CN113325117B - 一组生物标记物在制备预测静脉内平滑肌瘤病进展的试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组生物标记物在制备预测静脉内平滑肌瘤病进展的试剂盒中的应用，所述生物标记物为次黄嘌呤、甘油磷酸胆碱、乙酰肉碱、氢化可的松（皮质醇），所述生物标记物次黄嘌呤和甘油磷酸胆碱随着疾病进展表达量总体趋势降低，乙酰肉碱和氢化可的松（皮质醇）随着疾病进展表达量总体趋势升高。本发明还公开了一种用于静脉内平滑肌瘤病进展预测的生物标记物的筛选方法。利用本发明的生物标记物次黄嘌呤、甘油磷酸胆碱、乙酰肉碱、氢化可的松（皮质醇）预测静脉内平滑肌瘤病进展具有较高的特异性，有利于静脉内平滑肌瘤病的早发现、早治疗，具有良好的临床使用和推广价值。

Description

一组生物标记物在制备预测静脉内平滑肌瘤病进展的试剂盒 中的应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一组生物标记物在制备预测静脉内平滑肌瘤病进展的试剂盒中的应用。

背景技术

静脉内平滑肌瘤病(IVL)是一种罕见的雌激素依赖性肿瘤疾病。尽管IVL在组织学上是良性的，但其具有浸润性生长的特征。肿瘤起源于子宫静脉壁或盆腔静脉，可以伸入子宫或盆腔的静脉通道，经髂静脉或卵巢静脉侵入并延伸至下腔静脉。一旦肿瘤通过三尖瓣进入右心房或右心室以及肺动脉，会引起严重的循环障碍，可以导致晕厥或猝死。如果心脏的部分肿瘤脱落，可能导致肺栓塞或脑梗塞，危及生命。由于IVL的临床症状和影像学表现不明确，术前误诊漏诊率较高。当IVL病变在早期局限于盆腔而无血管侵犯时，其表现可能与子宫肌瘤相似。如果肿瘤晚期侵入下腔静脉或心脏，容易误诊为原发性心脏肿瘤或静脉血栓。研究显示，IVL术后复发的风险可高达30％，且大静脉受累患者术后复发的风险明显高于无静脉受累患者。目前大多数研究只是探讨影响IVL发病机制和预后的潜在调控基因，并未关注患者体内一系列代谢物的变化。所以，目前还没有特异的生化指标来判断IVL的诊断和预后。

随着现代生物分析技术的迅速发展，代谢组学已经成功地应用于许多领域，如癌症研究。代谢组学是“组学”技术之一，是基因组学、转录组学和蛋白质组学的补充。代谢物被定义为小型有机物和低分子量化合物(<1500道尔顿)，是代谢过程中的最终产物。对代谢物的研究有助于确定患者体内被激活或功能失调的代谢途径。在分子水平上，代谢组学采用新的生物标记物来探索疾病发展的潜在机制。代谢组学在疾病的诊断和预后中起着至关重要的作用。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一组用于静脉内平滑肌瘤病进展预测的生物标记物。

本发明的第二目的是提供所述生物标记物在制备预测静脉内平滑肌瘤病进展的试剂盒中的应用。

本发明的第三目的是提供一种用于静脉内平滑肌瘤病进展预测的生物标记物的筛选方法。

为实现上述目的，本发明首先提供一组用于静脉内平滑肌瘤病进展预测的生物标记物，所述生物标记物为次黄嘌呤、甘油磷酸胆碱、乙酰肉碱、氢化可的松(皮质醇)。优选的，所述生物标记物为血清标记物。

本发明进一步发现，所述生物标记物次黄嘌呤和甘油磷酸胆碱随着静脉内平滑肌瘤病进展表达量总体趋势降低，乙酰肉碱和氢化可的松(皮质醇)随着静脉内平滑肌瘤病进展表达量总体趋势升高。

进一步地，本发明提供了所述的生物标记物在制备预测静脉内平滑肌瘤病进展的试剂盒中的应用。

优选的，所述试剂盒包括检测次黄嘌呤、甘油磷酸胆碱、乙酰肉碱、氢化可的松(皮质醇)浓度的试剂。

进一步地，本发明提供了一种用于静脉内平滑肌瘤病进展预测的生物标记物的筛选方法，包括以下步骤：

(1)样本收集：收集静脉内平滑肌瘤病无复发患者(IVL-no)、静脉内平滑肌瘤病复发患者(IVL-re)、健康无子宫肌瘤对照者(Co-no)、健康有子宫肌瘤对照者(Co-um)血清样本；

