BRPI0815095B1 - Método de classificação de um indivíduo de acordo com a tolerância à glicose predita em tolerância à glicose normal (ngt), tolerância à glicose de jejum prejudicada (ifg), ou tolerância à glicose prejudicada (igt), para diabetes tipo 2, método de determinação da suscetibilidade de um indivíduo a diabetes tipo 2 e método de monitoramento da progressão ou regressão do pré- diabetes em um indivíduo - Google Patents

Método de classificação de um indivíduo de acordo com a tolerância à glicose predita em tolerância à glicose normal (ngt), tolerância à glicose de jejum prejudicada (ifg), ou tolerância à glicose prejudicada (igt), para diabetes tipo 2, método de determinação da suscetibilidade de um indivíduo a diabetes tipo 2 e método de monitoramento da progressão ou regressão do pré- diabetes em um indivíduo Download PDF

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Costel Chirila
Danny Alexander
Michael Milburn
Matthew W. Mitchell
Walter Gall
Kay Lawton
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Abstract

métodos de predição da taxa de disponibilidade de glicose, método de classificação de acordo com a tolerância à glicose, método de determinação da suscetibilidade a diabetes tipo 2, método de determinação de um escore de resistência à insulina, método de monitoramento da progressão ou regressão do pré-diabetes, da eficácia do tratamento de resistência à insulina ou da resposta ao tratamento para pré-diabetes ou diabetes, método para predição da resposta ao tratamento para pré-diabetes ou diabetes. a presente invenção refere-se a um biomarcadores que se relacionam à resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose e cardimiopatia são fornecidos, bem como métodos para uso de tais biomarcadores como biomarcadores para resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose e cardiomiopatia. além disso, métodos para modulação das respectivos distúrbios ou condições de um individuo também são fornecidos. também são fornecidos grupos de entidades de molécula pequena como biomarcadores para resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose e cardiomiopatia.

Description

Referência a Pedidos de Patente Relacionados
[0001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisória US N° 60/950.286, depositado em 17 de julho de 2007, e do Pedido de Patente Provisória US N° 61/037.628, depositado em 18 de março de 2008, as totalidades dos quais são por isto incorporadas por referência neste pedido.
Campo
[0002] A presente invenção em geral refere-se a biomarcadores, métodos para identificar biomarcadores correlacionados à resistência à insulina, doença cardiovascular e desordens relacionadas à síndro- me metabólica e métodos baseados nos mesmos biomarcadores.
Antecedentes
[0003] Diabetes é classificado como tipo 1 (início precoce) ou tipo 2 (início adulto), com o tipo 2 compreendendo 90 a 95% dos casos de diabetes. Diabetes é o estágio final em um processo de doença que começa a afetar indivíduos muito antes do que o diagnóstico do diabetes seja feito. Diabetes tipo 2 desenvolve-se por mais de 10 a 20 anos e resulta de uma capacidade prejudicada de utilizar glicose (utilização de glicose) devido à sensibilidade à insulina prejudicada (resistência à insulina).
[0004] No pré-diabetes, a insulina torna-se menos eficaz em auxi- liar tecidos a metabolizar a glicose. Os pré-diabéticos podem ser de- tectáveis tão cedo quanto 20 anos antes dos sintomas diabéticos tornarem-se evidentes. Estudos mostraram que embora pacientes mostrem muito poucos sintomas, o dano fisiológico de longo prazo já está ocorrendo neste estágio. Até 60% destes indivíduos progredirão para diabetes tipo 2 em 10 anos.
[0005] A Associação Americana de Diabetes (ADA) recomendou a classificação de rotina para detectar pacientes com pré-diabetes. Métodos de classificação atuais para pré-diabetes incluem o teste de glicose plasmá-tica de jejum (GPJ), o teste de tolerância à glicose oral (OGTT), teste de insulina de jejum e clamp euglicêmico hiperinsulinê- mico (clamp HI). Os dois primeiros testes são usados clinicamente ao passo que os dois últimos testes são usados extensivamente em pesquisa, mas raramente na clínica. Além disso, meios matemáticos (por exemplo, HOMA, QUICKI) que consideram a glicose de jejum e níveis de insulina em conjunto foram propostos. Entretanto, concentrações de insulina plasmáticas normais variam consideravelmente entre indivíduos bem como em um indivíduo ao longo do dia. Além disso, estes métodos sofrem de variabilidade e diferenças metodológicas entre laboratórios e não se correlacionam rigorosamente com estudos de clamp de glicose.
[0006] No mundo inteiro, aproximadamente 194 milhões de adultos têm diabetes tipo 2 e este número é esperado aumentar para 333 milhões antes de 2025, basicamente devido à epidemia de obesidade em sociedades ocidentalizadas. Nos Estados Unidos, é estimado que mais de 54 milhões de adultos são pré-diabéticos, dependendo do nível de resistência à insulina. Há aproximadamente 1,5 milhões de novos casos de diabetes tipo 2 por ano nos Estados Unidos. O custo do sistema de saúde dos Estados Unidos anual do diabetes é estimado em US$ 174 bilhões. Este número subiu mais de 32% desde 2002. Em países industrializados, tais como os Estados Unidos, aproximadamente 25% das despesas médicas tratam o controle glicêmico, 50% está associado com a assistência médica geral associada com diabetes, e os 25% restantes dos custos vão para tratamento de complicações de longo prazo, principalmente doença cardiovascular. Considerando a distribuição dos custos do sistema de saúde e o fato de que a resistência à insulina é um fator causal direto em doença cardiovascular e progressão de diabetes, não é surpresa que a doença cardiovascular contabilize de 70 a 80% da mortalidade observada em pacientes diabéticos. Detectar e prevenir diabetes tipo 2 tornou-se uma prioridade principal do sistema de saúde.
[0007] Diabetes também pode levar ao desenvolvimento de outras doenças ou condições, ou é um fator de risco no desenvolvimento de condições, tais como Síndrome Metabólica e doenças cardiovasculares. Síndrome Metabólica é o agrupamento de um conjunto de fatores de risco em um indivíduo. De acordo com a Associação Americana do Coração estes fatores de risco incluem: obesidade abdominal, capacidade reduzida de processar apropriadamente a glicose (resistência à insulina ou intolerância à glicose), dislipidemia (triglicerídeos altos, colesterol LDL alto, HDL baixo), hipertensão, estado pró-trombótico (fi- brinogênio alto ou inibidor do ativador de plasminogênio-1 no sangue) e estado pró-inflamatório (elevada proteína C-reativa no sangue). Sín- drome Metabólica também é conhecida como síndrome X, síndrome de resistência à insulina, síndrome de obesidade, síndrome dismeta- bólica e síndrome de Reaven. Os pacientes diagnosticados com a Síndrome Metabólica estão em um risco aumentado de desenvolver diabetes, doença cardíaca e vascular. É estimado que, nos Estados Unidos, 20% dos adultos (> 50 milhões de pessoas) têm síndrome metabólica. Enquanto pode afetar qualquer um em qualquer idade, os aumentos de incidência com o aumento de idade e em indivíduos que são inativos, e significativamente com sobrepeso, especialmente com gordura abdominal excessiva.
[0008] Diabetes tipo 2 é a forma mais comum de diabetes nos Estados Unidos. De acordo com a Fundação Americana de Diabetes, mais de 90% dos diabéticos dos Estados Unidos sofrem de diabetes tipo 2. Indivíduos com o diabetes tipo 2 tem uma combinação de resistência à insulina aumentada e secreção de insulina reduzida que se combinam para causar hiperglicemia. A maioria das pessoas com diabetes tipo 2 têm Síndrome Metabólica.
[0009] O diagnóstico da Síndrome Metabólica é baseado no agrupamento de três ou mais dos fatores de risco em um indivíduo. Não há critério bem aceito para diagnosticar a síndrome metabólica. Os critérios propostos pelo Programa de Educação de Colesterol Nacional (NCEP) Painel de Tratamento Adulto III (ATP III), com modificações menores, são atualmente recomendados e largamente usados.
[00010] A Associação Americana do Coração e o Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue recomendam que a síndrome metabólica seja identificada como a presença de três ou mais destes componentes: circunferência de cintura aumentada (Homens--igual ou maior do que 102 cm (40 polegadas), Mulheres--igual ou maior do que 88 cm (35 polegadas); triglicerídeos elevados (igual ou maior do que 150 mg/dL); colesterol HDL ("bom") reduzido (Homens--menos do que 40 mg/dL, Mulheres--menos do que 50 mg/dL); pressão arterial elevada (igual ou maior do que 130/85 mm Hg); glicose de jejum elevada (igual ou maior do que 100 mg/dL).
[00011] Diabetes tipo 2 se desenvolve lentamente e muitas vezes pessoas primeiro descobrem que têm diabetes tipo 2 através de testes sanguíneos feitos para outra condição ou como parte de um exame de rotina. Em alguns casos, diabetes tipo 2 pode não ser detectado antes que danos aos olhos, rins ou outros órgãos tenham ocorrido. Uma ne- cessidade existe para um objetivo, avaliação bioquímica (por exemplo, teste de laboratório) que possa ser administrado por um prestador de cuidados primários para identificar indivíduos que estão em risco de desenvolver Síndrome Metabólica ou diabetes tipo 2.
[00012] Mais recentes, diagnósticos moleculares mais inovadores que refletem os mecanismos da progressão patofisiológica de pré- diabetes e diabetes são necessários porque a prevalência de pré- diabetes e diabetes está aumentando em proporções epidêmicas globais. Refletindo a epidemia de obesidade, pré-diabetes e diabetes são amplamente evitáveis mas são frequentemente não diagnosticadas ou diagnosticadas muito tarde devido à natureza assintomática da progressão para doença clínica.
[00013] Por isso, há uma necessidade não-encontrada de biomar- cadores e testes diagnósticos que possam identificar pré-diabéticos em risco de desenvolver diabetes tipo 2 e determinar o risco da progressão da doença em indivíduos com resistência à insulina. Os bio- marcadores de resistência à insulina e testes diagnósticos podem identificar melhor e determinar o risco de desenvolvimento de diabetes em um indivíduo pré-diabético, podem monitorar o desenvolvimento e progressão e/ou regressão de doença, podem permitir novos tratamentos terapêuticos serem desenvolvidos e podem ser usados para testar agentes terapêuticos para a eficácia em reversão de pré- diabetes e/ou prevenção de diabetes. Além disso, uma necessidade existe para biomarcadores diagnósticos para avaliar mais efetivamente a eficácia e segurança de candidatos terapêuticos pré-diabéticos e diabéticos.
Sumário da Invenção
[00014] Em uma modalidade, a presente descrição fornece um método de diagnóstico da resistência à insulina em um indivíduo, o método compreendendo análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de resistência à insulina na amostra, onde um ou mais biomarcadores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, 28, 29 e combinações dos mesmos; e comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra para níveis de referência de resistência à insulina positivos e/ou de resistência à insulina negativos de um ou mais biomarcadores a fim de diagnosticar se o indivíduo é resistente à insulina.
[00015] Em outra modalidade, a presente descrição fornece um método de predição da taxa de disponibilidade de glicose em um indivíduo, o método compreendendo análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcado- res de resistência à insulina na amostra, onde um ou mais biomarca- dores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, e combinações dos mesmos; e comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra a níveis de referência da disponibilidade de glicose de um ou mais bio- marcadores a fim de predizer a taxa de disponibilidade de glicose no indivíduo.
[00016] A descrição também fornece um método de classificação de um indivíduo de acordo com a tolerância à glicose a partir da tolerância à glicose normal (NGT), tolerância à glicose prejudicada de jejum (IFG), ou tolerância à glicose prejudicada (IGT), para diabetes tipo 2, o método compreendendo análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de tolerância à glicose na amostra, onde um ou mais biomarcadores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, e combinações dos mesmos; e comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra dos níveis de referência da tolerância à glicose de um ou mais biomarcadores a fim de classificar o in- divíduo como tendo NGT, IFG, IGT, ou diabético.
[00017] Além disso, é fornecido um método de determinação da suscetibilidade de um indivíduo para desenvolver diabetes tipo 2, o método compreendendo análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de pré-diabetes na amostra, onde um ou mais biomarcadores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, e combinações dos mesmos; e comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra aos níveis de referência positivos para diabetes e/ou negativos para diabetes de um ou mais biomarcadores a fim de diagnosticar se o indivíduo é suscetível a desenvolver diabetes tipo 2.
[00018] A presente descrição também fornece um método de determinação de um escore de resistência à insulina em um indivíduo, o método compreendendo, análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra, onde um ou mais biomarcadores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, e combinações dos mesmos; e comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra aos níveis de referência para resistência à insulina de um ou mais biomarcadores a fim de determinar um escore de resistência à insulina para o indivíduo.
[00019] Em outra modalidade, a presente descrição fornece um método de monitoramento da progressão ou regressão de pré-diabetes em um indivíduo, o método compreendendo análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de pré-diabetes na amostra, onde um ou mais biomar- cadores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, e combinações dos mesmos; e comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra de níveis de referência para progressão de pré-diabetes e/ou regressão de pré-diabetes de um ou mais biomarcadores a fim de monitorar a progressão ou regressão do pré-diabetes em um indivíduo.
[00020] Ainda em outra modalidade, a presente descrição fornece um método de monitoramento da eficácia do tratamento de resistência à insulina, o método compreendendo: análise de uma primeira amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de pré-diabetes, a primeira amostra obtida do indivíduo em um ponto de tempo inicial em que um ou mais biomarcadores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, e 8, e combinações dos mesmos; tratamento do indivíduo para resistência à insulina; análise de uma segunda amostra biológica do indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais bio- marcadores, a segunda amostra obtida do indivíduo em um segundo ponto de tempo após tratamento; comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na primeira amostra ao(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na segunda amostra para avaliar a eficácia do tratamento para tratar resistência à insulina.
[00021] A presente descrição fornece ainda um método de diagnóstico se um indivíduo tem síndrome metabólica, o método compreendendo análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de síndrome metabólica na amostra, onde um ou mais biomarcadores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 12 e 13, analisando a amostra biológica para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomar- cadores de disponibilidade de glicose, obesidade e/ou doença cardiovascular, em que um ou mais biomarcadores de disponibilidade de glicose, obesidade e/ou doença cardiovascular são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores identificados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e combinações dos mesmos; e comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra aos respectivos níveis de referência positivos para desordem e/ou negativos para desordem de um ou mais biomarcadores a fim de diagnosticar se o indivíduo tem a síndrome metabólica.
[00022] Em outra modalidade, a presente descrição fornece um método de diagnóstico de uma doença cardiovascular em um indivíduo, o método compreendendo análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de uma doença cardiovascular na amostra, onde um ou mais biomarcado- res são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, e combinações dos mesmos; e comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra aos níveis de referência positivos para doença e/ou negativos para doença de um ou mais biomarcadores para diagnosticar se o indivíduo tem cardiomiopatia ou aterosclerose.
[00023] A descrição fornece ainda um método para determinar se um indivíduo é predisposto a se tornar obeso, o método compreendendo: análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de obesidade na amostra, onde um ou mais biomarcadores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados na Tabela 26; e comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra para níveis de referência positivos para obesidade e/ou negativos para obesidade e/ou positivos para magreza e/ou negativos para magreza de um ou mais biomarcado- res a fim de determinar se o indivíduo é suscetível à obesidade.
[00024] Ainda em uma modalidade adicional, a descrição fornece um método para determinar se um agente terapêutico é capaz de induzir ganho de peso em um indivíduo, o método compreendendo: análise de uma amostra biológica de um indivíduo recebendo um agente terapêutico para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcado- res de obesidade na amostra, onde um ou mais biomarcadores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados na Tabela 26; e comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra para níveis de referência positivos para obesidade e/ou negativos para obesidade e/ou positivos para magreza e/ou negativos para magreza de um ou mais biomarcadores a fim de determinar se o indivíduo é suscetível ao ganho de peso.
[00025] A presente descrição também fornece um método para predizer a resposta de um indivíduo a um curso de tratamento para pré-diabetes ou diabetes, o método compreendendo: análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de pré-diabetes, onde um ou mais biomarca- dores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados na Tabela 27; comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcado- res na amostra para níveis de referência positivos para tratamento e/ou negativos para tratamento de um ou mais biomarcadores para predizer se o indivíduo provavelmente responderá a um curso de tra-tamento.
[00026] A descrição também fornece um método para monitoramento da resposta de um indivíduo a um tratamento para pré-diabetes ou diabetes, o método compreendendo: análise de uma primeira amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de pré-diabetes, a primeira amostra obtida do indivíduo em um primeiro ponto de tempo onde um ou mais biomarca- dores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados na Tabela 28; administração da composição ao indivíduo; análise de uma segunda amostra biológica do indivíduo para determinar o(s) ní- vel(is) de um ou mais biomarcadores, a segunda amostra obtida do indivíduo em um segundo ponto de tempo após administração da composição; comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na primeira amostra ao(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na segunda amostra para avaliar a eficácia da composição para tratar pré-diabetes ou diabetes.
Breve Descrição dos Desenhos
[00027] A figura 1 fornece um gráfico mostrando os valores de R2 médios da correlação Rd como uma função do número de metabólitos. Como o número de compostos aumenta (da direita para esquerda), o valor de r-quadrado da correlação Rd (Y) aumenta até que alcance um número ótimo (n < 30), indicando que a seleção variável é mais ou menos estável aproximadamente para as 30 primeiras variáveis.
[00028] A figura 2 fornece um gráfico mostrando os valores de R2 médios da correlação Rd como uma função do número de metabólitos. Como o número de compostos aumenta (da direita para esquerda), erro do teste de correlação Rd (Y) diminui até alcançar um número ótimo (n < 30), indicando que a seleção variável é mais ou menos estável aproximadamente para as primeiras 30 variáveis.
[00029] A figura 3 fornece um gráfico mostrando os valores R- quadrado médios (eixo Y) da correlação Rd como uma função do número de metabólitos (eixo X).
[00030] A figura 4 fornece um gráfico mostrando os valores de erro de teste médio (eixo Y) da correlação Rd como uma função do número de metabólitos (eixo X).
[00031] A figura 5 fornece um exemplo esquemático de um relatório que descreve os resultados de previsão de um algoritmo usando bio- marcadores de resistência à insulina para determinar o nível de resistência à insulina de um indivíduo que é relatada como um "Escore IR" e contendo informação clínica adicional (por exemplo, IMC, informação demográfica).
[00032] A figura 6 fornece uma ilustração esquemática comparando o uso de biomarcadores para estratificação de paciente de acordo com o nível da resistência à insulina e o uso de biomarcadores para estratificação de risco do paciente para a progressão de resistência à insulina.
[00033] A figura 7 fornece um gráfico de Importância de Análise de Floresta Randômica de uma modalidade de metabólitos que são bio- marcadores úteis para predição da disponibilidade de glicose.
[00034] A figura 8 fornece um Gráfico de Importância de Análise de Floresta Randômica de uma modalidade de metabólitos séricos que são biomarcadores úteis para predição da síndrome metabólica.
[00035] A figura 9 fornece um Gráfico de Importância de Análise de Floresta Randômica de uma modalidade de metabólitos plasmáticos que são biomarcadores úteis para predição da síndrome metabólica.
[00036] A figura 10 fornece Gráficos de Importância de Análise de Floresta Randômica de modalidades de metabólitos a partir do plasma que são biomarcadores úteis para predição da aterosclerose nos estágios da doença iniciais (iniciação) (Figura 10A), intermediário (Figura 10B), posterior (Figura 10C), ou todos (Figura 10D).
[00037] A figura 11 fornece Gráficos de Importância de Análise de Floresta Randômica de modalidades de metabólitos a partir do tecido da aorta que são biomarcadores úteis para predição da aterosclerose nos estágios da doença inicial (iniciação) (Figura 11A), intermediário (Figura 11B), posterior (Figura 11C), ou todos (Figura 11D).
[00038] A figura 12 fornece Gráficos de Importância de Análise de Floresta Randômica de modalidades de metabólitos a partir do tecido hepático que são biomarcadores úteis para predizer a aterosclerose nos estágios da doença inicial (iniciação) (Figura 12A), intermediário (Figura 12B), posterior (Figura 12C), ou todos (Figura 12D).
[00039] A figura 13 fornece um exemplo de níveis plasmáticos de colesterol em indivíduos com aterosclerose e indivíduos controle com idades diferentes.
