ES2841950T3 - Un procedimiento de diagnóstico de cáncer pancreático en base al análisis lipidómico de un fluido corporal - Google Patents

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Robert Jirasko
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Abstract

Un procedimiento de diagnóstico de cáncer pancreático en base al análisis lipidómico de un suero obtenido del cuerpo de un paciente humano, caracterizado por que comprende las etapas de: - enriquecimiento de la muestra con un conjunto de patrones internos que comprenden al menos un patrón interno para cada clase lipídica presente en la muestra, - procesamiento posterior de la muestra por extracción lipidómica líquido-líquido, - medición de la muestra procesada por un procedimiento de espectrometría de masas, - determinación de concentraciones para al menos 60, preferentemente al menos 120 o al menos 230, más preferentemente para todos los lípidos presentes en un nivel por encima del umbral de detección del procedimiento de espectrometría de masas, usando los patrones internos para las clases lipídicas correspondientes para la cuantificación, o usando concentraciones relativas de lípidos, o usando proporciones de concentraciones y/o intensidades de señal, en el que los lípidos para los que se determinan las concentraciones incluyen los siguientes lípidos: **Tabla** - evaluación estadística de las concentraciones determinadas de los lípidos, determinando dicha evaluación estadística el nivel de probabilidad de que el paciente padezca cáncer pancreático en base a las concentraciones lipídicas determinadas en comparación con un patrón canceroso y un patrón no canceroso, en el que el patrón canceroso y el patrón no canceroso se determinan por análisis estadístico de las concentraciones lipídicas para un grupo de muestras de cáncer y muestras distintas de cáncer conocidas, en el que la evaluación estadística se realiza por separado para hombres y mujeres.

Description

DESCRIPCIÓN
Un procedimiento de diagnóstico de cáncer pancreático en base al análisis lipidómico de un fluido corporal
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a un procedimiento de diagnóstico de cáncer pancreático en base al análisis lipidómico de un fluido corporal que es adecuado para un cribado ultrarrápido con una alta selectividad y especificidad.
Técnica anterior
El cáncer pancreático se encuentra entre los tumores más letales con la tasa de supervivencia más baja de todos los cánceres. Se espera que se convierta en la segunda causa principal de muerte relacionada con cáncer en los EE. UU. así como en Europa para el año 2020. El cáncer pancreático es muy difícil de diagnosticar en fase precoz. El páncreas se encuentra en lo más profundo del cuerpo, por lo que los tumores precoces no se pueden ver ni palpar por los médicos durante exploraciones físicas rutinarias. Las personas normalmente no tienen síntomas hasta que el cáncer ya se ha diseminado a otros órganos. Si las personas tienen un incremento en el riesgo de cáncer pancreático debido a predisposiciones genéticas o muestran signos y síntomas que pueden estar asociados con esta enfermedad, se pueden realizar exámenes y pruebas específicas. Las pruebas de imagen se realizan con mayor frecuencia en caso de sospecha grave de cáncer pancreático: tomografía computarizada, resonancia magnética nuclear, ecografía abdominal o endoscópica, colangiopancreatografía, gammagrafía del receptor de somatostatina, tomografía por emisión de positrones o angiografía. Se pueden usar pruebas o exámenes de cribado para buscar una enfermedad en personas que no presentan síntomas y que no han tenido esa enfermedad antes. Sin embargo, las pruebas de imagen usadas para pacientes con un incremento en el riesgo o una sospecha de cáncer pancreático no son aplicables para el cribado de población a gran escala y, además, las pruebas de imagen pueden tener limitaciones de sensibilidad en la detección de tumores en una fase precoz. Para un diagnóstico concluyente de cáncer pancreático, se puede realizar una biopsia percutánea, endoscópica o quirúrgica, pero de nuevo estos procedimientos invasivos no son aplicables para el cribado de población rutinario.
Hasta ahora, se han considerado varios tipos de análisis de sangre para diagnosticar el cáncer pancreático, tales como antígeno de carbohidrato 19-9 (CA19-9), antígeno carcinoembrionario (CEA) o Kirsten-ras (KRAS), pero desafortunadamente la baja sensibilidad y la baja especificidad no permiten su uso en la práctica clínica para diagnóstico precoz. Hasta el momento no se han desarrollado pruebas de cribado que permitan la detección de fases suficientemente precoces para reducir el riesgo de muerte por cáncer pancreático. Se necesita con urgencia una detección fiable del cáncer pancreático en fase precoz, pero en este momento, ningún grupo profesional importante recomienda ningún cribado rutinario para el cáncer pancreático en personas en riesgo.
