CN115552025A

CN115552025A - 基于苯乙酰谷氨酰胺水平的疾病检测和治疗

Info

Publication number: CN115552025A
Application number: CN202180016552.XA
Authority: CN
Inventors: S·L·黑森; I·内梅特; P·萨哈
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Current assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 2020-02-05
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2022-12-30
Also published as: EP4100541A1; EP4100541A4; WO2021158720A1; US20230091848A1

Abstract

本发明涉及用于鉴定具有升高的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)或PAG和三甲胺‑n‑氧化物(TMAO)和/或N6‑三甲基‑赖氨酸(TML)和/或PSA和/或甜菜碱和/或胆碱的组合的水平的受试者的系统、药盒和方法，以及基于这样的水平确定疾病(例如，CVD、心力衰竭、哮喘、糖尿病、血栓形成和致死性前列腺癌)风险的方法。在某些实施方案中，受试者没有慢性肾脏疾病和/或患有II型糖尿病。在特定的实施方案中，将受试者用治疗剂诸如β‑肾上腺素能阻断剂、α2肾上腺素能受体激动剂、α2肾上腺素能受体拮抗剂、抗生素或抗生素混合物或前列腺癌治疗剂进行治疗。在某些实施方案中，将受试者用程序诸如近距离放射疗法、放射疗法或前列腺切除术进行治疗。

Description

基于苯乙酰谷氨酰胺水平的疾病检测和治疗

本申请要求2020年2月5日提交的美国临时申请系列第62/970,480号的优先权，将其通过引用并入本文。

关于联邦资金的声明

本发明是在美国国立卫生研究院颁发的授权号HL147823的政府支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及用于鉴定具有升高的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)或PAG和三甲胺-n-氧化物(TMAO)和/或N6-三甲基-赖氨酸(TML)和/或PSA和/或甜菜碱和/或胆碱的组合的水平的受试者的系统、药盒和方法，以及基于这样的水平确定疾病(例如，CVD、心力衰竭、哮喘、糖尿病、血栓形成、前列腺癌和致死性前列腺癌)风险的方法。在某些实施方案中，受试者没有慢性肾脏疾病和/或患有II型糖尿病。在特定的实施方案中，将受试者用诸如β-肾上腺素能阻断剂、α2肾上腺素能受体激动剂、α2肾上腺素能受体拮抗剂、抗生素或抗生素混合物或其他前列腺癌治疗剂的治疗剂进行治疗。在某些实施方案中，将受试者用诸如近距离放射疗法、放射疗法或前列腺切除术的程序进行治疗。

背景技术

心血管疾病(CVD)仍然是西方国家中的死亡和发病的主要原因，因而有助于CVD发展和进展的新治疗靶点是需要的。2型糖尿病(T2DM)受试者具有发生CVD及其主要不良后果(MACE，主要不良心脏事件＝心肌梗死(MI)、中风或死亡)的显著更高的风险，遭受更差的预后和结局，并且传统的CVD风险因素不能充分解释在T2DM受试者中观察到的风险增加。有趣的是，在T2DM内的血糖控制的程度是伴随的CVD风险的不良指标，许多抗糖尿病药物降低了血浆葡萄糖水平，而没有显著影响CVD发展或MACE风险(Action to ControlCardiovascular Risk in Diabetes Study等，2008)(Duckworth等人，2009；Gerstein等人，2001；Piarulli等人，2009)。这些观察结果表明，与葡萄糖相关途径不同的代谢紊乱发生在T2DM中，其促成了在该疾病中观察到的CVD风险增加。

发明内容

在一些实施方案中，本文提供的是至少基于来自受试者的样品中的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)水平进行活动的方法，所述方法包括：a)确定来自受试者的样品中的至少一种化合物的水平，其中所述至少一种化合物包括PAG，并且其中任选地所述受试者无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有II型糖尿病；和b)进行以下活动的至少一项：i)鉴定相比于对照水平增加的在所述样品中的所述至少一种化合物的水平，并用以下治疗受试者：A)治疗心血管疾病(CVD)、哮喘、心力衰竭和/或血栓形成的第一种剂或第一程序，其中所述受试者无CKD和/或患有糖尿病，B)选自以下的第二种剂：β-肾上腺素能阻断剂、α2肾上腺素能受体激动剂、α2肾上腺素能受体拮抗剂以及抗生素或抗生素混合物和/或C)选自以下的第三种剂或第二程序：前列腺癌治疗剂、近距离放射疗法、放射疗法和前列腺切除术；ii)生成和/或传输报告，所述报告指示在所述样品中的所述至少一种化合物的水平相比于对照水平升高并且指示所述受试者患有CVD、哮喘、前列腺癌(例如致死性前列腺癌)、血栓形成和/或心力衰竭或有患CVD、哮喘、前列腺癌(例如致死性前列腺癌)、血栓形成和/或心力衰竭的风险，并且可通过以下进行治疗：A)β-肾上腺素能阻断剂，和/或B)α2肾上腺素能受体激动剂和/或C)α2肾上腺素能受体拮抗剂和/或D)抗生素或抗生素混合物；和/或E)所述第三种剂或第二程序；iii)生成和/或传输指示在所述样品中的所述至少一种化合物的水平相比于对照水平升高并且指示所述受试者需要第一种剂、第二种剂和/或所述程序和/或第三种剂或第二程序的报告；iv)生成和/或传输指示所述受试者无CKD和/或患有糖尿病的报告，其中所述报告指示在所述样品中的所述至少一种化合物的水平相比于对照水平升高，并且指示所述受试者患有心血管疾病、哮喘、血栓形成、前列腺癌、致死性前列腺癌和/或心力衰竭或有患心血管疾病、哮喘、血栓形成、前列腺癌、致死性前列腺癌和/或心力衰竭的风险；和v)基于发现相比于对照水平升高的在所述样品中的所述至少一种化合物的水平，将无CKD和/或患有糖尿病的受试者表征为患有CVD、血栓形成和/或心力衰竭或有患CVD、血栓形成和/或心力衰竭的风险，或将所述受试者表征为患有致死性前列腺癌或有患致死性前列腺癌的风险。

在某些实施方案中，本文提供了治疗方法，所述方法包括：a)将受试者鉴定为具有相比于对照水平增加的至少一种化合物的水平，其中所述至少一种化合物包括苯乙酰谷氨酰胺(PAG)；b)用以下的至少一种治疗所述受试者：i)治疗心血管疾病(CVD)、心力衰竭、哮喘和/或血栓形成的第一种剂或程序，其中所述受试者无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有糖尿病，ii)选自以下的第二种剂：β-肾上腺素能阻断剂、α2肾上腺素能受体激动剂和α2肾上腺素能受体拮抗剂，iii)抗生素或抗生素混合物，其中所述受试者没有活动性感染，以及iv)选自以下的第三种剂或第二程序：前列腺癌治疗剂、近距离放射疗法、放射疗法和前列腺切除术。在某些实施方案中，鉴定包括接收受试者相比于对照具有增加的PAG水平的报告。

在特定的实施方案中，本文提供了系统和药盒，其包括：a)受试者患有心血管疾病、心力衰竭、哮喘、前列腺癌、致死性前列腺癌和/或血栓形成的报告，其中所述报告指示所述患者具有升高的至少一种化合物的水平，其中所述至少一种化合物包括苯乙酰谷氨酰胺(PAG)；和b)下述的至少一种：i)治疗CVD、心力衰竭、哮喘和/或血栓形成的第一种剂，其中所述受试者无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有糖尿病，ii)选自以下的第二种剂：β-肾上腺素能阻断剂、α2肾上腺素能受体激动剂和α2肾上腺素能受体拮抗剂，iii)抗生素或抗生素混合物，其中所述受试者没有活动性感染，以及iv)前列腺癌治疗剂。

在一些实施方案中，本文提供了检测样品中的至少三种化合物的方法，所述方法包括：a)获得样品，其中所述样品来自人受试者；b)在使得至少以下三种化合物的浓度得以确定的条件下处理所述样品：苯乙酰谷氨酰胺(PAG)、N6-三甲基-赖氨酸(TML)和三甲胺N-氧化物(TMAO)。

在一些实施方案中，方法还包括：c)如果所有下述三者都存在，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常：i)所述样品中的所述PAG水平高于来自一般群体或无疾病组的对照PAG值；ii)所述样品中的所述TMAO水平高于来自一般群体或无疾病组的对照TMAO值；iii)所述样品中的所述TML水平高于来自一般群体或无疾病组的对照TML值；并且其中所述疾病选自由心力衰竭、心血管疾病、肾脏疾病、哮喘或血栓形成组成的组。在某些实施方案中，方法还包括：c)如果所有下述三者都存在，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常：i)所述样品中的PAG水平高于第一最小值，其中所述最小值为至少3.8或4.9μM，ii)所述TMAO水平高于第二最小值，其中所述第二最小值为至少2.2或5.0μM；和iii)所述TML水平高于第三最小值，其中所述第二最小值为至少0.4或0.6μM；并且其中所述疾病选自由心力衰竭、心血管疾病、肾脏疾病、哮喘或血栓形成组成的组。

在一些实施方案中，至少一种化合物还包括三甲胺-n-氧化物(TMAO)。在另外的实施方案中，至少一种化合物还包括N6-三甲基-赖氨酸(TML)。在进一步的实施方案中，至少一种化合物还包括TMAO和TML。在一些实施方案中，至少一种化合物还包括PSA、胆碱和/或甜菜碱，并且所述受试者具有前列腺癌的风险或患有前列腺癌。在另外的实施方案中，至少一种化合物还包括三甲胺-n-氧化物(TMAO)和/或N6-三甲基-赖氨酸(TML)和/或PSA和/或胆碱和/或甜菜碱。

在某些实施方案中，其中：i)所述受试者具有心力衰竭、哮喘或心血管疾病的症状，有患心力衰竭、哮喘或心血管疾病的风险，或患有心力衰竭、哮喘或心血管疾病，并且其中所述至少一种化合物还包括N6-三甲基-赖氨酸(TML)和/或TMAO，或ii)所述受试者患有前列腺癌(或有患前列腺癌的风险)，并且所述至少一种化合物还包括PSA、胆碱和/或甜菜碱。在某些实施方案中，受试者患有前列腺癌或致死性前列腺癌并且用选自以下的剂进行治疗：β-肾上腺素能阻断剂、α2肾上腺素能受体激动剂、α2肾上腺素能受体拮抗剂以及抗生素或抗生素混合物。在一些实施方案中，受试者是患有前列腺癌、心血管疾病、哮喘或心力衰竭的人。

在特定的实施方案中，样品选自由以下组成的组：血浆样品、血清样品、全血样品和尿液样品。在其他实施方案中，确定包括用选自以下的分析装置检测至少一种化合物：质谱仪、NMR光谱仪和UV/Vis光谱仪、基于抗PAG抗体的检测系统(例如，ELISA或竞争性ELISA等)。在另外的实施方案中，确定包括使所述样品与抗PAG抗体或其PAG结合片段接触。

在一些实施方案中，β-肾上腺素能阻断剂选自：盐酸醋丁洛尔、阿替洛尔、盐酸倍他洛尔、富马酸比索洛尔、盐酸卡替洛尔、盐酸艾司洛尔、美托洛尔、硫酸喷布洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、马来酸噻吗洛尔、盐酸索他洛尔、卡维地洛和盐酸拉贝洛尔。在进一步的实施方案中，α2肾上腺素能受体激动剂选自：可乐定、右美托咪定、法多米定(Fadolmidine)、胍法辛、胍那苄、胍诺沙苄、胍乙啶、赛拉嗪、替扎尼定、美托咪定、甲基多巴、甲基去甲肾上腺素、去甲肾上腺素、(R)-3-硝基联苯茚二酮((R)-3-nitrobiphenyline)、阿米曲士、地托咪定、洛非西定和美托咪定。在其他实施方案中，α2肾上腺素能受体拮抗剂选自：阿替美唑、依法克生、咪唑克生、育亨宾、萝芙素和酚妥拉明。在某些实施方案中，第一种剂选自由以下组成的组：抗凝剂、抗血小板剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、钙通道阻断剂、降胆固醇药物、他汀类药物、洋地黄制剂、利尿剂和血管扩张剂。在某些实施方案中，抗生素是选自由以下组成的组的至少一种抗生素：甲硝唑、环丙沙星、新霉素、万古霉素、阿莫西林和广谱抗生素；并且其中所述受试者没有活动性感染。在特定的实施方案中，受试者是人。

在某些实施方案中，本文提供了检测样品中的至少一种化合物的方法，所述方法包括：a)获得样品，其中所述样品来自无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有糖尿病的人受试者；和b)在使得至少一种化合物的浓度得以确定的条件下处理所述样品，其中所述至少一种化合物包括苯乙酰谷氨酰胺(PAG)。在一些实施方案中，通过质谱法确定所述样品中的PAG的浓度。在进一步的实施方案中，样品是血浆或血清样品。在其他实施方案中，至少一种化合物还包括三甲胺-n-氧化物(TMAO)和/或N6-三甲基-赖氨酸(TML)。在某些实施方案中，样品来自患有前列腺癌、致死性前列腺癌、心血管疾病、哮喘、心力衰竭或血栓形成或有患前列腺癌、致死性前列腺癌、心血管疾病、哮喘、心力衰竭或血栓形成的风险的受试者。

在一些实施方案中，本文提供了检测血清或血浆样品中的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)的方法，所述方法包括：a)获得血浆或血清样品，其中所述血浆或血清样品来自无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有II型糖尿病的人受试者；b)在使得血浆或血清样品中存在的PAG浓度得以确定的条件下将至少一部分血浆或血清样品引入分析装置中，其中所述分析装置包括：i)NMR光谱仪、UV/Vis光谱仪或质谱仪，ii)在确定所述浓度之前提供PAG的物理分离的设备；和iii)基于抗PAG抗体的检测系统(例如，ELISA或竞争性ELISA等)，以及c)如果所述血浆或血清样品中的PAG水平高于第一最小值，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常，其中所述最小值为至少3.8或4.9μM，其中所述疾病选自由心力衰竭、心血管疾病、哮喘或血栓形成组成的组。

在某些实施方案中，方法还包括确定来自受试者的样品中的三甲胺N-氧化物(TMAO)的水平，并且当所述TMAO水平高于第二最小值时，以图形显示受试者的疾病风险高于正常，其中所述第二最小值为至少2.2μM(例如，至少2.5、3.0、3.5或4.0或5.0μM)。

在一些实施方案中，方法还包括确定来自受试者的样品中的N6-三甲基-赖氨酸(TML)的水平，并且当所述TML水平高于第二最小值时，以图形显示受试者的疾病风险高于正常，其中所述第二最小值为至少0.4μM(例如，至少0.5、0.6、0.7或0.8μM)。

在某些实施方案中，本文提供了检测血清或血浆样品中的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)的方法，所述方法包括：a)获得血浆或血清样品，其中所述血浆或血清样品来自任选地无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有II型糖尿病的人受试者；b)在使得血浆或血清样品中存在的PAG浓度得以确定的条件下将至少一部分血浆或血清样品引入分析装置中，其中所述分析装置包括：i)NMR光谱仪、UV/Vis光谱仪或质谱仪，ii)在确定所述浓度之前提供PAG的物理分离的设备；和iii)基于抗PAG抗体的检测系统(例如，ELISA或竞争性ELISA等)，以及c)如果所述血浆或血清样品中的PAG水平高于第一最小值，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常，其中所述最小值为至少1.0μM或至少3.0μM，其中所述疾病选自由前列腺癌和致死性前列腺癌组成的组。

在特定的实施方案中，方法还包括确定来自受试者的样品中的胆碱的水平，并且当所述胆碱水平高于第二最小值时，以图形显示受试者的疾病风险高于正常，其中所述第二最小值为至少11.0μM。在其他实施方案中，第二最小值为至少13.0μM、或至少14.0μM、或至少15.0μM、或至少17.0μM。

在一些实施方案中，方法还包括确定来自受试者的样品中的甜菜碱的水平，并且当所述甜菜碱水平高于第二最小值时，以图形显示受试者的疾病风险高于正常，其中所述第二最小值为至少35.6μM。在进一步的实施方案中，第二最小值为至少42.8μM、或至少54.0μM、或至少54.7μM、或至少55μM。

在某些实施方案中，本文提供了检测样品中的至少三种或四种化合物的方法，所述方法包括：a)获得样品，其中所述样品来自人受试者；和b)在使得至少以下三种化合物：苯乙酰谷氨酰胺(PAG)、胆碱和甜菜碱以及任选的第四种化合物：前列腺特异性抗原(PSA)的浓度得以确定的条件下处理所述样品。在某些实施方案中，方法还包括：c)如果所有下述三者都存在，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常：i)所述样品中的PAG水平高于来自一般群体或无疾病组的对照PAG值；ii)所述样品中的胆碱水平高于一般群体或无疾病组的对照胆碱值；和iii)所述样品中的甜菜碱水平高于来自一般群体或无疾病组的对照TML值；以及iv)并且任选地，所述样品中的PSA水平高于来自一般群体或无疾病组的对照PSA值；并且其中所述疾病选自由前列腺癌和致死性前列腺癌组成的组。在一些实施方案中，方法还包括：c)如果所有下述三者都存在，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常：i)所述样品中的PAG水平高于第一最小值，其中所述最小值为至少3.9或4.9μM，ii)所述胆碱水平高于第二最小值，其中所述第二最小值为至少11.0或13.0μM；和iii)所述甜菜碱水平高于第三最小值，其中所述第二最小值为至少35.6μM或42.8；并且其中所述疾病选自由前列腺癌和致死性前列腺癌组成的组。