[00040] A figura 14 fornece um exemplo de níveis plasmáticos de ácido docoexaenoico em indivíduos com aterosclerose e indivíduos controle com idades diferentes.
[00041] A figura 15 fornece um exemplo de níveis plasmáticos do Metabolito 7888 em indivíduos com aterosclerose e indivíduos controle com idades diferentes.
[00042] A figura 16 fornece um exemplo de níveis plasmáticos do Metabolito - X8403 em indivíduos com aterosclerose e indivíduos controle com idades diferentes.
[00043] A figura 17 fornece um exemplo de níveis plasmáticos do Metabolito - X1834 em indivíduos com aterosclerose e indivíduos controle com idades diferentes.
[00044] A figura 18 fornece um exemplo de níveis plasmáticos de p- cresol-sulfato em indivíduos com aterosclerose e indivíduos controle com idades diferentes.
[00045] A figura 19 fornece um exemplo de níveis plasmáticos do Metabolito 4887 em indivíduos com aterosclerose e indivíduos controle com idades diferentes.
[00046] A figura 20 fornece um exemplo de divisão recursiva de me- tabólitos de biomarcador DCM.
[00047] A figura 21 fornece um exemplo de validação de modelo usando plasma de indivíduos com síndrome metabólica e saudáveis.
[00048] A figura 22 fornece um exemplo de validação de modelo usando soro de indivíduos com síndrome metabólica e saudáveis.
[00049] A figura 23 fornece um exemplo de uma análise de regressão mostrando o poder de precissão de dez modelos combinados na taxa de disponibilidade de glicose (Rd).
[00050] A figura 24 fornece e ilustra as interrelações de vários fatores de risco para síndrome metabólica.
Descrição Detalhada da Invenção
[00051] A presente invenção relaciona-se a biomarcadores de pré- diabetes (por exemplo, tolerância à glicose prejudicada, tolerância à glicose prejudicada de jejum, resistência à insulina) e diabetes tipo 2; métodos de diagnóstico de pré-diabetes e diabetes tipo 2; métodos de determinação da pré-disposição para pré-diabetes e diabetes tipo 2; métodos de monitoramento da progressão/regressão de pré-diabetes e diabetes tipo 2; métodos de avaliação da eficácia de composições para tratar pré-diabetes e diabetes tipo 2; métodos de classificação de composições para atividade na modulação dos biomarcadores de pré- diabetes e diabetes tipo 2; métodos de tratamento de pré-diabetes e diabetes tipo 2; bem como outros métodos com base em biomarcado- res de pré-diabetes e diabetes tipo 2.
[00052] Testes de sangue atuais para resistência à insulina realizam mal a detecção precoce de resistência à insulina ou envolvem procedimentos médicos significantes.
[00053] Usando análise metabolômica, painéis de metabólitos que podem ser usados em um teste de sangue simples para predizer a resistência à insulina como medido pelo "padrão ouro" de clamps eugli- cêmicos hiperinsulinêmicos em pelo menos duas coortes independentes de indivíduos foram descobertos.
[00054] Estudos independentes foram realizados para identificar o conjunto de biomarcadores que quando usado com um algoritmo poli- nômico permitirá a detecção precoce de modificações na resistência à insulina em um indivíduo. A presente invenção fornece ao indivíduo com um escore indicando o nível de resistência à insulina ("Escore IR") do indivíduo. O escore pode ser baseado no nível de referência modificado clinicamente significante de um biomarcador e/ou combinação de biomarcadores. O nível de referência pode ser derivado de um algoritmo ou computado de índices de tolerância à glicose prejudicada e pode ser apresentado em um relatório como mostrado na Figura 5. O Escore IR coloca o indivíduo na faixa da resistência à insulina de nor mal a alta. Progressão da doença ou remissão pode ser monitorada por determinação e monitoramento periódicos do Escore IR. A resposta à intervenção terapêutica pode ser determinada pelo monitoramento do Escore IR. O Escore IR também pode ser usado para avaliar a eficácia do fármaco.
[00055] A presente invenção também refere-se a biomarcadores de síndrome metabólica e doenças cardiovasculares, tais como ateroscle- rose e cardiomiopatia; métodos de diagnóstico de tais doenças e sín- dromes; métodos de determinação de pré-disposição para tais doenças e síndromes; métodos de monitoramento da progressão/regressão de tais doenças e síndromes; métodos de avaliação da eficácia de composições para tratar tais doenças e síndromes; métodos de classificação de composições para atividade na modulação dos biomarcado- res de tais doenças e síndromes; métodos de tratamento de tais doenças e síndromes; bem como outros métodos com base em biomarca- dores de tais doenças e síndromes.
[00056] Antes da descrição desta invenção em detalhes adicionais, entretanto, os seguintes termos serão primeiro definidos.
Definições:
[00057] "Biomarcador" significa um composto, preferencialmente um metabolito, que está presente diferencialmente (isto é, aumentado ou reduzido) em uma amostra biológica de um indivíduo ou um grupo de indivíduos que têm um primeiro fenótipo (por exemplo, tendo uma doença) quando comparado com uma amostra biológica de um indivíduo ou grupo de indivíduos tendo um segundo fenótipo (por exemplo, não tendo a doença). Um biomarcador pode estar presente diferencialmente em qualquer nível, mas está presente geralmente em um nível que está aumentado em pelo menos 5%, em pelo menos 10%, em pelo menos 15%, em pelo menos 20%, em pelo menos 25%, em pelo menos 30%, em pelo menos 35%, em pelo menos 40%, em pelo menos 45%, em pelo menos 50%, em pelo menos 55%, em pelo menos 60%, em pelo menos 65%, em pelo menos 70%, em pelo menos 75%, em pelo menos 80%, em pelo menos 85%, em pelo menos 90%, em pelo menos 95%, em pelo menos 100%, em pelo menos 110%, em pelo menos 120%, em pelo menos 130%, em pelo menos 140%, em pelo menos 150%, ou mais; ou está presente geralmente em um nível que é reduzido em pelo menos 5%, em pelo menos 10%, em pelo menos 15%, em pelo menos 20%, em pelo menos 25%, em pelo menos 30%, em pelo menos 35%, em pelo menos 40%, em pelo menos 45%, em pelo menos 50%, em pelo menos 55%, em pelo menos 60%, em pelo menos 65%, em pelo menos 70%, em pelo menos 75%, em pelo menos 80%, em pelo menos 85%, em pelo menos 90%, em pelo menos 95%, ou em 100% (isto é, ausente). Um biomarcador está presente preferencialmente diferencialmente em um nível que é estatisticamente significante (por exemplo, um valor p menor que 0,05 e/ou um valor q de menos que 0,10 determinado usando teste T de Welch ou Teste de soma das ordens de Wilcoxon). Alternativamente, os biomarcadores demonstram uma correlação com pré-diabetes, ou níveis particulares de pré-diabetes. A faixa de correlações possíveis está entre 1 negativo (-) e 1 positivo (+). Um resultado de 1 negativo (-) significa uma correlação negativa perfeita e um 1 positivo (+) significa uma correlação positiva perfeita, e 0 significa nenhuma correlação. Uma "correlação positiva substancial" refere-se a um bio- marcador que tem uma correlação de +0,25 a +1,0 com uma desordem ou com uma medida clínica (por exemplo, Rd), enquanto uma "correlação negativa substancial" refere-se a uma correlação de -0,25 a -1,0 com uma dada desordem ou medida clínica. Uma "correlação positiva significante" refere-se a um biomarcador tendo uma correlação de +0,5 a +1,0 com uma dada desordem ou medida clínica (por exemplo, Rd), enquanto uma "correlação negativa significante" refere-se a uma correlação com uma desordem de -0,5 a -1,0 com uma dada desordem ou medida clínica.
[00058] O "nível" de um ou mais biomarcadores significa a quantidade absoluta ou relativa ou concentração do biomarcador na amostra.
[00059] "Amostra" ou "amostra biológica" ou "espécime" significam material biológico isolado de um indivíduo. A amostra biológica pode conter qualquer material biológico adequado para detectar os biomar- cadores desejados, e pode compreender o material celular e/ou não celular do indivíduo. A amostra pode ser isolada de qualquer tecido biológico ou fluido adequado tal como, por exemplo, tecido adiposo, tecido aórtico, tecido hepático, sangue, plasma sanguíneo, soro, ou urina.
[00060] "Indivíduo" significa qualquer animal, mas é preferencialmente um mamífero, tal como, por exemplo, um humano, macaco, primata não-humano, rato, camundongo, vaca, cão, gato, porco, cavalo ou coelho.
[00061] Um "nível de referência" de um biomarcador significa um nível do biomarcador que é indicativo de um determinado estado de doença, fenótipo, ou em falta do mesmo, bem como as combinações das condições de doença, fenótipos, ou em falta dos mesmos. Um nível de referência "positivo" de um biomarcador significa um nível que é indicativo de uma determinada condição de doença ou fenótipo. Um nível de referência "negativo" de um biomarcador significa um nível que é indicativo de uma falta de uma determinada condição de doença ou fenótipo. Por exemplo, um "nível de referência de pré-diabetes positivo" de um biomarcador significa um nível de um biomarcador que é indicativo de um diagnóstico positivo de pré-diabetes em um indivíduo, e um "nível de referência de pré-diabetes negativo" de um biomarcador significa um nível de um biomarcador que é indicativo de um diagnóstico negativo de pré-diabetes em um indivíduo. Como outro exemplo, um "nível de referência de progressão de pré-diabetes positivo" de um biomarcador significa um nível de um biomarcador que é indicativo da progressão de pré-diabetes em um indivíduo, e um "nível de referência de progressão de pré-diabetes positivo" de um biomarcador significa um nível de um biomarcador que é indicativo da regressão do pré- diabetes. Um "nível de referência" de um biomarcador pode ser uma quantidade ou concentração absoluta ou relativa do biomarcador, uma presença ou ausência do biomarcador, uma faixa de quantidade ou concentração do biomarcador, uma quantidade ou concentração mínima e/ou máxima do biomarcador, uma quantidade ou concentração média do biomarcador, e/ou uma quantidade ou concentração mediana do biomarcador; e, além disso, "níveis de referência" de combinações de biomarcadores também podem ser razões de quantidades ou concentrações absolutas ou relativas de dois ou mais biomarcadores com relação um ao outro. Níveis apropriados de referência positivos e negativos de biomarcadores de uma determinada condição de doença, fenótipo, ou falta dos mesmos podem ser determinados pela medida dos níveis dos biomarcadores desejados em um ou mais indivíduos apropriados, e tais níveis de referência podem ser feitos sob medida para populações específicas de indivíduos (por exemplo, um nível de referência pode ser combinado por idade para que comparações possam ser feitas entre níveis de biomarcador em amostras de indivíduos de uma certa idade e níveis de referência de uma determinada condição de doença, fenótipo, ou falta dos mesmos em um certo grupo de idade). Tais níveis de referência também podem ser feitos sob medida por técnicas específicas que são usadas para medir níveis de biomar- cadores em amostras biológicas (por exemplo, LC-MS, GC-MS, etc.), onde os níveis de biomarcadores podem diferenciar-se com base na técnica específica que é usada.
[00062] "Composto não-biomarcador" significa um composto que está presente não-diferencialmente em uma amostra biológica de um indivíduo ou um grupo de indivíduos tendo um primeiro fenótipo (por exemplo, tendo uma primeira doença) quando comparado com uma amostra biológica de um indivíduo ou grupo de indivíduos que têm um segundo fenótipo (por exemplo, não tendo a primeira doença). Tais compostos não-biomarcadores podem, entretanto, ser biomarcadores em uma amostra biológica de um indivíduo ou um grupo de indivíduos que têm um terceiro fenótipo (por exemplo, tendo uma segunda doença) quando comparado com o primeiro fenótipo (por exemplo, tendo a primeira doença) ou o segundo fenótipo (por exemplo, não tendo a primeira doença).
[00063] "Metabolito" ou "pequena molécula" significa moléculas orgânicas e inorgânicas que estão presentes em uma célula. O termo não inclui grandes macromoléculas, tais como grandes proteínas (por exemplo, proteínas com pesos moleculares mais de 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, ou 10.000), grandes ácidos nucleicos (por exemplo, ácidos nucleicos com pesos moleculares de mais de 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, ou 10.000), ou grandes polissacarídeos (por exemplo, polissacarídeos com pesos moleculares de mais de 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, ou 10.000). As pequenas moléculas das células são geralmente encontradas livres em solução no citoplasma ou em outras organelas, tais como as mitocôndrias, onde formam um agrupamento de intermediários que podem ser metabolizados ainda ou usados para gerar grandes moléculas, chamadas macromoléculas. O termo "pequenas moléculas" inclui moléculas sinalizadoras e intermediários nas reações químicas que transformam a energia derivada do alimento em formas usáveis. Exemplos de pequenas moléculas incluem açúcares, ácidos graxos, aminoácidos, nucleotídeos, intermediários formados durante os processos celulares e outras pequenas moléculas encontradas dentro da célula.
[00064] "Perfil metabólico", ou "perfil de pequena molécula", signifi- ca um inventário completo ou parcial de pequenas moléculas dentro de uma célula, tecido, órgão, organismo, ou fração dos mesmos visados (por exemplo, compartimento celular). O inventário pode incluir a quantidade e/ou o tipo de pequenas moléculas presentes. O "perfil de pequenas moléculas" pode ser determinado usando uma técnica única ou múltiplas técnicas diferentes.
[00065] "Metaboloma" significa todas as pequenas moléculas presentes em um dado organismo.
[00066] "Desordem metabólica" refere-se a desordens ou doenças que resultam na perturbação do estado fisiológico normal da homeos- tase devido a uma alteração no metabolismo (anabolismo e/ou catabolismo). Uma alteração no metabolismo pode resultar de uma incapacidade de decompor (catabolizar) uma substância que deve ser decomposta (por exemplo, fenilalanina) e como resultado, a substância e/ou uma substância intermediária acumula-se em níveis tóxicos, ou de uma incapacidade de produzir (anabolizar) alguma substância essencial (por exemplo, insulina).
[00067] "Síndrome metabólica" refere-se ao conceito de agrupamento de fatores de risco metabólico que vêm em conjunto para um indivíduo único e levam a um alto risco de desenvolver diabetes e/ou doenças cardiovasculares. As características principais da síndrome metabólica incluem a resistência à insulina, hipertensão (alta pressão arterial), anormalidades de colesterol, dislipidemia, anormalidades de triglicerí- deo, um risco aumentado de coagulação e peso corporal excessivo, especialmente no abdome, ou obesidade. Síndrome metabólica também é conhecida como síndrome X, síndrome de resistência à insulina, sín- drome de obesidade, síndrome dismetabólica e síndrome de Reaven. As interrelações dos vários fatores de risco para síndrome metabólica são ilustradas na Figura 24. A presença de três ou mais dos fatores de risco em um único indivíduo é indicativa de síndrome metabólica. A As- sociação Americana do Coração sugere que a síndrome metabólica seja diagnosticada pela presença de três ou mais dos seguintes componentes: (1) uma elevada circunferência abdominal (homens, igual ou maior do que 102 cm (40 polegadas); mulheres, igual ou maior do que 88 cm (35 polegadas)); (2) triglicerídeos elevados (igual ou maior do que 150 mg/dL); (3) Lipídios de Alta Densidade ou HDL reduzido (homens, menos de 40 mg/dL; mulheres, menos de 50 mg/dL); (4) pressão arterial elevada (igual ou maior do que 130/85 mm Hg); e (5) glicose de jejum elevada (igual ou maior do que 100 mg/dL).
[00068] "Desordem metabólica relacionada à síndrome metabólica" como usado neste pedido refere-se a síndrome metabólica bem como obesidade, resistência à insulina, diabetes tipo 2, aterosclerose e car- diomiopatia.
[00069] "Diabetes" refere-se a um grupo de doenças metabólicas caracterizadas por elevados níveis de açúcar (glicose) no sangue que resultam de defeitos na secreção ou ação de insulina, ou ambos.
[00070] "Diabetes tipo 2" refere-se a um dos dois tipos principais do diabetes, o tipo no qual as células-beta do pâncreas produzem a insulina, pelo menos nas primeiros estágios da doença, mas o corpo é incapaz de usá-la efetivamente porque as células do corpo são resistentes à ação da insulina. Em etapas posteriores da doença, as células- beta podem deixar de produzir a insulina. Diabetes tipo 2 também é conhecido como diabetes resistente à insulina, diabetes não- dependente de insulina e diabetes de início adulto.
[00071] "Pré-diabetes" refere-se a uma ou mais condições diabéticas precoces incluindo utilização de glicose prejudicada, anormal ou níveis prejudicados de glicose de jejum, tolerância à glicose prejudicada, sensibilidade à insulina prejudicada e resistência à insulina.
[00072] "Resistência à insulina" refere-se à condição quando as células tornam-se resistentes aos efeitos da insulina - um hormônio que regula a entrada de glicose nas células - ou quando a quantidade da insulina produzida é insuficiente para manter um nível de glicose normal. Diminuição da capacidade das células de responder à ação da insulina na promoção do transporte do açúcar glicose do sangue para músculos e outros tecidos (isto é, sensibilidade a reduções de insulina). Consequentemente, o pâncreas produz muito mais insulina do que o normal e as células continuam sendo resistentes. Enquanto insulina suficiente é produzida para superar esta resistência, os níveis de glicose sanguínea permanecem normais. Uma vez que o pâncreas não é mais capaz de manter, a glicose sanguínea começa a aumentar, resultando em diabetes. Resistência à insulina varia de normal (insulina sensível) à resistente à insulina (IR).
[00073] "Sensibilidade à insulina" refere-se à capacidade das células de responderem aos efeitos da insulina para regular a entrada e utilização de glicose. Sensibilidade à insulina varia de normal à Resistente à insulina (IR).
[00074] "Escore IR" é uma medida da resistência à insulina com base nos biomarcadores de resistência à insulina e algoritmos da presente invenção que permitirá ao médico colocar o paciente no espectro de tolerância à glicose, de normal a alta.
[00075] "Utilização de glicose" refere-se à absorção de glicose do sangue por músculo e células gordas e utilização do açúcar para metabolismo celular. A entrada de glicose nas células é estimulada pela insulina.
[00076] "Rd" refere-se à taxa de disponibilidade de glicose, uma métrica para utilização de glicose. A taxa na qual a glicose desaparece do sangue (taxa de disponibilidade) é uma indicação da capacidade do corpo de responder à insulina (isto é, sensibilidade à insulina). Há vários métodos para determinar Rd e o clamp euglicêmico hiperinsulinê- mico é considerado como método "padrão ouro". Nesta técnica, en- quanto uma quantidade fixa de insulina é infundida, a glicose sanguínea é "clampeada" a um nível predeterminado pela titulação de uma taxa variável de infusão de glicose. O princípio subjacente consiste em que para alcançar o estado de equilíbrio, por definição, a disponibilidade de glicose é equivalente à glicose aparente. Durante a hiperinsuli- nemia, disponibilidade de glicose (Rd) é principalmente contabilizada pela entrada de glicose no músculo esquelético, e glicose aparente é igual à soma da taxa de infusão de glicose exógena mais a taxa da produção de glicose hepática (HGO). A taxa de infusão de glicose durante os 30 últimos minutos do teste determina a sensibilidade à insulina. Se altos níveis (Rd = 7,5 mg/min ou mais alto) forem necessários, o paciente é sensível à insulina. Níveis muito baixos (Rd = 4,0 mg/min ou mais baixo) indicam que o corpo é resistente à ação de insulina. Níveis entre 4,0 e 7,5 mg/min (valores de Rd entre 4,0 mg/min e 7,5 mg/min) não são definitivos e sugerem "tolerância à glicose prejudicada", um primeiro sinal de resistência à insulina.