Se aplicó análisis lipidómico usando el enfoque de cromatografía de líquidos hidrófilos semicuantitativa más antiguo para tejidos tumorales de mama [E. Cífková, M. Holcapek, M. Lísa, D. Vrána, J. Gaték, B. Melichar, Anal. Bioanal. Chem. 407 (2015) 991-1002. Determination of lipidomic differences between human breast cancer and surrounding normal tissues using HILIC-HPLC/ESI-EM and multivariate data analysis] y líneas celulares tumorales de mama [E. Cífková, M. Lísa, R. Hrstka, D. Vrána, J. Gaték, B. Melichar, M. Holcapek, Rapid Commun. Mass Spectrom. 31 (2017) 253-263. Correlation of lipidomic composition of cell lines and tissues of breast cancer patients using hydrophilic interaction liquid chromatography - electrospray ionization mass spectrometry and multivariate data analysis] en comparación con tejidos normales circundantes o líneas celulares normales, respectivamente, y sugiere que los cambios lipidómicos inducidos por cáncer de células tumorales y tejidos se pueden usar para la diferenciación de tumores de tejidos normales. Estos estudios no se relacionaron con fluidos corporales. Se han presentado dos primeros intentos para diferenciar pacientes con cáncer pancreático de voluntarios sanos usando Sm 38:2 y otros lípidos [documento US 2013/0140452] o una combinación de lípidos, metabolitos y proteína CA19-9 seleccionados [documento WO 2016/207391], pero, lamentablemente, las selectividades y sensibilidades logradas en estos documentos (significativamente menos de un 90 % para muestras con clasificación conocida; no se proporcionaron datos para muestras con clasificación desconocida) no alcanzan el nivel requerido para programas de cribado de alto rendimiento de cáncer pancreático, de modo que los enfoques presentados aún no son aplicables para un cribado de población fiable y de alto rendimiento de cáncer pancreático.
El documento US 2012/0202188 propone diagnosticar el cáncer pancreático analizando una muestra del paciente por espectrometría de masas de alta resolución para obtener datos de intensidad de masa exactos, comparando los datos con datos correspondientes obtenidos de una o más muestras de referencia para identificar un incremento o disminución en la intensidad de masa exacta y usando este incremento o disminución para diagnosticar cáncer pancreático. En este documento se usan patrones internos, pero solo se añaden antes de la etapa de espectroscopía de masas. Los datos tampoco se evalúan por separado en base al género.
Hasta ahora, no se ha propuesto un procedimiento eficaz para programas de cribado de diagnóstico precoz de alto rendimiento con una selectividad y sensibilidad suficientemente altas.
El principal problema del análisis de líquidos corporales es que el tumor en fase precoz puede tener un impacto demasiado pequeño en la regulación incorrecta de metabolitos y lípidos verificados, lo que puede dar como resultado la situación de que el efecto de la variabilidad biológica es mayor que el efecto sobre el tipo de cáncer estudiado, y entonces no se pueden descubrir diferencias estadísticamente pertinentes en fluidos corporales.