附图说明

图1.非靶向代谢组学研究发现具有265.1188的m/z的代谢物与心血管疾病风险相关，随后将其鉴定为苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)。(A)在经历选择性诊断性心脏评价的连续稳定受试者中的具有m/z 265.1188的化合物的相对血浆水平。根据在3年的随访中是否((是)或(否))患有糖尿病或经历伴随的重大不良心脏事件(MACE：MI、中风或死亡)将受试者(n＝1,162)分为如指示的几个组。在盒须图中，盒的上边界和下边界代表第25和第75百分位数，中值由盒内的水平线标记，而须代表相对测量值的10％和90％。(B)Kaplan-Meier估计值和伴随的主要不良心脏事件(MACE、MI、中风或死亡)的风险，其按照来自未靶向分析的具有m/z 265.1188的未知化合物的相对量的四分位数排列。(C)在血浆(红色)中的代谢物m/z265.1188和合成PAGln(蓝色)的正离子模式下的高分辨率CID质谱的比较。(D)通过稳定同位素稀释法(靶向分析)测量的按PAGln水平的四分位数排列的Kaplan-Meier估计值和MACE风险。(E)根据PAGln水平的四分位数，在所有测试受试者(n＝4,000；左图)、糖尿病患者(n＝1,261；中图)和非糖尿病患者(n＝2,739，右图)中，指示PAGln的森林图与3年的MACE风险相关，风险比(黑色)的多变量Cox模型包括针对年龄、性别、吸烟、HDL、LDL、甘油三酯水平、收缩压、高脂血症和C反应蛋白水平的调整(调整的，红色)。通过线长指示5-95％置信区间(CI)。

图2.苯乙酰谷氨酰胺(“PAGln”或“PAG”)体内产生是在人和小鼠中的微生物群依赖性过程。(A)(i)在用广谱抗生素口服治疗之前(在Abx之前)，(ii)在抗生素方案七天之后(Abx)，以及(iii)在允许肠道微生物再繁殖的抗生素治疗结束之后三周(在Abx之后)，测量了人血浆中的PAGln水平。从过夜禁食的健康志愿者(n＝15)收集人血。使用Kruskal-Wallis进行统计分析。(B)在健康人受试者(左图)、常规小鼠(中图)和无菌(GF)小鼠(右图)中的PAGln和PAGly的水平。(C)在IP注射苯乙酸(50mg/kg)之后，小鼠主要产生PAGly(比PAGln多500倍)。(D)(i)在使用口服广谱抗生素之前(在Abx之前)，(ii)在抗生素治疗五天之后(Abx)，以及(iii)在允许肠道微生物再繁殖的抗生素洗脱之后一周(在Abx之后)，测量了小鼠血浆中的PAGln水平。从非禁食雄性(n＝11)和雌性(n＝15)C57Bl/6J小鼠收集小鼠血液。使用Kruskal-Wallis检验进行统计分析。(E)在人和小鼠中的苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)和苯乙酰甘氨酸(PAGly)的多有机体产生。苯乙酸是来源于苯丙氨酸的细菌产物，其在人肝脏中主要转化为苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)，而在小鼠中转化为苯乙酰甘氨酸(PAGly)。

图3.苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)与血栓形成潜力增强相关。(A)在生理剪切条件±PAGln下，全血中人血小板与微流控芯片表面(±胶原涂层)的粘附；在指示时间的血小板粘附的代表性图像。(B)每μm²芯片表面的粘附血小板面积。(C)从血浆PAGln水平低的健康志愿者分离富血小板血浆(PRP)。在添加PAGln(最终100μM，红色)与生理盐水(媒介物，蓝色)之后，将PRP在室温孵育30min，然后使用血小板集合度测定评估每位受试者的ADP、凝血酶(TRAP 6)和胶原剂量反应曲线(上图)。使用集合度测定评估在恒定浓度的激动剂(ADP(2μM)、TRAP6(7.5μM)或胶原(0.75μg/mL))下的PAGln剂量反应曲线(下图)。(D-E)凝血酶诱导的Fura 2填充的洗涤的人血小板中的细胞内钙浓度[Ca²⁺]的变化，所述血小板经过与不同量的PAGln(0(蓝色)；3.1(绿色)；10(红色)；33(紫色)和100(黑色)μM)一起孵育。(D)来自单一受试者的血小板制剂的代表性荧光信号。用非参数单或双因素ANOVA度量显著性。

图4.苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)和苯乙酰甘氨酸(PAGly)增强体内血栓形成潜力。(A-B)通过FeCl₃诱导的颈动脉损伤模型在IP注射(50mg/kg)的苯丙氨酸(Phe)；苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)、苯乙酰甘氨酸(PAGly)之后测量体内血栓形成潜力。显示了在动脉损伤后指示的时间点的颈动脉血栓形成的代表性重要显微镜图像(A)，以及在来自指示组的小鼠中的血流停止的时间(B)。条形代表在指示组内的血流停止的平均时间。用未配对单因素ANOVA度量显著性。(C)将通过具有苯丙氨酸还原代谢基因破坏的生孢梭菌ΔcutC突变体(ΔfldH)的苯乙酸和苯丙酸的合成与具有苯丙氨酸氧化代谢基因破坏的生孢梭菌ΔcutC突变体(ΔporA)进行比较。将生孢梭菌突变体与合成的¹³C₉ ¹⁵N-苯丙氨酸一起孵育，并且通过LC-MS/MS测量¹³C₈-苯乙酸(红色)和¹³C₉-苯丙酸(蓝色)的产生(通过光密度(OD)将这些值归一化)。(D)在用生孢梭菌ΔcutC或生孢梭菌ΔcutCΔfldH突变体单定殖2-7天的GF小鼠中在叶酸IP注射后24小时血流停止的时间。通过FeCl₃诱导的颈动脉损伤模型测量体内血栓形成潜力。显示了在动脉损伤后指示的时间点的颈动脉血栓形成的代表性重要显微镜图像(底部)，以及在来自指示组的小鼠中的血流停止的时间(顶部)。条形代表在指示组内的血流停止的平均时间。

图5.PAGln通过G蛋白偶联受体介导细胞反应，并且功能丧失研究表明，经由肾上腺素能受体的代谢物信号存在于人血小板上。(A)在MEG01细胞系中的苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)、去甲肾上腺素(Norepi)和苯丙氨酸(Phe)的动态质量再分布(DMR)剂量反应。在配体添加之后生成量化最大DMR峰的曲线。(B)在G蛋白调节剂、百日咳毒素(PTX；100ng/mL)、霍乱毒素(CTX；1μg/mL)、YM-254890(0.5μM)和SCH-202676(1μM)处理之后100μM PAGln(左)、10μM Norepi(中)和10μg/mL胶原蛋白(右)的DMR反应，所述处理分别掩盖了通过Gα_i亚基、Gα_s亚基、Gα_q亚基和几乎所有G蛋白亚基的信号传导。已将PAGln、Norepi和胶原的最大反应归一化为100％。(C-D)在PTX(100ng/mL)、CTX(1μg/mL)、YM-254890(1μM)和SCH-202676(1μM)存在下用PAGln(100μM)处理MEG01细胞系(C)和洗涤的人血小板(D)5min之后在它们中的cAMP水平。在添加PAGln之前，将所有经过调节剂处理的或未处理的受试者中的cAMP水平值归一化为100％。(E)结构分析表明，PAGln具有苯乙胺部分的核心骨架结构(标记为黄色)，类似于某些儿茶酚胺(异丙肾上腺素、Epi和Norepi)。(F)在用对照加扰的siRNA、针对MEG01细胞中的α2A、α2B和β2肾上腺素能受体的siRNA转染细胞之后，测量PAGln(100μM)的DMR反应。将PAGln的最大反应归一化为100％。(G)在用选择性β-2拮抗剂ICI118，551(10μM)、非选择性β-阻断剂普萘洛尔(10μM)和非选择性α2拮抗剂RX821002(10μM)处理MEG01细胞30min之后，将PAGln(100μM)DMR反应定量。将PAGln的最大反应归一化为100％。(H)在ICI118，551(10μM)、普萘洛尔(10μM)和RX821002(10μM)存在下用PAGln(100μM)处理细胞5min之后，测量MEG01细胞系中的cAMP水平。(在添加PAGln之前，将所有经过抑制剂处理的或未处理的受试者中的cAMP水平值归一化为100％)。通过用于多重比较的双尾学生t检验(非参数Mann Whitney检验)和Kruskal-Wallis(K.W.)检验确定显著性。数据点代表均值±s.e.m.(n＝生物学重复)。

图6.功能获得研究证实，PAGln通过血小板肾上腺素能受体显示细胞事件，导致体外和体内血小板聚集，用β阻断剂可使其减弱。(A)在用选择性β-2拮抗剂ICI118，551(10μM)、非选择性β-阻断剂普萘洛尔(10μM)和非选择性α2拮抗剂RX821002(10μM)处理细胞30min之后，分析在亲本HEK293、空载体转染的HEK293、ADRA2A转染的HEK293(左图)、α2B-HEK293稳定细胞(中间图)以及在β2-HEK293稳定细胞(右图)中的PAGln(100μM)DMR反应。(就所有受试者中的相对ATP反应而言，计算PAGln反应)。(B)在用指示的增加浓度的PAGln处理细胞10min之后，分析在亲本HEK293(绿线)和在β2-HEK293稳定细胞系(蓝线)中的cAMP水平。(C)在非选择性β阻断剂普萘洛尔(10μM)和非选择性α2阻断剂RX821002(10μM)的存在下，用次最大浓度的ADP(2μM)测量人富血小板血浆(PRP)中响应于PAGln(100μM)的血小板聚集。数据点代表聚集，其为从每位人受试者回收的PRP中的最大幅度的百分比。D)在小鼠中的FeCl₃诱导的颈动脉损伤后在指示时间点的颈动脉血栓形成的代表性重要显微镜图像，其中所述小鼠经i.p.注射PAGln并用补充有或未补充β阻断剂卡维地洛(1.5mg/kg)的饮食喂养一周。完全血管闭塞的时间在对应的右侧图中提及。(E)FeCl₃诱导的颈动脉损伤后的上述体内血栓形成的定量，将其累积地表示为针对每组中小鼠的指示数量的条形图。数据点代表每个小鼠受试者的流动停止的时间。在底部记录每个组的对应血浆PAGln水平。通过用于成对比较的非参数Mann Whitney(M.W.)检验和用于多重比较的Kruskal-Wallis(K.W.)检验确定显著性。数据点代表均值±s.e.m.(n＝生物学重复)。

图7显示了提议的苯乙酰甘氨酸和苯乙酰谷氨酰胺的多有机体产生。

图8.根据来自实施例2的高与低标志物水平的3年的主要不良心脏事件的事件发生率。

图9.根据来自实施例2的高与低标志物水平的5年的全因死亡率的事件发生率。

图10.图10显示了针对单个和多个标志物的3年(图10a)和5年(图10b)无事件存活率。

图11.肠道微生物组介导的三甲胺前体和选择性氨基酸的代谢。(A)三甲胺(TMA)的前体-包括胆碱、肉碱、甜菜碱、γ丁酰甜菜碱和巴豆甜菜碱-通过饮食消费。这些营养素可由宿主(经由蓝色箭头显示)或通过肠道微生物群(经由绿色箭头显示)转化为其他TMA前体。这些前体营养素中的少数到达大肠，并被肠道微生物群代谢为TMA，最终被宿主吸收。通过门脉循环，TMA到达肝脏，在肝脏它被含黄素的单加氧酶(FMO)氧化成三甲胺N-氧化物。然后，TMAO进入体循环，在体循环中它可能对其人宿主发挥其生理作用。(B)氨基酸-包括苯丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸-通过膳食蛋白质摄入。在胃和小肠中，通过蛋白酶释放这些氨基酸。这些氨基酸中的少数到达大肠中的肠道微生物群，在肠道中它们分别转化为苯乙酰谷氨酰胺(PAG)、马尿酸和硫酸对甲酚。这些肠道微生物群衍生的氨基酸衍生物被宿主吸收并最终进入体循环，在体循环中它们可以改变宿主中的生理和代谢过程。

图12.通过三甲胺相关分析物的四分位数显示与致死性前列腺癌相关的几率的森林图。

图13.通过肠道微生物组衍生的氨基酸代谢物的四分位数显示与致死性前列腺癌相关的几率的森林图。

图14.TMAO、胆碱、甜菜碱、肉碱、y-丁酰甜菜碱(butyrobet)、巴豆甜菜碱(crotonobet)、马尿酸(Hippuric)、硫酸对甲酚(PCS)和苯乙酰谷氨酰胺(PAG)的LC/ESI/MS/MS分析的标准曲线。将不同水平的指示代谢物与含有其对应的同位素标记的内标的4个体积的冷甲醇混合。将0.2ul注射到LC/MS上。使用在正离子模式下的电喷雾电离进行分析，但对于在负模式下的PCS除外，所述负模式具有母离子和特征子离子的多反应监测以及对监测的组分特异的保留时间。监测的跃迁是在方法中描述的质荷比。通过绘制峰面积比与其相应的同位素标记的标准品与浓度(以uM计)，生成每个代谢物的标准曲线。

定义

如本文所用，术语“心血管疾病”(CVD)或“心血管疾患”是用于对影响心脏、心脏瓣膜和身体脉管系统(例如，静脉和动脉)的许多病症进行分类的术语，并且涵盖多种疾病和病症，包括但不限于动脉硬化、动脉粥样硬化、心肌梗死、急性冠脉综合征、心绞痛、充血性心力衰竭、主动脉瘤、主动脉夹层、髂动脉瘤或股动脉瘤、肺栓塞、原发性高血压、心房颤动、中风、短暂性脑缺血发作、收缩功能障碍、舒张功能障碍、心肌炎、房性心动过速、心室颤动、心内膜炎、动脉病、血管炎、动脉粥样硬化斑块、易损斑块、急性冠脉综合征、急性缺血发作、心源性猝死、外周血管疾病、冠状动脉疾病(CAD)、外周动脉疾病(PAD)和脑血管疾病。

如本文所用，术语“动脉粥样硬化性心血管疾病”或“疾患”是指包括动脉粥样硬化作为特定类型心血管疾病的组成部分或前兆的心血管疾病的子集，并且包括但不限于CAD、PAD、脑血管疾病。动脉粥样硬化是发生在动脉血管壁中的慢性炎症反应。它涉及粥样斑块的形成，可导致动脉变窄(“狭窄”)，并最终导致动脉开口的部分或完全闭合和/或斑块破裂。因此，动脉粥样硬化性疾病或疾患包括粥样斑块形成和破裂的后果，包括但不限于动脉变窄或狭窄、心力衰竭、动脉瘤形成(包括主动脉瘤)、主动脉夹层以及缺血事件，比如心肌梗死和中风。

术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且通常是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物，包括猿猴和人、马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗)、猫科动物、各种驯养的家畜(例如，有蹄动物，比如猪(swine)、猪(pig)、山羊、绵羊等)，以及驯养的宠物和维持在动物园里的动物。在一些实施方案中，受试者具体地是人受试者。

如本文所用的“心力衰竭”是指当心脏不能充分泵送以维持满足身体需要的血流量时。心力衰竭的体征和症状通常包括呼吸急促、过度疲劳和腿部肿胀。呼吸急促通常在运动、躺下时加重，在夜间可以使人醒来。运动能力受限也是一个共同特征。心力衰竭的常见病因包括冠状动脉疾病，包括既往或当前的心肌梗死(心脏病发作)、高血压、心房颤动、瓣膜性心脏病、过量饮酒、感染和原因不明的心肌病。

如本文所用的“前列腺癌”是指前列腺的癌症。前列腺是雄性生殖系统中的一个腺体，其围绕膀胱正下方的尿道。大多数前列腺癌生长缓慢。癌细胞可扩散到身体的其他区域，特别是骨骼和淋巴结。它最初可能不引起症状。在稍后阶段，症状包括排尿疼痛或困难、尿液中带血或骨盆或背部疼痛。其他晚期症状包括由于红细胞水平低所致的疲劳。“致死性前列腺癌”是导致死亡的前列腺癌，并且Helgstrand等人，Eur J Cancer.2017年10月；84：18-26(通过引用并入本文)提供了诊断特征。

具体实施方式

本发明涉及用于鉴定具有升高的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)或PAG和三甲胺-n-氧化物(TMAO)和/或N6-三甲基-赖氨酸(TML)和/或PSA和/或甜菜碱和/或胆碱的组合的水平的受试者的系统、药盒和方法，以及基于这样的水平确定疾病(例如，CVD、心力衰竭、哮喘、糖尿病、血栓形成和前列腺癌)风险的方法。在某些实施方案中，受试者没有慢性肾脏疾病和/或患有II型糖尿病。在特定的实施方案中，将受试者用诸如β-肾上腺素能阻断剂、α2肾上腺素能受体激动剂、α2肾上腺素能受体拮抗剂、抗生素或抗生素混合物或前列腺癌治疗剂的治疗剂进行治疗。在某些实施方案中，将受试者用诸如近距离放射疗法、放射疗法或前列腺切除术的程序进行治疗。

在本文实施方案的开发过程中进行的工作鉴定出苯乙酰谷氨酰胺(PAG或PAGln)与心血管疾病(CVD)和主要不良心血管事件(心肌梗死、中风或死亡)显著相关。在人和小鼠中，用抗生素抑制肠道微生物群耗尽了PAGln的全身水平，并且PAGln的生理水平增加了全血的血小板在胶原表面的粘附和活化、血小板刺激依赖性Ca2+释放、血小板对多种激动剂的高反应性以及动脉损伤鼠模型中的血栓形成率和闭塞时间。