[00077] "Glicose de jejum prejudicada (IFG)" e "tolerância à glicose prejudicada (IGT)" são duas definições clínicas de "pré-diabetes". IFG é definida como uma concentração de glicose sanguínea de jejum de 100 a 125 mg/dL. IGT é definida como uma concentração de glicose sanguínea pós-prandial (após alimentação) de 140 a 199 mg/dL. É conhecido que IFG e IGT não detectam sempre as mesmas populações pré-diabéticas. Entre as duas populações há aproximadamente uma sobreposição de 60% observada. Níveis de glicose plasmática de jejum são um meio mais eficiente de inferir a função pancreática de um paciente, ou secreção de insulina, ao passo que os níveis de glicose pós-prandiais se associam mais frequentemente com dedução dos níveis da sensibilidade ou resistência à insulina. É conhecido que IGT identifica uma maior porcentagem da população pré-diabética comparada à IFG. A condição IFG é associada com menor secreção de insu- lina, ao passo que se conhece que a condição IGT é associada fortemente com resistência à insulina. Numerosos estudos que foram realizados demonstram que os indivíduos com IGT com valores de GPJ normais estão em risco aumentado de doença cardiovascular. Pacientes com valores de GPJ normais podem ter valores de glicose pós- prandiais anormais e muitas vezes estão ignorando seu risco de pré- diabetes, diabetes e doença cardiovascular.
[00078] "Teste de glicose plasmática de jejum (GPJ)" é um teste simples de medida dos níveis de glicose sanguínea após um jejum de 8 horas. De acordo com a ADA, a concentração de glicose sanguínea de 100 a 125 mg/dL é considerada IFG e define pré-diabetes ao passo que > 126 mg/dL define diabetes. Como afirmado pela ADA, GPJ é teste preferencial para diagnosticar diabetes e pré-diabetes devido a sua facilidade de uso, aceitabilidade do paciente, menor custo e relativa reprodutibilidade. A fraqueza no teste de GPJ é que os pacientes são bastante avançados em direção ao Diabetes Tipo 2 antes da modificação de níveis de glicose de jejum. "Teste de tolerância à glicose oral (OGTT)", uma medida dinâmica de glicose, é uma medida pós- prandial de níveis de glicose sanguínea de um paciente após ingestão oral de uma bebida com 75 g de glicose. Medidas tradicionais incluem uma amostra de sangue de jejum no início do teste, uma amostra de sangue no ponto de tempo de uma hora, e uma amostra de sangue no ponto de tempo de duas horas. A concentração de glicose sanguínea de um paciente no ponto de tempo de duas horas define o nível da tolerância à glicose: tolerância à glicose normal (NGT) < glicose sanguínea 140 mg/dL; tolerância à glicose prejudicada (IGT) = glicose sanguínea 140 a 199 mg/dL; Diabetes > glicose sanguínea 200 mg/dL. Como afirmado por ADA, embora OGTT seja conhecido ser mais sen-sível e específico em diagnóstico de pré-diabetes e diabetes, não é recomendado para o uso clínico de rotina por causa de sua reproduti-bilidade ruim e dificuldade de executar na prática.
[00079] "Teste de insulina de jejum" mede a forma madura circulante da insulina no plasma. A definição atual de hiperinsulinemia é difícil devido à falta da padronização de imunoensaios de insulina, reativida- de cruzada a formas de proinsulina, e nenhum consenso em exigências analíticas dos ensaios. CVs intraensaio variam de 3,7% a 39% e CVs interensaio variam de 12% a 66%. Por isso, a insulina de jejum não é comumente medida em cenário clínico e é limitada ao cenário de pesquisa.
[00080] O "clamp euglicêmico hiperinsulinêmico (clamp HI)" é considerado no mundo inteiro como "padrão-ouro" para medir a resistência à insulina em pacientes. É realizado em um cenário de pesquisa, requer inserção de dois cateteres no paciente e o paciente deve permanecer imobilizado durante até seis horas. O clamp HI envolve criação de hiperinsulinemia em estado de equilíbrio por infusão de insulina, junto com infusão de glicose paralela a fim de quantificar a quantidade necessária de glicose para manter a euglicemia (concentração normal de glicose no sangue; também chamado normoglicemia). O resultado é uma medida da taxa de disponibilidade de glicose dependente de insulina (Rd), medindo a entrada periférica de glicose pelo músculo (principalmente) e tecidos adiposos. Esta taxa da entrada de glicose é assinalada por M, metabolismo de glicose corporal pela ação de insulina sob condições de estado de equilíbrio. Por isso, um alto M indica alta sensibilidade à insulina e um M de valor mais baixo indica sensibilidade à insulina reduzida, isto é, resistência à insulina. O clamp HI necessita que três profissionais treinados executem o procedimento, incluindo infusões simultâneas de insulina e glicose por 2 a 4 horas e amostragem sanguínea frequente a cada 5 minutos para análise dos níveis de insulina e glicose. Devido ao alto custo, complexidade, e tempo requerido para a clamp HI, este procedimento é estritamente limitado ao cenário de pesquisa clínica.
[00081] "Obesidade" refere-se a uma condição crônica definida por uma gordura corporal de quantidade excessiva. A quantidade normal de gordura corporal (expresso como porcentagem do peso corporal) está entre 25 e 30% em mulheres e 18 e 23% em homens. Mulheres com mais de 30% de gordura corporal e homens com mais de 25% de gordura corporal são considerados obesos.
[00082] "Índice de Massa Corporal, (ou IMC)" refere-se a um cálculo que usa a altura e peso de um indivíduo para estimar a quantidade de gordura corporal do indivíduo. Muita gordura corporal (por exemplo, obesidade) pode levar a doenças e outros problemas de saúde. IMC é a medida da escolha de muitos médicos e pesquisadores que estudam obesidade. IMC é calculado usando uma fórmula matemática que considera tanto a altura como o peso do indivíduo. IMC iguala o peso de uma pessoa em quilogramas dividido pela altura em metros quadrados. (IMC=kg/m2). Indivíduos que têm um IMC menor que 19 são considerados sendo de peso inferior ao normal, enquanto que aqueles com um IMC entre 19 e 25 são considerados sendo de peso normal, enquanto um IMC entre 25 e 29 é considerado geralmente com sobrepeso, enquanto indivíduos com um IMC de 30 ou mais são tipicamente considerados obesos. Obesidade mórbida refere-se a um indivíduo tendo um IMC de 40 ou maior.
[00083] "Doença cardiovascular" refere-se a qualquer doença do coração ou vasos sanguíneos. Doença cardiovascular ou cardíaca inclui mas não é limitada a, por exemplo, angina, arritmia, doença de artéria coronária (CAD), doença cardíaca coronária, cardiomiopatia (incluindo cardiomiopatia dilatada, cardiomiopatia restritiva, cardiomio- patia ventricular direita arritmogênica e cardiomiopatia diabética), ataque cardíaco (enfarte miocárdico), falência cardíaca, cardiomiopatia hipertrófica, regurgitação mitral, prolapso de valva mitral, estenose pulmonar, etc. Doença de vaso sanguíneo inclui mas não é limitada a, por exemplo, doença vascular periférica, doença arterial, doença da artéria carótida, trombose de veia profunda, doenças venosas, ateros- clerose, etc.
I. Biomarcadores
[00084] Os biomarcadores descritos neste pedido foram descobertos usando técnicas de perfil metabolômico. Tais técnicas de perfil me- tabolômico são descritas em mais detalhes nos Exemplos apresentados abaixo bem como nas Patentes US N° 7.005.255 e 7.329.489 e Pedidos de Patente US N°s 11/357.732 (Publicação N° 2007/0026389), 11/301.077 (Publicação N° 2006/0134676),11/301.078 (Publicação N° 2006/0134677), 11/301.079 (Publicação N° 2006/0134678) e 11/405.033 (Publicação US N° 2007/0072203), os conteúdos inteiros os quais são por isto incorporados neste pedido por referência.
[00085] Em geral, os perfis metabólicos podem ser determinados para amostras biológicas a partir de indivíduos humanos diagnosticados com uma condição, tal como pré-diabetes bem como de um ou mais grupos de indivíduos humanos (por exemplo, indivíduos-controle saudáveis com tolerância à glicose normal, indivíduos com tolerância à glicose prejudicada, indivíduos com resistência à insulina). O perfil metabólico de uma desordem pré-diabetes pode então ser comparado com o perfil metabólico de amostras biológicas a partir de um ou mais grupos de indivíduos. As comparações podem ser conduzidas usando modelos ou algoritmos, tais como os descritos neste pedido. Aquelas moléculas diferencialmente apresentam, incluindo aquelas moléculas diferencialmente apresentam um nível que é estatisticamente signifi- cante, no perfil metabólico de amostras de indivíduos com uma desordem pré-diabetes comparando a outro grupo (por exemplo, indivíduos controle saudáveis não pré-diabéticos) pode ser identificado como bi- omarcadores para distinguir aqueles grupos.
[00086] Biomarcadores para uso nos métodos descritos neste pedido podem ser obtidos de qualquer fonte de biomarcadores relacionados ao pré-diabetes e/ou diabetes tipo 2. Biomarcadores para uso em métodos descritos neste pedido que se relacionam a pré-diabetes incluem os listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, 28, 29, e combinações e subconjuntos dos mesmos. Em uma modalidade, os bio- marcadores incluem os listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, 28, e combinações dos mesmos. Biomarcadores adicionais incluem os descritos no Pedido de Patente US N° 60/950.286, a totalidade do qual está por isto incorporado por referência em sua totalidade. Em um as-pecto, os biomarcadores correlacionam-se à resistência à insulina.
[00087] Biomarcadores para uso em métodos descritos neste pedido que se relacionam a desordens metabólicas relacionadas à sín- drome metabólica incluem os listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, e combinações dos mesmos. Por exemplo, os biomarcadores para uso na distinção, ou auxílio na distinção, entre indivíduos que têm síndrome metabólica e indivíduos não tendo síndrome metabólica incluem aqueles biomar- cadores identificados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, e combinações dos mesmos. Em um aspecto, biomarcadores para uso em métodos que se relacionam com síndrome metabólica incluem um ou mais dos listados nas Tabelas 12 e 13. Em outro aspecto, biomarcadores para uso em métodos que se relacionam à síndrome metabólica usando amostras plasmáti- cas obtidas de um indivíduo incluem um ou mais dos listados na Tabela 12. Em um aspecto preferencial, biomarcadores para uso em métodos descritos neste pedido relacionados à síndrome metabólica usando amostras plasmáticas obtidas de um indivíduo incluem um ou mais dos biomarcadores N-acetilglicina, Metabolito - 6346, Metabolito - 8792, gama-glu-leu, Metabolito - 4806, Metabolito - 3165, Metabolito - 7762, Metabolito - 3030, Metabolito - 5978, Metabolito - 3218, Metabo- lito - 2000, Metabolito - 5848, Metabolito - 3370, ácido málico, Metabo- lito - 3843, Metabolito - 4275, Metabolito - 3094, Metabolito - 4167, Me- tabolito - 3073, aldosterona, Metabolito - 1320, Metabolito - 2185, feni- lalanina, Metabolito - 2139, ácido glutâmico, alfa-tocoferol, Metabolito - 5767, Metabolito - 5346, Metabolito - 9855 e 1-octadecanol, e combinações dos mesmos. Ainda em outro aspecto, biomarcadores para uso em métodos que se relacionam à síndrome metabólica usando amostras séricas obtidas de um indivíduo incluem um ou mais dos listados na Tabela 13. Em um aspecto preferencial, os biomarcadores para uso em métodos de síndrome metabólica descritos neste pedido usando amostras séricas obtidas de um indivíduo incluem um ou mais dos biomarcadores Metabolito - 8792, Metabolito - 5767, Metabolito - 2139, Metabolito - 8402, Metabolito - 3073, fenilalanina, Metabolito - 4929, Metabolito - 3370, nonanato, N-acetilglicina, Metabolito - 5848, Metabolito - 3077, monopalmitina, dioctil-ftalato, ácido octadecanoico, colesterol, Metabolito - 2608, Metabolito - 6272, Metabolito - 3012, D- glicose, Metabolito - 2986, Metabolito - 4275, Metabolito - 6268, tirosi- na, Metabolito - 10683, Metabolito - 2000, alfa-tocoferol, Metabolito - 2469, xantina e Metabolito - 2039, e combinações dos mesmos.
[00088] Em outro aspecto, biomarcadores para uso em métodos descritos neste pedido que se relacionam à síndrome metabólica podem incluir o uso de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 12 e/ou 13 em combinação com um ou mais biomarcadores em uma ou mais das Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, ou combinações dos mesmos. Por exemplo, biomarca- dores para uso em métodos que se relacionam à síndrome metabólica podem incluir um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 12 e/ou 13 em combinação com um ou mais biomarcadores associados com a resistência à insulina, tais como os listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, 28, ou combinações dos mesmos.
[00089] Biomarcadores para uso em métodos descritos neste pedido que se relacionam a condições pré-diabéticas ou diabéticas, tais como sensibilidade à insulina prejudicada, resistência à insulina, ou diabetes tipo 2 incluem um ou mais dos listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, 28, e combinações dos mesmos. Tais biomarcadores permitem a indivíduos serem classificados como resistentes à insulina, insulina prejudicada, ou sensível à insulina. Em um aspecto, biomar- cadores para uso na distinção ou auxílio na distinção, entre indivíduos tendo sensibilidade à insulina prejudicada de indivíduos não tendo sensibilidade à insulina prejudicada incluem um ou mais dos listados na Tabela 4, 5, 6, 7, 8, 9A, e/ou 9B. Em outro aspecto, biomarcadores para uso em diagnóstico de resistência à insulina incluem um ou mais dos listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, e/ou 9B. Em outro exemplo, biomarcadores para uso na distinção de indivíduos tendo resistência à insulina de indivíduo não tendo resistência à insulina incluem um ou mais dos listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, e/ou 9B. Em outro exemplo, biomarcadores para uso na categorização, ou auxílio na ca- tegorização, de um indivíduo como tendo níveis de glicose de jejum prejudicados ou tolerância à glicose prejudicada incluem um ou mais dos listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, e/ou 9B.
[00090] Biomarcadores para uso nos métodos descritos neste pedido que se relacionam à aterosclerose incluem um ou mais dos listados nas Tabelas 14, 15, 16, e/ou 17 e combinações dos mesmos. Por exemplo, biomarcadores para uso na distinção, ou auxílio na distinção, de indivíduos ateroscleróticos de indivíduos não-ateroscleróticos incluem um ou mais dos biomarcadores listados nas Tabelas 14, 15, 16, 17, 3-metil-histidina, p-cresol sulfato, manose, glicose e/ou gluconato, e combinações dos mesmos. Em um aspecto, biomarcadores para uso em métodos que se relacionam à aterosclerose usando amostras plasmáticas de um indivíduo incluem um ou mais de 3-metil-histidina, p-cresol sulfato, manose, glicose, gluconato, e os listados nas Tabelas 14 e 17. Em outro aspecto, biomarcadores para uso em métodos que se relacionam à aterosclerose usando amostras aórticas de um indivíduo incluem um ou mais dos listados na Tabela 15. Ainda em outro aspecto, biomarcadores para uso em métodos que se relacionam à aterosclerose usando amostras hepáticas de um indivíduo incluem um ou mais dos listados na Tabela 16. Em um aspecto, biomarcadores preferenciais para uso em métodos que envolvem indivíduos em uma etapa inicial da aterosclerose incluem os biomarcadores identificados nas Figuras 10A, 11A e 12A. Biomarcadores preferenciais para uso em métodos que envolvem indivíduos na etapa intermediária da ate- rosclerose incluem os biomarcadores identificados nas Figuras 10B, 11B e 12B. Biomarcadores preferenciais para uso em métodos que envolvem indivíduos em uma etapa posterior da aterosclerose incluem os biomarcadores identificados nas Figuras 10C, 11C, e 12C. Biomar- cadores preferenciais para uso em métodos que envolvem indivíduos em qualquer etapa de aterosclerose incluem os biomarcadores identificados nas Figuras 10D, 11D e 12D.
[00091] Biomarcadores para uso em métodos descritos neste pedido que se relacionam à cardiomiopatia incluem um ou mais dos bio- marcadores listados nas Tabelas 21, 22, 23 e/ou 25. Tais marcadores podem ser usados, por exemplo, para distinção, ou auxiliar na distinção, entre indivíduos tendo cardiomiopatia de indivíduos não tendo cardiomiopatia. Em um aspecto, biomarcadores para uso em métodos que se relacionam à cardiomiopatia usando amostras de tecido cardíaco de um indivíduo incluem um ou mais dos listados na Tabela 21. Em outro aspecto, biomarcadores para uso em métodos que se relacionam à cardiomiopatia usando amostras plasmáticas de um indivíduo incluem um ou mais dos listados na Tabela 22 e/ou 23.
[00092] Biomarcadores para uso nos métodos descritos neste pedido que se relacionam à obesidade incluem um ou mais dos biomarca- dores listados na Tabela 26. Tais marcadores podem ser usados, por exemplo, para distinguir indivíduos obesos de indivíduos magros. Tais marcadores também podem ser usados em combinação com biomar- cadores de pré-diabetes, síndrome metabólica, aterosclerose, ou car- diomiopatia. Em outro aspecto, os marcadores podem ser usados, por exemplo, para determinar a suscetibilidade à obesidade ou ao ganho de peso. Em outro aspecto, os marcadores podem ser usados, por exemplo, para determinar se um agente terapêutico provavelmente induzirá o ganho de peso em um indivíduo.
[00093] Qualquer número de biomarcadores pode ser usado nos métodos descritos neste pedido. Isto é, os métodos descritos podem incluir a determinação do(s) nível(is) de um biomarcador, dois ou mais biomarcadores, três ou mais biomarcadores, quatro ou mais biomar- cadores, cinco ou mais biomarcadores, seis ou mais biomarcadores, sete ou mais biomarcadores, oito ou mais biomarcadores, nove ou mais biomarcadores, dez ou mais biomarcadores, quinze ou mais bio- marcadores, etc., incluindo uma combinação de todos os biomarcado- res em cada ou todas as Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, ou qualquer fração dos mesmos. Em outro aspecto, o número de biomarcadores para uso nos métodos descritos inclui os níveis de aproximadamente trinta ou menos biomarcado- res, vinte e cinco ou menos, vinte ou menos, quinze ou menos, dez ou menos, nove ou menos, oito ou menos, sete ou menos, seis ou menos, cinco ou menos biomarcadores. Em outro aspecto, o número de biomarcadores para uso nos métodos descritos inclui os níveis de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, vinte, vinte e cinco, ou trinta biomarcadores.
[00094] Embora as identidades de alguns compostos biomarcado- res não sejam conhecidas até agora, tais identidades não são necessárias para identificação dos biomarcadores em amostras biológicas de indivíduos, já que os compostos "não-denominados" foram suficientemente caracterizados por técnicas analíticas para permitir tal identificação. A caracterização analítica de tais compostos "não- denominados" é listada nos Exemplos. Tais biomarcadores "não- denominados" são indicados neste pedido usando a nomenclatura "Metabolito" seguido por um número específico do metabolito.
[00095] Além disso, os métodos descritos neste pedido usando os biomarcadores listados nas tabelas podem ser usados em combinação com medidas diagnósticas clínicas das respectivas condições. Combinações com diagnósticos clínicos podem facilitar os métodos descritos, ou confirmar resultados dos métodos descritos (por exemplo, facilitando ou confirmando diagnóstico, monitorando progressão ou regressão, e/ou determinando pré-disposição para pré-diabetes).
[00096] Finalmente, onde a identidade potencial de um composto é proposta para um metabolito "não-denominado" e tal identidade não foi confirmada, a nomenclatura do "possível" (junto com a potencial identidade do composto) segue o número do "Metabolito". Tal identidade proposta não deve ser considerada como limitação da caracterização analítica dos compostos "não-denominados" de outra maneira.
II. Métodos Diagnósticos
[00097] Os biomarcadores descritos neste pedido podem ser usados para diagnosticar, ou auxiliar no diagnóstico, se um indivíduo tem uma doença ou condição, tal como resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose ou cardiomiopatia. Por exemplo, biomarcadores para uso em diagnóstico, ou auxílio no diagnóstico, se um indivíduo tem uma resistência à insulina incluem um ou mais dos identificados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, 28, 29, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade, os biomarcado- res incluem um ou mais dos identificados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, 28, e combinações dos mesmos. Em outra modalidade, as combinações de biomarcadores incluem aquelas, tais como 2- hidroxibutirato em combinação com um ou mais biomarcadores identificados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, 28, e/ou 29.