(2)液相色谱质谱采集：通过液相色谱对样本进行预分离，质谱采集一级、二级谱图；

(3)数据分析：wiff格式的原始MS数据经ProteoWizardMSConvert转换为mzXML文件，然后采用XCMS软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积，对XCMS提取得到的数据首先进行代谢物结构鉴定、数据预处理，然后进行实验数据质量评价，最后再进行数据分析，首先采用单变量统计分析方法，包括fold change(FC)分析和Student's t检验或Mann-Whitney U检验，然后用R软件包(ropls)对处理后的数据进行主成分分析，并进行正交偏最小二乘法-判别分析，正交偏最小二乘法-判别分析得到的OPLS-DA模型用多重交叉验证和置换检验对模型的稳定性进行了评价；

(4)筛选：根据上述正交偏最小二乘法-判别分析得到的OPLS-DA模型的变量重要性评分和P值进行差异代谢物筛选，筛选标准为：VIP＞1，P值＜0.05；

(5)鉴定：采用超高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用仪(UHPLC-Q-TOF MS)进行检测样本中的代谢物，通过分析匹配代谢物的保留时间、分子质量(分子质量误差在<25ppm内)、二级碎裂谱图、碰撞能等信息，对生物样本中的代谢物进行结构鉴定，并对鉴定结果进行严格的人工二次核对、确认。参照国际上针对代谢物标准倡议(Metabolomics StandardsInitiative,MSI)提供的代谢物鉴定等级。等级0：具有明确的三维结构和立体化学信息。等级1：可靠的二维结构鉴定，至少需要将真实化学标准品的两个或多个正交性质(如MS/MS谱图、保留时间RT或碰撞截面(CCS)值)与在相同分析条件下分析的感兴趣代谢物的相同性质进行比较。等级2级或3级为假定的注释结果，通常仅基于一个或两个性质，依赖于与不同实验室收集的或用不同分析方法获得的数据进行比较，而不是在相同分析条件下与真实的化学标准进行直接比较。不能被鉴定为以上等级的为等级4未知物。本项目代谢物的最终鉴定等级均在Level 2以上。

优选的，所述方法还包括采用层次聚类分析方法、KEGG途径富集方法、Lasso回归分析方法、广义线性回归模型、ROC曲线分析方法中的一种或多种对筛选到的差异生物标记物进一步筛选。

优选的，所述血清样本在基于液相色谱质谱采集时，每7个样本加入一个质量控制样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性；

优选的，所述样本进样前进行以下处理：样本在4℃环境下缓慢解冻后，将样本与预冷甲醇/乙腈/水溶液(2：2：1，v/v)涡旋混合，低温超声30min，-20℃静置10min；4℃离心机中14000g离心20min，取上清真空干燥，质谱分析时加入100μL乙腈水溶液(乙腈：水＝1:1，v/v)复溶，涡旋，4℃离心机中14000g离心15min，取上清液进样分析；

优选的，液相色谱所用色谱柱为Agilent 1290Infinity LC超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC色谱柱，柱温25℃，流速0.5mL/min，进样量2μL，色谱流动相包含两种溶剂A和B：流动相A为水+25mM乙酸铵+25mM氨水，流动相B为乙腈，色谱梯度洗脱程序为：0-0.5min为95％B，0.5-7min为B从95％线性变化至65％，7-8min为B从65％线性变化至40％，8-9min为B维持在40％，9-9.1min为B从40％线性变化至95％，9.1-12min为B维持在95％，整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中，为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析；