注意的是，N6-三甲基-赖氨酸，也被称为(S)-2-氨基-6-(三甲铵基)己酸酯；(S)-2-氨基-6-(三甲铵基)己酸；δ-三甲基赖氨酸；ε-N-三甲基-L-赖氨酸；ε-三甲基-L-赖氨酸；N(6)，N(6)，N(6)-三甲基-L-赖氨酸；ε-N-三甲基-R-赖氨酸；ε-三甲基-R-赖氨酸；N(6)，N(6)，N(6)-三甲基-R-赖氨酸；ε-N-三甲基-赖氨酸；ε-三甲基-赖氨酸；N(6)，N(6)，N(6)-三甲基-赖氨酸；(S)-5-氨基-5-羧基-N，N，N-三甲基-1-戊鎓；三甲基赖氨酸；6-N-三甲基-L-赖氨酸；6-N-三甲基R-赖氨酸；6-N-三甲基-赖氨酸；ε-N-三甲基-赖氨酸；三甲基赖氨酸；三甲基-赖氨酸氢氧化物，内盐，(S)-异构体；三甲基赖氨酸，(+-)-异构体；三甲基赖氨酸氢氧化物，内盐，(+-)-异构体；三甲基赖氨酸氯化物，(S)异构体；和三甲基赖氨酸氯化物，(R)-异构体。

在某些实施方案中，本文采用的抗生素包括但不限于氨苄西林；巴氨西林；卡茚西林；美洛西林；哌拉西林；替卡西林；阿莫西林-克拉维酸；氨苄西林-舒巴坦；苄青霉素；氯唑西林；双氯西林；甲氧西林；苯唑西林；青霉素G；青霉素V；哌拉西林他唑巴坦；替卡西林克拉维酸；萘夫西林；I代头孢菌素；头孢羟氨苄；头孢唑啉；头孢氨苄；头孢噻吩；头孢匹林；头孢拉定；头孢克洛；头孢孟多；头孢尼西；头孢替坦；头孢西丁；头孢丙烯；头孢美唑；头孢呋辛；氯碳头孢；头孢地尼；头孢布烯；头孢哌酮；头孢克肟；头孢噻肟；头孢泊肟酯；头孢他啶；头孢唑肟；头孢曲松；头孢吡肟；阿奇霉素；克拉霉素；克林霉素；地红霉素；红霉素；林可霉素；醋竹桃霉素；西诺沙星；环丙沙星；依诺沙星；加替沙星；格帕沙星；左氧氟沙星；洛美沙星；莫西沙星；萘啶酸；诺氟沙星；氧氟沙星；司帕沙星；曲伐沙星；噁喹酸；吉米沙星；培氟沙星；亚胺培南-西司他丁美罗培南；氨曲南；阿米卡星；庆大霉素；卡那霉素；新霉素；奈替米星；链霉素；妥布霉素；巴龙霉素；替考拉宁；万古霉素；地美环素；多西环素；美他环素；米诺环素；土霉素；四环素；金霉素；磺胺米隆；磺胺嘧啶银；磺胺醋酰；磺胺嘧啶；磺胺甲噁唑；柳氮磺胺吡啶；磺胺异噁唑；甲氧苄啶-磺胺甲噁唑；磺胺甲噻二唑；利福布汀；利福平；利福喷丁；利奈唑胺；链阳性菌素；奎奴普丁/达福普汀；杆菌肽；氯霉素；磷霉素；异烟肼；乌洛托品；甲硝唑(Metronidazol)；莫匹罗星；呋喃妥因；呋喃西林；新生霉素；多粘菌素；大观霉素；甲氧苄啶；粘菌素；环丝氨酸；卷曲霉素；乙硫异烟胺；吡嗪酰胺；对氨基水杨酸；和琥乙红霉素。

在某些实施方案中，前列腺癌治疗剂选自由以下组成的组：乙酸阿比特龙、阿帕他胺、比卡鲁胺、卡巴他赛、康士得(比卡鲁胺)、达洛鲁胺、地加瑞克、多西他赛、埃利加德(醋酸亮丙瑞林)、恩杂鲁胺、厄利达(阿帕鲁胺)、辅美康(地加瑞克)、氟他胺、醋酸戈舍瑞林、去癌达(卡巴他赛)、醋酸亮丙瑞林、柳菩林持续性皮下注射剂(醋酸亮丙瑞林)、利普卓(奥拉帕尼)、盐酸米托蒽醌、尼兰德龙(尼鲁米特)、尼鲁米特、诺倍戈(达洛鲁胺)、奥拉帕尼、奥戈维克斯(瑞卢戈利)、普列威(西普赛尔-T)、二氯化镭223、瑞格列克、卢卡帕尼(瑞卡帕布樟脑磺酸盐)、瑞卡帕布樟脑磺酸盐、西普赛尔-T、泰索帝(多西他赛)、多菲戈(二氯化镭223)、安可坦(恩杂鲁胺)、延沙(乙酸阿比特龙)、诺雷德(醋酸戈舍瑞林)和泽珂(乙酸阿比特龙)。

实施例

下面的实施例仅仅是为了说明的目的，并非意在限制权利要求书的范围。

实施例1

苯乙酰谷氨酰胺的检测

本实施例描述了如何发现被鉴定为苯乙酰谷氨酰胺(PAG或PAGln)的一种代谢物(m/z＝265.1188)，进而表明其在独立队列(n＝4,000位受试者)中与心血管疾病(CVD)和主要不良心血管事件(心肌梗死、中风或死亡)显著相关。在人和小鼠中，用抗生素抑制肠道微生物群耗尽了PAGln的全身水平，并且PAGln的生理水平增加了全血的血小板在胶原表面的粘附和活化、血小板刺激依赖性Ca2+释放、血小板对多种激动剂的高反应性以及动脉损伤鼠模型中的血栓形成率和闭塞时间。对人共生体的功能和基因工程研究，加上无菌小鼠的微生物定殖，表明微生物porA基因可以促进膳食苯丙氨酸转化为苯乙酸，随后宿主产生PAGln和苯乙酰甘氨酸(PAGly)可促进更高的血小板反应性和体内血栓形成潜力。采用遗传和药理学工具的功能获得和丧失研究表明，PAGln通过包括α2A、α2B和β2-肾上腺素能受体(ADR)在内的G蛋白偶联受体(GPCR)介导细胞事件。总的来说，这些结果揭示了CVD的治疗靶点-一种涉及膳食苯丙氨酸和肠道微生物群依赖性转化为PAGln的元有机体途径，其经由肾上腺素能受体发信号。

材料和方法

人受试者

临床研究群体。收集血浆样品和相关的临床数据，作为三级保健中心的2项研究的一部分。所有受试者都签署了知情同意书，并且克利夫兰诊所机构审查委员会批准了所有研究方案。在GeneBank样品上进行代谢组学研究，GeneBank是大型的(n＞10,000)表征良好的纵向组织存储库，具有相关的临床数据库。它由GeneBank研究中招募的连续参与者组成，该研究由没有急性冠脉综合征证据的连续稳定受试者(心肌肌钙蛋白I＜0.03ng/mL)组成，所述受试者接受选择性诊断性冠状动脉造影(心导管插入术或冠状动脉计算机断层扫描)，以便评价CAD(Tang等人，2013；Wang等人，2011；Wang等人，2007)。监测了所有受试者的广泛临床和纵向结局数据，包括在招募后所有参与者的随后3至5年的判决结局。将MACE定义为招募后死亡、非致死性心肌梗死或非致死性脑血管意外(中风)。非靶向代谢组学的发现队列(n＝1,157)和独立验证队列(n＝4,000)来源于在GeneBank中招募的连续同意受试者。在Roche Cobas平台(Roche Diagnostics)上测量空腹高敏C反应蛋白和脂质谱。

从接受社区健康筛查的非空腹受试者收集正常范围样品。根据这些，选择了受试者的随机子集(n＝25)，所述受试者没有心血管疾病或代谢病的病史，具有正常的生命体征和筛查实验室结果(脂质谱、基础化学组)，并且没有服用任何药物的病史。

在另外的研究中，健康志愿者(n＝10)同意并接受抗生素混合物7天(甲硝唑(500mg，每日两次)加环丙沙星(500mg，每日一次)；还有其他2种组合：环丙沙星、甲硝唑和万古霉素；以及环丙沙星、甲硝唑、万古霉素和新霉素)。如果参与的志愿者怀孕，患有慢性疾病(包括已知的心力衰竭、肾衰竭、肺部疾病、胃肠道疾病或血液疾病的病史)，则被排除在外。在隔夜空腹之后(n＝15个样品总数)在3个不同的时间点收集血液：基线(在抗生素治疗之前(在Abx之前))；刚好在七天抗生素方案之后(Abx)和在抗生素洗脱以允许肠道微生物再繁殖之后(在Abx之后；至少三周)。在ClinicalTrials.gov标识符：NCT01731236下注册的批准方案下进行肠道微生物代谢物水平的抑制。

人血浆样品的非靶向LC-MS/MS分析

使用HILIC-MS的血浆样品的非靶向分析。血浆样品的非靶向分析与之前描述的相似(Tsugawa等人，2015)。简言之，使用乙腈/异丙醇/水(3∶3∶2，v/v/v)混合物(1mL)进行血浆样品(30μL)极性代谢物的提取。使等分试样(300μL)蒸发，使用含有一系列氘代内标的乙腈/水(4∶1，v/v)混合物(60μL)重悬，涡旋，离心，并将50μL转移到具有微型插入物的玻璃小瓶中。在包括Agilent 1290 Infinity LC系统(Agilent Technologies)和泵(G4220A)、柱温箱(G1316C)、自动进样器(G4226A)和TripleTOF 5600+(SCIEX)的系统上进行亲水相互作用色谱(HILIC)分析。在与Waters Acquity UPLC BEH Amide VanGuard precolumn(5×2.1mm；1.7μm)偶联的Acquity UPLC BEH Amide柱(150×2.1mm；1.7μm，Waters)上分离提取物。将柱保持在45℃，流速为0.4mL/min。流动相由(A)水与甲酸铵(10mM)和甲酸(0.125％)和(B)95∶5(v/v)乙腈/水与甲酸铵(10mM)和甲酸(0.125％)组成。在以下梯度下进行分离：0min 100％B；0-2min 100％B；2-7.7min 70％B；7.7-9.5min 40％B；9.5-10.25min 30％B；10.25-12.75min 100％B；12.75-17.75min 100％B。使用1μl样品体积注入。样品温度保持在4℃。用以下参数在正离子模式下在电喷雾电离中运行QTOFMS仪器：气帘气，35psi；离子源气1，50psi；离子源气2，50psi；温度，300℃；离子喷雾电压浮动，4.5kV；去簇电压，100V；采集速度，2个光谱/s。对于数据处理，使用MZmine 2(37)和MultiQuant(SCIEX)软件程序。

化合物鉴定

为了在化学上定义具有m/z 265.1188的血浆分析物的结构，用HPLC/高分辨率质谱仪以相同的保留时间、高分辨率质量和碎片离子作为标准来鉴定血浆中的PAGln。使用与TripleTOF 5600质谱仪(AB SCIEX)串联的带有SIL-HTC自动进样器接口的2LC-20ADShimadazu泵系统(Shimadzu Scientific Instruments，Inc.，Columbia，MD，USA)，通过将在蛋白质的甲醇沉淀之后的血浆上清液注入到C18柱或HILIC柱上进行分析。通过采用以下梯度进行分离：对于反相色谱，使用Kinetex c18柱(50mm×2.1mm；2.6μm)(目录号00B-4462-AN，Phenomenex，Torrance，CA)。溶剂A(在水中的0.1％乙酸)和B(在乙腈中的0.1％乙酸)在以下梯度下运行：0.0min(0％B)；0.0-2.0min(0％B)；2.0-5.0min(0％B→20％B)；5.0-6.0min(20％B→60％B)；6.0-7.5min(60％B→70％B)；7.5-8.0min(70％B→100％B)；8.0-9.5min(100％)；9.5-10min(100％B→0％B)；10.0-15.0min(0％B)，流速为0.4mL/min，进样体积为1μL。为了在HILIC柱上分离，使用BEH酰胺柱(Bridge柱；BEH酰胺2.1x150mmx2.5μm柱)(目录号186006724，Waters，Ireland)。溶剂A(10mM乙酸铵+在水中的0.125％乙酸)和B(10mM乙酸铵+在95％乙腈和5％水中的0.125％醋酸)在以下梯度下运行：0.0min(100％)；0.0-0.5min(100％B→70％B)；0.5-1.0min(70％B→60％B)；1.0-2.0min(60％B)；2.0-7.0min(60％B→50％B)；7.0-8.0min(50％B)；8.0-9.0min(50％B→100％B)；9.0-14.0min(100％)。0.0-9.0min的流速为0.2mL/min，并且9.5-14min的流速为0.4mL/min。

为了进一步证实化合物结构，通过以下程序从人血浆部分地纯化具有m/z265.1188的化合物。用冰冷的甲醇(1∶4；v/v)使来自人血浆(500mL)的第一批蛋白质沉淀，并且在减压下干燥上清液。将干残留物用0.1％乙酸(50mL)溶解在水中，并在C18柱(StrataC18_E(55μm，70A；20g/60mL Giga Tubes，Phenomenex，目录号8B-S001-VFF)上进行出固相提取。通过质谱分析洗脱的级分，获得含有具有m/z 265.1188的化合物的级分，并且在减压下干燥。通过HPLC在半制备C18柱(ODS，10x250mm；5μm)(Beckman Coulter)上进一步纯化干残留物。流动相由溶剂A(在水中的0.2％乙酸)和B(在水中的90％甲醇中的0.2％乙酸)组成，使用以下梯度：0-23min(0％B→80％B)；23-37min(80％B→100％B)；27-32min(100％B)。每0.5min收集一次级分。获得含有具有m/z 265.1188的化合物的级分，并且在减压下干燥。将干残留物溶解在NaOH的水溶液中(5.0mL，5mM)。将等分试样(300μL)的样品上清液转移到玻璃管中，并将丙醇/吡啶(3∶2，v/v，300μL)和氯甲酸丙酯(50μL)的混合物添加到样品中，并将管封盖，涡旋(1min)，超声处理(2min)。添加己烷(300μL)，并通过涡旋样品5min进行液/液萃取。将样品离心(20min，5000g)，并将有机层转移到另一个玻璃管中，在氮气流下干燥。将干残留物溶解在水中的50％甲醇中，并如上所述在C18柱上进行LC-MS分析。

入血浆样品的靶向LC-MS/MS分析

使用稳定同位素稀释LC-MS/MS将人血浆(20μL)中的PAGln定量。将含有内标(D₅-苯乙酰谷氨酰胺)的冰冷甲醇添加到血浆样品(80μL)中，然后涡旋和离心(14，000rpm；4℃持续15min)。将透明上清液转移到具有微型插入物的玻璃小瓶中，并提交给LC-MS/MS分析。在色谱系统上进行LC-MS/MS分析，所述系统由两个Shimadzu LC-30AD泵(Nexera X2)、在30℃下运行的CTO 20AC温箱和SIL-30AC-MP自动进样器组成，其与来自8050系列的三重四重质谱仪(Shimadzu Scientific Instruments，Inc.，Columbia，MD，USA)串联。对于色谱分离，使用Kinetex C18柱(50mm×2.1mm；2.6μm)(目录号00B-4462-AN，Phenomenex，Torrance，CA)。溶剂A(在水中的0.1％乙酸)和B(在乙腈中的0.1％乙酸)在以下梯度下运行：0.0min(0％B)；0.0-2.0min(0％B)；2.0-5.0min(0％B→20％B)；5.0-6.0min(20％B→60％B)；6.0-7.5min(60％B→70％B)；7.5-8.0min(70％B→100％B)；8.0-9.5min(100％)；9.5-10min(100％B→0％B)；10.0-15.0min(0％B)，流速为0.4mL/min，进样体积为1μL。在离子喷雾正模式下，使用多反应监测(MRM)进行检测。使用了以下转换：对于PAGln的m/z265.2→130.15以及对于D5-PAGln的m/z 270.1→130.15。应用了以下离子源参数：雾化气体流速，3l/min；加热气体流量，10l/min；界面温度，300℃；脱溶剂管线温度，250℃；加热块温度，400℃；和干燥气体流速，10l/min。检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.010和0.033μM。用每批样品运行质量控制样品，并且以变异系数(CV)表示的批间变异小于10％。

通过生孢梭菌突变体从苯丙氨酸产生苯乙酸和苯丙酸的体外筛选

为了产生生孢梭菌双敲除突变体，从新的基于CRISPR-Cas9的梭菌属遗传系统生成缺乏cutC基因的生孢梭菌，如前所述(Guo等人，2018)。如前所述，使用Clostron诱变系统破坏第二基因(Dodd等人，1017)。简言之，将porA或fldH重新靶向的pMTL007C-E2载体缀合到生孢梭菌ΔcutC和甲砜霉素抗性菌落中。通过诊断性PCR验证含有感兴趣的质粒之后，将这些菌落铺展到补充有红霉素的TYG平板上。为了评估所述第二基因破坏，使用从红霉素抗性菌落分离的基因组DNA作为模板进行诊断性PCR。设计引物集，以鉴定内含子到靶基因中的插入。

生孢梭菌突变体在大豆胰蛋白酶血琼脂平板(TSBA；Anaerobe系统，目录号AS-542)上在37℃下厌氧生长48至72h。然后将单菌落接种到Mega培养基(3mL)中，并在37℃下厌氧生长过夜。将过夜培养物(100μL)添加到含有¹³C₆-苯丙氨酸(100μM)的新鲜mega培养基(1mL)中，另外培养24h。将培养基离心，使上清液通过3K离心过滤器(Amicon Ultra-0.5mL离心过滤器，Ultracel-3K，Merck Millipore Ltd.)。使滤液(20μL)经受稳定同位素稀释LC-MS/MS分析，以量化¹³C₈-苯乙酸和¹³C₉-苯丙酸。将含有内标(¹³C₂-苯乙酸；80μL)的冰冷甲醇添加到上清液中，然后涡旋和离心(14，000rpm；4℃持续15min)。将透明上清液转移到具有微型插入物的玻璃小瓶中，并提交给LC-MS/MS分析。在色谱系统上进行LC-MS/MS分析，所述系统由两个ShimadZu LC-30AD泵(Nexera X2)、在30℃下运行的CTO 20AC温箱和SIL-30AC-MP自动进样器组成，其与来自8050系列的三重四重质谱仪(Shimadzu ScientificInstruments，Inc.，Columbia，MD，USA)串联。对于色谱分离，使用Kinetex C18柱(50mm×2.1mm；2.6μm)(目录号00B-4462-AN，Phenomenex，Torrance，CA)。溶剂A(在水中的0.1％乙酸)和B(在乙腈中的0.1％乙酸)在以下梯度下运行：0.0min(0％B)；0.0-2.0min(0％B)；2.0-5.0min(0％B→20％B)；5.0-6.0min(20％B→60％B)；6.0-7.5min(60％B→70％B)；7.5-8.0min(70％B→100％B)；8.0-9.5min(100％)；9.5-10min(100％B→0％B)；10.0-15.0min(0％B)，流速为0.4mL/min，进样体积为1μL。在离子喷雾负模式下，使用多反应监测(MRM)进行检测。使用了以下转换：对于苯乙酸的m/z 135.0→91.0；对于¹³C₈-苯乙酸的143.0→98.0；分别对于苯丙酸和¹³C₉-苯丙酸的149.50→105和158→113.0以及对于¹³C₂-苯乙酸(内标)的137.0→92.0。