[00098] Métodos para diagnóstico, ou auxílio no diagnóstico, se um indivíduo tem uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, sín- drome metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia, podem ser realizados usando um ou mais dos biomarcadores identificados nas respectivas tabelas fornecidas neste pedido. Um método de diagnóstico (ou auxílio no diagnóstico) se um indivíduo tem uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, síndrome metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia, compreende (1) análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcado- res da doença ou condição na amostra e (2) comparação do(s) ní- vel(is) de um ou mais biomarcadores na amostra aos níveis de referência positivos para doença ou condição e/ou negativos para doença ou condição de um ou mais biomarcadores para diagnóstico (ou auxílio no diagnóstico) se o indivíduo tem a doença ou condição. Por exemplo, um método de diagnóstico (ou auxílio em diagnóstico) se um indivíduo é pré-diabético compreende (1) análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de pré-diabetes na amostra e (2) comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra de positivo para pré-diabetes positivo e/ou negativo para pré-diabetes de um ou mais biomarcadores a fim de diagnosticar (ou auxiliar no diagnóstico) se o indivíduo tem pré-diabetes. Um ou mais biomarcadores que são usados são selecionados a partir das Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, e combinações dos mesmos. Quando tal método é usado em auxílio no di- agnóstico de uma doença ou condição, tal como resistência à insulina, pré-diabetes, síndrome metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia, os resultados do método podem ser usados junto com outros métodos (ou os resultados do mesmo) úteis na determinação clínica se um indivíduo tem uma dada doença ou condição. Métodos úteis na determinação clínica se um indivíduo tem uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, síndrome metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia são conhecidos na técnica. Por exemplo, métodos úteis na determinação clínica se um indivíduo tem pré-diabetes incluem, por exemplo, taxas de disponibilidade de glicose (Rd), medidas de peso corporal, medidas de circunferência de cintura, determinações de IMC, medidas de Peptídeo YY, medidas de Hemoglobina A1C, medidas de adiponec- tina, medidas de glicose plasmática de jejum, medidas de ácido graxo livre, medidas de insulina plasmática de jejum, e similares. Métodos úteis para a determinação clínica de aterosclerose e/ou cardiomiopatia em um indivíduo incluem angiografia, teste de esforço, testes sanguíneo (por exemplo, para medir homocisteína, fibrinogênio, lipoproteína (a), pequenas partículas de LDL, e níveis de proteína c reativa), eletro- cardiografia, ecocardiografia, exames de tomografia computadorizada (CT), índice tornozelo/braço e ultrassons intravasculares.
[00099] Em outro exemplo, a identificação de biomarcadores para doenças ou condições, tais como resistência à insulina, pré-diabetes, síndrome metabólica, aterosclerose e cardiomiopatia, consideram o diagnóstico de (ou para auxiliar no diagnóstico de) tais doenças ou condições em indivíduos que apresentam um ou mais sintomas da doença ou condição. Por exemplo, um método de diagnóstico (ou auxílio no diagnóstico) se um indivíduo tem resistência à insulina compreende (1) análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de resistência à insulina na amostra e (2) comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcado- res na amostra aos níveis de referência positivos para resistência à insulina e/ou negativos para resistência à insulina de um ou mais bio- marcadores a fim de diagnosticar (ou auxiliar no diagnóstico) se o indivíduo tem resistência à insulina. Um ou mais biomarcadores que são usados são selecionados a partir das Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, e/ou 9B. Os biomarcadores de resistência à insulina também podem ser usados para classificar indivíduos como resistentes à insulina, sensíveis à insulina, ou tendo sensibilidade à insulina prejudicada. Como descrito no Exemplo 2, abaixo, biomarcadores que são identificados podem ser usados para classificar indivíduos como sendo resistentes à insulina, sensíveis à insulina, ou tendo sensibilidade à insulina prejudicada. Os biomarcadores nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, e/ou 9B, também podem ser usados para classificar indivíduos como tendo níveis de glicose de jejum prejudicados ou tolerância à glicose prejudicada ou tolerância à glicose normal. Dessa forma, os biomarcadores podem indicar compostos que aumentam e diminuem como os aumentos de taxa de disponibilidade de glicose. Pela determinação de níveis de referência apropriados dos biomarcadores de cada grupo (resistente à insulina, insulina prejudicada, sensível à insulina), indivíduos podem ser diagnosticados apropriadamente. Os resultados deste método podem ser combinados com os resultados de medidas clínicas para auxiliar no diagnóstico de resistência à insulina ou para categorizar o indivíduo como tendo NGT, IFG, ou IGT.
[000100] Resistência à insulina aumentada correlaciona a taxa de disponibilidade de glicose (Rd) como medido pelo clamp HI. Como exemplificado abaixo, análise metabolômica foi executada para identificar biomarcadores que correlacionam-se com a taxa de disponibilidade de glicose (Rd). Estes biomarcadores podem ser usados em um modelo matemático para determinar a taxa de disponibilidade de glicose do indivíduo. A sensibilidade do indivíduo à insulina pode ser de- terminada usando este modelo. Usando análise metabolômica, painéis de metabólitos que podem ser usados em um teste sanguíneo simples para predizer a resistência à insulina como medido pelo "padrão ouro" de clamps euglicêmicos hiperinsulinêmicos em pelo menos duas coortes independentes de indivíduos foram descobertos. Em outro exemplo, biomarcadores que são identificados correlacionam-se com os resultados de testes de tolerância à glicose oral (OGTT) para uso na ca- tegorização de indivíduos como tendo tolerância à glicose normal (NGT), níveis de glicose de jejum prejudicados (IFG), ou tolerância à glicose prejudicada (IGT).
[000101] Estudos independentes foram executados para identificar um grupo de biomarcadores que quando usados com um algoritmo polinômico permitirão a detecção precoce de modificações na resistência à insulina em um indivíduo. Em um aspecto, a presente invenção fornece ao indivíduo um escore que indica o nível de resistência à insulina ("Escore IR") do indivíduo. O escore é baseado no nível de referência modificado clinicamente significante de um biomarcador e/ou combinação de biomarcadores. O nível de referência pode ser derivado de um algoritmo ou computado de índices de tolerância à glicose prejudicada e pode ser apresentado em um relatório como mostrado na Figura 5. O Escore IR coloca o indivíduo na faixa de resistência à insulina de normal (isto é, sensível à insulina) a alta. A progressão ou remissão da doença pode ser monitorada por determinação periódica e monitoramento do Escore IR. Resposta à intervenção terapêutica pode ser determinada pelo monitoramento do Escore IR. O Escore IR também pode ser usado para avaliar a eficácia do fármaco.
[000102] Métodos para determinação do escore de resistência à insulina de um indivíduo (Escore IR) podem ser realizados usando um ou mais dos biomarcadores identificados nas respectivas Tabelas fornecidas neste pedido. Por exemplo, um método para determinar o Es core IR de um indivíduo compreende as etapas de: (1) análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de resistência à insulina na amostra, e (2) comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de resistência à insulina na amostra aos níveis de referência a resistência à insulina de um ou mais biomarcadores a fim de determinar o escore de resistência à insulina do indivíduo. Um ou mais biomarcadores que são usados podem ser selecionados a partir de Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, e combinações dos mesmos. O método pode empregar qualquer número de marcadores selecionados a partir das Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, e/ou 9B, incluindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais marcadores. Múltiplos biomarcadores podem ser correlacionados com uma dada condição, tal como resistência à insulina, por qualquer método, incluindo métodos estatísticos, tais como análise de regressão.
[000103] Também como exemplificado abaixo, análise metabolômica foi executada para identificar biomarcadores que se correlacionam com síndrome metabólica, aterosclerose, cardiomiopatia, e outras doenças ou condições. Tais biomarcadores podem ser usados nos métodos da presente invenção para analisar amostras biológicas para identificar ou medir o nível dos biomarcadores na amostra.
[000104] Qualquer método adequado pode ser usado para analisar a amostra biológica a fim de determinar o(s) nível(is) de um ou mais bi- omarcadores na amostra. Métodos adequados incluem cromatografia (por exemplo, HPLC, cromatografia gasosa, cromatografia líquida), espectrometria de massa (por exemplo, MS, MS-MS), ensaio imuno- absorvente ligado à enzima (ELISA), ligação a anticorpo, outras técnicas imunoquímicas, e combinações dos mesmos. Além disso, o(s) ní- vel(is) de um ou mais biomarcadores pode ser medido indiretamente, por exemplo, pelo uso de um ensaio que mede o nível de um composto (ou compostos) que se correlaciona com o nível do biomarcador(es) que é desejado ser medido.
[000105] Após o(s) nível(is) de um ou mais biomarcador(es) ser determinado, o(s) nível(is) pode(m) ser comparado(s) ao(s) nível(is) de referência da condição ou doença de um ou mais biomarcador(es) para determinar uma avaliação de cada um ou mais biomarcador(es) na amostra. A avaliação(ões) podem ser agregada usando qualquer algoritmo para criar um escore, por exemplo, um escore de resistência à insulina (IR) para o indivíduo. O algoritmo pode considerar qualquer fator que se relaciona com a doença ou condição, tal como resistência à insulina, incluindo o número de biomarcadores, a correlação dos bi- omarcadores à doença ou condição, etc..
[000106] Em um exemplo, o escore de resistência à insulina do indivíduo pode ser correlacionado a qualquer índice indicativo de um nível de resistência à insulina, da tolerância à glicose normal à resistente à insulina. Por exemplo, um indivíduo que tem um escore de resistência à insulina de menos de 25 pode indicar que o indivíduo tem tolerância à glicose normal; um escore entre 26 e 50 pode indicar que o indivíduo tem tolerância à glicose prejudicada baixa; um escore entre 51 e 75 pode indicar que o indivíduo tem tolerância à glicose prejudicada média; um escore entre 76 e 100 pode indicar que o indivíduo tem tolerância à glicose prejudicada alta; e um escore acima de 100 pode indicar que o indivíduo tem diabetes tipo 2.
III. Monitoramento de Progressão/Regressão de Doença ou Condição
[000107] A identificação de biomarcadores neste pedido considera o monitoramento da progressão/regressão das respectivas doenças ou condições (por exemplo, pré-diabetes, síndrome metabólica, ateroscle- rose, cardiomiopatia, resistência à insulina, etc.) em um indivíduo. Um método de monitoramento da progressão/regressão de doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose e cardiomiopatia, em um indivíduo compreende (1) aná- lise de uma primeira amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores da respectiva doença ou condição selecionada a partir das Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e combinações dos mesmos na primeira amostra obtida do indivíduo em um primeiro ponto de tempo, (2) análise de uma segunda amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores, a segunda amostra obtida do indivíduo em um segundo ponto de tempo, e (3) comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na primeira amostra ao(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na segunda amostra a fim de monitorar a progressão/regressão da doença ou condição no indivíduo. Os resultados do método são indicativos do curso da doença ou condição (isto é, progressão ou regressão, se qualquer modificação) no indivíduo.
[000108] Em uma modalidade, os resultados do método podem ser baseados no Escore de Resistência à Insulina (IR) que é indicativo da resistência à insulina no indivíduo e que pode ser monitorado ao longo do tempo. Pela comparação do Escore IR de uma amostra de um primeiro ponto de tempo para o Escore IR de pelo menos uma amostra de um segundo ponto de tempo, a progressão ou regressão de IR podem ser determinadas. Tal método de monitoramento da progres- são/regressão de pré-diabetes e/ou diabetes tipo 2 em um indivíduo compreende (1) análise de uma primeira amostra biológica de um indivíduo para determinar um Escore IR da primeira amostra obtida do in-divíduo em uma primeiro ponto de tempo, (2) análise de uma segunda amostra biológica de um indivíduo para determinar um segundo Escore IR, a segunda amostra obtida do indivíduo em um segundo ponto de tempo, e (3) comparação do Escore IR na primeira amostra ao Escore IR na segunda amostra a fim de monitorar a progressão/regressão do pré-diabetes e/ou diabetes tipo 2 no indivíduo.
[000109] O uso dos biomarcadores e do algoritmo da presente invenção para monitoramento da progressão pode guiar, ou auxiliar a decisão de um médico para implementar medidas preventivas, tais como restrições dietéticas, exercício, ou tratamento com fármaco em estágio inicial.
IV. Determinação da Pré-disposição a uma Doença ou Condição
[000110] Os biomarcadores identificados neste pedido também podem ser usados na determinação se um indivíduo não exibindo qualquer sintoma de uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose ou cardiomiopatia. Os biomarcadores podem ser usados, por exemplo, para determinar se um indivíduo é predisposto ao desenvolvimento, por exemplo, de resistência à insulina. Tais métodos de determinação se um indivíduo que não tem sintoma de uma determinada doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose ou cardiomiopatia, é predisposto ao desenvolvimento de uma determinada doença ou condição compreendem (1) análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores listados nas respectivas tabelas (por exemplo, Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, e combinações dos mesmos) na amostra e (2) comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores para níveis de referência na amostra positivos para doença ou condição e/ou negativos para doença ou condição de um ou mais biomarcadores a fim de determinar se o indivíduo é predisposto ao desenvolvimento da respectiva doença ou condição. Por exemplo, a identificação de biomarcadores para resistência à insulina considera a determinação se um indivíduo que não tem sintomas de resistência à insulina é predisposto a desenvolver resistência à insulina. Um método de determinação se um indivíduo que não tem sintomas de resistência à insulina é predisposto ao desenvolvimento de re- sistência à insulina compreende (1) análise de uma amostra biológica de um indivíduo para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomar- cadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, e 9B, e combinações dos mesmos na amostra e (2) comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de níveis de referência na amostra de resistência à insulina positiva e/ou resistência à insulina negativa de um ou mais biomarcadores a fim de determinar se o indivíduo é predisposto ao desenvolvimento de resistência à insulina. Os resultados do método podem ser usados junto com outros métodos (ou os resultados dos mesmos) úteis na determinação clínica se um indivíduo é predisposto ao desenvolvimento da doença ou condição.
[000111] Após o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra ser determinado, o(s) nível(is) é comparado aos níveis de referência positivos para doença ou condição e/ou negativos para doença ou condição a fim de predizer se o indivíduo é predisposto ao desenvolvimento de uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose ou cardiomiopatia. Os níveis de um ou mais biomarcadores em uma amostra correspondente aos níveis de referência positivos para doença ou condição (por exemplo, níveis que são os mesmos que os níveis de referência, substancialmente os mesmos que os níveis de referência, acima e/ou abaixo dos níveis de referência mínimos e/ou máximos, e/ou dentro da faixa dos níveis de referência) são indicativos do indivíduo que é predisposto ao desenvolvimento da doença ou condição. Níveis de um ou mais biomarcadores em uma amostra correspondente aos níveis de referência negativos para doença ou condição (por exemplo, níveis que são os mesmos que os níveis de referência, substancialmente os mesmos que os níveis de referência acima e/ou abaixo dos níveis de referência mínimos e/ou máximos, e/ou dentro da faixa dos níveis de referência) são indicativos do indivíduo que não é predisposto ao de- senvolvimento da doença ou condição. Além disso, os níveis de um ou mais biomarcadores que estão presentes diferencialmente (especialmente em um nível que é estatisticamente significante) na amostra quando comparado aos níveis de referência negativos para doença ou condição podem ser indicativos do indivíduo que é predisposto ao desenvolvimento da doença ou condição. Os níveis de um ou mais bio- marcadores que estão presentes diferencialmente (especialmente em um nível que é estatisticamente significante) na amostra quando comparado aos níveis de referência positivos para doença ou condição são indicativos do indivíduo que não é predisposto ao desenvolvimento da doença ou condição.
[000112] Por meio do exemplo, após o(s) nível(is) de um ou mais bi- omarcadores na amostra ser determinado, o(s) nível(is) é(são) compa- rado(s) aos níveis de referência de resistência à insulina positiva e/ou resistência à insulina negativa a fim de predizer se o indivíduo é predisposto ao desenvolvimento de resistência à insulina. Os níveis de um ou mais biomarcadores em uma amostra correspondente aos níveis de referência de resistência à insulina positiva (por exemplo, níveis que são os mesmos que os níveis de referência, substancialmente os mesmos que os níveis de referência acima e/ou abaixo dos níveis de referência mínimos e/ou máximos, e/ou dentro da faixa dos níveis de referência) são indicativos do indivíduo que é predisposto ao desenvolvimento de resistência à insulina. Níveis de um ou mais bio- marcadores em uma amostra correspondente aos níveis de referência de resistência à insulina negativa (por exemplo, níveis que são os mesmos que os níveis de referência, substancialmente os mesmos que os níveis de referência acima e/ou abaixo dos níveis de referência mínimos e/ou máximos, e/ou dentro da faixa dos níveis de referência) são indicativos do indivíduo que não é predisposto ao desenvolvimento de resistência à insulina. Além disso, os níveis de um ou mais biomar- cadores que estão presentes diferencialmente (especialmente a um nível que é estatisticamente significante) na amostra quando comparado aos níveis de referência de resistência à insulina negativa são indicativos do indivíduo que é predisposto ao desenvolvimento de resistência à insulina. Os níveis de um ou mais biomarcadores que estão presentes diferencialmente (especialmente a um nível que é estatisticamente significante) na amostra quando comparado aos níveis de referência de resistência à insulina positiva são indicativos do indivíduo que não é predisposto ao desenvolvimento de resistência à insulina. Embora a resistência à insulina seja discutida neste exemplo, a pré- disposição para outras doenças ou condições também pode ser determinada conforme este método pelo uso de um ou mais dos respectivos biomarcadores como apresentados acima.
[000113] Além disso, também pode ser possível determinar níveis de referência específicos para a avaliação se um indivíduo que não tem uma doença ou condição, tal como resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose ou cardiomiopatia, é predisposto ao desenvolvimento de uma doença ou condição. Por exemplo, pode ser possível determinar níveis de referência dos bio- marcadores para avaliar graus diferentes de risco (por exemplo, baixo, médio, alto) em um indivíduo para desenvolver uma doença ou condição. Tais níveis de referência podem ser usados para comparação aos níveis de um ou mais biomarcadores em uma amostra biológica de um indivíduo.
V. Monitoramento de Eficácia Terapêutica:
[000114] Os biomarcadores fornecidos também consideram a avaliação da eficácia de uma composição para tratar uma doença ou condição, tal como resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, sín- drome metabólica, aterosclerose ou cardiomiopatia. Por exemplo, a identificação de biomarcadores para resistência à insulina também con- sidera a avaliação da eficácia de uma composição para tratar a resistência à insulina bem como a avaliação da eficácia relativa de duas ou mais composições para tratar a resistência à insulina. Tal avaliação pode ser usada, por exemplo, em estudos de eficácia bem como na seleção direcionada de composições para tratar a doença ou condição.
[000115] Dessa forma, são também fornecidos métodos de avaliação da eficácia de uma composição para tratar uma doença ou condição, tal como resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia compreendendo (1) análise, de um indivíduo (ou grupo de indivíduos) tendo uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose ou cardiomiopatia e atualmente ou anteriormente sendo tratado com uma composição, uma amostra biológica (ou grupo de amostras) para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores da desordem selecionada a partir das Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e combinações dos mesmos, e (2) comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra a (a) nível(is) de um ou mais biomarcadores em uma amostra biológica anteriormente tomada do indivíduo, em que a amostra biológica anteriormente tomada foi obtida do indivíduo antes de ser tratado com a composição, (b) níveis de referência doença ou condição positiva de um ou mais biomarcadores, (c) níveis de referência negativos para doença ou condição de um ou mais biomarcadores, (d) níveis de referência de progressão positivos para doença ou condição de um ou mais biomarcadores, e/ou (e) níveis de referência de regressão positivos para doença ou condição de um ou mais biomarcadores. Os resultados da comparação são indicativos da eficácia da composição para tratar a respectiva doença ou condição.
[000116] A modificação (se alguma) no(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores ao longo do tempo pode ser indicativa de progressão ou regressão da doença ou condição no indivíduo. Para caracterizar o curso de uma dada doença ou condição no indivíduo, o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na primeira amostra, o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na segunda amostra, e/ou os resultados da comparação dos níveis dos biomarcadores nas primeira e segunda amostras podem ser comparados aos respectivos níveis de referência de doença ou condição positiva e/ou negativos para doença ou condição de um ou mais biomarcadores. Se as comparações indicarem que o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores está(ão) aumentando ou diminuindo ao longo do tempo (por exemplo, na segunda amostra quando comparada à primeira amostra) para tornar-se mais similares aos níveis de referência positivos para doença ou condição (ou menos similar aos níveis de referência negativos para doença ou condição), então os resultados são indicativos da progressão da doença ou condição. Se as comparações indicarem que o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores está aumentando ou diminuindo ao longo do tempo para tornar-se mais similar aos níveis de referência da negativos para doença ou condição (ou menos similar aos níveis de referência positivos para doença ou condição), então os resultados são indicativos da regressão da doença ou condição.
