边形代表代谢网络中的代谢物，圆圈代表代谢网络的蛋白质。网络中每个节点的颜色代表代谢物或蛋白质与SCD之间的关联方向。红色表示SCD组与对照组相比显著上调的蛋白质和代谢物，蓝色表示下调，星号表示与MI组的显著差异。代谢物和蛋白质根据KEGG数据库进行生物关联，代谢物与蛋白质通过实线连接，以表示直接的生物关联。通过不超过3个中间代谢物或蛋白质的生物关联省略中间链接，并用虚线连接节点以表示间接生物关联。代谢物和疾病严重程度指标之间的实线表示统计关联。网络中实线的颜色表示线段两端节点的统计相关方向，红色表示正相关，蓝色表示负相关，实线的宽度表示P值。P值越小，实线越粗。虚线的颜色表示代谢物和蛋白质之间的简单统计关联。虚线框代表KEGG代谢网络中的五条主要代谢途径，黑色虚线框表示核心途径。
Claims (1)
1.检测生物标志物的试剂在制备筛查急性冠脉综合征所致心源性猝死的试剂盒的应用，其特征在于：所述试剂盒包含检测生物标志物的试剂，所述生物标志物为4-乙酰氨基丁酸和丙酮酸的组合，所述4-乙酰氨基丁酸和丙酮酸均来源于血浆细胞外囊泡代谢物。
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