鼠抗生素激发

在由克利夫兰诊所的机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行所有动物研究。通过隐静脉将全血收集(存活收集)到肝素处理的毛血管中。将C57BL/6J雄性(n＝11)和雌性(n＝15)8-10周龄鼠用抗生素混合物治疗以抑制肠道微生物生长，如前所述(Devlin等人，2016)。简言之，给予小鼠常规饲料饮食，并收集血液进行基线测量。之后，将小鼠给予在其饮用水中的抗生素混合物，包括卡那霉素(0.4mg/mL)、庆大霉素(0.035mg/mL)、粘菌素(0.057mg/mL)、甲硝唑(0.215mg/mL)、万古霉素(0.045mg/mL)和红霉素(0.01mg/mL)。抗生素混合物共施用3天，然后进行第二次采血。之后，将小鼠放回没有抗生素的普通水上，同时将来自常规饲养的同窝仔的粪便颗粒添加到笼子中，这些颗粒从未用抗生素处理过，以允许肠道微生物的再繁殖。在抗生素停用之后7天进行第三次采血。

全血体外血栓形成测定

使用Cellix微流体系统(Cellix Ltd.，Dublin，Ireland)进行微流体实验。在有指示的情况下，Vena8 Fluoro+生物芯片的每个微通道涂覆有1型胶原(15μL；150μg/mL)，然后将生物芯片置于4℃的加湿箱中过夜。在将生物芯片置于显微镜上之前，使用MirusNanopump用1X PBS洗涤Vena8Fluoro+生物芯片的每个通道。使用HC Plan Apo 20X/0.7NA镜头在配备有环境室和Hamamasu ImagEM冷却的CCD相机的Leica DMI6000倒置显微镜上收集图像。将从同意的健康志愿者收集的全血用钙黄绿素AM进行荧光标记，并用PAGln(最终100μM，pH 7.4)或生理盐水对照在22℃下预处理30min。在孵育之后，然后使用多通道微流体装置以生理剪切速率(67.5达因/cm²)在涂有或未涂固定的1型胶原(150μg/mL)的芯片上灌注血液3分钟。在此期间，每5秒捕获一次粘附在胶原涂层上的荧光血小板的图像。在实验结束时，移出含有血小板的管，并通过通道以20达因抽出生物芯片储备池中的1X PBS。在此期间，沿着通道的长度捕获十个图像。然后通过计算机辅助断层扫描分析对血小板活化和及其对胶原表面的粘附进行定量，如前所述(Gupta等人，2015；Srikanthan等人，2014)。

人血小板制剂和集合度测定分析

如前所述进行集合度测定分析(Zhu等人，2016)。简言之，使用柠檬酸钠(0.109M)作为抗凝剂从同意的健康供体收集全血。通过在22℃下以100xg离心10min分离富血小板血浆(PRP)。通过以11,000xg进一步离心2min制备贫血小板血浆(PPP)。使用血细胞计数器对血小板进行计数，对于集合度测定分析，用PPP将浓度调整至2x108/mL。为了制备用于研究的洗涤血小板，将前列腺素E1(PGE-1；100nM)添加到PRP中，然后将PRP在22℃下以500xg离心20min。用具有PGE-1(100nM)的改良的磷酸盐缓冲盐水(NaCl(137mM)、KCl(2.7mM)、Na₂HPO₄(12mM)、MgCl₂(1mM)和葡萄糖(5.5mM)；pH 7.4)轻轻洗涤血小板沉淀，并在500xg下再次离心20min。然后将血小板沉淀重悬在改良的Tyrode缓冲液(NaCl(137mM)、KCl(2.7mM)、NaHCO₃(12mM)、NaH₂PO₄(0.4mM)、HEPES(5mM)、葡萄糖(5.6mM)、BSA(0.35％)；pH7.4)中。使用ADP(高达4μM)、TRAP6(高达10μM)和胶原(高达1.0μg/mL)作为指示，通过不断搅拌(600rpm)启动聚集。将血小板用PAGln或PAGly(最终100μM或指示浓度)在22℃下预孵育30分钟，然后进行血小板聚集。

细胞内Ca²⁺测量

为了制备用于细胞内Ca²⁺测量的洗涤血小板，将100nM前列腺素E1(PGE-1)添加到PRP，然后将PRP在22℃下以500x g离心20min。用具有PGE-1(100nM)的改良的磷酸盐缓冲盐水(NaCl(137mM)、KCl(2.7mM)、Na₂HPO₄(12mM)、MgCl₂(1mM)和葡萄糖(5.5mM)，pH 7.4)将血小板沉淀轻轻洗涤，并在500xg下再次离心20min。然后将血小板沉淀重悬在具有100nMPGE-1的改良的Hank缓冲盐溶液(HBSS-BSA-葡萄糖；NaCl(0.137M)、KCl(5.4mM)、Na₂HPO₄(0.25mM KH₂PO₄()，0.44mM)、CaCl₂(1.3mM)、MgSO₄(1.0mM)、NaHCO₃(4.2mM)、葡萄糖(5mM)和BSA(0.1％))中。对于比率荧光测量，将洗涤的血小板用Fura 2-AM(1μM)在22℃下孵育30min，通过以500x g离心30min除去过量的Fura 2-AM。然后将血小板沉淀重悬在改良的Hank缓冲盐溶液中，并通过测量Fura 2-AM荧光来监测[Ca2⁺]_i的变化，其中使用340/380nm双波长激发并在37℃下在510nm发射，同时在温控荧光分光光度计中不断搅拌(Zhu等人，2016)。

定菌小鼠定殖

使用由克利夫兰诊所的动物护理和使用委员会批准的方案进行所有涉及小鼠的实验。将8-10周龄的C57BL/6雌性小鼠作为一个群体维持在威斯康星大学麦迪逊分校或内布拉斯加大学林肯分校的无菌动物设施的受控环境中，所述环境在塑料柔性薄膜无菌隔离器中，处于严格的14h光照/10h黑暗周期下，并且它们随意接受灭菌水和食物。将动物无菌地运送至克利夫兰诊所的勒纳研究所无菌设施。在到达之后，将小鼠饲养在带有HEPA过滤器的密封灭菌笼中。

生孢梭菌突变体在大豆胰蛋白酶血琼脂平板(TSBA；Anaerobe系统，目录号AS-542)上在37℃下厌氧生长48至72h。挑选单菌落并用于接种在准备好的亨盖特(Hungate)管中的Mega培养基(3mL)。使培养物在37℃下厌氧生长18-24h。此时，移出等分试样的培养物(500μL)，并将剩余的细菌培养物用在水中的甘油(40％)(v∶v)中以1∶1稀释并储存在-80℃。将等分试样离心并在LC/MS上针对代谢物谱筛选上清液，同时从沉淀分离DNA，用于16srRNA基因测序(如下所述)和PCR确认porA和fldH的存在/不存在。使用指示的生孢梭菌突变体，在生物安全柜内将无菌的C57Bl/6雄性8-10周龄小鼠用约0.2mL的细菌培养物通过口服管饲法单定殖。将小鼠维持在灭菌饮食中，并在体内血栓形成前24h注射过滤灭菌叶酸(250mg/kg)。在处死时(定殖后2-7天)，使小鼠经受颈动脉FeCl₃损伤血栓形成测定，并在测定之后立即收集组织，冷冻并储存在-80℃。定殖后，就治疗组而言，未对研究人员设盲，以避免交叉污染。

为了确认定殖，使用NucleoSpin组织试剂盒(Macherey-Nagel，目录号740952.250)根据细菌DNA分离的制造说明，从定殖小鼠的速冻盲肠内容物中分离DNA。在具有GoTaq绿色主混合物以及8F和1492R 16S rRNA通用引物的PCR反应中，使用分离的DNA。在具有20μl终体积的96孔板中进行PCR反应，如下所示：95℃持续2分钟；95℃持续30秒，51℃持续30秒，72℃持续1分20秒(x30)；72℃持续5分钟。完成的反应被送到Eurofins Genomics进行PCR纯化，并使用其标准内部引物(16F)进行16S rRNA基因测序。使用NCBI BLAST确认序列同一性。

颈动脉FeCl₃损伤血栓形成测定

对IP注射媒介物(生理盐水)、PAGln(50mg/kg)、PAGly(50mg/kg)后以及定殖后48小时无菌的小鼠进行麻醉，并如先前描述使其经受颈总动脉损伤(Zhu等人，2016)。简言之，将罗丹明6G(100μL；0.5mg/mL)直接注射到右颈静脉中，从而标记血小板。使左颈动脉暴露，通过放置FeCl₃浸泡的滤纸1分钟使其损伤。使用配备有视频记录的活体荧光显微镜检查实时观察血栓形成。对于所有研究，通过两个不同的研究者的目视检查确定经由血块形成的血流停止的时间。将终点设置为血流停止持续30秒至30分钟。

对悬浮细胞的动态质量再分布(DMR)研究

通过在补充有胎牛血清(FBS；10％)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的RPMI 1640培养基中使细胞在37℃在5％CO₂的加湿气氛中生长，对悬浮细胞、MEG01和HEL92.1.7进行DMR实验。在进行实验之前，使细胞在减血清培养基opti-MEM中过夜孵育。此后，使用1X HBSS缓冲液与HEPES(20mM；pH 7.4)洗涤细胞，并将细胞接种到96孔纤连蛋白包被的Epic Corning DMR板(目录5082-Corning)中，密度为每孔约80-100k个细胞，悬浮在相同缓冲液(100μL)中。将细胞在室温下低速短暂离心(100g，持续10-15秒)，以允许细胞沉降在板的底部。之后，在运行DMR测量之前，允许细胞在室温下经历1h的温度平衡。首先，将基础DMR反应绘制大约15min，以获得定义零水平并且还确保信号稳定的基线读数。对于DMR剂量反应实验，我们添加(25μL；5X浓度)不同的浓度增加的感兴趣的化合物(PAGln、去甲肾上腺素(Norepi)和苯丙氨酸(Phe))，并在Corning Epic BT系统(产品代码5053)中读取DMR信号持续60-90分钟。通过将细胞与百日咳毒素(PTX；100ng/mL)(目录3097-Tocris)孵育30min，与霍乱毒素(CTX；1μg/mL)(目录C9903-Sigma)孵育45min，与YM-254890(目录257-00631-Wako；0.5μM)孵育30min，并且与SCH-202676(1μM)(目录1400-Tocris)孵育30min，然后添加感兴趣的化合物(PAGln(100μM)、去甲肾上腺素(10μM)和胶原(10μg/mL))，对悬浮细胞进行G蛋白调节剂DMR研究。在RNAi转染方案后，通过用ADRA2A、ADRA2B、ADRB2和阴性对照沉默子选择siRNA(对于每个基因的3个siRNA的组合)转染细胞，用siRNA对MEG01进行DMR研究，其中在96孔DMR中每孔三个siRNA中的每个的浓度为1pmol(沉默子选择人GPCR siRNA文库V4方案2013-Ambion-Lipofactamine RNAiMAX-invitrogen，目录13778150)。在转染后40h之后，通过用PAGln(100μM)、肾上腺素(10μM)和ATP(50μM)处理，将siRNA转染的细胞进行DMR读取。通过在添加感兴趣的化合物(PAGln(100μM)、ISO(10μM)、B-HT933(50μM)和ATP(50μM))之前用ICI118，551(10μM)、普萘洛尔(10μM)和RX821002(10μM)处理细胞30min，进行用肾上腺素能受体(ADR)抑制剂对MEG01的DMR研究。在感兴趣的化合物添加后，记录DMR反应信号持续60-90分钟。

对粘附细胞的动态质量再分布(DMR)研究

在亲本HEK293、α2B-HEK293(稳定)和β2-HEK293(稳定)细胞上进行粘附细胞系中的DMR实验，方法是将它们接种到EPIC-corning纤连蛋白包被的96孔DMR微孔板(目录5082-Corning)中，密度为每孔约50k个细胞。使细胞在补充有FBS(10％)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM(100μL)培养基中在37℃在5％CO₂中的加湿气氛中生长1天，然后进行DMR实验。对于α2AADR的功能获得研究，使用Lipofactamine 3000转染试剂盒-Invitrogen(目录L3000008)，用pcDNA3.1(+)-N-DYK空载体或用pcDNA3.1(+)-ADRA2A-N-DYK克隆(克隆id：OHu19050C-GenScript)转染亲本HEK293细胞。在转染后2天之后，对瞬时转染的细胞进行DMR研究。在运行DMR实验之前，用具有HEPES(20mM，pH 7.4)的1X HBSS缓冲液洗涤细胞，并允许其在100μL的相同缓冲液中在室温下经历1h的温度平衡。将基础DMR反应绘制大约15min，以获得定义零水平并且还确保信号稳定的基线读数。在添加感兴趣的化合物(PAGln(100μM)、ISO(10μM)，B-HT933(50μM)和ATP(50μM))之后，监测DMR信号持续60-90分钟。对于抑制剂研究，在添加感兴趣的化合物之前，将ICI118，551(10μM)、普萘洛尔(10μM)和RX821002(10μM)孵育30min。

MEG01细胞中的实时(RT)PCR：在siRNA转染40小时后，按照TRIZOL RNA分离方案从MEG01细胞分离总RNA。按照推荐的方案，使用高容量RNA至cDNA试剂盒(AppliedBiosystem-目录号4387406)进行逆转录。使用来自ThermoFisher Scientific的ADRA2A(测定Id Hs01099503_s1)、ADRA2B(测定Id Hs00265081_s1)和ADRB2(测定Id Hs00240532_s1)的RT引物和探针，在TaqMan基因表达测定方案之后进行实时(RT)PCR。

在MEG01、血小板和HEK293细胞中的cAMP测定：使用来自分子器件的(目录R8089)的CatchPoint环AMP荧光测定试剂盒测量细胞内cAMP水平。简言之，用具有HEPES(20mM；pH7.4)的1X HBSS缓冲液洗涤MEG01细胞并重悬于刺激缓冲液(1X HBSS、HEPES(20mM)；pH7.4，IBMX(0.5mM)、咯利普兰(0.1mM)和BSA(0.1％))中。将细胞进一步接种到96孔细胞培养板中，密度为在100μL刺激缓冲液中的每孔约100k个细胞。类似地，将洗涤的人血小板很轻地重悬在刺激缓冲液中，并以在100μL刺激缓冲液中的每孔约4-6百万个血小板接种到96孔细胞培养板中。此后将MEG01细胞和血小板两者都在37℃培养箱中保持10min，然后添加抑制剂或测试化合物。用刺激缓冲液孵育后，添加10μL(10X浓度)的调节剂/抑制剂(必要时)并在37℃保持15min。之后，添加10μL(10X浓度)的测试化合物(PAGln(100μM)和ISO(10μM))并在37℃孵育不同的时间段。在缓冲液T(1X HBSS、HEPES(20mM)；pH 7.4，IBMX(0.5mM)和咯利普兰(0.1mM))中制备测试化合物。通过添加50μL的裂解缓冲液(提供在试剂盒CatchPoint环AMP荧光测定试剂盒目录R8089-分子器件)停止反应，进一步添加IBMX(0.5mM)和咯利普兰(0.1mM))，并在平板振荡器中搅拌10min以促进细胞裂解。将裂解的细胞立即进行cAMP测定。为了定量cAMP，将裂解的样品(40μL)、缓冲液对照和cAMP校准物添加到96孔透明底的黑壁cAMP测定板(提供在试剂盒中)的适当孔中。此后，将重组的兔抗cAMP抗体(40μL)添加到所有孔中，并在平板振荡器上混合5min以确保混合。在下一步中，将重组的HRP-cAMP缀合物(40μL)添加到每个孔中，适当混合并在室温下保持2h。此后，将板内容物吸出并用洗涤缓冲液(300μL(提供在试剂盒中))洗涤4次。将反光红色底物(提供在试剂盒中)添加到每个孔中，从而最大限度地减少了在黑暗中开始和完成之间的时间。将所述板用铝箔覆盖并在室温下放置至少10min，然后在FlexStation 3多模式酶标仪-分子器件中读取荧光强度。对于使用G蛋白调节剂进行的cAMP测定，每孔添加10μL(10X浓度)每种调节剂，与百日咳毒素(PTX；100ng/mL)(目录3097-Tocris)孵育45min，与霍乱毒素(CTX；1μg/mL)(目录C9903-Sigma)孵育60min，与YM-254890(0.5μM)(目录257-00631-Wako)孵育45min，并且与SCH-202676(1μM)(目录1400-Tocris类)孵育45min，然后添加测试化合物。通过在添加感兴趣的化合物之前，添加每孔10μL(10X浓度)对应的抑制剂，用ICI118，551(10μM)、普萘洛尔(10μM)和RX821002(10μM)处理细胞15min，用ADR抑制剂在MEG01细胞中进行cAMP测定。对于粘附细胞系中的cAMP测定，在37℃在5％CO₂中的加湿气氛中，将亲本HEK293和β2-HEK293(稳定)细胞接种到96孔细胞培养微孔板中，每孔具有在DMEM(100μL)培养基中的大约50k个细胞，所述培养基补充有FBS(10％)、青霉素(100U/mL)和链霉素(100μg/mL)。使细胞生长24h，然后按照如对于MEG01细胞所述的相似方法进行cAMP实验。