La presente invención tiene como objetivo superar los problemas y desafíos del estado de la técnica actual y proporcionar un procedimiento de diagnóstico de cáncer pancreático incluso en fases precoces, siendo dicho procedimiento utilizable para el cribado de población de alto rendimiento rutinario.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento de diagnóstico de cáncer pancreático en base al análisis lipidómico de un suero obtenido del cuerpo de un paciente humano, caracterizado por que comprende las etapas de: - enriquecimiento de la muestra con un conjunto de patrones internos que comprenden al menos un patrón interno para cada clase lipídica presente en la muestra,
- procesamiento posterior de la muestra por extracción lipidómica líquido-líquido,
- medición de la muestra procesada por un procedimiento de espectrometría de masas,
- determinación de concentraciones para al menos 60, preferentemente al menos 120 o al menos 230, más preferentemente para todos los lípidos presentes en un nivel por encima del umbral de detección del procedimiento de espectrometría de masas, usando los patrones internos para las clases lipídicas correspondientes para la cuantificación, o usando concentraciones relativas de lípidos, o usando proporciones de concentraciones y/o intensidades de señal,
en el que los lípidos para los que se determinan las concentraciones incluyen los siguientes lípidos:
HexCer d18:1/16:0; HexCer d18:1/15:1 (1OH)
SM 34:1
HexCer d18:1/24:1; HexCer d18:1/23:2 (1OH)
PE 34:1; PE P-35:0
PC 32:0; PC O-33:0
PE 36:4; PE P-37:3
PC 34:1; PC P-35:0
PE 34:2; PE P-35:1
PC P-34:0; PC 33:1
DG 36:2
Cer d18:1/24:1; Cer d18:1/23:2 (1OH)
CE 16:0
SM 41:1
SM 41:2
PC 34:4; PC P-35:3
HexCer d18:1/24:0; HexCer d18:1/23:1 (1OH)
PE P-36:3 PE 35:4
PE P-38:4 PE 37:5
PE P-38:5 PE 37:6
PE P-36:2 PE 35:3
SM 32:1
HexCer d18:1/22:0; HexCer d18:1/21:1 (1OH)
PE P-38:3; PE 37:4
PC P-38:2; PC 37:3
PE P-40:5; PE 39:6
PE 36:0; PE P-38:6
PE 38:0; PE P-40:6, PE O-39:0
PE P-36:3; PE 35:4
PC P-34:1; PC 33:2
PC P-36:2; PC 35:3
DG 34:3
- evaluación estadística de las concentraciones determinadas de los lípidos, determinando dicha evaluación estadística el nivel de probabilidad de que el paciente padezca cáncer pancreático en base a las concentraciones lipídicas determinadas en comparación con un patrón canceroso y un patrón no canceroso, en el que el patrón canceroso y el patrón no canceroso se determinan por análisis estadístico de las concentraciones lipídicas para un grupo de muestras de cáncer y muestras distintas de cáncer conocidas, en el que la evaluación estadística se realiza por separado para hombres y mujeres.
Preferentemente, los patrones internos son compuestos lipídicos exógenos, que tienen la estructura de cabeza polar típica para la clase lipídica pertinente y que contienen acilos grasos con cadenas más cortas que los lípidos naturales, preferentemente cadenas 12:0 o 14:0, o acilos grasos con número impar de átomos de carbono, preferentemente cadenas 17:0, 17:1 o 19:1, o los patrones internos son análogos marcados isotópicamente de los lípidos de la clase lipídica pertinente, preferentemente D7-Chol, D7-CE 16:0; en los que la notación de compuestos lipídicos es como sigue: abreviatura de la clase de los compuestos, número de carbonos: número de dobles enlaces, precedida por información sobre marcaje isotópico.
Más preferentemente, un conjunto de patrones internos contiene:
D7-CE 16:0 MG 19:1
Cer d18:1/12:0 PA 14:0/14:0
DG 12:1/12:1 PC 14:0/14:0
Hex2Cer d18:1/12:0 PE 14:0/14:0
HexCer d18:1/12:0 PG 14:0/14:0
D7-Chol PS 14:0/14:0 LPC 17:0 SM d18:1/12:0 LPE 14:0 SulfoHexCer d18:1/12:0
LPG 14:0 TG 19:1/19:1/19:1
LPA 14:0 LPS 17:1
en los que la notación de compuestos lipídicos es como sigue: abreviatura de la clase de los compuestos, número de carbonos: número de dobles enlaces, precedida por información sobre marcaje isotópico.
Los patrones internos son compuestos de tipo lipídico, estructuralmente cercanos a la clase lipídica pertinente. Típicamente, los patrones internos son compuestos que tienen la estructura (en particular la estructura de cabeza polar) típica para la clase lipídica pertinente pero que contienen acilos grasos con cadenas más cortas que los lípidos naturales (por ejemplo, cadenas 12:0 o 14:0) o acilos grasos con número impar de átomos de carbono (por ejemplo, cadenas 17:0, 17:1 o 19:1) o análogos marcados isotópicamente (por ejemplo, D7-Chol, D7-CE16:0).