[000117] Por exemplo, a fim de caracterizar o curso da resistência à insulina no indivíduo, o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na primeira amostra, o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na segunda amostra, e/ou os resultados da comparação dos níveis dos bi- omarcadores nas primeira e segunda amostras podem ser comparados aos níveis de referência de resistência à insulina positiva e/ou resistência à insulina negativa de um ou mais biomarcadores. Se as comparações indicarem que o(s) nível(is) de um ou mais biomarcado- res está aumentando ou diminuindo ao longo do tempo (por exemplo, na segunda amostra quando comparada à primeira amostra) para tor- nar-se mais similar à níveis de referência de resistência à insulina positiva (ou menos similar aos níveis de referência de resistência à insulina negativa), então os resultados são indicativos da progressão de resistência à insulina. Se as comparações indicam que o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores está(ão) aumentando ou diminuindo ao longo do tempo para tornar-se mais similar aos níveis de referência de resistência à insulina negativa (ou menos similar aos níveis de referência de resistência à insulina positiva), então os resultados são indicativos da regressão de resistência à insulina.
[000118] A segunda amostra pode ser obtida do indivíduo em qualquer período de tempo após a primeira amostra seja obtida. Em um aspecto, a segunda amostra é obtida 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou mais dias após a primeira amostra ou após o início da administração de uma composição. Em outro aspecto, a segunda amostra é obtida 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais semanas após a primeira amostra ou após o início da administração de uma composição. Em outro aspecto, a segunda amostra pode ser obtida 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ou mais meses após a primeira amostra ou após o início da administração de uma composição.
[000119] O curso de uma doença ou condição, tal como resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, ateroscle- rose, ou cardiomiopatia em um indivíduo também pode ser caracterizado pela comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na primeira amostra, do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na segunda amostra, e/ou dos resultados da comparação dos níveis dos biomarcadores nas primeira e segunda amostras aos níveis de referência de progressão positivos para doença ou condição e/ou de regressão positivos para doença ou condição. Se as comparações indicarem que o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores está(ão) aumentando ou diminuindo ao longo do tempo (por exemplo, na segunda amostra quando comparada à primeira amostra) para tornar-se mais similar à níveis de referência de progressão positivos para doença ou condição (ou menos similar à níveis de referência de regressão positivos para doença ou condição), então os resultados são indicativos da progressão da doença ou condição. Se as comparações indicarem que o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores está(ão) aumentando ou diminuindo ao longo do tempo para tornar-se mais similar à níveis de referência de regressão positivos para doença ou condição (ou menos similar à níveis de referência de progressão positivos para doença ou condição), então os resultados são indicativos da regressão de doença ou condição.
[000120] Tal como acontece com outros métodos descritos neste pedido, as comparações feitas nos métodos de monitoramento de pro- gressão/regressão de uma doença ou condição, tal como resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, ateroscle- rose, ou cardiomiopatia em um indivíduo pode ser realizados usando várias técnicas, incluindo comparações simples, uma ou mais análises estatísticas, e combinações dos mesmos.
[000121] Os resultados do método podem ser usados junto com outros métodos (ou resultados dos mesmos) úteis no monitoramento clínico da progressão/regressão da doença ou condição em um indivíduo.
[000122] Como descrito acima com relação a métodos de diagnóstico (ou auxílio no diagnóstico de) uma doença ou condição, tal como resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia, qualquer método adequado pode ser usado para analisar as amostras biológicas a fim de determinar o(s) ní- vel(is) de um ou mais biomarcadores nas amostras. Além disso, o(s) nível(is) um ou mais biomarcadores, incluindo uma combinação de todos os biomarcadores nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, e/ou 28, ou qualquer fração dos mesmos, pode ser determinado e usado em métodos de monitoramento da progres- são/regressão da respectiva doença ou condição em um indivíduo.
[000123] Tais métodos podem ser conduzidos para monitorar o curso do desenvolvimento de doença ou condição em indivíduos, por exemplo, o curso do pré-diabetes para diabetes tipo 2 em um indivíduo que tem pré-diabetes, ou podem ser usados em indivíduos que não têm uma doença ou condição (por exemplo, indivíduos suspeitos de serem predispostos ao desenvolvimento da doença ou condição) a fim de monitorar níveis de pré-disposição para a doença ou condição.
[000124] Estudos clínicos em todo mundo foram realizados para testar se terapias antidiabéticas, tais como metformina ou acarbose, pode prevenir a progressão de diabetes em pacientes pré-diabéticos. Estes estudos mostraram que tais terapias podem prevenir o início de diabetes. No Programa de Prevenção de Diabetes dos Estados Unidos (DPP), a metformina reduziu a taxa de progressão para diabetes em 38% e a intervenção no estilo de vida e exercício reduziram a taxa de progressão para diabetes em 56%. Por causa de tais êxitos, a ADA revisou seus Padrões de Cuidados Médicos em Diabetes de 2008 para incluir as seguintes afirmações na seção na Prevenção/Retardo do Diabetes Tipo 2: "Além do aconselhamento de estilo de vida, a metformi- na pode ser considerada naqueles que estão em risco muito alto (IFG e IGT combinadas mais outros fatores de risco) e que são obesos e com menos de 60 anos".
[000125] Companhias farmacêuticas realizaram estudos para avaliar se certas classes de fármacos, tais como a classe PPAR de sensibi- lizadores insulínicos, podem prevenir a progressão de diabetes. Similar ao estudo DPP, alguns destes estudos mostraram grande promessa e êxito para prevenir o diabetes, ao passo que os outros expuseram certa quantidade de risco associado com certos tratamentos farmacológicos antidiabéticos quando dado à população pré-diabética geral como definido pelos diagnósticos de IR atuais. As companhias farmacêuticas estão em necessidade de diagnósticos que possam identificar e estratificar pré-diabéticos de alto risco, portanto podem avaliar a eficácia de seus candidatos terapêuticos pré-diabéticos mais efetivamente e seguramente.
[000126] Considerando a infrequência dos procedimentos de teste de tolerância à glicose oral (OGTT) no cenário clínico, um novo teste diagnóstico que diretamente mede a resistência à insulina em uma amostra de jejum permitiria a um médico identificar e estratificar pacientes que estão se movendo em direção à etiologia de pré-diabetes e doença cardiovascular muito antes.
VI. Identificação de Respondedores e Não Respondedores à Terapêutica:
[000127] Os biomarcadores fornecidos também consideram a identificação de indivíduos nos quais a composição para tratar uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia é eficaz (isto é, o paciente responde à terapêutica). Por exemplo, a identificação de biomarcadores para resistência à insulina também considera a avaliação da resposta do indivíduo a uma composição para tratar a resistência à insulina, bem como a avaliação da resposta do paciente em relação a duas ou mais composições para tratar a resistência à insulina. Tal avaliação pode ser usada, por exemplo, na seleção de composições para tratar a doença ou condição de certos indivíduos.
[000128] Dessa forma, também são fornecidos métodos de predição da resposta de um paciente a uma composição para tratar uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia compreendendo (1) análise de um indivíduo (ou grupo de indivíduos) tendo uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, ate- rosclerose, ou cardiomiopatia e atualmente ou anteriormente sendo tratado com uma composição, uma amostra biológica (ou grupo de amostras) para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores da desordem selecionada a partir das Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, e 28, e combinações dos mesmos, e (2) comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra ao(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores em uma amostra biológica anteriormente tomada do indivíduo, em que a amostra biológica anteriormente tomada foi obtida do indivíduo antes de ser tratado com a composição, (b) níveis de referência positivos para doença ou condição de um ou mais biomarcadores, (c) níveis de referência negativos para doença ou condição de um ou mais biomarcadores, (d) níveis de referência de progressão positivos para doença ou condição de um ou mais biomarcadores, e/ou (e) níveis de referência de regressão positivos para doença ou condição de um ou mais biomarcadores. Os resultados da comparação são indicativos da resposta do paciente à com-posição para tratar a respectiva doença ou condição.
[000129] A modificação (se alguma) no(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores ao longo do tempo pode ser indicativa da resposta do indivíduo à terapêutica. Para caracterizar o curso de uma dada terapêutica no indivíduo, o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na primeira amostra, o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na segunda amostra, e/ou os resultados da comparação dos níveis dos bi- omarcadores nas primeira e segunda amostras podem ser comparados aos respectivos níveis de referência positivos para doença ou condição e/ou negativos para doença ou condição de um ou mais bio- marcadores. Se as comparações indicarem que o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores está aumentando ou diminuindo ao longo do tempo (por exemplo, na segunda amostra quando comparada à primeira amostra) para tornar-se mais similar aos níveis de referência à doença ou condição positiva (ou menos similar aos níveis de referência negativos para doença ou condição), então os resultados são indicativos do paciente que não responde à terapêutica. Se as comparações indicarem que o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores está aumentando ou diminuindo ao longo do tempo para tornar-se mais similar aos níveis de referência negativos para doença ou condição (ou menos similar aos níveis de referência doença ou condição positiva), então os resultados são indicativos do paciente que responde à terapêutica.
[000130] Por exemplo, para caracterizar a resposta do paciente a uma terapêutica para resistência à insulina, o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na primeira amostra, o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na segunda amostra, e/ou os resultados da comparação dos níveis dos biomarcadores na primeira e segunda amostras podem ser comparados aos níveis de referência de resistência à insulina positiva e/ou resistência à insulina negativa de um ou mais bio- marcadores. Se as comparações indicarem que o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores está(ão) aumentando ou diminuindo ao longo do tempo (por exemplo, na segunda amostra quando comparada com a primeira amostra) para tornar-se mais similar aos níveis de referência de resistência à insulina positiva (ou menos similar aos níveis de referência de resistência à insulina negativa), então os resultados são indicativos da não resposta à terapêutica. Se as comparações indicarem que o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores está(ão) aumentando ou diminuindo ao longo do tempo para tornar-se mais similar aos níveis de referência de resistência à insulina negativa (ou menos similar aos níveis de referência de resistência à insulina positiva), então os resultados são indicativos da resposta à terapêutica.
[000131] A segunda amostra pode ser obtida do indivíduo em qualquer período de tempo após a primeira amostra ser obtida. Em um aspecto, a segunda amostra é obtida 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou mais dias após a primeira amostra. Em outro aspecto, a segunda amostra é obtida 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais semanas após primeira amostra ou após início do tratamento com a composição. Em outro aspecto, a segunda amostra pode ser obtida 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, ou mais meses após primeira amostra ou após início do tratamento com a composição.
[000132] Tal como outros métodos descritos neste pedido, as comparações feitas nos métodos de determinação de uma resposta do paciente a uma terapêutica para uma doença ou condição, tal como resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia em um indivíduo pode ser realizada usando várias técnicas, incluindo comparações simples, uma ou mais análises estatísticas, e combinações das mesmas.
[000133] Os resultados do método podem ser usados junto com outros métodos (ou os resultados dos mesmos) úteis na determinação de uma resposta do paciente a uma terapêutica para doença ou condição em um indivíduo.
[000134] Como descrito acima com relação a métodos de diagnóstico (ou auxílio no diagnóstico de) uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia, qualquer método adequado pode ser usado para analisar as amostras biológicas a fim determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores nas amostras. Além disso, o(s) nível(is) um ou mais biomarcadores, incluindo uma combinação de todos os biomar- cadores nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, e/ou 28, ou qualquer fração dos mesmos, pode ser determinado e usado em métodos de monitoramento da progres- são/regressão da respectiva doença ou condição em um indivíduo.
[000135] Tais métodos podem ser conduzidos para monitorar a resposta do paciente a uma terapêutica para o desenvolvimento de uma doença ou condição em indivíduos, por exemplo, o curso do pré- diabetes para diabetes tipo 2 em um indivíduo que tem pré-diabetes, ou podem ser usados em indivíduos que não têm uma doença ou condição (por exemplo, indivíduos suspeitos de serem predispostos ao desenvolvimento da doença ou condição) a fim de monitorar níveis de pré-disposição à doença ou condição.
[000136] Companhias farmacêuticas realizaram estudos para avaliar se certas classes de fármacos, tais como a classe PPAR de sensibi- lizadores insulínicos, podem prevenir a progressão de diabetes. Alguns destes estudos mostraram grande promessa e êxito para prevenir o diabetes, ao passo que outros expuseram certa quantidade do risco associado com certos tratamentos farmacológicos antidiabéticos quando dado à população pré-diabética geral como definido pelos diagnósticos de IR atuais. As companhias farmacêuticas precisam de diagnósticos que possam identificar respondedores e não- respondedores a fim de estratificar pré-diabéticos de alto risco para avaliar a eficácia de seus candidatos terapêuticos pré-diabéticos mais efetivamente e seguramente. Um novo teste diagnóstico que discrimina pacientes não-respondedores de respondedores a uma terapêutica permitiria a companhias farmacêuticas identificar e estratificar pacientes que provavelmente responderão ao agente terapêutico e terapêuticos alvo-específicos para certas coortes que provavelmente responderão à terapêutica.
VII. Métodos de Classificação de uma Composição de Atividade em Modulação de Biomarcadores
[000137] Os biomarcadores fornecidos neste pedido também consideram a classificação de composições para atividade na modulação de biomarcadores associados com uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, e cardiomiopatia, que podem ser úteis no tratamento da doença ou con dição. Tais métodos compreendem avaliação de compostos teste para atividade na modulação dos níveis de um ou mais biomarcadores selecionados a partir dos respectivos biomarcadores listados nas respectivas tabelas. Tais ensaios de classificação podem ser conduzidos in vitro e/ou in vivo, e podem estar em qualquer forma conhecida na técnica útil para analisar a modulação de tais biomarcadores na presença de uma composição teste tal como, por exemplo, ensaios de cultura celular, ensaios de cultura de órgão, e ensaios in vivo (por exemplo, ensaios que envolvem modelos animais). Por exemplo, a identificação de biomarcadores para resistência à insulina também considera a classificação de composições para atividade na modulação de biomar- cadores associados com a resistência à insulina, que podem ser úteis no tratamento de resistência à insulina. Métodos de classificação de composições úteis para o tratamento da resistência à insulina compreende avaliação de composições teste para atividade na modulação dos níveis de um ou mais biomarcadores nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, e/ou 28. Embora a resistência à insulina seja discutida neste exemplo, outras doenças e condições, tais como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, e cardiomiopatia também podem ser diagnosticadas ou auxiliadas a serem diagnosticadas conforme este método pelo uso de um ou mais dos respectivos bio- marcadores como apresentados acima.
[000138] Os métodos para classificação de uma composição para atividade na modulação de um ou mais biomarcadores de uma doença ou condição, tal como resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, e cardiomiopatia compreende (1) contato de uma ou mais células com uma composição, (2) análise de pelo menos uma porção de uma ou mais células ou uma amostra biológica associada com as células para determinar o(s) ní- vel(is) de um ou mais biomarcadores de uma doença ou condição se- lecionados a partir dos biomarcadores fornecidos nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, e/ou 26; e (3) comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores com níveis-padrão predeterminados de um ou mais biomarcadores para determinar se a composição modulou o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores. Em uma modalidade, um método para classificação de uma composição para atividade na modulação de um ou mais biomarcadores de resistência à insulina compreende (1) contato de uma ou mais células com uma composição, (2) análise de pelo menos uma porção de uma ou mais células ou uma amostra biológica associada com as células para determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de resistência à insulina selecionada a partir das Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, e/ou 9B; e (3) comparação do(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores com níveis padrão predeterminados de um ou mais biomarcadores para determinar se a composição modulou o(s) nível(is) de um ou mais bio- marcadores. Como discutido acima, as células podem ser contatadas com a composição in vitro e/ou in vivo. Os níveis padrão predeterminados de um ou mais biomarcadores podem ser os níveis de um ou mais biomarcadores em uma ou mais células na ausência da composição. Os níveis padrão predeterminados de um ou mais biomarcado- res também podem ser o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores em células controle não contatadas com a composição.
[000139] Além disso, os métodos podem compreender ainda a análise de pelo menos uma porção de uma ou mais células ou uma amostra biológica associada com as células para determinar o(s) nível(is) de um ou mais compostos não-biomarcadores de uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, ate- rosclerose, e cardiomiopatia. Os níveis dos compostos não- biomarcadores então podem ser comparados aos níveis padrão predeterminados de um ou mais compostos não-biomarcadores.
[000140] Qualquer método adequado pode ser usado para analisar pelo menos uma porção de uma ou mais células ou uma amostra biológica associada com as células a fim de determinar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores (ou níveis de compostos não- biomarcadores). Métodos adequados incluem cromatografia (por exemplo, HPLC, cromatografia gasosa, cromatografia líquida), espec- trometria de massa (por exemplo, MS, MS-MS), ELISA, ligação ao anticorpo, outras técnicas imunoquímicas, reações ou ensaios bioquímicos ou enzimáticos, e combinações dos mesmos. Além disso, o(s) ní- vel(is) de um ou mais biomarcadores (ou os níveis de compostos não- biomarcadores) podem ser medidos indiretamente, por exemplo, pelo uso de um ensaio que mede o nível de um composto (ou compostos) que se correlaciona com o nível do biomarcador(es) (ou compostos não-biomarcadores) que são desejados a serem medidos.
VIII. Método de Identificação Potenciais-alvos de Fármaco
[000141] A descrição também fornece métodos de identificação de potenciais-alvos de fármaco para doenças ou condições, tais como resistência à insulina, pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose e cardiomiopatia, usando os biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, e/ou 28. Um método para identificação um potencial-alvo de fármaco para uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, a síndrome metabólica, a aterosclerose e a cardiomiopatia compreendem (1) identificação de uma ou mais vias bioquímicas associadas com um ou mais biomarcadores de uma desordem metabólica relacionada à síndrome metabólica selecionada a partir das respectivas tabelas (Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, e/ou 28); e (2) identificação de uma proteína (por exemplo, uma enzima) que afeta pelo menos uma de uma ou mais vias bioquímicas iden-tificadas, a proteína sendo um potencial-alvo de fármaco para doença ou condição. Por exemplo, a identificação de biomarcadores de resistência à insulina também considera a identificação de potenciais-alvos de fármaco para resistência à insulina. Um método para identificação um potencial-alvo fármaco de resistência à insulina compreende (1) identificação de uma ou mais vias bioquímicas associadas com um ou mais biomarcadores de resistência à insulina selecionados a partir das Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, e/ou 28, e (2) identificação de uma proteína (por exemplo, uma enzima) que afeta pelo menos uma de uma ou mais vias bioquímicas identificadas, a proteína sendo um potencial-alvo de fármaco para resistência à insulina. Embora a resistência à insulina seja discutida neste exemplo, outras doenças ou condições, tais como diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose e cardiomiopatia, também podem ser diagnosticadas ou auxiliadas a serem diagnosticadas conforme este método pelo uso de um ou mais dos respectivos biomarcadores como apresentados acima.
[000142] Outro método para identificação um potencial-alvo de fár- maco para uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, e cardiomiopatia compreende (1) identificação de uma ou mais vias bioquímicas associadas com um ou mais biomarcadores de uma desordem metabólica relacionada à síndrome metabólica selecionada a partir da respectiva tabe- la(s) (Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, e/ou 28) e um ou mais compostos não-biomarcadores da doença ou condição e (2) identificação de uma proteína que afeta pelo menos uma de uma ou mais vias bioquímicas identificadas, a proteína sendo um potencial-alvo de fármaco para a doença ou condição. Por exemplo, um método para identificação de um potencial-alvo de fármaco para resistência à insulina compreende (1) identificação de uma ou mais vias bioquímicas associadas com um ou mais biomarcadores de resistência à insulina selecionados a partir das Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, e/ou 28, e um ou mais compostos não-biomarcadores de resistência à insulina e (2) identificação de uma proteína que afeta pelo menos uma de uma ou mais vias bioquímicas identificadas, a proteína sendo um potencial-alvo de fármaco para resistência à insulina.
[000143] Uma ou mais vias bioquímicas (por exemplo, via biossinté- tica e/ou metabólica (catabólica)) são identificadas que estão associadas com um ou mais biomarcadores (ou compostos não- biomarcadores). Após as vias bioquímicas serem identificadas, uma ou mais proteínas que afetam pelo menos uma das vias são identificadas. Preferencialmente, aquelas proteínas que afetam mais de uma das vias são identificadas.