细胞内Ca²⁺测量：使用FLIPR钙5测定试剂盒-分子器件(目录R8186)，测量了在MEG01、HEL92.1.7、亲本HEK293、β2-HEK293(稳定)细胞、空载体(EV)转染的HEK293细胞、ADRA2A转染的HEK293细胞中和在α2B-HEK293稳定细胞中的细胞内Ca²⁺。简言之，将悬浮细胞以每孔约100k个细胞或粘附细胞以每孔约50k个细胞接种到96孔透明底的黑壁细胞培养板(目录号353219 Falcon)中的测定缓冲液(100μL；1X HBSS、20mM HEPES，pH 7.4)中。在实验前使粘附细胞生长1天。将钙测定试剂组分A(提供在试剂盒中)重悬于组分B(10mL；提供在试剂盒中)中，并通过涡旋混合1至2min来制备上样缓冲液。在进行测定之前，在上样缓冲液中添加丙磺舒(100μL，250mM)。将上样缓冲液(100μL)添加到96孔板的每个孔中。将板在37℃孵育1小时，此后保持在室温下直至用于测定。制备测试化合物96孔微孔板，在适当的孔中添加5X浓度的感兴趣的化合物(PAGln(100μM)、ADP(1OμM)和TFLLR-NH₂(10μM))。在化合物添加时，在FlexStation 3多模式酶标仪-分子器件中，将50μL的测试化合物添加到测定板的对应孔中。在化合物添加后，实时监测Ca²⁺水平，计为相对荧光单位(RFU)。使用最大RFU峰减去最小基线RFU，作为Ca²⁺水平的净测量。

统计学

使用连续变量的学生t检验(2尾)或Wilcoxon秩和检验以及分类变量的χ2检验来检验组之间的差异。基于秩次的非参数Kruskal-Wallis检验用于非正态分布数据。将数值数据呈现为均值±SD或中值(第25-第75百分位数＝Q1-Q3)。将分类数据显示为n(％)。使用单变量(未调整)和多变量(调整)Cox模型两者估计3年随访的MACE的HR和相应的95％CI。使用具有Cox比例风险回归的Kaplan-Meier分析进行事件时间分析，以确定MACE的HR和95％95％CI。对个体传统心脏风险因素进行了调整，所述因素包括年龄、性别、HDL、LDL、甘油三酯、高脂血症、吸烟、糖尿病、收缩压和高敏C反应蛋白水平。使用R 3.4.2(Vienna，Austria，2017年)进行所有分析。＜0.05的P值被视为是统计学上显著的。

结果

非靶向代谢组学鉴定苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)与CVD相关

在最初的发现队列(n＝1,162)中，对来自接受选择性诊断性心脏评价的连续稳定受试者的血浆进行非靶向代谢组学研究，同时进行纵向(3年)随访，如方法所述。将血浆分析物根据三个筛选纳入标准进行优先排序：(i)与伴随的(3年)主要不良心脏事件(MACE＝心肌梗死、中风或死亡)的关联；(ii)T2DM的存在；和(iii)与血糖控制的指标(即空腹血糖、HgbA1C和胰岛素/葡萄糖)的差的相关性。在监测的血浆的光谱特征中，将与MACE相关的靠前的预测分析物优先排序为两个列表-在分析时已知结构与未知结构的光谱特征。前5种已鉴定的(“已知”)化合物包括三甲胺-N-氧化物(TMAO)和三甲基赖氨酸(TML)，这些化合物与肠道微生物群代谢有关，其水平以前与伴随的CVD风险有关(Koeth等人，2013；Li等人，2018；Tang等人，2013；Wang等人，2011)，以及三种具有暂定结构鉴定的二烷基甘油磷脂(diradylglycerophospholipid)。将我们的注意力转向“未知”候选列表，与MACE相关的靠前的候选物(高分辨率m/z 265.1188)满足所有三个筛选纳入标准，并且显示出伴随的(3年)的MACE风险的风险比(HR)95％(置信区间(CI))为2.69(1.61-4.52)；P＜0.0001(图1A、1B；表S2)。随后通过多种方法将m/z 265.1188血浆分析物(在血浆或分离的血浆中)明确地鉴定为苯乙酰谷氨酰胺(PAGln)，所述方法包括与在多柱固定相上的真实的合成标准材料以及在具有或没有衍生化的色谱条件下显示出相同的高分辨率MS/MS谱和保留时间(图1C)。m/z 265.1188血浆分析物也显示出具有与保藏在北美的MassBank的最近保藏的真实的合成PAGln的MS/MS谱相同的质谱。

非靶向代谢组学分析只是半定量的，并且需要对候选药物进行验证和更多的定量分析，以证实观察到的关联。因此，我们开发了稳定同位素稀释LC/MS/MS测定法，用于量化接受选择性诊断性心脏评价的稳定受试者的独立(非重叠)验证队列(n＝4,000)中的PAGln。在整个队列内，在T2DM受试者中(P＝0.0002与非糖尿病患者)以及在MACE受试者中(P＜0.0001与非MACE)，观察到更高的血浆PAGln水平。Kaplan-Meier生存分析显示，PAGln水平高的受试者具有更大的伴随的(3年)MACE风险(图1D；对于检验的所有组的对数秩，P＜0.0001)。具体地说，相对于第一个四分位数(Q1)，具有在第四个四分位数(Q4)的PAGln水平的受试者显示出伴随的(3年)MACE风险的显著增加的风险(所有受试者(HR，2.80；95％CI，2.17-3.61)；T2DM(HR，2.73；95％CI，1.84-4.05)和非糖尿病患者(HR，2.18；95％CI，1.59-3.00)；图1E)。而且，在对传统心脏风险因素进行调整后，较高的PAGln水平仍然是伴随的MACE风险的独立预测因子(图1E)。

肠道微生物群参与体内PAGIn和苯乙酰甘氨酸(PAGly)的产生

在分析首先在基线(在Abx之前)回收的血浆的研究中，通过证明受试者(n＝15)全身PAGln水平的显著抑制(P＜0.0001)来建立肠道微生物对人PAGln生成的贡献，然后继之以口服吸收不良的先前显示抑制肠道微生物群(Tang等人，2013年)的广谱抗生素混合物(Abx)的7天疗程，最后继之以洗脱期(≥3周)，以允许常规人肠道共生体的再繁殖(在Abx之后)(图2A)。以前对肝脏提取物或分离酶的研究已经报道，可以通过人和恒河猴肝酶将苯乙酸与氨基酸谷氨酰胺缀合而形成PAGln(Webster等人，1976)；而其他研究表明，苯乙酸可以通过培养物中必需氨基酸苯丙氨酸的细菌发酵产生(Dodd等人，2017)。除了PAGln之外，还注意到苯乙酸与氨基酸甘氨酸的缀合，从而生成苯乙酰甘氨酸(PAGly)(Gonzalez-Guardia等人，2015；Wang等人，2013)。因此，我们评价了苯乙酸的甘氨酸与谷氨酰胺衍生物在明显健康的受试者(n＝25)中以及小鼠中的生理分布，在其中将进行机理研究。在人中，发现PAGln的循环水平比PAGly高出一个数量级以上；相比之下，小鼠中的PAGly水平比PAGln高出一个数量级(图2B)。另外，在小鼠腹膜内(i.p.)注射之后，证明苯乙酸主要被代谢成PAGly(图2C)。最后，比较在传统小鼠与无菌小鼠中或在口服Abx治疗实验之前与之后的内源性血清PAGly水平，表明肠道微生物群是从苯乙酸形成PAGly的关键参与者(图2B、D)。因而，在人和小鼠中，PAGln和PAGly通过元有机体途径在体内产生，其中膳食苯丙氨酸通过肠道微生物群转化为苯乙酸，然后宿主与谷氨酰胺(在人中优选)或甘氨酸(在啮齿动物中优选)发生缀合反应，分别产生PAGln和PAGly(图2E)。

PAGIn增强血小板刺激诱导的钙释放和对多种激动剂的反应性。

观察到的在人中的PAGln水平与伴随的血栓形成事件之间的正相关(图1)表明PAGln对血小板功能和与血管基质相互作用的潜在影响。因而，我们研究了PAGln是否在生理剪切力下影响血小板粘附至全血中胶原表面，如前所述(Zhu等人，2016)。从健康志愿者(均被证实具有低的(<第4个四分位数PAGln水平))回收的全血暴露(30min)于生理相关水平的PAGln的全血大大加快了胶原依赖性血小板粘附的速度以及生理剪切流下观察到的到表面的扩散(P＝0.025；图3A、B)。此外，用PAGln(100uM)与盐水(媒介物)对人富血小板血浆(PRP)进行短暂(30min)预处理显示，PAGln显著增强了刺激依赖性血小板聚集至次最大浓度的三种不同的已知血小板激动剂：ADP、凝血酶受体激活肽(TRAP6)和胶原(图3C顶部；对于ADP，P＜0.001；对于TRAP6，P＝0.003，并且对于胶原，P＝0.02)。而且，当使用每种血小板激动剂(ADP、TRAP6或胶原)的固定的次最大水平时，在我们的临床队列中发现的PAGln浓度的生理范围内，观察到PAGln以剂量依赖性方式增强了在PRP中观察到的血小板聚集程度(图3C底部；对于ADP，P＝0.016；对于TRAP6，P＝0.002，并且对于胶原，P＝0.018)。这些结果共同表明，PAGln可能直接与血小板相互作用，从而增强在胞质Ca²⁺浓度方面的刺激依赖性升高。为了直接测试这一点，从健康供体回收分离的人血小板，加载钙选择性染料Fura 2-AM，并在凝血酶诱导的活化之前与之后监测实时细胞内离子化胞质Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_i)。用PAGln预孵育血小板对基线[Ca²⁺]_i水平没有影响(图3D)。然而，暴露于生理水平的PAGln以剂量依赖方式增强了次最大(0.02U)凝血酶诱发的[Ca²⁺]_i增加(图3D、E)。对于PAGly观察到类似的结果，其中除了PRP增强刺激(ADP)依赖性血小板聚集反应外，并且除了洗涤的人血小板外，激发了响应于次最大凝血酶暴露的[Ca²⁺]_i的进一步升高。累积起来，上述数据证明，肠道微生物群依赖性代谢物PAGln和PAGly显著影响血小板功能，从而增强血小板对胶原基质的粘附，并且增强响应于激动剂的血小板刺激依赖性[Ca²⁺]_i升高和聚集。

PAGln加速血小板凝块形成并增强体内血栓形成潜力

使用FeCl₃诱导的颈动脉损伤模型检验了PAGln和PAGly对体内血块形成的影响，所述模型是诱导血栓形成的常用实验方法。通过对小鼠的i.p.注射，PAGln或PAGly单独地急性地升高到生理相关水平(即，在第4个四分位数内；图1)，并且将血小板凝固的速率和颈动脉内血流停止的时间定量。值得注意的是，与用营养前体氨基酸苯丙氨酸或生理盐水(媒介物)对照替代治疗的小鼠(图4B)相比，PAGln和PAGly两者都诱导了受损颈动脉内血小板血栓形成增加(图4A)，并相应地缩短了损伤后流动停止的时间(即，闭塞时间)。

肠道微生物porA和fldH体内调节宿主血栓形成潜力。

接下来，我们试图测试肠道微生物共生体和有助于宿主内PAGln/PAGly生成的基因是否可以体内调节血小板功能和血栓形成潜力。基于先前研究的组合(Dodd等人，2017；Elsden等人，1976；Dickert等人，2002)，我们在图7中展示了提出的元有机体微生物代谢途径的示意图，所述途径用于膳食苯丙氨酸到苯乙酸(氧化途径)或苯丙酸(还原途径)的初始厌氧转化。这些反应之后是宿主催化的氨基酸(Gln或Gly)与苯乙酸的缩合反应以形成PAGln和PAGly，以及苯丙酸β氧化成苯甲酸并与Gly缩合以形成马尿酸。Dodd及其同事(Dodd等人，2017)最近的研究报道了porA基因在人共生体生孢梭菌将苯丙氨酸氧化代谢为苯乙酸中的作用。另外，Elsden及其同事先前报道苯丙酸是梭状芽胞杆菌代谢苯丙氨酸的主要产物(Elsden等人，1976)，并且Dodd及其同事还表征了生孢梭菌中的15kb基因簇，该基因簇含有苯乳酸脱水酶基因(fldABC)(Dickert等人，2002)以及相邻基因(例如fldH)，这些基因被证明对包括苯丙氨酸在内的芳香族氨基酸的催化还原代谢至关重要(Dodd等人，2017)。所述方案还基于以前研究的在人和其他哺乳动物中的苯乙酸代谢，因为它用作尿素循环障碍患者中的高氨血症的急性紧急治疗，促进以PAGln形式经由尿液排泄的氮去除(Brusilow等人，1980；Webster等人，1976)。因此，我们产生了缺乏porA或fldH基因的生孢梭菌突变体，如方法中所述。因为生孢梭菌生成三甲胺的能力，三甲胺为替代的肠道微生物群衍生的代谢物，是促血栓形成代谢物TMAO的已知前体(Skye等人，2018；Zhu等人，2016)，所以porA或fldH缺失突变体两者都在生孢梭菌ΔcutC背景中产生。为了在功能上表征所述突变体，将它们在厌氧条件下在[¹³C₉，¹⁵N₁]-苯丙氨酸存在下培养，并且通过LC/MS/MS确定[¹³C₈]-苯乙酸与[¹³C₉]-苯丙酸的生成，如方法中所述。如图4C中所示，虽然含有porA和fldH两者的生孢梭菌ΔcutC仅生成同位素标记的苯丙酸而不是苯乙酸，但ΔcutCΔfldH突变体(仍然具有功能性porA)不再生成苯丙酸，而是生成苯乙酸。相反，ΔcutCΔporA生孢梭菌(仍具有功能性fldH)突变体不再生成苯乙酸，而仅形成苯丙酸。为了直接测试肠道微生物苯乙酸生成对宿主体内血栓形成潜力的影响，因此我们用生孢梭菌ΔcutC或生孢梭菌ΔcutCΔfldH突变体来定殖无菌小鼠。微生物定殖后，使用FeCl₃诱导的颈动脉损伤模型，通过LC/MS/MS确定在体内血栓形成评估时回收的血清样品中的PAGly的血浆水平，如方法所述。通过从接种后处死时的盲肠内容物提取的DNA的PCR，确认生孢梭菌菌株的定殖。正如体外培养数据所预测(图4C)，用生孢梭菌ΔcutCΔfldH定殖无菌小鼠导致PAGly水平显著高于(P＜0.001)在用生孢梭菌ΔcutC定殖的无菌小鼠中观察到的水平(图4D)。重要的是，在动脉损伤后，在用生孢梭菌突变体定殖的小鼠中，血栓形成的速率和受伤血管内流动停止的时间两者都显著降低，其中产生更高水平的苯乙酸(即，ΔcutCΔfldH)，并且因此，产生更高水平的PAGly(图4D)。

PAGln显示出与细胞的可饱和且特异的结合，表明了特异性受体-配体结合相互作用。

由于PAGln直接促进在生理水平上的细胞效应，我们接下来试图译解可能有助于PAGln引发的细胞事件的潜在分子参与者。为了测试PAGln是否显示出与细胞受体结合的证据，我们使用动态质量再分布(DMR)，这是一种基于折射率变化的无标记技术，能够实时检测活细胞中的配体依赖性综合细胞反应(Schroder等人，2010；Schroder等人，2011)。将PAGln添加至人骨髓来源的原巨核细胞细胞系MEG01(一种可培养的血小板前体细胞)，导致类似于已知的受体结合配体(如分别与肾上腺素能受体和糖蛋白VI(GPVI)受体结合的去甲肾上腺素和胶原蛋白)的阳性DMR反应，并且将其用作阳性对照(Leitinger，2011；Small等人，2003)。相反，PAGln前体(和结构类似物)苯丙氨酸不与正规的细胞受体结合，没有表现出DMR反应(类似于媒介物对照)，将其用作阴性对照。用MEG01细胞增加的潜在结合配体(PAGln与去甲肾上腺素与苯丙氨酸)浓度的检查显示出可饱和的且特异的DMR剂量反应曲线，这对于PAGln和阳性对照(去甲肾上腺素)是典型的配体-受体相互作用过程，但对于苯丙氨酸则不然(图5A)。在平行研究中，相同的实验研究检查了PAGln与人骨髓来源的红白血病细胞系HEL92.1.7的结合，其还显示出与PAGln的可饱和且特异的DMR剂量反应信号，类似于去甲肾上腺素。