质谱检测使用四级杆串联飞行时间质谱仪Q-TOF，采用AB Triple TOF 6600质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集，HILIC色谱分离后的ESI源条件如下：Ion Source Gas1(Gas1)：60，Ion Source Gas2(Gas2)：60，Curtain gas(CUR)：30，source temperature：600℃，IonSapary Voltage Floating(ISVF)：±5500V(正负两种模式)；TOF MS scan m/zrange：60-1000Da，product ion scan m/z range：25-1000Da，TOF MS scan accumulationtime 0.20s/spectra,product ion scan accumulation time 0.05s/spectra；二级质谱采用information dependent acquisition(IDA)获得，并且采用high sensitivity模式，Declustering potential(DP)：±60V(正负两种模式)，Collision Energy碰撞能量：35±15eV，IDA设置如下Exclude isotopes within 4Da，Candidate ions to monitor percycle：10。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明采用血清代谢组学技术以及数据统计分析技术得到用于静脉内平滑肌瘤病进展预测的生物标记物及其筛选方法，可操作性强，准确性高，通过取血就能实现诊断，快速便捷，开发了无创新方法，有利于静脉内平滑肌瘤病的早发现、早治疗，具有良好的临床价值。

附图说明

图1.样本质量控制分析。A、B.所有样品的总离子色谱图以及阳离子和阴离子模式下的质量控制。横坐标代表每个色谱峰的保留时间，纵坐标代表峰的强度。C、D.对所有样本分别进行主成分分析，主成分分析采用阳离子模式和阴离子模式。

图2.差异表达代谢物的鉴定。A.饼图显示了在这个项目中确定的所有代谢物(合并正负离子鉴定到的代谢物)，以及它们的化学属性。B.火山图显示了IVL组和健康受试者之间的变化。图右侧的点代表上调的代谢物，左侧的点代表下调的代谢物，中间的点代表无显著差异。X轴对应差异表达倍数(Fold Change)的log2的对数值，纵坐标为显著性P value的-log10的对数值。C.IVL组和对照组的OPLS-DA评分图，显示两组之间的分离程度。在OPLS-DA模型中，t[1]表示主成分1，to[1]表示主成分2，椭圆为95％置信区间。相同颜色的点意味着组内的每一个生物重复，点的分布状态反映了组间和组内的差异程度。D.为避免有监督模型在建模过程中发生过拟合，采用置换检验(Permutation test)对模型进行检验，以保证模型的有效性。结果显示随着置换保留度逐渐降低，随机模型的R²和Q²均逐渐下降，说明不存在过拟合现象，模型稳健性良好。E.条形图显示IVL患者与对照组之间有16种重要差异代谢物(VIP>1，P<0.05)。X轴代表这些代谢物差异表达的倍数变化。

图3. 16种已鉴定代谢物的特征。A.正离子模式下基于层次聚类分析的代谢组学数据热图可视化。颜色反映血清中代谢物的相对含量。颜色越相似，表达模式越相似。右边的面板显示了不同的代谢物。每个色块意味着一个IVL或Co组的样本。B.不同代谢途径的差异丰度(DA)评分。Y轴代表差异路径的名称，X轴坐标代表DA分数。DA评分被定义为代谢途径中所有代谢物的总变化。得分为1表示该途径中所有已鉴定代谢物的表达均呈上调趋势，而-1则正好相反。线段长度代表DA评分的绝对值；线段末端点的大小与路径中代谢物的数量有关；点越大，代谢物的数量越多。线段和点的颜色深度与DA评分成正比。

图4.Lasso回归模型构建和相关分析。A.Lasso回归模型的拟合过程。每条曲线代表一种代谢物。B.通过交叉验证计算偏似然偏差λ确定最小平均交叉验证误差。红点和实心垂直线分别表示部分似然偏差和相应的95％置信区间。此外，两条虚线分别表示均方误差最小时的λ值即lambda.min，或距离均方误差最小时一个标准误的λ值即lambda.1se。C.相关图显示了5种代谢物表达模式的相关性。颜色越深相关性越强。点的大小与相关系数成正比。

图5.各组间代谢物的相对含量。图A、B、C、D、E分别为IVL组和对照组之间差异表达代谢物的箱线图(**P<0.01)，包括次黄嘌呤、甘油磷酸胆碱、氢化可的松(皮质醇)、癸酰-L-肉碱和乙酰肉碱。图F、G、H、I、J分别为上述5种代谢物在Co-no、Co-um、IVL-no和IVL-re组中表达的比较(*P<0.05，**P<0.01)。

图6.基于广义线性回归模型的核心代谢物鉴定。A.森林图显示5种代谢物在IVL进展中的OR(比值比)值。P值用广义线性回归模型计算，并根据这些代谢物的相对含量进行调整。