Las clases lipídicas son como sigue:
Ésteres de colesterilo (CE) Lisofosfatidilserinas (LPS)
Ceramidas (Cer) Monoacilgliceroles (MG)
Diacilgliceroles (DG) Ácidos fosfatídicos (PA)
Dihexosilceramidas (Hex2Cer) Fosfatidilcolinas (PC)
Hexosilceramidas (HexCer) Fosfatidiletanolaminas (PE)
Colesterol Fosfatidilgliceroles (PG)
Ácidos lisofosfatídicos (LPA) Fosfatidilserinas (PS)
Lisofosfatidilcolinas (LPC) Esfingomielinas (SM) Lisofosfatidiletanolaminas (LPE) Sulfohexosilceramidas (SulfoHexCer) Lisofosfatidilgliceroles (LPG) Triacilgliceroles (TG)
La notación de compuestos lipídicos en este texto es como sigue: abreviatura de la clase de los compuestos, número de carbonos: número de dobles enlaces. La abreviatura de la clase puede estar precedida por información sobre marcaje isotópico, si es pertinente.
Debido a la adición del patrón interno antes del procesamiento de muestra, las ligeras diferencias debidas, por ejemplo, a errores de pipeteo se pueden compensar ya que el patrón interno se ve afectado de la misma forma que los compuestos objetivo. Esto garantiza una mejor fiabilidad de la cuantificación de lípidos individuales.
Las extracciones lipidómicas líquido-líquido son conocidas en la técnica. Se pueden usar disolventes, seleccionados de alcanos clorados, éteres de dialquilo, alcoholes y mezclas de agua, lo que forma sistemas bicapa que contienen fases orgánicas y acuosas. Preferentemente, se usan cloroformo, éter metil-terc-butílico, metanol, etanol, propanol y/o butanol. Lo más preferentemente, se usa el sistema cloroformo-metanol-agua, como se describe, por ejemplo, en E. Cífková, M. Holcapek, M. Lísa, D. Vrána, J. Gaték, B. Melichar, Anal. Bioanal. Chem. 407 (2015) 991-1002; o en E. Cífková, M. Lísa, R. Hrstka, D. Vrána, J. Gaték, B. Melichar, M. Holcapek, Rapid Commun. Mass Spectrom. 31 (2017) 253-263. La fase orgánica del sistema de extracción líquido-líquido que contiene lípidos se obtiene y se usa para procesamiento adicional. Como la migración y la solubilidad de los componentes de la muestra dependen del tiempo, es altamente recomendable que la etapa de extracción se realice siempre de la misma forma para todas las muestras medidas en un lote, en particular que la extracción se realice durante el mismo período de tiempo para cada muestra.
La fase orgánica se procesa típicamente por evaporación del disolvente orgánico y redisolución del residuo en el disolvente para la medición de espectrometría de masas. Los disolventes adecuados para las mediciones de espectrometría de masas incluyen alcanos clorados, alcanos y alcoholes, preferentemente cloroformo o diclorometano, hexano y alcoholes C1-C4, lo más preferentemente una mezcla de cloroformo y 2-propanol (por ejemplo, en una proporción de volumen 1:1) o hexano: 2-propanol : cloroformo 7:1,5:1,5 o cloroformo-metanol-2-propanol (1:2:4, v/v/v). Se pueden añadir otros componentes, por ejemplo, acetato de amonio, ácido acético, etc. Los alcanos, a menos que se defina de otro modo, quieren decir alcanos C1-C6, preferentemente alcanos C1-C4.
Es preferente retirar las proteínas de la muestra durante o después de la extracción líquido-líquido, ya que las proteínas pueden interferir indeseablemente con el análisis de lípidos.
El procedimiento de espectrometría de masas se selecciona de espectrometría de masas indiscriminada, cromatografía de líquidos de ultraalto rendimiento-espectrometría de masas (UHPLC/EM), cromatografía de fluidos supercríticos de ultraalto rendimiento-espectrometría de masas (UHPSFC/EM) y espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (EM/MALDI).
En un modo de realización preferente, se prepara una muestra combinada mezclando volúmenes idénticos de varias muestras que incluyen muestras de pacientes con cáncer pancreático y voluntarios sanos, y dicha muestra combinada se usa y se procesa de la misma forma que las muestras medidas;
preferentemente, la muestra combinada se usa para observar la exactitud intradía y precisión intradía, así como la exactitud interdía y precisión interdía, y/o para determinar el límite inferior de cuantificación y el límite superior de cuantificación, y/o para el control de calidad durante las mediciones del conjunto de muestras.