PAGln经由G蛋白偶联受体(GPCR)介导细胞事件

由于PAGln显示出与细胞的受体-配体相互作用特性，我们测试了PAGln诱导的DMR细胞反应是否受到已知的GPCR信号通路调节剂的影响，所述调节剂如百日咳毒素(PTX)、霍乱毒素(CTX)和YM-254890，它们分别减弱Gα_i/o、Gα_s和Gα_q亚基介导的信号通路的激活(Campbell和Smrcka，2018；Milligan和Kostenis，2006)。另外，我们检查了在不存在或存在剂SCH-202676的情况下PAGln诱导的DMR细胞反应，其中所述剂为全局GPCR抑制剂，其阻断激动剂和拮抗剂两者与许多结构多样的GPCR结合，所述GPCR与Gα_i/o、Gα_s和Gα_q蛋白偶联(Fawzi等人，2001；Lewandowicz等人，2006)。作为阳性对照，我们使用去甲肾上腺素(Norepi)作为GPCR结合配体，而将胶原(非GPCR结合配体)用作阴性对照。通过用所有三种调节剂(PTX、CTX和YM-254890)的组合或使用全局GPCR抑制剂SCH-202676预处理细胞，显著降低了MEG01细胞中的PAGln诱导的DMR反应，强烈暗示GPCR涉及细胞的PAGln反应(图5B，左图)。此外，用PTX或CTX(而不用YM-254890)预处理细胞显著抑制了PAGln诱导的DMR反应，表明Gα_i/o和Gα_s参与(图5B，左图)。而且，对Norepi(阳性对照)的DMR反应的检查显示在与每种已知的GPCR调节剂孵育后，DMR信号显著降低(图5B，中间图)，其中已知所述Norepi不同程度地通过上述所有三个G蛋白亚基发信号(Hein，2006)。相反，与血小板上的非GPCR受体糖蛋白VI(GPVI)结合的胶原(阴性对照)的DMR信号未受每种已知GPCR调节剂对细胞预处理的影响(图5B，右图)。在HEL.92.1.7细胞中也指示了GPCR参与PAGln诱导的DMR反应，其中观察到这些G蛋白调节剂的相似作用，尽管与MEG01不同，Gα_q调节剂YM-254890也显示出在PAGln诱导的DMR反应方面的显著降低。

上述数据表明，在MEG01和HEL92.1.7细胞中，PAGln诱导的DMR反应似乎是经由对一种或多种GPCR的可饱和且特异的反应介导的。因此，我们检查了PAGln是否在细胞内cAMP或Ca²⁺方面引发可检测的变化，后二者是传统上在GPCR途径的功能测定中监测的第二信使(Zhang和Xie，2012)。正如我们之前在血小板中注意到的(图3D)，在不存在其他激动剂的情况下，没有观察到单独的PAGln对MEG01或HEL92.1.7细胞中的细胞内Ca²⁺水平的直接影响(图5F)。然而，在MEG01细胞(图5C)和洗涤的人血小板(图5D)中，生理水平的PAGln确实引发细胞内cAMP水平的适度(大约20-30％)但显著的(各自P＝0.0002)瞬时的(5min内)增加。而且，当MEG01或洗涤的人血小板各自用已知的GPCR调节剂预处理时，只有CTX和全局GPCR抑制剂SCH-202676抑制了PAGln诱发的cAMP产生，这表明在这些细胞中的PAGln暴露触发了Gα_s介导的腺苷酸环化酶活化。将异丙肾上腺素(ISO)用作阳性对照，其主要与β2-肾上腺素能受体结合，主要与MEG01细胞和血小板两者中的Gα_s亚基偶联(Koryakina等人，2012)。总的来说，这些数据表明，PAGln在包括分离的人血小板在内的多种细胞中通过GPCR介导细胞反应。

肠道微生物群依赖性代谢物PAGln经由肾上腺素能受体(肾上腺素受体)起作用

鉴于PAGln经由GPCR介导细胞反应，我们接下来试图确定它们的身份。在人基因组中存在近1000种不同的GPCR，因此鉴定哪一种(或多种)可能对PAGln有反应是令人生畏的。然而，我们注意到，PAGln本身具有苯乙胺部分的核心骨架结构(标记为高亮)，类似于许多已知与肾上腺素能受体(ADR)的大型多基因家族结合的儿茶酚胺类(图5E)。因此，我们假设PAGln可能通过肾上腺素能受体诱导细胞信号传导，所述肾上腺素能受体受到关注的是先前报道存在于人血小板上的ADR家族成员(α2A、α2B和β2 ADR)的(Anfossi和Trovati，1996；Barnett等人，1985；Colman，1990)。我们最初使用遗传和药理学方法在MEG01细胞中进行了功能丧失研究。在用对照加扰的siRNA或靶向α2A、α2B或β2 ADR的siRNA转染后，监测在MEG01细胞中的PAGln诱导的DMR反应。重要的是，我们证实，在α2A、α2B或β2 ADR的siRNA靶向之后，ADR2A、ADR2B或ADRB2的MEG01细胞mRNA水平分别降低了50％以上，但在对照加扰的siRNA后没有降低。值得注意的是，针对三种ADR的siRNA中的每一种在MEG01细胞中都显示出在PAGln诱导的DMR反应方面的平行显著降低，而对照加扰的siRNA对DMR反应没有影响(图5F)。而且，另一个阳性对照(肾上腺素的DMR反应，所述肾上腺素在不同程度上与所有上述血小板ADR结合；Hein，2006)显示，通过对α2A、α2B或β2 ADR的siRNA敲低，DMR信号显著降低，但对照加扰的sigRNA则不然。此外，靶向相同ADR的siRNA的每一种在暴露于非ADR结合配体ATP(用作额外对照)后显示出对MEG01 DMR反应没有影响。

在补充研究中，我们使用针对人血小板中的已知ADR(α2A、α2B或β2ADR)的药理学抑制剂，即选择性β2-拮抗剂ICI118，551、非选择性β阻断剂普萘洛尔和非选择性α2-拮抗剂RX821002(Atwood等人，2011；Bilski等人，1983；O′Rourke等人，1994)。通过PAGln与MEG01细胞孵育诱导的DMR反应被上述药理学抑制剂中的每一种显著降低，而单独的抑制剂不影响DMR反应(图5G)。作为阳性对照，在ICI118，551以及普萘洛尔的存在下，β2-激动剂异丙肾上腺素(ISO)的DMR反应被削弱；用RX821002适当抑制了细胞暴露于α2-激动剂B-HT933的DMR反应。作为额外对照，在存在任何测试的ADR抑制剂(ICI118，551、普萘洛尔或RX821002)的情况下，暴露于非ADR结合配体ATP的细胞DMR反应保持不变。最后，还使用药理学抑制剂进行功能丧失研究，以分析MEG01细胞和洗涤的人血小板中的cAMP产生。ICI118，551(β2选择性拮抗剂)和普萘洛尔(非选择性β阻断剂)，但不是RX821002(非选择性α拮抗剂)，抑制了PAGln(5min暴露)诱导的在MEG01细胞(图5H)和血小板中的细胞内cAMP产生。类似地，用ICI118，551和普萘洛尔降低了在MEG01和洗涤的人血小板中进行ISO处理之后的细胞内cAMP产生，但用RX821002则不然。因而，遗传和药理学功能丧失研究两者都证实PAGln经由α2A、α2B和β2 ADR诱导细胞反应。

功能获得研究证实PAGln可经由α2A、α2B和β2 ADR发信号

为了进一步证实PAGln通过ADR发挥作用的能力，我们通过在人胚胎肾细胞系(HEK293细胞)中单独地过表达α2A、α2B和β2 ADR进行了功能获得研究，选择这些ADR是因为它们的内源性水平低(Atwood等人，2011)。虽然亲本或空载体转染的HEK293细胞与PAGln孵育引发标称的DMR反应，但对于用adra2a基因瞬时转染的HEK293细胞(α2A-HEK293)或稳定过表达α2B ADR(α2B-HEK293)或β2 ADR(β2-HEK293)的HEK293细胞观察到增强的PAGln诱发的DMR反应(图6A)。而且，使用上述选择性ADR药理学抑制剂逆转了在相应的表达ADR的细胞中的PAGln诱导的DMR反应(即，在α2A-HEK293和α2B-HEK293细胞中的PAGln诱导的DMR反应被非选择性α2-拮抗剂RX821002逆转，并且在β2-HEK293细胞中的PAGln诱导的DMR反应被选择性β2拮抗剂ICI118，551或非选择性β阻断剂普萘洛尔削弱(图6A))。作为另外的对照研究，我们使用α2-激动剂B-HT933对α2A-HEK293(瞬时)和α2B-HEK293(稳定)细胞进行了相似的实验，并且观察到与亲本HEK-293细胞相比，B-HT933引发的DMR反应升高，而RX821002削弱了反应。同样，β2-激动剂ISO在β2-HEK293(稳定)细胞系中显示出增强的DMR反应，所述反应被ICI118，551或普萘洛尔抑制。作为另外的(阴性)对照，在存在对应的ADR抑制剂的情况下，在所有ADR转染的细胞(α2A-HEK293(瞬时)、α2B-HEK293(稳定)和β2-HEK293(稳定))中，ATP引发的DMR反应未受影响。

在补充的功能获得研究中，我们分析了在不存在与存在渐增浓度的PAGln的情况下在亲本HEK293和β2-HEK293(稳定)细胞中的cAMP水平。值得注意的是，亲本HEK293细胞在细胞内cAMP水平(绿线)方面未显示PAGln诱发的变化，而β2-HEK293(稳定)细胞在胞质cAMP水平(蓝线)方面表现出剂量依赖性显著增加(图6B)。此外，在所有检查的细胞(亲本HEK293、β2-HEK293(稳定)细胞、空载体(EV)转染的HEK293细胞、α2A-HEK293(瞬时)细胞和α2B-HEK293(稳定)细胞)中，细胞内Ca²⁺水平未受PAGln暴露的影响。因而，总的来说，在多种细胞类型中采用遗传或药理学方法的功能丧失和功能获得研究证实，PAGln可经由α2A、α2B和β2肾上腺素能受体诱导细胞反应。

用选定的ADR抑制剂削弱了由PAGln诱发的血小板高反应性和加速的体内血栓生成速率。

上述研究表明，肾上腺素能受体阻断剂在CVD中的一些潜在益处可能来自对PAGln诱导效应的拮抗作用。与此一致，我们观察到从具有低PAGln水平的健康志愿者回收的富血小板血浆(PRP)暴露于病理生理相关水平的PAGln增强的次最大ADP刺激的血小板聚集反应。同时，在存在非选择性β阻断剂普萘洛尔或非选择性α2拮抗剂RX821002的情况下，PAGln暴露削弱了PAGln诱导的高反应性(图6c)。此外，两种ADR抑制剂均未显示对次最大ADP刺激的血小板聚集反应有直接影响(但消除了PAGln增加的血小板聚集反应；图6C)。因而，每种肾上腺素能受体抑制剂的添加逆转了PAGln引发的血小板高反应性。

在另一系列研究中，我们检验了临床实践中广泛使用的β阻断剂(BBlkr)卡维地洛(Gupta等人，2004)对PAGln诱导的体内血栓形成增强的影响。如前所述进行研究(图4)，检验PAGln(经由i.p.注射急性升高)对FeCl₃诱导的动脉损伤激发的血小板血栓形成速率和血管闭塞时间的影响；然而，这次使用在不存在与存在卡维地洛(一周1.5g/kg)的情况下的小鼠。值得注意的是，在不存在BBlkr治疗的情况下，PAGln再次显著加快了血小板血栓生成速率(图6D)，并缩短了观察到的血流停止的时间(图6E)。然而，通过用卡维地洛对小鼠进行预处理逆转了PAGln对血块形成速率和闭塞时间的促血栓形成作用(图6D、E)。

为了丰富我们与伴随的CVD事件风险相关的候选代谢紊乱的潜在池，并增加发现新途径的可能性，我们选择将我们的研究最初集中于已知CVD风险增加但机制不明确的弱势患者群体-糖尿病患者，即，在T2DM中CVD风险增加被认为部分地经由不同于传统CVD风险因素和葡萄糖控制程度的机制(Action to Control Cardiovascular Risk in DiabetesStudy等人.，2008；Duckworth等人，2009；Gerstein等人，2001；Piarulli等人，2009)。因而，我们试图确定与非糖尿病受试者相比，在T2DM中的循环代谢物增加与伴随的CVD发展及其主要不良事件(心脏病发作、中风和死亡)相关，并且与血糖控制指标(即空腹血糖、HgbA1C、葡萄糖/胰岛素比值)相关性低。值得注意的是，许多经鉴定符合这些标准的靠前的候选物(分析时已知结构和未知结构两者)被证明与肠道微生物群在机理上相关(例如PAGln、TMAO和TML；Koeth等人，2013；Tang等人，2013；Wang等人，2011；Zhu等人，2016)。而且，观察到PAGln(如TMAO和TML)与T2DM受试者和非糖尿病受试者中的伴随CVD风险同样地相关。因而，使用非靶向代谢组学与功能研究相结合已被证明是发现在临床和机理上与CVD相关的新途径的有价值的方法，并且有趣的是，似乎有很大比例的代谢候选物/途径与肠道微生物组-我们最大的环境暴露的过滤器-我们吃什么有关(Aron-Wisnewsky和Clement，2016；Brown和Hazen，2018；Jonsson和Backhed，2017；Koopen等人，2016)。

将总结PAGln(和PAGly)的元有机体起源、它被ADR识别以及如通过提供的这些研究揭示的它与CVD的整体关系的图解展示在图6f中。摄入苯丙氨酸(Phe)后，大部分必需氨基酸在小肠中被吸收，但到达大肠的未吸收的Phe可以被肠道微生物群代谢形成苯基丙酮酸(最初微生物群生成的脱氨产物)和随后的苯乙酸。在吸收到门脉系统中后，苯乙酸容易在肝脏中代谢以产生PAGln(人中的主要产物)和PAGly(小鼠中的主要产物)。PAGln长期以来一直被公认为是人肝脏和肾组织的苯乙酸和谷氨酰胺的合成产物(Moldave和Meister，1957)，以及人和灵长类动物中的柠檬酸循环中间体的非侵入性探针(Yang等人，1996)。目前的研究证实了肠道微生物群在人和小鼠的“内源性”PAGln(和PAGly)生成中的主要作用，正如使用抗生素混合物抑制肠道微生物群的研究以及使用无菌与常规饲养的小鼠的确证研究所示。值得注意的是，使用半定量分析的有限数量的最近研究已表明在PAGln与一些心脏代谢表型之间的关联。例如，在一项研究中，注意到PAGln水平在终末期肾病受试者中升高，并且与死亡率相关(Shaft等人，2015)，而在另一项研究中则不然(Shaft等人，2017)。此外，最近，PAGln的尿水平升高与肥胖症(Elliott等人，2015)、早期肾功能下降(Barrios等人，2015；Poesen等人，2016)相关，并且最近在糖尿病患者中注意到PAGln水平升高(Loo等人，2018；Urpi-Sarda等人，2019)。然而，尽管有这些报道，在PAGln和CVD发病机制之间的机制联系尚无报道。

值得注意的是，本研究提出了几种机制，通过这些机制，PAGln升高与伴随的CVD风险之间可发生临床关联。首先，证明PAGln通过多种补充方法影响血栓形成潜力。使用全血、富血小板血浆和分离的血小板进行的离体细胞研究都表明，PAGln(和PAGly)增强了血小板功能(对多种激动剂和细胞内钙释放的增强的刺激依赖性反应性)。此外，许多体内研究揭示了PAGln或PAGly的病理生理相关水平，它们各自有助于提高动脉损伤模型中的血栓形成速率和血栓形成潜力，所述研究包括范围从直接施用PAGln或PAGly的研究到调节苯乙酸(PAGln(和PAGly)的前体)的产生的微生物移植研究。值得注意的是，对定菌小鼠的微生物工程和移植研究表明，肠道微生物fldH基因簇与porA基因的相对活性可调节肠道微生物产生苯乙酸(相对于苯丙酸)的总量，从而影响宿主(定殖的GF小鼠)内的PAGly产生。关键的是，在FldH与PorA蛋白任一者的肠道微生物活性之间的平衡最终影响了在定菌条件下的定殖小鼠中的体内血栓形成潜力，正如通过动脉损伤后的血栓形成速率和血管闭塞时间两者所监测的。

PAGln可影响CVD相关表型的另一种机制是经由其与GPCR(包括ADR)的新证明的相互作用。直接的生物物理研究指示PAGln与细胞的可饱和且特异的结合，表明细胞受体-配体相互作用，并且用多种补充的已知GPCR抑制剂的研究调节PAGln介导的细胞反应和下游信号传导。一系列系统的遗传功能丧失研究和功能获得研究以及多种确证药理学抑制剂和激动剂研究，明确表明PAGln可经由α2A、α2B和β2 ADR发信号，其中已知所述ADR在血小板上表达。而且，观察到在临床实践中用广泛使用的β阻断剂治疗小鼠逆转了PAGln在动脉损伤小鼠模型中引发的促血栓形成作用。另外，用特异性ADR siRNA敲低或ADR拮抗剂的研究都显示阻断了PAGln诱导的促血栓形成表型，进一步表明PAGln可经由ADR促进细胞信号。已知β阻断剂疗法有助于患有CVD的一些受试者中的许多临床益处(例如，降低心脏病发作、中风、心力衰竭和死亡的风险；Black等人，2010；Bumett等人，2017；Witte等人，2018)。

ADR在几乎所有细胞类型上广泛表达，并且已知不仅在血管和心肌功能中起重要作用，而且更广泛地说，在健康和病理状态下调节身体稳态。它们影响心肌收缩、血压、肺部气流，并刺激交感神经系统和中枢神经系统功能(Amrani和Bradding，2017；Hein和Kobilka；1997；Lefkowitz等人，2000；Rockman等人，2002)。肾上腺素能系统的激活也对代谢具有深刻影响，长时间激活可导致胰岛素抵抗、葡萄糖和脂肪酸代谢的改变以及线粒体功能障碍(Ciccarelli等人，2013；Fu等人，2017)。

实施例2

PAG、TMAO和TML的检测

本实施例描述了PAG、TMAO和TML的联合检测，用于检测在2138位受试者的大型队列中的3年和5年的主要不良心脏疾病(MACE)的风险。受试者的基线特征提供在下表1中。