图7.验证了模型的预测准确性。A.基于Python中的Scikit-learn模块，通过micro和macro-average机器学习算法对上述4种核心差异代谢物进行ROC曲线分析。Class 0～3分别代表Co-no、Co-um、IVL-no和IVL-re组，证明每一组和其他三组都能较好区分开来。应用AUC值来表征模型的预测准确性。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本发明所用术语IVL为静脉内平滑肌瘤病(intravenous leiomyomato-sis)的英文缩写。

1、样本收集

本研究符合《赫尔辛基宣言》和《临床实践协调会议指南》，并经北京协和医院伦理委员会批准(伦理学：JS-2654)。研究的所有参与者都签署了知情同意书。本研究中的疾病组包括2011年12月至2020年5月在北京协和医院接受手术并定期随访的IVL患者。研究人群分为两组：30例健康对照者为Co组，其中半数无子宫肌瘤(Co-no)，其余为子宫肌瘤(Co-um)；根据术后复发情况将30例IVL患者进一步分为无复发组(IVL-no)和复发组(IVL-re)。上述四个亚组各有15例样本。

Co-no组超声检查证实子宫肌层回声均匀，无子宫肌瘤及盆腔占位性病变，腹盆静脉无占位。Co-um组的特征是超声在子宫肌层中发现至少一个低回声肿块(最大直径≥2CM)，超声表现为典型的漩涡状结构，腹部和盆腔静脉均经超声证实无血管内占位。IVL-re组定义为至少连续两次超声检查发现盆腔或腹腔静脉(下腔静脉和髂静脉)占位性病变≥1cm或残余病变比以前增大，如果盆腔或血管内无占位性病变，则将患者分为IVL-no组。

IVL疾病组入组标准：

(1)术前影像学或术中观察到的腹盆腔静脉(宫旁生殖静脉、髂静脉、下腔静脉)或右心房占位病变；

(2)在北京协和医院手术治疗的患者；

(3)术后病理诊断IVL且伴血管侵犯的；

(4)年龄≥18岁。

IVL疾病组排除标准：

(1)临床资料不全；

(2)孕妇和哺乳期妇女；

(3)不能自理的人；

(4)不愿意参与本研究的患者；

(5)合并其他恶性肿瘤患者。

健康对照组入组标准：

(1)年龄≥18岁；

(2)无其他恶性肿瘤史；

(3)非孕妇和哺乳期妇女；

(4)既往无子宫肌瘤切除或子宫切除相关妇科手术史。

首先，由5年经验的超声医生对所有受试者进行超声检查，由另外两名高年资医生独立阅读结果，如有不一致的结果则经讨论决定。所有受试者空腹检查腹部和盆腔血管，并建议他们适当憋尿充盈膀胱，以便更好评估子宫和双附件。IVL组首先检查腹腔大血管，包括下腔静脉和双侧髂静脉的通畅情况，然后观察盆腔内是否有占位性病变。Co组行下腔静脉、髂静脉及妇科超声检查，证实腹盆腔血管无占位性病变，以及子宫有无肌瘤。如果有子宫肌瘤，同时记录最大平滑肌瘤的位置和大小。每位患者完成超声检查后，从肘静脉采集静脉血，分别提取血浆，血清，血细胞并分装到0.5毫升低温试管中并在管上标记相关信息以备后续检索查找样品。所有等分的样品都储存在-80℃的冰柜中，冰柜配有适当的报警系统和紧急备用电源，以防止意外解冻。

2、受试者的基线特征

本研究涉及30名IVL患者和30名健康对照者，他们的中位年龄分别为49.0岁和49.5岁(P＝0.25)。另外，月经初潮的年龄在两组之间没有差异。IVL患者症状不典型，主要表现为下肢水肿(n＝4)、呼吸急促(n＝8)和腰背痛(n＝4)。一些病人没有症状，只有少数人主诉腹胀，月经过多，腹部包块，甚至晕厥。在大多数情况下，盆腔包块的平均直径变化约8.3厘米。所有IVL患者均有子宫肌瘤病史。同样，超过三分之二的患者接受过子宫手术。值得注意的是，IVL的延伸路径主要集中在左、右髂静脉和右生殖静脉。此外，受累范围主要包括右心室(n＝4)、右心房(n＝14)和肾下段下腔静脉(n＝4)，形状分为铸型或管型。关于IVL分期手术，23例患者接受了I期手术，其余患者接受了II期手术。除4例有血管内残留和1例有盆腔残留外，大多数患者接受了完全切除。更重要的是，一半的病例在手术后复发，其病变主要表现在血管、盆腔或以上两个部位。详细情况见表1。