[000144] Um aumento de um metabolito (por exemplo, um intermediário da via) pode indicar a presença de um 'bloco' a jusante do meta- bolito e o bloco pode resultar em um nível baixo/ausente de um meta- bolito a jusante (por exemplo, produto de uma via biossintética). De uma maneira similar, a ausência de um metabolito pode indicar a presença de um 'bloco' na via a montante do metabolito que resulta em enzima(s) inativa(s) ou não-funcional(ais) ou de indisponibilidade de intermediários bioquímicos que são substratos necessários para produzir o produto. Alternativamente, um aumento no nível de um meta- bolito pode indicar uma mutação genética que produz uma proteína aberrante que resulta na superprodução e/ou acúmulo de um metaboli- to que então leva a uma alteração de outras vias bioquímicas relacionadas e resulta na desregulação do fluxo normal através da via; além disso, o aumento do metabolito bioquímico intermediário pode ser tóxico ou pode comprometer a produção de um intermediário necessário de uma via relacionada. É possível que a relação entre vias seja atualmente desconhecida e estes dados podem revelar tal relação.
[000145] As proteínas identificadas como potenciais-alvos de fárma- co então podem ser usadas para identificar composições que podem ser candidatos potenciais para tratar uma determinada doença ou condição, tal como resistência à insulina, incluindo composições para terapia gênica.
IX. Métodos de Tratamento
[000146] Em outro aspecto, métodos para tratamento de uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, e cardiomiopatia são fornecidos. Os métodos geralmente envolvem o tratamento de um indivíduo que tem uma doença ou condição, tal como pré-diabetes, diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose e cardiomiopatia com uma quantidade eficaz de um ou mais biomarcador(es) que estão reduzidos em um indivíduo que tem a doença ou condição quando comparado a um indivíduo saudável não tendo a doença ou condição. Os biomarcadores que podem ser administrados podem compreender um ou mais dos biomar- cadores nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e/ou 29 que são reduzidos a um estado de condição ou doença quando comparado a indivíduos não tendo aquela doença ou condição. Tais biomarcadores podem ser isolados com base na identidade do composto biomarcador (isto é, nome do composto). Os bio- marcadores que são metabólitos atualmente não-denominados podem ser isolados com base nas caracterizações analíticas dos biomarcado- res listados nos Exemplos abaixo (por exemplo, Tabela 29). Em algumas modalidades, os biomarcadores que são administrados são um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e/ou 29 que são reduzidos a uma desordem metabólica relacionada à síndrome metabólica e que tem um valor p menor que 0,05 ou um valor q menor que 0,10, ou tanto um valor p menor que 0,05 como um valor q menor que 0,10, como de-terminado pelo uso de um teste T de Welch ou Teste de soma de ordens de Wilcoxon. Em outras modalidades, os biomarcadores que são administrados são biomarcador ou biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e/ou 29 que são reduzidos em uma doença ou uma condição e que tem uma correlação positiva ou negativa com uma doença ou uma condição. Em uma modalidade, os biomarcadores têm uma correlação positiva ou negativa > +0,5 ou < -0,5, respectivamente, com uma doença ou uma condição. Em outras modalidades, os biomarcadores que são administrados são biomarcador ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e/ou 29 que são reduzidos em uma doença ou condição em pelo menos 5%, em pelo menos 10%, em pelo menos 15%, em pelo menos 20%, em pelo menos 25%, em pelo menos 30%, em pelo menos 35%, em pelo menos 40%, em pelo menos 45%, em pelo menos 50%, em pelo menos 55%, em pelo menos 60%, em pelo menos 65%, em pelo menos 70%, em pelo menos 75%, em pelo menos 80%, em pelo menos 85%, em pelo menos 90%, em pelo menos 95%, ou em 100% (isto é, ausente). Em um exemplo, a identificação de biomarcadores de resistência à insulina também considera o tratamento de resistência à insulina. Por exemplo, a fim de tratar um indivíduo que tem resistência à insulina, uma quantidade eficaz de um ou mais biomarcadores de resistência à insulina que são reduzidos em indivíduos que têm resistência à insulina quando comparados a um indivíduo saudável não tendo resistência à insulina pode ser administrada ao indivíduo. Os biomarcadores que podem ser administrados podem compreender um ou mais dos biomarcadores nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 27, 28, e/ou 29 que estão reduzidos em um indivíduo que tem resistência à insulina. Embora a resistência à insulina seja discutida neste exemplo, outras doenças ou condições, tais como diabetes tipo 2, síndrome metabólica, aterosclerose, e cardiomiopatia, também podem ser tratadas conforme este método pelo uso de um ou mais dos respectivos bio- marcadores como apresentados acima.
X. Métodos de Uso de Biomarcadores para Outras Doenças ou Condições
[000147] Em outro aspecto, pelo menos alguns biomarcadores descritos neste pedido para uma determinada doença ou condição também podem ser biomarcadores de outras doenças ou condições. Por exemplo, acredita-se que pelo menos alguns biomarcadores de resistência à insulina podem ser usados nos métodos descritos neste pedido para outras doenças ou condições (por exemplo, síndrome metabólica). Isto é, os métodos descritos neste pedido com respeito à resistência à insulina também podem ser usados para diagnosticar (ou auxiliar no diagnóstico de) uma doença ou condição, tal como diabetes tipo 2, síndro- me metabólica, aterosclerose, ou cardiomiopatia, métodos de monitoramento de progressão/regressão de tal doença ou condição, métodos de avaliação de eficácia de composições para tratamento de tal doença ou condição, métodos de classificação de uma composição para atividade na modulação de biomarcadores associados com tal doença ou condição, métodos de identificação de potenciais-alvos de fármaco para tais doenças e condições, e métodos de tratamento de tais doenças e condições. Tais métodos podem ser conduzidos como descrito neste pedido com respeito à resistência à insulina.
XI. Outros métodos
[000148] Outros métodos de uso dos biomarcadores discutidos neste pedido também são contemplados. Por exemplo, os métodos descritos na Patente US N° 7.005.255 e Pedidos de Patente US N°s 11/357.732, 10/695.265 (Publicação No. 2005/0014132), 11/301.077 (Publicação No. 2006/0134676), 11/301.078 (Publicação No. 2006/0134677),11/301.079 (Publicação No. 2006/0134678), e 11/405.033 podem ser conduzidos usando um perfil de pequena molécula compreendendo um ou mais dos biomarcadores descritos neste pedido.
[000149] Em quaisquer dos métodos listados neste pedido, os bio- marcadores que são usados podem ser selecionados a partir dos bio- marcadores nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e/ou 29 tendo valores p de menos que 0,05 e/ou os biomarcadores nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e/ou 29 tendo valores q de menos que 0,10, e/ou tendo uma correlação positiva ou negativa > +0,5 ou < -0,5, respectivamente, com uma desordem. Os biomarcadores que são usados em quaisquer dos métodos descritos neste pedido também podem ser selecionados a partir dos biomarcadores nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e/ou 29 que estão reduzidos em uma desordem metabólica relacionada à síndrome metabólica (quando comparados ao controle ou remissão) ou que estão reduzidos na remissão (quando comparados ao controle ou uma determinada doença ou condição) em pelo menos 5%, em pelo menos 10%, em pelo menos 15%, em pelo menos 20%, em pelo menos 25%, em pelo menos 30%, em pelo menos 35%, em pelo menos 40%, em pelo menos 45%, em pelo menos 50%, em pelo menos 55%, em pelo menos 60%, em pelo menos 65%, em pelo menos 70%, em pelo menos 75%, em pelo menos 80%, em pelo menos 85%, em pelo menos 90%, em pelo menos 95%, ou em 100% (isto é, ausente); e/ou os biomarca- dores nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, e/ou 29 que estão aumentados em uma dada doença ou condição (quando comparados ao controle ou remissão) ou que estão aumentados na remissão (quando comparados ao controle ou uma dada doença ou condição) em pelo menos 5%, em pelo menos 10%, em pelo menos 15%, em pelo menos 20%, em pelo menos 25%, em pelo menos 30%, em pelo menos 35%, em pelo menos 40%, em pelo menos 45%, em pelo menos 50%, em pelo menos 55%, em pelo menos 60%, em pelo menos 65%, em pelo menos 70%, em pelo menos 75%, em pelo menos 80%, em pelo menos 85%, em pelo menos 90%, em pelo menos 95%, em pelo menos 100%, em pelo menos 110%, em pelo menos 120%, em pelo menos 130%, em pelo menos 140%, em pelo menos 150%, ou mais.
Exemplos 1. Métodos Gerais A. Identificação de Perfis Metabólicos
[000150] Cada amostra foi analisada para determinar a concentração de várias centenas de metabólitos. As técnicas analíticas, tais como GC-MS (cromatografia gasosa-espectrometria de massa) e LC-MS (cromatografia líquida-espectrometria de massa) foram usadas para analisar os metabólitos. Múltiplas alíquotas foram simultaneamente, e em paralelo, analisadas, e, após controle de qualidade apropriado (QC), a informação derivada de cada análise foi recombinada. Cada amostra foi caracterizada de acordo com as vários milhares de características, as quais por fim totalizam várias centenas de espécies químicas. As técnicas usadas foram capazes de identificar compostos novos e quimicamente não-denominados.
B. Análise Estatística:
[000151] Os dados foram analisados usando vários métodos estatísticos para identificar moléculas (metabólitos conhecidos, denominados ou metabólitos não-denominados) presentes em níveis diferenciais em uma população ou subpopulação definível (por exemplo, biomarcado- res para amostras biológicas de síndrome metabólica comparadas às amostras biológicas controle ou comparadas aos pacientes em remissão de resistência à insulina) úteis para distinção entre as populações definíveis (por exemplo, resistência à insulina e controle, resistência à insulina e remissão, remissão e controle). Outras moléculas (metabóli- tos conhecidos, denominados ou metabólitos não-denominados) na população ou subpopulação definível também foram identificadas.
[000152] Análises de floresta randômica foram usadas para a classificação de amostras em grupos (por exemplo, doente ou saudável, resistente à insulina ou sensibilidade à insulina normal, aterosclerose ou normal, síndrome metabólica ou obesidade, mas não síndrome metabólica). Florestas randômicas fornecem uma estimativa de como podemos classificar indivíduos em um novo conjunto de dados em cada grupo, em contraste com um teste t, que testa se as médias desconhecidas de duas populações são diferentes ou não. Florestas randô- micas criam o grupo de árvores de classificação com base na amostragem contínua das unidades e compostos experimentais. Então cada observação é classificada com base nos votos da maioria de todas as árvores de classificação.
[000153] Análise de regressão foi realizada usando o método de Regressão de Floresta Randômica e o método de Correlação Univaria- da/Regressão Linear para construir modelos que são úteis para identificar os compostos biomarcadores que estão associados com doença ou indicadores de doença (por exemplo, aterosclerose, síndrome metabólica, Rd) e então identificar o composto biomarcador útil para classificar indivíduos de acordo com, por exemplo, o nível de utilização de glicose como normal, insulina prejudicada, ou resistente à insulina. Compostos biomarcadores que são úteis para predizer doença ou medidas de doença (por exemplo, aterosclerose, síndrome metabólica, Rd) e que são positivamente ou negativamente correlacionados com doença ou medidas de doença (por exemplo, aterosclerose, síndrome metabólica, Rd) foram identificados nestas análises. Todos os compostos biomarcadores identificados nestas análises foram estatisticamente significantes (p <0,05, q <0,1).
[000154] Particionamento recursivo relaciona-se a uma variável 'dependente' (Y) a uma coleção de variáveis independentes ('preditor') (X) a fim de descobrir -- ou simplesmente entender -- a relação elusiva, Y=f(X). A análise foi realizada com o programa JMP (SAS) para gerar uma árvore de decisão. A significância estatística de cada "divisão" dos dados pode ser colocada em um apoio mais quantitativo por valores p computacionais, que discernem a qualidade de uma divisão em relação a um evento randômico. O nível de significância de cada "divisão" de dados nos nós ou ramos da árvore foi computado como valores p, que discernem a qualidade da divisão em relação a um evento randômico. Foi dado como ValorLog, que é o log10 negativo de um valor p bruto.
[000155] Análises estatísticas foram realizadas com o programa "R" disponível na rede de alcance mundial no sítio da rede cran.r- project.org e em JMP 6.0.2 (SAS® Institute, Cary, NC).
Exemplo 2: Biomarcadores de Pré-diabetes 2A: Identificação de biomarcadores que se correlacionam com disponibilidade de glicose
[000156] Uma combinação de biomarcadores foi descoberta que, quando usada em um algoritmo, correlaciona-se com a taxa de disponibilidade de glicose (isto é, Rd). Além disso, o painel inicial de bio- marcadores pode ser restrita para o desenvolvimento de ensaios direcionados compreendidos de 15 a 30 metabólitos candidatos. Um algoritmo para predizer resistência à insulina foi desenvolvido.
[000157] Vários estudos foram conduzidos para identificar biomarca- dores que se correlacionam com disponibilidade de glicose. Em um primeiro estudo, amostras plasmáticas foram coletadas de 113 indivíduos magros, obesos ou diabéticos que tinham recebido o tratamento com um dos três diferentes fármacos tiazolidinadiona (T = troglitazona, R = rosiglitazona, ou P = pioglitazona) (Tabela 1). Amostras de referência obtidas dos indivíduos antes do tratamento (S = referência) serviram como controles. Uma a três amostras plasmáticas foram obtidas de cada indivíduo, com amostras coletadas na referência (todos os indivíduos; A), e após 12 semanas (B) ou 4 semanas (C) de tratamento com fármaco (Tabela 2). Taxa de disponibilidade de glicose foi medida em cada indivíduo pelo clamp euglicêmico hiperinsulinêmico (HI) após cada extração de sangue. Um total de 198 amostras plasmáticas foi coletado para análise.
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[000158] Em um segundo estudo, amostras plasmáticas foram coletadas de 402 indivíduos que foram equilibrados para idade e gênero. Os indivíduos foram submetidos ao clamp HI para determinar a taxa de disponibilidade de glicose (Rd) de cada indivíduo. Com base em um Teste de Tolerância à Glicose Oral (OGTT) ou um Teste de Glicose Plasmática de Jejum (FPGT), a tolerância à glicose dos indivíduos foi indicada como tolerância à glicose Normal (NGT), Glicose de Jejum Prejudicada (IFG) ou Tolerância à glicose Prejudicada (IGT). A coorte é descrita na Tabela 3.
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Abreviações Rd: Taxa de disponibilidade de glicose NGT: Tolerância à Glicose Normal (OGTT, <140 mg/dL ou < 7,8 mmol/L) IFG: Glicose de Jejum Prejudicada (Glicose plasmática de jejum, 100 a 125 mg/dL ou 5,6 a 6,9 mmol/L) IGT: Tolerância à Glicose Prejudicada (OGTT, 140 a 199 mg/dL ou 7,8 a 11,0 mmol/L)
[000159] Todas as amostras de ambos os estudos foram analisadas por GC-MS e LC-MS para identificar e quantificar a presença de pequenas moléculas nas amostras. Mais de 400 compostos foram detectados nas amostras.
[000160] Análises estatísticas foram realizadas para determinar os compostos que são úteis como biomarcadores. Regressão linear foi usada para correlacionar os níveis de referência de compostos individuais com a taxa de disponibilidade de glicose (Rd) como medida pelo clamp euglicêmico hiperinsulinêmico de cada indivíduo. Esta análise foi seguida pela análise de Floresta Randômica para identificar as variáveis mais úteis para a modelagem de Rd. Então, análise de Regressão LASSO foi realizada nas variáveis validadas cruzadamente da análise de Floresta Randômica para escolher a combinação de variáveis úteis para predizer Rd.
2B: Biomarcadores de utilização de glicose, moléculas positivamente e negativamente correlacionadas com a taxa de disponibilidade de glicose (Rd)
[000161] Biomarcadores foram descobertos por (1) análise de amostras de sangue extraídas de grupos diferentes de indivíduos humanos para determinar os níveis de metabólitos nas amostras e então (2) análise estatística dos resultados para determinar aqueles metabólitos que estavam diferencialmente presentes nos grupos de indivíduos e os metabólitos que se correlacionam com a taxa de disponibilidade de glicose, um indicador de sensibilidade à insulina.
[000162] As amostras plasmáticas usadas para a análise foram das coortes descritas nas Tabelas 1, 2 e 3; os indivíduos tinham várias taxas da disponibilidade de glicose (Rd). Com base nos valor de Rd, indivíduos foram classificados como resistentes à insulina (Rd < 4), insulina prejudicada (4 < Rd < 7,5) ou sensíveis à insulina (Rd> 7,5). Após os níveis de metabólitos serem determinados, os dados foram analisados usando Correlação Univariada/Regressão Linear.
[000163] Como listado abaixo na Tabela 4, os biomarcadores que foram descobertos foram correlacionados com a taxa de disponibilidade de glicose (Rd), um indicador de sensibilidade à insulina.
[000164] A tabela 4 inclui, para cada biomarcador listado, o valor p determinado na análise estatística dos dados acerca dos biomarcado- res, e a correlação (Corr) com Rd. Uma correlação positiva indica que o nível do biomarcador aumenta conforme os aumentos da taxa de disponibilidade de glicose. Uma correlação negativa indica que o nível do biomarcador diminui conforme os aumentos da taxa de disponibilidade de glicose. A faixa de correlações possíveis está entre 1,0 negativo (-) e 1,0 positiva (+). Um resultado de 1,0 negativo (-) significa uma correlação negativa perfeita, um 1,0 positivo (+) significa uma correlação positiva perfeita, e 0 significa nenhuma correlação. O termo "isó- baro" como usado na tabela indica os compostos que não podem ser distinguidos um dos outros na plataforma analítica usada na análise (isto é, os compostos em um isóbaro eluem quase ao mesmo tempo e têm similar (e, às vezes, exatamente a mesma) quantidade de íons, e dessa forma não podem ser distinguidos).
[000165] Os resultados desta análise mostraram os compostos individuais que são correlacionados com Rd tanto no estudo 1 como estudo 2; estes biomarcadores são listados na Tabela 4. Para cada biomarca- dor, o estudo, nome do composto, identificador no banco de dados, a importância mediana são dados. O ID de Biblioteca (ID_BLIB) indica a plataforma analítica que foi usada para medir o composto biomarcador. GC-MS é indicado pelo ID de Biblioteca (ID_Blib) 50 ao passo que LC- MS é indicado pelo ID de Biblioteca 61, 200 e 201. Os compostos bio- marcadores são ordenados na tabela pela significância estatística da correlação (valor-P). "RF_Ranque" refere-se ao escore de importância obtido para o biomarcador a partir de análise de Floresta Randômica. "Comp_ID" refere-se ao identificador no banco de dados interno daquele composto em nossa biblioteca interna de compostos.
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2C: Seleção Variável com Floresta Randômica para modelagem de Rd
[000166] 50 iterações de uma análise de floresta randômica com regressões de validação cruzada de 5 vezes completas (para o Estudo 1, esta análise incluiu somente dados de referência, n=111; enquanto para o Estudo 2, todas as amostras foram incluídas, n=402) foi realizado como se segue:
[000167] 80% dos dados foram usados como o conjunto de instrução para dirigir 1000 regressões de florestas randômicas, registrar o escore de importância e classificar as variáveis de acordo com seus escores de importância;
[000168] após, quatro variáveis de uma vez foram deletadas começando das variáveis classificadas mais abaixo, então a floresta randô- mica foi dirigida com as variáveis restantes no conjunto de instrução para predizer os 20% restantes dos dados (isto é, conjunto de teste). O erro e o R-quadrado para cada um foram registrados.
[000169] Para cada variável, o escore de importância médio/mediano e classificação através de toda a corrida foram calculados.
[000170] A seleção de variável é mais ou menos estável para apro-ximadamente as primeiras 30 a 60 variáveis.
2D: Estimativa do número de metabólitos considerado significante para a correlação Rd
[000171] Os valores de R-quadrado médios permanecem constantemente altos e os erros correspondentes permanecem constantemente baixos quando o número de metabólitos alcança aproximadamente 30 ou mais (Figuras 1 e 2), sugerindo que um total de aproximadamente 30 metabólitos possa ser suficiente para a construção de um algoritmo para correlacionar-se com Rd, embora também possa ser possível construir um algoritmo para correlacionar-se com Rd com base em uma combinação de menos de sete metabólitos. Por conseguinte, somente 30 a 50 melhores compostos validados cruzadamente foram selecionados para análises de regressão.