实施例3

肠道微生物组代谢物和致死性前列腺癌的风险：PLCO队列的前瞻性分析

三甲胺相关营养素和氨基酸的肠道微生物群依赖性代谢与心血管疾病和癌症相关。然而，这些化合物和代谢物与致死性前列腺癌的关联仍然未知。本实施例的目的是评价与致死性前列腺癌风险相关的三甲胺前体营养素、三甲胺N-氧化物和肠道微生物群衍生的氨基酸衍生物的基线血清水平的关联。采用嵌套病例对照设计来确定基线胆碱、肉碱、甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、巴豆甜菜碱、三甲胺N-氧化物、苯乙酰谷氨酰胺(PAG)、马尿酸和硫酸对甲酚水平的差异是否与伴随的致死性前列腺癌相关。基于年龄、种族、基线抽血时间和招募日期，以1∶3的比率将病例与对照随机匹配。在1993年11月至2001年7月期间收集基线血清样品，作为前列腺癌、肺癌、结直肠癌和卵巢癌(PLCO)癌症筛查试验的一部分。筛查于2006年完成，死亡率数据收集到2015年。分析了173个病例和519个没有致死性PCa的对照。从以前未被诊断患有前列腺癌的分配到PLCO试验的干预组的年龄55-74岁的男性收集样品。相对于第一四分位数中的那些，具有较高胆碱基线水平的病例(Q3 OR：2.37，95％CI：1.35-4.17；Q4 OR：2.19，95％CI：1.23-3.90；P-趋势：0.005)和甜菜碱(Q3 OR：2.13，95％CI：1.22-3.70；Q4 OR：1.86，95％CI：1.05-3.30；P-趋势；0.11)表现出在调整BMI和PSA之后发生致死性前列腺癌的几率增加。对于其他三甲胺相关化合物(包括肉碱、γ-丁酰甜菜碱、巴豆甜菜碱和三甲胺N-氧化物)，这种关联并未被一致证明。较高的苯乙酰谷氨酰胺基线血清水平(Q3：2.54，95％CI：1.41-4.58；Q4：2.55，95％CI：1.40-4.64；P-趋势：0.003)(苯乙酰谷氨酰胺是苯丙氨酸的肠道微生物组代谢物)也与致死性前列腺癌相关，不过马尿酸和硫酸对甲酚的升高则不然。

方法：

前列腺、肺、结直肠和卵巢(PLCO)队列

PLCO癌症筛查试验是基于群体的大型随机对照试验，旨在评价在年龄为55至74岁的男性和女性中癌症筛查的影响。²⁵在1993年11月至2001年7月之间，美国的十个筛查中心招募了76,685名男性，将他们随机分配至干预组或对照组。干预组的男性在试验的前六年通过PSA和直肠指检接受了PCa筛查，此后至少进行了七年的随访。试验数据收集到2009年12月，包括基线血液样品采集(癌症诊断前)、人口统计信息和筛查结果。该试验的主要终点是癌症特异性死亡率，尽管检查了与癌症筛查和发病率相关的多个次要终点。到2015年，通过管理年度研究更新问卷、医师或家庭报告或通过进行国家死亡指数加搜索来收集参与者死亡数据。然后进行死亡审查过程以评价所有死亡并确定PLCO癌症是否是其原因。²⁶

嵌套病例对照研究设计

我们采用了嵌套病例对照设计。分析了来自173个致死性PCa病例和519个无致死性PCa的对照的基线血清标本。从以前未被诊断为PCa的分配到PLCO试验的干预组的男性收集样品。所述173个病例代表可获得诊断前样品的干预组中的所有PCa死亡。在死亡时，将病例以1∶3的比率与相应风险中的随机选择的活体受试者进行匹配，所述风险在种族、年龄(2年内)、基线抽血时间(6个月内)和招募日期(1年内)的基础上设定。这项研究旨在鉴定致死性疾病的潜在驱动因素，因此使用严格的风险集采样来关注致死性PCa。

根据明显健康受试者血清中的分析物水平的单一基线测量，将胆碱、肉碱、甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、巴豆甜菜碱、TMAO、PAGln、马尿酸和硫酸对甲酚的血清水平进行定量，然后对所述受试者前瞻性地随访PCa的伴随发生。通过国家癌症研究所和克利夫兰诊所机构审查委员会获得研究批准。

用于代谢组学分析的试剂

d₉-[N，N，N-三甲基]胆碱(d₉-胆碱)、L-肉碱：HCL(甲基-D3，d₃-肉碱)、d₉-三甲胺N-氧化物(d₉-TMAO)、马尿酸(苯甲酰基-D5，d₅-马尿酸)和对甲酚硫酸钾盐(D7，d₇-硫酸对甲酚)从剑桥同位素实验室(Andover，MA)购买。硫酸对甲酚(钾盐)从开曼化学公司(AnnArbor，MI)购买。d₉-[N，N，N-三甲基]-甜菜碱(d₉-甜菜碱)和Nα-(苯基-d5-乙酰基)-L-谷氨酰胺(d₅-苯乙酰谷氨酰胺)从C/D/N同位素公司(Quebec，Canada)购买。d₉-[N，N，N-三甲基-γ-丁酰甜菜碱(d₉-γ-丁酰甜菜碱)和d₉-[N，N，N-三甲基]-巴豆甜菜碱(d₉-巴豆甜菜碱)如前所述合成。^27-29所有其他试剂均以HPLC级从西格玛奥德里奇公司(St.Louis，MO)或赛默飞世尔科技公司(Pittsburgh，PA)购买。

代谢组学分析

将20μl血浆与含有同位素标记的内标混合物的80μl冷甲醇混合，所述内标混合物由d₉-胆碱、d₉-TMAO、d₉-甜菜碱、d₃-肉碱、d₉-γ-丁酰甜菜碱、d₉-巴豆甜菜碱、d₇-硫酸对甲酚、d₅-苯乙酰谷氨酰胺和d₅-马尿酸(各5μM)组成。将混合物涡旋并在4℃下以20,000g离心10分钟。使用与Thermo Quantiva质谱仪(Thermo Scientific)和TSQ Quantiva三重四极杆质谱仪(Thermo Scientific)接口的Vanquish高效液相色谱(HPLC)系统，以0.25ml/min的流速将0.2μl上清液上样到二氧化硅(150×2mm，00F-4274-B0，Phenomenx)上。使用由两种溶剂(A：在水中的0.1％丙酸，B：在甲醇中的0.1％乙酸)以0.25ml/min的流速生成的液相色谱(LC)梯度来解析分析物。在LC/MS/MS系统上依次连续运行样品，其中实验室人员对于样品的病例状态来说是设盲的。

使用电喷雾电离(ESI)在正离子模式下(使用负离子模式的硫酸对甲酚除外)监测靶向代谢物和同位素标记的内标，其中如以前报道对前体和特征产物离子跃迁进行多反应监测(MRM)。^30，31针对单个代谢物和内标优化了离子监测的参数。使用氩气作为碰撞诱导解离(CID)气体，否则使用氮气(纯度99.95％)。

将各种浓度的标准品与固定浓度的同位素标记的内标混合物混合，以制备用于定量目标分析物的校准曲线。用于胆碱、肉碱、甜菜碱、γ-丁酰甜菜碱、巴豆甜菜碱、PAGln、马尿酸和硫酸对甲酚定量的标准曲线如图14中所示。所有分析物的定量曲线的误差均小于5％，证明了这种分析方法的可靠性。

统计分析

通过四分位数分析血清测量值，其中对照中的分析物水平的分布用于确定四分位数(Q)阈值。在调节病例状态并调整PSA和BMI之后，使用多变量条件逻辑回归分析评估了分析物水平与致死性PCa的关联。对于营养素和代谢物水平的每个四分位数，报告了发生致死性PCa的优势比(OR)和95％置信区间(95％CI)，其中第一四分位数(Q1)用作参考。还使用Cochran-Armitage检验基于四分位数中值评估了增加的OR趋势。对于在病例和对照之间的其他比较，报告了中值和四分位距(IQR)或计数和百分比，尽管显著性是基于其中提供p值的单变量条件逻辑回归。利用显著性阈值0.05，使用R(版本3.6.3)进行所有分析。

结果

分析了按年龄和种族良好匹配的173个致死性PCa病例和519个对照(表3)。

表3.基线临床和病理特征^a

缩写：BMI，体重指数；PSA，前列腺特异性抗原；IQR，四分位距

^a除非另有说明，否则将数据呈现为病例或对照的数量(百分比)

^b使用单变量条件逻辑回归进行的显著性检验

^c用于在病例死亡时匹配受试者的患者因素，作为严格风险集采样的一部分

^d报告的数量代表经历前列腺癌分期评价但缺少临床信息的病例或对照，或适当避免活检和/或分期评价的对照

少数对照在观察期结束时被诊断患有非致死性PCa(16.4％[85/519])。在病例和对照之间，最接近PCa诊断的PSA水平中值是相似的(7.3与5.8ng/dL，P＝0.06)。大多数致死性前列腺癌在临床T2期被诊断，相比之下，少数非致死性癌症被诊断(57％[94/165]与36％[30/83])。

使用条件单变量逻辑回归建模，比较了TMA相关营养素的中位基线水平(表4)。

表4.血清分析物水平的分布和趋势评估^a

代谢物，uM	对照(n＝519)	病例(n＝173)	P-值<sup>b</sup>	P-趋势<sup>c</sup>
					胆碱	13.1(11.0-16.0)	13.9(12.1-16.9)	0.003	0.005
肉碱	41.0(34.0-48.3)	42.3(36.2-50.5)	0.03	0.08
					甜菜碱	42.8(35.6-54.0)	46.1(37.3-54.7)	0.46	0.11
γ-丁酰甜菜碱	0.63(0.53-0.79)	0.67(0.56-0.82)	0.29	0.11
					巴豆甜菜碱	0.07(0.06-0.09)	0.07(0.06-0.10)	0.34	0.73
TMAO	3.63(2.46-5.72)	4.00(2.92-6.21)	0.07	0.16
					PAGln	1.75(0.96-3.03)	2.13(1.27-3.40)	0.002	0.003
马尿酸	2.38(1.07-4.99)	2.66(1.21-5.00)	0.99	0.51
					硫酸对甲酚	15.0(7.5-27.6)	19.7(10.6-31.7)	0.01	0.01

简称：TMAO，三甲胺N-氧化物；PAGln，苯乙酰谷氨酰胺；IQR，四分位距

^a血清分析物浓度呈现为中值(IQR)

^b基于针对在基线样品收集时测量的体重指数(BMI)和前列腺特异性抗原(PSA)调整的多变量条件逻辑回归

^c使用Cochran-Armitage检验基于四分位数中值评估了增加的OR趋势。

在发生伴随的致死性PCa的受试者(病例)中相比于未发生致死性PCa者(对照)中的胆碱(13.9与13.1uM，P＝0.003)和肉碱(42.3与41.0uM，P＝0.03)更高。关于甜菜碱(46.1与42.8uM，P＝0.46)、γ-丁酰甜菜碱(0.67与0.63uM，P＝0.29)、巴豆甜菜碱(0.07与0.07uM，P＝0.34)或TMAO(4.00与3.63uM，P＝0.07)的基线循环水平，在病例和对照之间未观察到统计学显著性差异。有趣的是，肠道微生物群衍生的代谢物PAGln(2.13uM与1.75uM，P＝0.002)和硫酸对甲酚(19.7与15.0uM，P＝0.01)的基线水平在随后发生致死性PCa的男性中较高，而马尿酸的基线水平(2.66与2.38uM，P＝0.99)在病例和对照之间相似。

跨分析物四分位数评价了肠道微生物群依赖性代谢物TMAO的营养素前体与致死性PCa风险之间的关联(图12)。值得注意的是，在针对PSA和BMI调整的条件多变量逻辑回归模型中，具有较高的胆碱(Q3 OR：2.37，95％CI：1.35-4.17；Q4 OR：2.19，95％CI：1.23-3.90)或甜菜碱(Q3 OR：2.13，95％CI：1.22-3.70；Q4 OR：1.86，95％CI：1.05-3.30)的基线血清水平的参与者表现出增加的发生致死性PCa(相对于Q1)的几率。致死性PCa风险跨胆碱的四分位数以剂量依赖性方式增加(P趋势：0.005)，随着甜菜碱的分位数增加未观察到这一趋势(P趋势：0.11)。在这个模型中，肉碱的较高基线血清水平与致死性PCa不一致，只有Q2(OR：1.95，95％CI：1.12-3.39)和Q4(OR：2.00，95％CI：1.13-3.56)实现统计显著性(P趋势：0.08)。监测的其他TMA相关分析物均未显示出与伴随的致死性PCa显著关联，所述分析物包括γ-丁酰甜菜碱(Q4 OR：1.35，95％CI：0.76-2.37；P趋势：0.11)、巴豆甜菜碱(Q4 OR：0.99，95％CI：0.59-1.66；P趋势：0.73)和TMAO(Q4 OR：1.46，95％CI：0.86-2.50；P趋势：0.16)。

芳香族氨基酸分解代谢的肠道微生物群依赖性代谢物也是分析的目标(图13)。值得注意的是，在针对BMI和PSA进行调整的条件回归模型中，具有较高的基线PAGln的血清水平的参与者(Q3：2.54，95％CI：1.41-4.58；Q4：2.55，95％CI：1.40-4.64)表现出增加的发生伴随的致死性PCa的几率(相对于Q1)。PCa特异性死亡的风险通常跨PAGln的四分位数增加，表明了剂量依赖性关系(P趋势：0.003)。在上述模型中，更高水平的马尿酸(Q3：1.79，95％CI：1.04-3.09：Q4 OR：1.49，95％CI：0.84-2.62；P趋势：0.51)和硫酸对甲酚(Q3：1.70，95％CI：1.00-2.90；Q4 OR：1.56，95％CI：0.92-2.64；P趋势：0.01)与致死性PCa风险增加的相关不一致。

饮食、肠道微生物组和宿主代谢对人疾病的影响日益明显。^32-35在这项嵌套病例对照研究中，我们表明具有较高的胆碱、甜菜碱或PAGln水平的男性在以后被诊断为伴随的致死性PCa的几率大约为两倍(相对于Q1)。虽然以前的研究已经将胆碱、TMAO或两者与肿瘤风险相关联，但属于这类研究的本研究首次证明，对肠道微生物群具有强制性要求的代谢物(例如PAGln)和产生微生物组相关代谢物的营养素前体(例如胆碱和甜菜碱)与致死性PCa的风险增加相关。^17，18，21

PAGln的高血清浓度与致死性PCa的显著关联是令人感兴趣的。PAGln是膳食苯丙氨酸的肠道微生物群依赖性代谢物，其中苯丙氨酸是经由膳食蛋白质消耗的氨基酸。³⁶苯丙氨酸通过消化蛋白酶释放，并且主要在小肠中吸收。然而，一些苯丙氨酸到达大肠，其中厌氧微生物在PAGln产生中起重要作用。³⁷Nemet等人采用遗传和药理学研究来明确证明这种肠道微生物群衍生的代谢物通过多个肾上腺素能受体(α2A、α2B和β2肾上腺素能受体)在宿主中发信号。²⁴事实上，在多个细胞系统和动物模型研究中，PAGln促进的许多心血管相关效应被β阻断剂削弱。²⁴因此，高度相关的是，特别是通过β2肾上腺素能受体的交感神经信号传导已被证明通过使细胞凋亡失调、增强细胞迁移、增加转移潜能以及加速在某些肿瘤中观察到的上皮-间质转化来增加PCa侵袭性。³⁸而且，最近的荟萃分析检验了16,825位患者，这些患者的β阻断剂使用与较低的PCa特异性死亡率相关(HR：0.85，95％CI：0.77-0.95)。³⁹

本研究最引人注目的发现之一是，胆碱和甜菜碱(但不是肉碱、γ-丁酰甜菜碱和巴豆甜菜碱或TMAO)的基线水平预测了致死性PCa的伴随风险增加，这表明肿瘤风险的这种升高与肠道微生物组相关代谢无关。先前的一份报告将胆碱摄入量增加与更大的致死性PCa风险相关联，而以前的一项嵌套病例对照研究将更高水平的血清胆碱与任何(致死性或非致死性)前列腺癌诊断的几率增加联系起来。^11，40胆碱可能与肿瘤发生有关，因为它用作各种磷脂(包括磷脂酰胆碱)的结构组分，使这种营养素对维持细胞膜和癌症生长至关重要。⁴¹另外，磷脂酰胆碱可被代谢为信号分子(比如磷酸胆碱和二酰基甘油)，其转换为细胞生长的有丝分裂命令。⁴²还观察到胆碱代谢在PCa中的失调，特别是当胆碱激酶(一种促进磷脂酰胆碱生物合成中的限速步骤的酶)过表达时。⁴³鉴于使用基于胆碱(¹¹C-胆碱和¹⁸F-胆碱)的PET成像来重演具有恶性潜能增加的PCa的临床效用，胆碱代谢中的这些改变特别有意义。^44-47

胆碱氧化产物甜菜碱的血清升高也与致死性PCa相关。甜菜碱在产生S-腺苷甲硫氨酸的途径中充当甲基供体，S-腺苷甲硫氨酸是介导DNA和组蛋白甲基化的底物。⁴⁸虽然我们的研究首次将基线甜菜碱水平升高与致死性PCa正相关，但其他评价饮食摄入的研究得出结论，更多的甜菜碱消耗提供了免于致死性PCa的保护。⁴⁹有趣的是，元有机体(涉及细菌和宿主两者)甜菜碱和胆碱代谢已被证明改变全局DNA甲基化模式，诱导表观遗传变化，甚至影响啮齿动物模型中的后代的行为。^50，51

胆碱、甜菜碱和PAGln与致死性PCa风险增加独立相关的发现对PCa风险调整和筛查具有潜在意义。如果这些关联在独立的临床研究中得到证实，可能对于具有这些分析物水平升高的男性能够考虑饮食或药理学风险降低策略，所述策略调节元有机体胆碱、甜菜碱或苯丙氨酸代谢。还由此得出，前瞻性研究可能调查胆碱、甜菜碱和PAGln水平的评估是否有助于鉴定可能需要更早开始PSA筛查的患者。在这项研究中，大部分致死性PCa患者患有GS 7疾病，这表明在权衡中等风险患者中的主动监测的资格时，可以考虑这些分析物的水平。