表1.相关患者的基线特征

3、样品的处理：

(1)样本在4℃环境下缓慢解冻后，将样本与预冷甲醇/乙腈/水溶液(2：2：1，v/v)涡旋混合，低温超声30min，-20℃静置10min；

(2)4℃离心机中14000g离心20min，取上清真空干燥，质谱分析时加入100μL乙腈水溶液(乙腈：水＝1:1，v/v)复溶，涡旋，4℃离心机中14000g离心15min，取上清液进样分析。

(3)由待测样本等量混合制成QC样本(质量控制样本)。

4、液相色谱质谱联用分析

(1)色谱条件：柱温25℃，流速0.5mL/min，进样量2μL，色谱流动相包含两种溶剂A和B：流动相A为水+25mM乙酸铵+25mM氨水，流动相B为乙腈，色谱梯度洗脱程序为：0-0.5min为95％B，0.5-7min为B从95％线性变化至65％，7-8min为B从65％线性变化至40％，8-9min为B维持在40％，9-9.1min为B从40％线性变化至95％，9.1-12min为B维持在95％，整个分析过程中样品置于4℃自动进样器中，为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。

(2)质谱条件：采用AB Triple TOF 6600质谱仪进行样本一级、二级谱图的采集，HILIC色谱分离后的ESI源条件如下：Ion Source Gas1(Gas1)：60，Ion Source Gas2(Gas2)：60，Curtain gas(CUR)：30，source temperature：600℃，IonSapary VoltageFloating(ISVF)：±5500V(正负两种模式)；TOF MS scan m/z range：60-1000Da，production scan m/z range：25-1000Da，TOF MS scan accumulation time 0.20s/spectra,product ion scan accumulation time 0.05s/spectra；二级质谱采用informationdependent acquisition(IDA)获得，并且采用high sensitivity模式，Declusteringpotential(DP)：±60V(正负两种模式)，Collision Energy碰撞能量：35±15eV，IDA设置如下Exclude isotopes within 4Da，Candidate ions to monitor per cycle：10。

(3)实验质量控制

在正式样品上机前用QC样本做稳定性测试，将同一个QC样本重复进样10针左右，待仪器稳定后进样。进样时，每7个样本中间插入一个QC样本。

比较了正离子和负离子模式下质控样品的总离子色谱图(TICs)。结果表明，每个色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，表明在整个实验过程中，仪器误差引起的变化可以忽略不计(图1A，B)。此外，对所有样本进行主成分分析(PCA)，反应实验的稳定性和重复性以及数据质量的可靠性。

5、数据处理和诊断生物标记物筛选

wiff格式的原始MS数据经ProteoWizardMSConvert转换为mzXML文件，然后采用XCMS软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积，对XCMS提取得到的数据首先进行代谢物结构鉴定、数据预处理，然后进行实验数据质量评价，最后再进行数据分析，数据分析内容包括单变量统计分析、多维统计分析、差异代谢物筛选、差异代谢物相关性分析、KEGG通路分析等内容。

对于色谱质谱数据，在归一化至总峰强度后，用R软件包(ropls)对处理后的数据进行分析，并进行正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)，采用多重交叉验证和置换检验对模型的稳定性进行了评价。结合VIP和P值筛选差异代谢物，并对差异代谢物做进一步的层次聚类分析、KEGG途径富集、Lasso回归分析、广义线性回归模型、多参数ROC曲线分析确定潜在的生物标记物。

6、代谢谱分析和潜在的生物标记物

(1)样本质量控制分析

图1A、B所示所有样品的总离子色谱图以及阳离子和阴离子模式下的质量控制。横坐标代表每个色谱峰的保留时间，纵坐标代表峰的强度。图C、D对所有样本分别进行主成分分析，主成分分析采用阳离子模式和阴离子模式。结果表明在本实验中，实验的稳定性和重复性以及数据质量的可靠性足以进行进一步分析。