[000172] Com base em procedimentos de seleção de variável em floresta randômica, os compostos biomarcadores que são considerados confiavelmente significantes para a construção de um algoritmo para correlação Rd foram identificados. O escore de RF de cada um dos compostos biomarcadores é listado na coluna encabeçada por "Ranque RF" na Tabela 4.
2E: Modelagem de correlação Rd com compostos superiores
[000173] Com base nos experimentos de modelagem, os valores de R-quadrado médios permanecem constantemente altos e os erros cor-respondentes permanecem constantemente baixos quando o número de metabólitos alcança sete e acima (Figuras 3 e 4), sugerindo que uma combinação de sete metabólitos seja suficiente para a construção de um algoritmo para correlacionar-se com Rd, embora também possa ser possível construir um algoritmo para correlacionar-se com Rd baseado em uma combinação de menos de sete metabólitos.
2F: Regressão LASSO
[000174] Somente variáveis cruzadamente validadas a partir das análises de floresta randômica acima foram usadas para a Regressão LASSO para escolher a melhor combinação de variáveis para predizer Rd. A transformação mais apropriada das variáveis validadas cruzadamente também foi considerada para a Regressão LASSO.
[000175] Análise de Regressão LASSO com base na coorte no estudo 1 forneceu um dos melhores modelos de regressão Rd com três a nove variáveis e valores de r-quadrado validados cruzadamente para a correlação. O melhor valor de r-quadrado aproxima-se de 0,68 com sete a oito metabólitos usando os dados não-transformados (Tabela 5) e aproxima-se de 0,69 a 0,70 com o mesmo número de metabólitos com a transformação apropriada de cada variável (Tabela 6).
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[000176] O R-quadrado da correlação de Rd com 7 a 8 metabólitos aproxima-se de 0,70 com a validação cruzada em uma coorte inde-pendente.
[000177] Análise LASSO com base na coorte no estudo 1 forneceu os melhores modelos de regressão Rd com 3 a 9 variáveis com valores de r-quadrado validados cruzadamente para a correlação de outro conjunto aproximando-se de 0,68 com 7 a 8 metabólitos usando os dados não-transformados como mostrado na Tabela 7.
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2G: Modelos de precissão de resistência à insulina.
[000178] No estudo 2, os compostos identificados como importantes na criação de modelos para predizer Rd por Regressão Lasso e Floresta Randômica são listados na Tabela 4. Os compostos validados cruzadamente foram então selecionados para a análise de regressão junto com medidas clínicas (por exemplo, insulina de jejum, proinsulina de jejum, ácidos graxos livres (AGL)de jejum, peptídeo C de jejum, co-lesterol HDL, colesterol LDL, glicose plasmática de jejum, adiponecti- na, IMC, PYY, etc.) Cada método de regressão e o método do modelo de Correlação Univariada/Regressão Linear então foram usados para predizer Rd de cada indivíduo, que foi por sua vez usado para classificar indivíduos de acordo com o nível de utilização de glicose como normal, insulina prejudicada, ou resistente à insulina. Amostras de noventa por cento dos indivíduos foram usadas para construir o modelo e amostras de dez por cento restantes dos indivíduos foram usadas para testar o poder de precissão do modelo. Compostos biomarcadores que são úteis para predizer Rd e que são positivamente ou negativamente correlacionados com Rd foram identificados nestas análises. Estes marcadores são úteis para predizer a resistência à insulina. Todos os compostos biomarcadores são estatisticamente significantes (p <0,05) em cada um dos modelos de regressão.
[000179] Os modelos gerados usando esta abordagem analítica são resumidos na Tabela 8. A sensibilidade, especificidade e poder de precissão (positivo, PPV e negativo, NPV) dos modelos são mostrados na Tabela 8. A sensibilidade dos modelos varia de aproximadamente 54% a aproximadamente 63% e as faixas de especificidade de apro-ximadamente 63% a mais do que 95%. A faixa de PPV é de aproxima-damente 78% a aproximadamente 94% e o NPV de mais do que apro-ximadamente 79% a mais do que aproximadamente 83%.
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2H: Compostos Biomarcadores Correlacionados:
[000180] Muitos compostos biomarcadores foram correlacionados como mostrado nas Tabelas 9A e 9B. A tabela 9A contém a análise de correlação pareada de biomarcadores identificados no Estudo 1 e a Tabela 9B contém a análise de correlação pareada de biomarcadores identificados no Estudo 2. Os compostos correlacionados são muitas vezes mutuamente exclusivos em modelos de regressão e dessa forma podem ser usados (isto é, substituídos por um composto correlacionado) em modelos diferentes que tinham poderes de predição similares como os mostrados na Tabela 8 acima. Este aspecto é útil desenvolvendo ensaios bioquímicos que são direcionados a biomarcadores específicos uma vez que certos biomarcadores podem ser mais receptivos para analisar o desenvolvimento do que outros biomarcadores.
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2I: Predição e Monitoramento de Resistência à insulina:
[000181] O painel e o algoritmo de biomarcadores medirão a resistência à insulina (IR) que é uma causa raiz de diabetes tipo 2. Os resultados serão apresentados como um "Escore IR®" que representa o nível de resistência à insulina do indivíduo. Escores IR variarão de Tolerância à Glicose Normal (NGT) a níveis crescentes (Baixo, Médio, Alto) de Tolerância à Glicose Prejudicada (IGT). O Escore IR® permitirá ao médico colocar o paciente no espectro da tolerância à glicose, de normal a alta. Por exemplo, um Escore IR® de 25 colocará o paciente na categoria IGT Baixa enquanto um Escore IR® de 80 colocará o paciente na categoria IGT Alta.
[000182] Pela determinação do Escore IR em uma base anual ou semianual, médicos podem monitorar a progressão de um paciente em direção ao diabetes. Por exemplo, um Escore IR de 25 foi obtido em um primeiro ponto de tempo, um Escore IR de 34 foi obtido em um segundo ponto de tempo, um Escore IR de 40 foi obtido em um terceiro ponto de tempo, um Escore IR de 40 foi obtido em um terceiro ponto de tempo, um Escore IR de 55 foi obtido em um quarto ponto de tempo, e um Escore IR de 80 foi obtido em um quarto ponto de tempo in- dicando um aumento em IR e progressão da doença de normal à tole-rância de glicose altamente prejudicada. O uso de biomarcadores e do algoritmo da presente invenção para monitoramento da progressão guiará a decisão do médico para implementar medidas preventivas, tais como restrições dietéticas, exercício, ou tratamento de fármaco de estágio inicial. Um exemplo de um relatório demonstrando o uso do Escore IR para monitorar o status de IR ao longo do tempo é mostrado na Figura 5.
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2J: Biomarcadores que se correlacionam com testes de tolerância à glicose
[000183] Outro estudo será realizado para testar os biomarcadores descobertos na presente invenção com uma nova coorte e descobrir biomarcadores bioquímicos adicionais que se correlacionam com a sensibilidade à insulina (IS) e resistência à insulina (IR) como medido pelo clamp euglicêmico hiperinsulinêmico (HI) (Tabela 11). Usando o seguinte desenho de estudo, amostras de plasma de referência de jejum coletadas em EDTA a partir de NGT, IGT, IFG IGT/IFG e indivíduos diabéticos (total = 250) serão analisadas.
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Abreviações NGT: Tolerância à Glicose Normal (OGTT, <140 mg/dL ou < 7,8 mmol/L) IGT: Tolerância à Glicose Prejudicada (OGTT, 140 a 199 mg/dL or 7,8 a 11,0 mmol/L) IFG: Glicose de Jejum Prejudicada (Glicose plasmática de jejum, 100 a 125 mg/dL ou 5,6 a 6,9 mmol/L) IGT/IFG: IGT e/ou IFG T2D: Diabetes Tipo 2 (OGTT, > 200 mg/dL ou > 11,1 mmol/L)
Exemplo 3: Biomarcadores de Desordens Relacionadas à Síndrome Metabólica 3A: Biomarcadores de Síndrome Metabólica
[000184] Os biomarcadores foram descobertos por (1) análise de amostras de plasma e soro extraídas de diferentes grupos de indivíduos para determinar os níveis de metabólitos nas amostras e então (2) análise estatística dos resultados para determinar aqueles metabó- litos que estavam presentes diferencialmente nos dois grupos.
[000185] As amostras usadas para a análise foram obtidas de 19 homens caucasianos de idade de 18 a 39, idade média de 25,6, que foram diagnosticados com síndrome metabólica e 19 homens caucasianos saudáveis, combinados por idade.
[000186] Os testes T foram usados para determinar diferenças nos níveis médios de metabólitos entre as duas populações (isto é, Sín- drome metabólica versus Controles saudáveis).
Biomarcadores:
[000187] Como listado abaixo nas Tabelas 12 e 13, os biomarcado- res que foram descobertos estavam presentes diferencialmente entre amostras de indivíduos com Síndrome Metabólica e indivíduos Controle (saudáveis).
[000188] As tabelas 12 e 13 incluem, para cada biomarcador listado, o valor p e valor q determinado na análise estatística dos dados acerca dos biomarcadores e uma indicação do nível médio na síndrome me-tabólica, o nível médio no controle, e a diferença de porcentagem no nível médio de síndrome metabólica quando comparado ao nível médio no plasma (Tabela 12) e soro (Tabela 13) saudáveis. O termo "Isó- baro" como usado nas tabelas indica os compostos que não podem ser distinguidos um dos outros na plataforma analítica usada na análise (isto é, os compostos em um isóbaro eluem quase ao mesmo tempo e têm similar (e às vezes exatamente a mesma) quantidade de íons, e dessa forma não podem ser distinguidos). Comp_ID refere-se ao número de identificação do composto usado como uma chave primária para aquele composto no banco de dados químico interno. A biblioteca indica a biblioteca química que foi usada para identificar os compostos. O número 50 refere-se à biblioteca de GC e o número 61 refere-se à biblioteca de LC.
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[000189] Florestas randômicas foram geradas para biomarcadores de soro e plasma. Os modelos dos biomarcadores de soro classificaram corretamente 81,5% dos indivíduos como sendo saudáveis ou tendo síndrome metabólica; 83% dos indivíduos saudáveis foram classificados corretamente e 77% dos indivíduos tendo síndrome metabólica foram corretamente classificados. Para os modelos com base nos biomarcadores do plasma, 89% dos indivíduos foram corretamente classificados como sendo saudáveis ou tendo síndrome metabólica; 100% dos indivíduos saudáveis foram corretamente classificados e 77% dos indivíduos de síndrome metabólica foram corretamente classificados. Os biomarcadores mais importantes são mostrados no gráfico de importância na Figura 8 (Soro) e na Figura 9 (Plasma).
3B: Biomarcadores de aterosclerose
[000190] Os biomarcadores foram descobertos por (1) análise de amostras de plasma, aorta e fígado extraídas de indivíduos com ate- rosclerose e indivíduos saudáveis para determinar os níveis de meta- bólitos nas amostras e então (2) análise estatística dos resultados para determinar aqueles metabólitos que estavam presentes diferencialmente nos dois grupos.
[000191] As amostras usadas para a análise foram de camundongos de tipo selvagem e transgênicos, C57BL/6 e LDb, respectivamente. Os camundongos LDb transgênicos fornecem um modelo de aterosclero- se em indivíduos humanos. Estudos prévios mostraram que os ca-mundongos transgênicos LDb em um contexto C57BL/6 têm aproxi- damente níveis de colesterol e triglicerídeos 5 vezes maiores no plasma do que camundongos C57BL/6 de tipo selvagem e começam a de-senvolver lesões ateroscleróticas em aproximadamente 3 meses da idade. Plasma, tecidos de aorta ascendente e descendente e tecido hepático de cada grupo de camundongos em 2, 5 ou 8 meses foram submetidos à análise metabolômica. Estes pontos de tempo de coleta representam os estágios inicial (início), intermediário e posterior da aterosclerose no modelo transgênico.
[000192] Testes T foram usados para determinar diferenças nos níveis médios de metabólitos entre as duas populações (isto é, LDb versus C57BL/6). Análise de classificação foi realizada usando análises de particionamento recursivo e de floresta randômica para descobrir os biomarcadores que podem diferenciar melhor os 2 grupos de camun-dongos. O particionamento recursivo relaciona uma variável 'dependente' (Y) a uma coleção de variáveis independentes ('preditor') (X) a fim de descobrir -- ou simplesmente entender -- a relação elusiva, Y=f(X). Foi realizado com o programa JMP (SAS) para gerar uma árvore de decisão. A significância estatística da "divisão" dos dados pode ser colocada em um apoio mais quantitativo por valores p computacionais, que discernem a qualidade de uma divisão em relação a um evento randômico. O nível de significância de cada "divisão" de dados nos nós ou nos ramos da árvore foi computado como valores p, que discernem a qualidade da divisão em relação a um evento randômico. Foi dado como ValorLog, que é o log10 negativo de um valor-p bruto. As análises estatísticas foram realizadas com o programa "R" disponível na rede mundial no sítio da rede cran.r-project.org.
[000193] Florestas randômicas fornecem uma estimativa de como os indivíduos podem ser classificados em um novo conjunto de dados em cada grupo, em contraste com um teste t, que testa se as médias des-conhecidas de duas populações são diferentes ou não. Florestas ran- dômicas criam um grupo de árvores de classificação com base na amostragem contínua das unidades e compostos experimentais. Então cada observação é classificada com base nos votos da maioria de todas as árvores de classificação. As análises estatísticas foram realizadas com o programa "R" disponível na rede mundial no sítio da rede cran.r-project.org.
Biomarcadores:
[000194] Como listado abaixo nas Tabelas 14, 15 e 16, os biomarca- dores que foram descobertos estavam presentes diferencialmente entre amostras de indivíduos LDb (ateroscleróticos) e indivíduos C57BL/6 (saudáveis).
[000195] As tabelas 14, 15 e 16 incluem, para cada biomarcador listado, o valor p e valor q determinados na análise estatística dos dados acerca dos biomarcadores e uma indicação da diferença de porcentagem no nível médio aterosclerótico quando comparado ao nível médio saudável no plasma (Tabela 14), aorta (Tabela 15) e fígado (Tabela 16). O termo "isóbaro" como usado nas tabelas indica os compostos que não podem ser distinguidos um dos outros na plataforma analítica usada na análise (isto é, os compostos em um isóbaro eluem quase ao mesmo tempo e têm similar (e às vezes exatamente a mesma) quantidade de íons, e dessa forma não podem ser distinguidos). Comp_ID refere-se ao número de identificação do composto usado como uma chave primária para aquele composto no banco de dados químico interno. Biblioteca indica a biblioteca química que foi usada para identificar os compostos. O número 50 refere-se à biblioteca de GC e o número 61 refere-se à biblioteca de LC.
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ciclopentanocarboxílico [2] Possível 5-metil-desoxicitidina-monofosfato [3] Isóbaro-24 inclui L-arabitol, adonitol, xilitol [4] Isóbaro-1 inclui manose, frutose, glicose, galactose, alfa-L- sorbopiranose, Inositol, D-alose, D-altrose, D-psicona, L-gulose, alo- inositol
[000196] A identificação de biomarcadores plasmáticos indicativos do início e/ou progressão da aterosclerose auxiliaria o diagnóstico e o tra-tamento de pacientes humanos com esta doença. Particionamento re-cursivo de metabólitos plasmáticos identificou o colesterol como um biomarcador que pode diferenciar os camundongos LDb e C57BL/6 perfeitamente, como esperado. Três outros metabólitos também foram identificados pelo particionamento recursivo para diferenciar os ca-mundongos LDb e C57BL/6 (Tabela 17). Os níveis plasmáticos destes metabólitos, como colesterol plasmático, foram mais altos em camun-dongos LDb até 2 meses da idade e permaneceram consistentemente mais altos durante os 6 próximos meses, sugerindo que o aumento mais precoce destes metabólitos esteja provavelmente envolvido no desenvolvimento de aterosclerose e forneça biomarcadores para pro-gressão (Figuras 13, 14, 15, e 16). Tabela 17. Biomarcadores de aterosclerose no plasma que diferenciam indivíduos com Aterosclerose (LDb) e indivíduos controle saudáveis (camundongos C57BL/6) sem erro.
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[000197] O Metabolito - 1834 não segregou os grupos LDb e C57BL/6 em camundongos de 2 meses de idade, mas começou perfei- tamente a segregar camundongos de 5 meses de idade e segregou os de 8 meses de idade (Figura 17). Este metabolito é um dos biomarca- dores para progressão de aterosclerose.
[000198] Vários metabólitos (p-cresol-sulfato, Metabolito - 4887, Me- tabolito - 5386) classificaram indivíduos como LDb ou C57BL/6 muito bem em camundongos de 2 meses de idade, mas o poder de diferen-ciação diminuiu quando os camundongos envelheceram, com nenhuma segregação em camundongos de 8 meses de idade (Figuras 18 e 19). Estes metabólitos são biomarcadores para início de aterosclerose.
[000199] Resultados de floresta randômica mostram que as amostras podem ser classificadas corretamente com graus variados de acu- rácia usando os biomarcadores. As matrizes de confusão demonstram que os indivíduos LDb podem ser distinguidos dos indivíduos C57BL/6 usando amostras de plasma (Tabela 18), aorta (Tabela 19) e fígado (Tabela 20). O Erro "Out-of-Bag" (OOB) fornece uma estimativa de como novas observações podem perfeitamente ser preditas usando o modelo de floresta randômica (por exemplo, se uma amostra é de um indivíduo que tem aterosclerose ou de um indivíduo controle).Tabela 18. Matrizes de Confusão de Floresta Randômica para Ateros- clerose no Plasma
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[000200] Além disso, um estudo foi realizado em indivíduos humanos so-frendo de aterosclerose (n=15) ou indivíduos saudáveis (n=14). Os bi- omarcadores 3-metil-histidina, p-cresol-sulfato, manose, glicose, e glu-conato mostraram as mesmas alterações no plasma humano de indi-víduos doentes vs saudáveis como visto no modelo de camundongo. Dessa forma, estes compostos foram identificados como biomarcado- res importantes úteis para distinguir indivíduos com aterosclerose de indivíduos saudáveis.
3C: Biomarcadores de cardiomiopatia
[000201] Os biomarcadores foram descobertos por (1) análise de amostras de tecido cardíaco (Tabela 21) ou amostras plasmáticas (Tabela 22) de grupos diferentes de indivíduos camundongo para de-terminar os níveis de metabólitos nas amostras e então (2) análise es-tatística dos resultados para determinar aqueles metabólitos que esta-vam presentes diferencialmente nos dois grupos. Estes indivíduos for-necem um modelo animal (camundongo) de DCM humano.
[000202] Dois grupos de indivíduos foram usados. Um grupo consistiu em oito indivíduos exibindo dilatação cardíaca e função sistólica ventricular esquerda deprimida (fração de ejeção de menos de 0,40), como determinado pela ecocardiografia (camundongos transgênicos cTnT-W141). Treze indivíduos combinados por idade e gênero (ca-mundongos não-transgênicos (linhagem de contexto de tipo selvagem)) serviram como controles. Todos os camundongos tinham de 7 a 19 meses de idade e pesavam de 23 a 40 g.
[000203] Testes T foram usados para determinar diferenças nos níveis médios de metabólitos entre as duas populações (isto é, Cardio- miopatia Dilatada, DCM versus Controle saudável). Análise de classificação foi realizada usando análise de particionamento recursivo e de floresta randômica para descobrir os biomarcadores que podem diferenciar melhor os dois grupos. Particionamento recursivo relaciona uma variável 'dependente' (Y) a uma coleção de variáveis independentes ('preditor) (X) a fim de descobrir -- ou simplesmente entender -- a relação elusiva, Y=f(X). Foi realizado com o programa JMP (SAS) para gerar uma árvore de decisão. A significância estatística da "divisão" dos dados pode ser colocada em um apoio mais quantitativo por valores p computacionais, que discernem a qualidade de uma divisão em relação a um evento randômico. O nível de significância de cada "divisão" de dados nos nós ou nos ramos da árvore foi computado como valores p, que discernem a qualidade da divisão em relação a um evento randômico. Foi dado como ValorLog, que é o log10 negativo de um valor p bruto.