当针对PSA和BMI进行调整时，胆碱和甜菜碱的基线血清升高与伴随的致死性PCa相关，其中致死性PCa与TMAO途径中的其他营养素和代谢物无关。这种关联也与较高的PAGln循环水平一起显示，其中PAGln是一种苯丙氨酸代谢物，由肠道微生物群代谢产生，其经由肾上腺素能受体发信号。

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尽管只有少数示例性实施方案已经详细描述，但本领域技术人员将容易理解的是，在示例性实施方案中的许多修改是可能的，所述修改在实质上不脱离本公开的新的教导和优点。因此，所有此类修改和替代方案预期均被包括在以下权利要求书中定义的本发明范围内。本领域技术人员还应当认识到，此类修改和等效构造或方法不脱离本公开的精神和范围，并且它们可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下在本文中进行各种改变、取代和变更。

Claims

1.一种基于来自受试者的样品中的至少苯乙酰谷氨酰胺(PAG)的水平进行活动的方法，所述方法包括：

a)确定来自受试者的样品中的至少一种化合物的水平，其中所述至少一种化合物包括PAG，并且其中任选地所述受试者无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有II型糖尿病；和

b)进行以下活动的至少一项：

i)鉴定相比于对照水平增加的在所述样品中的所述至少一种化合物的水平，并用以下治疗所述受试者：

A)治疗心血管疾病(CVD)、哮喘、心力衰竭和/或血栓形成的第一种剂或第一程序，其中所述受试者无CKD和/或患有糖尿病；

B)选自以下的第二种剂：β-肾上腺素能阻断剂、α2肾上腺素能受体激动剂、α2肾上腺素能受体拮抗剂以及抗生素或抗生素混合物；和/或

C)选自以下的第三种剂或第二程序：前列腺癌治疗剂、近距离放射疗法、放射疗法和前列腺切除术，

ii)生成和/或传输报告，所述报告指示在所述样品中的所述至少一种化合物的水平相比于对照水平升高并且指示所述受试者患有CVD、血栓形成、哮喘、致死性前列腺癌和/或心力衰竭或有患CVD、血栓形成、哮喘、致死性前列腺癌和/或心力衰竭的风险，并且可通过以下进行治疗：A)所述β-肾上腺素能阻断剂，和/或B)所述α2肾上腺素能受体激动剂，和/或C)所述α2肾上腺素能受体拮抗剂和/或D)所述抗生素或抗生素混合物；和/或E)所述第三种剂或第二程序；

iii)生成和/或传输指示在所述样品中的所述至少一种化合物的水平相比于对照水平升高并且指示所述受试者需要所述第一种剂、所述第二种剂和/或所述第一程序和/或第三种剂或第二程序的报告；

iv)生成和/或传输指示所述受试者无CKD和/或患有糖尿病的报告，其中所述报告指示在所述样品中的所述至少一种化合物的水平相比于对照水平升高，并且指示所述受试者患有心血管疾病、血栓形成、致死性前列腺癌和/或心力衰竭或有患心血管疾病、血栓形成、致死性前列腺癌和/或心力衰竭的风险；和

v)基于发现在所述样品中的所述至少一种化合物的水平相比于对照水平升高，将无CKD和/或患有糖尿病的所述受试者表征为患有CVD、血栓形成和/或心力衰竭或有患CVD、血栓形成和/或心力衰竭的风险，或将所述受试者表征为患有致死性前列腺癌或有患致死性前列腺癌的风险。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种化合物还包括三甲胺-n-氧化物(TMAO)。

3.如权利要求1所述的方法，其中：i)所述受试者患有心力衰竭、哮喘或心血管疾病，并且其中所述至少一种化合物还包括N6-三甲基-赖氨酸(TML)和/或TMAO，或ii)所述受试者患有前列腺癌，并且所述至少一种化合物还包括PSA、胆碱和/或甜菜碱。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种化合物还包括TMAO和TML。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述样品选自由以下组成的组：血浆样品、血清样品、全血样品和尿液样品。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述确定包括用选自以下的分析装置检测所述至少一种化合物：质谱仪、NMR光谱仪和UV/Vis光谱仪。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述确定包括使所述样品与抗PAG抗体或其PAG结合片段接触。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述β-肾上腺素能阻断剂选自：盐酸醋丁洛尔、阿替洛尔、盐酸倍他洛尔、富马酸比索洛尔、盐酸卡替洛尔、盐酸艾司洛尔、美托洛尔、硫酸喷布洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、马来酸噻吗洛尔、盐酸索他洛尔、卡维地洛和盐酸拉贝洛尔。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述α2肾上腺素能受体激动剂选自：可乐定、右美托咪定、法多米定、胍法辛、胍那苄、胍诺沙苄、胍乙啶、赛拉嗪、替扎尼定、美托咪定、甲基多巴、甲基去甲肾上腺素、去甲肾上腺素、(R)-3-硝基联苯茚二酮、阿米曲士、地托咪定、洛非西定和美托咪定。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述α2肾上腺素能受体拮抗剂选自：阿替美唑、依法克生、咪唑克生、育亨宾、萝芙素和酚妥拉明。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述第一种剂选自由以下组成的组：抗凝剂、抗血小板剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、钙通道阻断剂、降胆固醇药物、他汀类药物、洋地黄制剂、利尿剂和血管扩张剂。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述抗生素是选自由以下组成的组的至少一种抗生素：甲硝唑、环丙沙星、新霉素、万古霉素、阿莫西林和广谱抗生素；并且其中所述受试者没有活动性感染。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是患有前列腺癌、心血管疾病、哮喘或心力衰竭或有患前列腺癌、心血管疾病、哮喘或心力衰竭的风险的人。

14.一种治疗方法，所述方法包括：

a)将受试者鉴定为具有相比于对照水平增加的至少一种化合物的水平，其中所述至少一种化合物包括苯乙酰谷氨酰胺(PAG)；和

b)用以下的至少一种治疗所述受试者：

i)治疗心血管疾病(CVD)、心力衰竭、哮喘和/或血栓形成的第一种剂或程序，其中所述受试者无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有糖尿病，

ii)选自以下的第二种剂：β-肾上腺素能阻断剂、α2肾上腺素能受体激动剂和α2肾上腺素能受体拮抗剂，

iii)抗生素或抗生素混合物，其中所述受试者没有活动性感染；

iv)选自以下的第三种剂或第二程序：前列腺癌治疗剂、近距离放射疗法、放射疗法和前列腺切除术。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述鉴定包括接收所述受试者相比于对照具有增加的PAG水平的报告。

16.如权利要求14所述的方法，其中所述至少一种化合物还包括PSA、胆碱和/或甜菜碱，并且所述受试者患有前列腺癌。

17.如权利要求14所述的方法，其中所述受试者是患有心力衰竭、哮喘、心血管疾病或前列腺癌的人。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述β-肾上腺素能阻断剂选自：盐酸醋丁洛尔、阿替洛尔、盐酸倍他洛尔、富马酸比索洛尔、盐酸卡替洛尔、盐酸艾司洛尔、美托洛尔、硫酸喷布洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、马来酸噻吗洛尔、盐酸索他洛尔、卡维地洛和盐酸拉贝洛尔。

19.如权利要求14所述的方法，其中所述α2肾上腺素能受体激动剂选自：可乐定、右美托咪定、法多米定、胍法辛、胍那苄、胍诺沙苄、胍乙啶、赛拉嗪、替扎尼定、美托咪定、甲基多巴、甲基去甲肾上腺素、去甲肾上腺素、(R)-3-硝基联苯茚二酮、阿米曲士、地托咪定、洛非西定和美托咪定。

20.如权利要求14所述的方法，其中所述α2肾上腺素能受体拮抗剂选自：阿替美唑、依法克生、咪唑克生、育亨宾、萝芙素和酚妥拉明。

21.如权利要求14所述的方法，其中所述第一种剂选自由以下组成的组：抗凝剂、抗血小板剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、钙通道阻断剂、降胆固醇药物、他汀类药物、洋地黄制剂、利尿剂和血管扩张剂。

22.如权利要求14所述的方法，其中所述抗生素是选自由以下组成的组的至少一种抗生素：甲硝唑、环丙沙星、新霉素、万古霉素、阿莫西林和广谱抗生素；并且其中所述受试者没有活动性感染。

23.如权利要求14所述的方法，其中所述受试者患有心力衰竭、哮喘或心血管疾病，并且其中所述至少一种化合物还包括三甲胺-n-氧化物(TMAO)和/或N6-三甲基-赖氨酸(TML)。

24.一种检测样品中的至少一种化合物的方法，所述方法包括：

a)获得样品，其中所述样品来自任选地无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有糖尿病的人受试者；和

b)在使得至少一种化合物的浓度得以确定的条件下处理所述样品，其中所述至少一种化合物包括苯乙酰谷氨酰胺(PAG)。

25.如权利要求24所述的方法，其中通过质谱法确定所述样品中的所述PAG的所述浓度。

26.如权利要求24所述的方法，其中所述其中所述受试者患有心力衰竭、哮喘、心血管疾病或前列腺癌。

27.如权利要求24所述的方法，其中所述至少一种化合物还包括三甲胺-n-氧化物(TMAO)和/或N6-三甲基-赖氨酸(TML)和/或PSA和/或胆碱和/或甜菜碱。

28.一种系统或药盒，其包括：

a)患有心血管疾病、心力衰竭、哮喘、血栓形成和/或前列腺癌的受试者的报告，其中所述报告指示所述患者具有升高的至少一种化合物的水平，其中所述至少一种化合物包括苯乙酰谷氨酰胺(PAG)；和

b)下述的至少一种：

i)治疗CVD、心力衰竭和/或血栓形成的第一种剂，其中所述受试者无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有糖尿病，

iii)抗生素或抗生素混合物，其中所述受试者没有活动性感染，和

iv)前列腺癌治疗剂。

29.如权利要求28所述的系统，其中所述受试者是人。

30.如权利要求28所述的系统，其中所述β-肾上腺素能阻断剂选自：盐酸醋丁洛尔、阿替洛尔、盐酸倍他洛尔、富马酸比索洛尔、盐酸卡替洛尔、盐酸艾司洛尔、美托洛尔、硫酸喷布洛尔、纳多洛尔、奈必洛尔、吲哚洛尔、普萘洛尔、马来酸噻吗洛尔、盐酸索他洛尔、卡维地洛和盐酸拉贝洛尔。

31.如权利要求28所述的系统，其中所述α2肾上腺素能受体激动剂选自：可乐定、右美托咪定、法多米定、胍法辛、胍那苄、胍诺沙苄、胍乙啶、赛拉嗪、替扎尼定、美托咪定、甲基多巴、甲基去甲肾上腺素、去甲肾上腺素、(R)-3-硝基联苯茚二酮、阿米曲士、地托咪定、洛非西定和美托咪定。

32.如权利要求28所述的系统，其中所述α2肾上腺素能受体拮抗剂选自：阿替美唑、依法克生、咪唑克生、育亨宾、萝芙素和酚妥拉明。

33.如权利要求28所述的系统，其中所述第一种剂选自由以下组成的组：抗凝剂、抗血小板剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、钙通道阻断剂、降胆固醇药物、他汀类药物、洋地黄制剂、利尿剂和血管扩张剂。

34.如权利要求28所述的系统，其中所述抗生素是选自由以下组成的组的至少一种抗生素：甲硝唑、环丙沙星、新霉素、万古霉素、阿莫西林和广谱抗生素；并且其中所述受试者没有活动性感染。

35.如权利要求28所述的系统，其中所述至少一种化合物还包括三甲胺-n-氧化物(TMAO)和/或N6-三甲基-赖氨酸(TML)和/或PSA和/或胆碱和/或甜菜碱。

36.一种检测血清或血浆样品中的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)的方法，所述方法包括：

a)获得血浆或血清样品，其中所述血浆或血清样品来自无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有II型糖尿病的人受试者；

b)在使得所述血浆或血清样品中存在的PAG的浓度得以确定的条件下将至少一部分所述血浆或血清样品引入分析装置中，

其中所述分析装置包括：i)NMR光谱仪、UV/Vis光谱仪或质谱仪，ii)在确定所述浓度之前提供所述PAG的物理分离的设备，和iii)基于抗PAG抗体的检测系统；以及

c)如果所述血浆或血清样品中的PAG的所述水平高于第一最小值，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常，其中所述最小值为至少4.9μM或至少3.8μM，其中所述疾病选自由心力衰竭、哮喘、心血管疾病或血栓形成组成的组。

37.如权利要求36所述的方法，其还包括确定来自受试者的样品中的三甲胺N-氧化物(TMAO)的水平，并且当所述TMAO水平高于第二最小值时，以图形显示所述受试者的所述疾病风险高于正常，其中所述第二最小值为至少2.2μM。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述第二最小值为至少2.5μM。

39.如权利要求36所述的方法，其中所述第二最小值为至少3.0μM。

40.如权利要求36所述的方法，其中所述第二最小值为至少4.0μM。

41.如权利要求36所述的方法，其中所述第二最小值为至少5.0μM。

42.如权利要求36所述的方法，其还包括确定来自受试者的样品中的N6-三甲基-赖氨酸(TML)的水平，并且当所述TML水平高于第二最小值时，以图形显示所述受试者的所述疾病风险高于正常，其中所述第二最小值为至少0.4μM。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述第二最小值为至少0.5μM。

44.如权利要求42所述的方法，其中所述第二最小值为至少0.6μM。

45.如权利要求42所述的方法，其中所述第二最小值为至少0.7μM。

46.如权利要求42所述的方法，其中所述第二最小值为至少0.8μM。

47.一种检测样品中的至少三种化合物的方法，所述方法包括：

a)获得样品，其中所述样品来自人受试者；以及

b)在使得至少以下三种化合物的浓度得以确定的条件下处理所述样品：苯乙酰谷氨酰胺(PAG)、N6-三甲基-赖氨酸(TML)和三甲胺N-氧化物(TMAO)。

48.如权利要求48所述的方法，其还包括：c)如果所有下述三者都存在，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常：

i)在所述样品中的PAG的所述水平高于来自一般群体或无疾病组的对照PAG值；

ii)在所述样品中的所述TMAO水平高于来自一般群体或无疾病组的对照TMAO值；和

iii)在所述样品中的所述TML水平高于来自一般群体或无疾病组的对照TML值；并且

其中所述疾病选自由心力衰竭、心血管疾病、肾脏疾病、哮喘或血栓形成组成的组。

49.如权利要求48所述的方法，其还包括：c)如果所有下述三者都存在，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常：

i)在所述样品中的PAG的所述水平高于第一最小值，其中所述最小值为至少3.9或4.9μM，

ii)所述TMAO水平高于第二最小值，其中所述第二最小值为至少2.2或5.0μM；和

iii)所述TML水平高于第三最小值，其中所述第二最小值为至少0.4μM或0.6；并且

50.一种检测血清或血浆样品中的苯乙酰谷氨酰胺(PAG)的方法，所述方法包括：

a)获得血浆或血清样品，其中所述血浆或血清样品来自任选地无慢性肾脏疾病(CKD)和/或患有II型糖尿病的人受试者；

其中所述分析装置包括：i)NMR光谱仪、UV/Vis光谱仪或质谱仪，ii)在确定所述浓度之前提供所述PAG的物理分离的设备；和iii)基于抗PAG抗体的检测系统；以及

c)如果所述血浆或血清样品中的PAG的所述水平高于第一最小值，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常，其中所述最小值为至少1.0μM或至少3.0μM，其中所述疾病选自由前列腺癌和致死性前列腺癌组成的组。

51.如权利要求51所述的方法，其还包括确定来自受试者的样品中的胆碱的水平，并且当所述胆碱水平高于第二最小值时，以图形显示所述受试者的所述疾病风险高于正常，其中所述第二最小值为至少11.0μM。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述第二最小值为至少13.0μM。

53.如权利要求51所述的方法，其中所述第二最小值为至少14.0μM。

54.如权利要求51所述的方法，其中所述第二最小值为至少15.0μM。

55.如权利要求51所述的方法，其中所述第二最小值为至少17.0μM。

56.如权利要求51所述的方法，其还包括确定来自受试者的样品中的甜菜碱的水平，并且当所述甜菜碱水平高于第二最小值时，以图形显示所述受试者的所述疾病风险高于正常，其中所述第二最小值为至少35.6μM。

57.如权利要求57所述的方法，其中所述第二最小值为至少42.8μM。

58.如权利要求57所述的方法，其中所述第二最小值为至少54.0μM。

59.如权利要求57所述的方法，其中所述第二最小值为至少54.7μM。

60.如权利要求57所述的方法，其中所述第二最小值为至少55.0μM。

61.一种检测样品中的至少三种或四种化合物的方法，所述方法包括：

a)获得样品，其中所述样品来自人受试者；以及

b)在使得至少以下三种化合物：苯乙酰谷氨酰胺(PAG)、胆碱和甜菜碱以及任选的第四种化合物：前列腺特异性抗原(PSA)的浓度得以确定的条件下处理所述样品。

62.如权利要求62所述的方法，其还包括：c)如果所有下述三者都存在，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常：

ii)在所述样品中的所述胆碱水平高于来自一般群体或无疾病组的对照胆碱值；和

iii)在所述样品中的所述甜菜碱水平高于来自一般群体或无疾病组的对照TML值；和

iv)并且任选地，在所述样品中的所述PSA水平高于来自一般群体或无疾病组的对照PSA值；并且

其中所述疾病选自由前列腺癌和致死性前列腺癌组成的组。

63.如权利要求63所述的方法，其还包括：c)如果所有下述三者都存在，则以图形显示所述受试者患有疾病的风险高于正常：

ii)所述胆碱水平高于第二最小值，其中所述第二最小值为至少11.0或13.0μM；和

iii)所述甜菜碱水平高于第三最小值，其中所述第二最小值为至少35.6μM或42.8；并且

其中所述疾病选自由前列腺癌和致死性前列腺癌组成的组。