(2)单变量统计分析

如图2A所示，本项目最终确定了240种Superclass level的代谢物(鉴定等级均在Level 2以上，包括未定义的代谢物)，并以正离子和负离子模式进行检测(本项目正负离子模式合并后鉴定240种代谢物，其中正负离子模式鉴定到的代谢物数量分别为135种和131种)。这些代谢物根据其化学成分的归属进行分类。结果表明，这些可识别的代谢产物主要是脂类或类脂分子(17.92％)、有机酸或衍生物(16.25％)和有机杂环化合物(9.167％)。此外，在血清标本中还检测到一些有机氧化合物、核苷、核苷酸或类似物、苯类化合物、有机氮化合物、苯丙酸或聚酮类化合物。为了分析IVL组与健康对照组在正离子模式下的差异，采用了单变量统计分析方法，包括fold change(FC)分析和Student's t检验或Mann-WhitneyU检验。在这些代谢物中，筛选出差异表达代谢物(差异代谢物)并显示为图2B中的火山图，FC>1.5且P值<0.05。在火山图中，上调和下调的代谢物分别在右侧或左侧。数据表明，这些差异代谢物可分为脂类或类脂分子、核苷、核苷酸或类似物以及有机杂环化合物。

(3)正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)

为了筛选出与IVL发生相关的代谢物，根据代谢物建立判别模型，采用有监督的判别分析方法OPLS-DA对两组样本进行判别。如图2C所示，根据得分，两组在正离子模式下彼此分离良好。为了避免监督模型在建模过程中的过度拟合，采用置换检验对模型的稳定性进行了评价。图2D显示随机模型的R²和Q²值随着置换保留度的减少而逐渐减小，这意味着模型的稳定性是可以接受的，并且本研究建立的模型具有良好的拟合度和可预测性，R²Y＝0.95，Q²＝0.66。计算OPLS-DA模型中每个变量权重值(VIP)的重要性，以表示其对分类的贡献，VIP越大的代谢物，对分类的贡献越大。VIP值>1的代谢物在单变量水平上进一步进行Student's t检验或Mann-WhitneyU检验，以测量每种代谢物的显著性，P值小于0.05被认为具有统计学意义。据分析，在满足本实验筛选标准时，最终鉴定出16种正离子模式的代谢物：VIP>1，P值<0.05，如图2E所示。在这些代谢物中，IVL组有10种上调，包括腺苷、癸酰-L-肉碱、胆红素、氢化可的松(皮质醇)和胆绿素等。相反，与Co组相比，1-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、甘油磷酸胆碱、苯丙氨酸-苯丙氨酸、2-氨基-1-苯乙醇、次黄嘌呤表达下调。

(4)层次聚类分析与KEGG途径富集

为了全面、直观地揭示不同样本之间的关系和差异，采用层次聚类分析法(HCA)。聚集在同一簇中的代谢物具有相似的表达模式，可能具有相似的功能或参与相同的代谢过程或细胞途径。HCA结果包括上述16个显著差异代谢物(VIP>1，P<0.05)，如图3A所示。结果发现，两组具有完全不同的代谢模式，6种主要富集于Co组的上调代谢产物。相反，IVL组中剩余的10种代谢物含量丰富。随后，为了捕捉上述16个差异代谢物在特定路径中的平均和整体变化，本研究引入了基于差异丰度(DA)评分的代谢变化分析。如图3B所示，这些代谢物主要参与cGMP-PKG信号通路、神经活性配体-受体相互作用、GABA能突触、谷氨酸能突触、D-谷氨酰胺或D-谷氨酸代谢、嘌呤代谢、皮质醇合成或分泌以及癌症中的胆碱代谢。所有的差异代谢途径都根据其先前的途径层次进行了进一步的分类和分配，这些代谢产物主要参与癌症、内分泌或代谢疾病、其他氨基酸或核苷酸的代谢、信号分子的相互作用或转导以及脂代谢，和膜运输。