Biomarcadores:
[000204] Como listado abaixo nas Tabelas 21 e 22, os biomarcado- res que foram descobertos estavam presentes diferencialmente entre amostras de tecido cardíaco e plasma, respectivamente, coletados de indivíduos com cardiomiopatia dilatada e indivíduos saudáveis.
[000205] As tabelas 21 e 22 incluem, para cada biomarcador listado, o valor p e valor q determinado na análise estatística dos dados acerca dos biomarcadores e uma indicação da diferença de porcentagem no nível médio de cardiomiopatia dilatada quando comparada ao nível médio saudável em tecido cardíaco (Tabela 21) ou plasma (Tabela 22). O termo "isóbaro" como usado nas tabelas indica os compostos que não podem ser distinguidos um dos outros na plataforma analítica usada na análise (isto é, os compostos em um isóbaro eluem quase ao mesmo tempo e têm similar (e às vezes exatamente a mesma) quantidade de íons, e dessa forma não podem ser distinguidos). Comp_ID refere-se ao número de identificação do composto usado como uma chave primária para aquele composto no banco de dados químico interno. Biblioteca indica a biblioteca química que foi usada para identificar os compostos. O número 50 refere-se à biblioteca de GC e o número 61 refere-se à biblioteca de LC.Tabela 21. Biomarcadores Metabólicos de Cardiomiopatia Dilatada
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[000206] Análise estatística de particionamento recursivo de todos os me- tabólitos no tecido cardíaco entre indivíduos normais e DCM identificaram o Metabolito - 3808 (Metabolito - 3808) como um composto que separou ambos os grupos de indivíduos perfeitamente (ValorLog = 6,61). Especificamente, todos os indivíduos com o fenótipo DCM tinham níveis do Metabolito - 3808 acima do valor de corte de 629275 enquanto todos os indivíduos com um fenótipo normal tinham níveis de Metabolito - 3808 abaixo do valor de corte (Figura 20). O valor de corte no gráfico na Figura 20 é indicado por uma linha tracejada.
[000207] Para avaliar os biomarcadores descobertos no modelo de camundongo de DCM, a análise de indivíduos humanos foi realizada. Os biomarcadores foram descobertos por (1) análise de amostras de plasma de grupos diferentes de indivíduos humanos para determinar os níveis de metabólitos nas amostras e então (2) análise estatística dos resultados para determinar aqueles metabólitos que estavam presentes diferencialmente nos dois grupos.
[000208] Dois grupos de indivíduos foram usados. Um grupo consistiu em 39 indivíduos (18 homens, 21 mulheres) com cardiomiopatia dilatada (DCM). O segundo grupo consistiu em 31 indivíduos controle saudáveis (14 homens, 17 homens). Os indivíduos foram equilibrados por idade e gênero; a idade média de mulheres controle foi de 50,1 anos +/- 10,1 e mulheres com DCM foi de 50,0 anos +/- 11,3 enquanto a idade média de homens controle foi de 42,7 anos +/- 11,3 e homens com DCM foi de 45,8 anos +/-10,9.
[000209] Testes T (Tabela 23) foram usados para determinar diferenças nos níveis médios de metabólitos entre as duas populações (isto é, Cardiomiopatia Dilatada, DCM versus Controle saudável). A análise de classificação foi realizada usando análises de floresta ran- dômica para descobrir os biomarcadores que podem diferenciar melhor os dois grupos. Os resultados da análise de Floresta Randômica são mostrados na Tabela 24 e os biomarcadores mais importantes úteis para classificar indivíduos como saudável ou DCM são listados na Tabela 25.
Biomarcadores:
[000210] Como listado abaixo na Tabela 23, os biomarcadores que foram descobertos estavam presentes diferencialmente entre amostras plasmáticas coletadas de indivíduos com cardiomiopatia dilatada e in-divíduos saudáveis.
[000211] A tabela 23 inclui, para cada biomarcador listado, os valores p e q determinados na análise estatística dos dados acerca dos biomarcadores e uma indicação da diferença de porcentagem no nível médio de cardiomiopatia dilatada quando comparada ao nível médio saudável no plasma. "ID" refere-se ao número de identificação do composto usado como uma chave primária para aquele composto no banco de dados químico interno. "Biblioteca" indica a biblioteca química que foi usada para identificar os compostos. O número 50 refere-se à biblioteca de GC e os números 200 e 201 referem-se à biblioteca de LC. "Camundongo" indica os compostos que foram também biomarca- dores descobertos no modelo de camundongo de DCM.
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[000212] Análise de tendência da via mostrou forte diferenciação de pacientes com DCM em vias energéticas e lipídicas, sugerindo inibição do ciclo de TCA, mobilização de aminoácido glicogênico, e aumentos de p-oxidação. Esteroides adrenérgicos (cortisol, cortisona) estavam aumentados, compatíveis com estresse geral, e os metabólitos andró- genos (DHEA-S) estavam fortemente diminuídos em pacientes com DCM, resultando em uma aparente "feminização" metabólica dos homens com DCM.
[000213] A comparação de estudo prévio de plasma no modelo de DCM em camundongo transgênico mostrou que oito compostos, incluindo urato, malato, tirosina, fenilalanina, eritritol, e outros exibiram respostas similares e foram fortemente significantes em ambos os estudos. Outros 16 que foram fortemente significantes no estudo humano tenderam de uma maneira similar no estudo de camundongo. Estes incluíram α-cetoglutarato, isocitrato, pantotenato, mio-inositol e gluta- mato. Os dados confirmam que os perfis metabolômicos de plasma refletem a condição de doença em pacientes humanos com DCM, e que o modelo de camundongo transgênico compartilha muitas das alterações de biomarcador associadas com a doença humana.
[000214] Testes T são usados para determinar se as médias da popu-lação são diferentes, mas não nos dizem sobre observações individuais. Análise de Floresta Randômica é uma técnica multivariada para identifi-car compostos que distinguem os Grupos. As florestas randômicas são usadas para classificar indivíduos. As florestas randômicas são baseadas em um consenso de um grande número de árvores de decisão; é uma técnica de multivariada extremamente eficaz, sendo resistente a desvios, insensível ao método de normalização, e possui capacidade altamente de previsão para novas amostras. São mostrados na Tabela 24 resultados do uso de biomarcadores listados na Tabela 23 para classificar os indivíduos como "Saudável" ou "DCM". Os indivíduos são corretamente classificados como Saudáveis (Controle), 81% do tempo e corretamente classificados como tendo DCM, 72% do tempo. Os indivíduos são corretamente classificados com acurácia global > 75%.
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[000215] Os biomarcadores que são os mais importantes para classificar corretamente indivíduos são mostrados na Tabela 25 e o gráfico de Importância é mostrado na Figura 20.
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3D: Biomarcadores de obesidade; Metabólitos que estão presentes diferencialmente em indivíduos magros comparados aos obesos
[000216] Os biomarcadores foram descobertos por (1) análise de amostras de sangue extraídas de grupos diferentes de indivíduos humanos para determinar os níveis de metabólitos nas amostras e então (2) análise estatística dos resultados para determinar aqueles metabó- litos que estavam presentes diferencialmente nos dois grupos.
[000217] As amostras de plasma usadas para a análise foram de 40 indivíduos magros (IMC <25) e 40 indivíduos obesos (IMC > 30) que foram combinadas por idade e gênero. Após os níveis de metabólitos serem determinados, os dados foram analisados usando testes T uni- variados (isto é, teste T de Welch).
[000218] Testes T foram usados para determinar diferenças nos níveis médios de metabólitos entre as duas populações (isto é, Obeso versus Magro).
Biomarcadores:
[000219] Como listado abaixo na Tabela 26, os biomarcadores que foram descobertos estavam presentes diferencialmente entre amostras de indivíduos obesos e indivíduos magros.
[000220] A tabela 26 inclui, para cada biomarcador listado, o valor p e valor q determinado na análise estatística dos dados acerca dos bi- omarcadores e uma indicação do nível médio obeso, nível médio magro, e a razão do nível médio obeso para o nível médio magro (Tabela 26). O termo "isóbaro" como usado nas tabelas indica os compostos que não podem ser distinguidos uns dos outros na plataforma analítica usada na análise (isto é, os compostos em um isóbaro eluem quase ao mesmo tempo e têm similar (e às vezes exatamente a mesma) quantidade de íons, e dessa forma não podem ser distinguidos). Comp_ID refere-se ao número de identificação do composto usado como uma chave primária para aquele composto no banco de dados químico interno. Biblioteca indica a biblioteca química que foi usada para identificar os compostos. O número 50 refere-se à biblioteca de GC e o número 61 refere-se à biblioteca de LC.
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3E: Algoritmos (modelos) para diagnosticar Síndrome Metabólica e a predisposição para Síndrome Metabólica (sensibilidade à insulina).
[000221] Modelos foram desenvolvidos para testar a capacidade de predizer a sensibilidade à insulina (Rd) e a síndrome metabólica usando os metabólitos biomarcadores sozinhos e/ou em combinação com medidas clínicas da síndrome metabólica (por exemplo, IMC, Rd). As amostras de plasma usadas para a análise foram de indivíduos com várias taxas da disponibilidade de glicose (Rd).
[000222] Os algoritmos para determinação da sensibilidade à insulina foram desenvolvidos por múltiplas iterações de análise de regressão da taxa de utilização de glicose (isto é, Rd) em combinação com medidas de biomarcadores metabólitos. As amostras foram divididas em dois grupos. O primeiro grupo foi usado como um conjunto de 'instrução' e o segundo grupo foi usado como um conjunto de 'teste'. Então um modelo foi desenvolvido usando o conjunto de instrução e o poder de precissão do modelo resultante foi determinado usando o conjunto de teste. Vários modelos foram desenvolvidos para identificar os mais importantes metabólitos biomarcadores para predição de sensibilidade à insulina e por meio disso demonstrar a utilidade desta abordagem e destes metabólitos biomarcadores.
[000223] Um modelo foi desenvolvido para predizer a sensibilidade à insulina (isto é, Rd) usando amostras de plasma coletadas de uma coorte com níveis variados de sensibilidade à insulina e IMC menor que 27,9 e IMC maior do que 27,9. Para este modelo, o grupo de instrução incluiu a metade das amostras de plasma e foi equilibrado para IMC e Rd. O modelo então foi testado usando um grupo de teste que incluiu a outra metade das amostras e também foi equilibrado para IMC e Rd. Os re-sultados desta análise mostraram que o melhor modelo para predizer a sensibilidade à insulina inclui: IMC e os metabólitos biomarcadores gli-cose, ácido 3-metil-2-oxobutírico, 1,5-anidroglucitol e Metabolito - 6268.
[000224] Outro modelo foi desenvolvido para predizer a sensibilidade à insulina (isto é, Rd) usando amostras de plasma reunidas de uma coorte com níveis variados de sensibilidade à insulina e IMC menor que 27,9. Para este modelo, o grupo de instrução incluiu metade das amostras de plasma e foi equilibrado para sensibilidade à insulina (Rd). O modelo então foi testado usando um grupo de teste que incluiu a outra metade das amostras de plasma e também foi equilibrado para Rd. Os resultados desta análise mostraram que o melhor modelo para predizer a sensibilidade à insulina inclui os metabólitos biomarcadores: glicose, Metabolito - 2546, Metabolito - 2853, Metabolito - 2370 e Me- tabolito - 2386.Outro modelo ainda foi desenvolvido para predizer a sensibilidade à insulina (isto é, Rd) usando amostras de plasma coletadas de uma coorte com níveis variados de sensibilidade à insulina e IMC maior que 27,9. Para este modelo, o grupo de instrução incluiu metade das amostras de plasma e foi equilibrado para a sensibilidade à insulina (Rd). O modelo então foi testado usando um grupo de teste que incluiu a outra metade das amostras de plasma e também foi equilibrado para Rd. Os resultados desta análise mostraram que o melhor modelo para predizer a sensibilidade à insulina inclui os metabólitos biomarcadores: 3-metil-2-oxobutírico, Metabolito - 3097, Metabolito - 4020, Metabolito - 3056 e Metabolito - 1831.
[000225] O modelo: IMC e os metabólitos biomarcadores glicose, ácido 3-metil-2-oxobutírico, 1,5-anidroglucitol e Metabolito - 6268; foi usado em uma nova coorte para predizer a sensibilidade à insulina (Rd). O modelo foi desenvolvido para predizer a sensibilidade à insulina (isto é, Rd) usando amostras de plasma coletadas de uma coorte com níveis variados de sensibilidade à insulina e IMC menor que 27,9 e IMC maior do que 27,9, como descrito acima. As amostras usadas para testar o modelo para esta análise foram obtidas de 19 homens caucasianos de idade de 18 a 39 anos, idade média de 25,6 anos, que foram diagnosticados com síndrome metabólica e 19 homens caucasi-anos saudáveis, combinados por idade. As amostras de plasma e as amostras de soro foram avaliadas. Os resultados desta análise mostram que o modelo pode predizer corretamente a sensibilidade à insulina nesta nova coorte usando amostras de plasma (Figura 21) ou soro (Figura 22).
Exemplo 4: Biomarcadores de Resposta ao Tratamento
[000226] Os biomarcadores que são de previsão da resposta ao tra-tamento foram identificados através de comparações de indivíduos que foram 'não respondedores' (isto é, aqueles com pouca ou nenhuma modificação (<15%) em Rd entre a referência e pós-tratamento de 12 semanas) e aqueles indivíduos que foram responsivos ao tratamento (isto é, 'respondedores'). Os biomarcadores que foram de previsão de indivíduos como respondedores ou não respondedores ao tratamento foram baseados nos níveis de composto somente na referência. Os respondedores foram definidos como aqueles indivíduos com uma modificação de Rd de 35% ou maior ou como aqueles com uma modi-ficação de Rd de 15% ou maior. Dados foram analisados pela compa-ração de Não respondedores com ambas as classes de Respondedo- res. Ambas as análises (isto é, Não respondedor com modificação de Rd abaixo de 15% vs Respondedor com modificação de Rd acima de 35%, Não respondedor com modificação de Rd abaixo de 15% vs Respondedor com modificação de Rd acima de 15%) foram então combinadas e aqueles biomarcadores com um valor p de <0,1 em QUALQUER das 2 análises foram identificados. Os biomarcadores são listados na Tabela 27. As medidas de biomarcador antes do tratamento foram de previsão de resposta à tiazolidinadiona (TZD), e dessa forma podem ser usadas para selecionar pacientes para tratamento com fármacos TZD. Os experimentos são planejados para avaliar os biomarcadores como de previsão de outros tratamentos para sensibili- dade à insulina, pré-diabetes e controle de diabetes, tais como outros agentes terapêuticos (por exemplo, metformina, etc.), perda de peso, modificações de nutrição e outras de estilo de vida. Este grupo de bi- omarcadores de previsão fornece um instrumento extremamente valioso para medicina personalizada.
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[000227] Análise de particionamento recursivo foi realizada nos indivíduos. Os níveis de referência (isto é, antes do tratamento) dos compostos biomarcadores foram determinados nos Respondedores (indivíduos com um aumento pós-tratamento em Rd > 35%, N=28) e nos Não respondedores (indivíduos com um aumento pós-tratamento de Rd <15%, N=14). Os resultados desta análise mostraram que os indivíduos foram classificados com uma AUC de 0,8214. A análise adicional identificou o "Metabolito - 11737" como um biomarcador que é particularmente importante na classificação de respondedores e não res- pondedores. Usando o nível de referência para somente este biomar- cador, 22 de 28 Respondedores foram corretamente classificados e 12 de 14 Não respondedores foram corretamente classificados. Este marcador sozinho teve uma sensibilidade de 78,6% e uma especificidade de 85,7%. O Valor De previsão Positivo (PPV) foi 91,7% e o Valor De previsão Negativo (NPV) foi 66,7%.
[000228] Os biomarcadores que são biomarcadores farmacodinâmi- cos (PD) da eficácia do tratamento foram identificados através de comparações dos não respondedores (isto é, aqueles com pouca ou nenhuma modificação (<15%) em Rd entre a referência e 12 semanas pós-tratamento) vs respondedores. Os biomarcadores PD foram base-ados na diferença entre a referência e 12 semanas pós-tratamento. Os biomarcadores que foram identificados mostraram modificações nos níveis de referência sob tratamento com TZD e controlados com a mo-dificação na sensibilidade à insulina naqueles indivíduos. Estes bio- marcadores são listados na Tabela 28.
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[000229] A análise de particionamento recursivo foi realizada nos in-divíduos. Os níveis de referência (isto é, antes do tratamento) e os níveis pós-tratamento dos compostos biomarcadores foram determinados nos Respondedores (indivíduos com um aumento pós-tratamento em Rd> 35%, N=28) e nos Não respondedores (indivíduos com um aumento pós-tratamento em Rd <15%, N=14). Os resultados desta análise mostraram que os indivíduos foram classificados com uma AUC de 0,7679. Experimentos adicionais são planejados para avaliar os biomarcadores como biomarcadores de PD para outros agentes terapêuticos para sensibilidade à insulina, pré-diabetes e diabetes (por exemplo, metformina, etc.) bem como tratamentos envolvendo modifi-cação da dieta (por exemplo, perda de peso, nutrição) e estilo de vida (por exemplo, exercício).
Exemplo 5: Caracterização analítica de compostos biomarcadores não-denominados:
[000230] A tabela 29 abaixo inclui características analíticas de cada um dos metabólitos não-denominados listados nas Tabelas acima. A tabela inclui, para cada Metabolito listado, o tempo de retenção (RT), índice de retenção (RI), massa, quantidade de massa, e polaridade obtidas usando os métodos analíticos descritos acima. "Massa" refere- se à massa do isótopo C12 do íon parental usado na quantificação do composto. "Polaridade" indica a polaridade do íon quantitativo como sendo positivo (+) ou negativo (-).
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[000231] Enquanto a invenção foi descrita detalhadamente e com referência a modalidades específicas da mesma, será evidente a um versado na técnica que várias modificações e mudanças podem ser feitas sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

Claims (5)

1. Método de classificação de um indivíduo de acordo com a tolerância à glicose predita em tolerância à glicose normal (NGT), tole-rância à glicose de jejum prejudicada (IFG), ou tolerância à glicose prejudicada (IGT), para diabetes tipo 2, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: analisar uma amostra biológica de um indivíduo para de-terminar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores de tolerância à glicose na amostra, em que um ou mais biomarcadores compreendem 2-hidroxibutirato e opcionalmente um ou mais biomarcadores são se-lecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, e combinações dos mesmos; e comparar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra aos níveis de referência de tolerância à glicose de um ou mais biomarcadores a fim de classificar o indivíduo como tendo NGT, IFG, IGT, ou diabético.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda determinar as medições do indivíduo de insulina plasmática em jejum, glicose plasmática em jejum, pró-insulina em plasma em jejum, ácidos graxos livres em jejum, HDL-colesterol, LDL-colesterol, peptídeo C, adiponectina, peptídeo YY, hemoglobina A1C, circunferência da cintura, peso corporal ou índice de massa corporal.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o método compreende analisar o indivíduo e uma amostra biológica do indivíduo usando um modelo listado na Tabela 8.
4. Método de determinação da suscetibilidade de um indiví-duo a diabetes tipo 2, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: analisar uma amostra biológica de um indivíduo para de- terminar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores para resistência à insulina na amostra, em que um ou mais biomarcadores compreendem 2-hidroxibutirato e opcionalmente um ou mais biomarcadores são selecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, e combinações dos mesmos; e comparar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra aos níveis de referência positivos para diabetes e/ou negativos para diabetes de um ou mais biomarcadores a fim de diagnosticar se o indivíduo é suscetível ao desenvolvimento de diabetes tipo 2.
5. Método de monitoramento da progressão ou regressão do pré-diabetes em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que com-preende as seguintes etapas: analisar uma amostra biológica de um indivíduo para de-terminar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores para resistência à insulina na amostra, em que um ou mais biomarcadores compreendem 2-hidroxibutirato e opcionalmente um ou mais biomarcadores são se-lecionados a partir de um ou mais biomarcadores listados nas Tabelas 4, 5, 6, 7, 8, 9A, 9B, e combinações dos mesmos; e comparar o(s) nível(is) de um ou mais biomarcadores na amostra aos níveis de referência para progressão de resistência à in-sulina e/ou regressão de resistência à insulina de um ou mais biomar- cadores a fim de monitorar a progressão ou regressão de resistência à insulina em um indivíduo.
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