(5)基于Lasso回归分析的代谢物筛选

在上述筛选的代谢物中，进行了Lasso回归分析并确定了5种代谢物，这些代谢物基于交叉验证进一步验证，包括次黄嘌呤、甘油磷酸胆碱、氢化可的松(皮质醇)、癸酰-L-肉碱和乙酰肉碱(图4A，B)。为了解释所有差异代谢物之间的代谢相关性，进行了相关分析，这对进一步了解代谢物之间的相互调节具有重要意义。具有表达相关性的代谢物可能共同参与生物过程，即功能相关性。在此分析的基础上，发现次黄嘌呤与甘油磷酸胆碱呈正相关(Cor＝0.31)，癸酰-L-肉碱也与氢化可的松(皮质醇)或乙酰肉碱呈正相关(Cor＝0.42，0.58)。相反，乙酰肉碱呈负趋势，次黄嘌呤和甘油磷酸胆碱的丰度都很高(图4C)。根据IVL组和Co组之间这五种代谢物的表达水平，发现IVL组次黄嘌呤和甘油磷酸胆碱显著下调，而IVL组氢化可的松(皮质醇)、癸酰-L-肉碱和乙酰肉碱上调(图5A、B、C、D、E)。为了研究这些代谢物在IVL进展中的作用，根据子宫肌瘤的存在和IVL复发情况将所有样本进一步分为上述四组(Co-no、Co-um、IVL-no、IVL-re)。Co-no组和Co-um组次黄嘌呤的相对含量与IVL-no组和IVL-re组显著不同(P<0.01)(图5F)。至于图5G，H中的乙酰肉碱和癸酰-L-肉碱，与健康对照组相比，IVL-no组的乙酰肉碱和癸酰-L-肉碱升高。此外，与Co-no组相比，IVL-re组这些代谢物的水平有显著差异。图5I中的甘油磷酸胆碱，尽管仅观察到IVL-no和IVL-re组与Co-no组相比有显著差异，与Co-um组相比无显著差异，但随着疾病的进展，甘油磷酸胆碱的浓度呈下降趋势(四组相对含量分别为1.00±0.10,0.95±0.19,0.82±0.11,0.80±0.24)。图5J中，氢化可的松(皮质醇)呈逐渐上升趋势(四组相对含量分别为1.00±0.75,1.08±0.62,1.99±0.96,2.58±2.54)，但IVL-no组和Co-um组之间的比较似乎没有统计学意义。

(6)与IVL进展相关的核心(Hub)代谢物的测定

考虑到代谢物之间的相互作用，进一步使用广义线性回归模型(GLM)来寻找与IVL进展相关的核心代谢物与五种代谢物的相对含量。数据证明四种代谢物(次黄嘌呤、乙酰肉碱、甘油磷酸胆碱和氢化可的松(皮质醇))与IVL的进展密切相关，如图6A所示。次黄嘌呤和甘油磷酸胆碱可能是疾病进展中的独立保护因子(OR值分别为0.19和0.02)；然而，乙酰肉碱和氢化可的松(皮质醇)，尤其是前者，可能作为疾病的危险指标或危险因素，促进IVL的进展(OR值分别为18.16和2.10)。这些结果表明，这四种代谢物是预测IVL预后和进展的有希望的因素。

7、ROC分析对核心代谢物预测的验证

为了证实上述四种核心代谢物的预测准确性，我们进一步使用Python模块Scikitlearn进行了接收器-操作器特征曲线分析(https://scikit-learn.org/)。本发明介绍了两种最新的机器学习算法，包括micro-average和macro-average。我们的结果表明，这四种代谢物在区分不同病理状态的病例方面发挥了很好的作用，两种算法所得到的曲线下面积(AUC)分别为0.72和0.81(图7A)。这些发现表明了四种核心代谢物所建立模型的预测价值。

8、结果

经过以上分析，我们发现次黄嘌呤和甘油磷酸胆碱作为潜在的保护指标，随着疾病的进展总体趋势降低。相反，乙酰肉碱和氢化可的松(皮质醇)被证明是IVL的危险因素，随着疾病的发生和复发总体趋势增加。根据多分类ROC分析进一步证实。IVL的进展分为4个阶段，分别为完全健康、健康有子宫肌瘤、IVL未复发、IVL复发。根据广义线性回归模型z＝β0+β1*x1+β2*x2+β3*x3+...+βn*xn(β0为固定值)。计算回归系数和优势比OR值(oddsratio)，将回归系数代入方程可得到ln(比值odds)＝β0-1.659*次黄嘌呤+2.899*乙酰肉碱-3.716*甘油磷酸胆碱+0.743*氢化可的松(皮质醇)。

例如，一个患者a时间为健康有子宫肌瘤，次黄嘌呤(OR值＝0.19)0.47、乙酰肉碱(OR值＝18.16)0.90、甘油磷酸胆碱(OR值＝0.02)0.80、氢化可的松(皮质醇)(OR值＝2.1)1.10；过了一段时间，b时间(和a处在同一阶段，也为健康有子宫肌瘤)的4个代谢物依次为1.07、1.15、0.95、1.08。

ln(a时间)-ln(b时间)＝ln(a时间/b时间)＝-1.659*(0.47-1.07)+2.899*(0.9-1.15)-3.716*(0.8-0.95)+0.743*(1.1-1.08)，两边取指数后：

a时间/b时间优势比OR值＝exp^(-0.1659*(0.47-1.07)+2.899*(0.9-1.15)-3.716*(0.8-0.95)+0.743*(1.1-1.08))＝2.32倍，此患者a时间比b时间疾病进展到IVL风险高2.32倍。由此可以看出，本发明筛选得到的次黄嘌呤、甘油磷酸胆碱、乙酰肉碱、氢化可的松(皮质醇)这一组标记物在预测静脉内平滑肌瘤病进展的应用效果方面是比较显著的，具有一定的临床价值。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.一组生物标记物在制备预测静脉内平滑肌瘤病进展的试剂盒中的应用，其特征在于，所述生物标记物为次黄嘌呤、甘油磷酸胆碱、乙酰肉碱、氢化可的松。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标记物为血清代谢物。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物标记物次黄嘌呤和甘油磷酸胆碱随着静脉内平滑肌瘤病进展表达量总体趋势降低，乙酰肉碱和氢化可的松随着静脉内平滑肌瘤病进展表达量总体趋势升高。

4.如 权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括检测次黄嘌呤、甘油磷酸胆碱、乙酰肉碱、氢化可的松浓度的试剂。

5.一种如权利要求1-4任意一项中所述的生物标记物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样本收集：收集静脉内平滑肌瘤病无复发患者、静脉内平滑肌瘤病复发患者、健康无子宫肌瘤对照者、健康有子宫肌瘤对照者血清样本；

（2）液相色谱质谱采集：通过液相色谱对样本进行预分离，质谱采集一级、二级谱图；

（3）数据分析：wiff格式的原始MS数据经ProteoWizardMSConvert转换为mzXML文件，然后采用XCMS软件进行峰对齐、保留时间校正和提取峰面积，对XCMS提取得到的数据首先进行代谢物结构鉴定、数据预处理，然后进行实验数据质量评价，最后再进行数据分析，首先采用单变量统计分析方法，包括fold change分析和Student's t检验或Mann-Whitney U检验，然后用R软件包对处理后的数据进行主成分分析，并进行正交偏最小二乘法-判别分析，正交偏最小二乘法-判别分析得到的OPLS-DA模型用多重交叉验证和置换检验对模型的稳定性进行了评价；

（4）筛选：根据上述正交偏最小二乘法-判别分析得到的OPLS-DA模型的变量重要性评分和P值进行差异代谢物筛选，筛选标准为：VIP＞1，P值＜0.05；

（5）鉴定：通过分析匹配代谢物的保留时间、分子质量、二级碎裂谱图、碰撞能等信息，其中分子质量误差在<25 ppm内，对生物样本中的代谢物进行结构鉴定，并对鉴定结果进行严格的人工二次核对、确认，鉴定等级在Level2以上。

6.如权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述方法还包括采用层次聚类分析方法、KEGG途径富集方法、Lasso回归分析方法、广义线性回归模型、ROC曲线分析方法中的一种或多种对筛选到的差异代谢物进一步筛选。

7.如权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述液相色谱质谱采集时，每7个样本加入一个质量控制样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。

8.如权利要求5所述的筛选方法，其特征在于，所述样本进样前进行以下处理：样本在4℃环境下缓慢解冻后，将样本与预冷甲醇/乙腈/水溶液涡旋混合，其中甲醇/乙腈/水体积比例为2：2：1，低温超声30min，-20℃静置10min； 4℃离心机中14000g离心20min，取上清真空干燥，质谱分析时加入100μL乙腈水溶液，乙腈与水体积比为1:1，复溶，涡旋，4℃离心机中14000g离心15min，取上清液进样分析。

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