El procedimiento de la presente invención se beneficia del uso de una muestra combinada. Una muestra combinada es una muestra preparada mezclando volúmenes idénticos de varias muestras, en la que las muestras mezcladas incluyen muestras de pacientes con cáncer pancreático y voluntarios sanos. La proporción de muestras procedentes de hombres con respecto a muestras procedentes de mujeres debe ser aproximadamente la misma que en el lote medido de muestras. El término "aproximadamente el mismo" se refiere a la desviación de la proporción de hombre:mujer en el lote medido como máximo en un 20 %, preferentemente como máximo en un 10 %, más preferentemente como máximo en un 5 %. La muestra combinada se obtiene preferentemente combinando 50-100 muestras.
La muestra combinada, procesada de la misma forma que cualquier otra muestra, es decir, enriquecida con una mezcla de patrón interno y sometida a extracción líquido-líquido y cualquier otra etapa de procesamiento de muestra, se usa para la validación completa y el control de calidad durante las mediciones de espectrometría de masas. El orden de las muestras se aleatoriza en secuencias de medición de muestras para evitar mediciones de muestras no cancerosas y cancerosas en una determinada parte de la secuencia de medición.
La muestra combinada se puede usar para observar la exactitud intradía y precisión intradía, así como la exactitud interdía y precisión interdía.
Además, es ventajoso preparar muestras de prueba o muestras combinadas enriquecidas con concentraciones variables de la mezcla de patrón interno.
Preferentemente, el orden de las muestras se aleatoriza en las secuencias de medición de muestras.
El límite de detección (LOD) de un lípido se determina preferentemente en base a la proporción de señal con respecto a ruido, por ejemplo, tal como S/N = 3.
La muestra combinada enriquecida con concentraciones variables de la mezcla de patrón interno se usa para determinar el límite inferior de cuantificación (LLOQ) y el límite superior de cuantificación (ULOQ), dichos límites correspondientes a los primer y último puntos del intervalo de linealidad de la curva de calibración. La curva de calibración es la dependencia de la señal sobre la concentración de un lípido. El intervalo de linealidad de la curva de calibración es un intervalo de LLOQ a ULOQ, donde se puede determinar la concentración de lípidos.
Las concentraciones para todos los lípidos presentes a un nivel superior a LLOQ del procedimiento de espectrometría de masas también se denominan comúnmente "perfil lipidómico".
La cuantificación (determinación de concentraciones) para todos los lípidos presentes a un nivel superior a LLOQ del procedimiento de espectrometría de masas, usando los patrones internos para las clases lipídicas correspondientes para la cuantificación, comprende preferentemente los siguientes procedimientos y correcciones:
- corrección isotópica (desisotopado), es decir, corrección de la intensidad de señal de un lípido que tiene debido a la contribución isotópica M+2 de otro lípido con un peso molecular que es 2 unidades de masa menor que dicho lípido (por ejemplo, interferencia isotópica del lípido con un doble enlace adicional) o debido a la contribución isotópica M+1 de otro lípido con un peso molecular 1 unidad de masa menor que dicho lípido (por ejemplo, interferencias entre los subgrupos PC y SM). La corrección se realiza restando la intensidad relativa calculada M+2 (o M+1) en base a la intensidad conocida en los espectros medidos.
- procedimiento de llenado con ceros en el que las señales de especies lipídicas que no se detectan para una muestra particular, se reemplazan por de un 50 a un 100 %, preferentemente por de un 70 a un 100 %, más preferentemente por de un 80 a un 90 % o un 80 %, de la concentración mínima observada para dichas especies lipídicas en todas las muestras.
La exactitud y fiabilidad de la cuantificación se garantizan o mejoran por los siguientes rasgos característicos:
- uso de al menos un patrón interno de clase lipídica exógena para la cuantificación de especies lipídicas en cada clase,
- coelución y coionización de patrones internos de (sub)clase lipídica y analitos de la misma clase lipídica usando el procedimiento de cromatografía de separación de clases lipídicas acoplado a espectrometría de masas (EM) o bien EM sin ninguna separación cromatográfica. Este coprocesamiento se garantiza por la adición del patrón interno antes de que se procese la muestra,
- uso de la muestra combinada enriquecida con los patrones internos como muestra de control de calidad inyectada después de un número predeterminado de muestras,
- procedimiento de llenado con ceros,
- corrección isotópica.
Estos rasgos característicos evitan uno o más de: baja reproducibilidad, falta de robustez, cambios de señal con el tiempo, supresión/potenciación de iones, efectos de arrastre y cambio de respuesta del espectrómetro de masas debido a contaminación.
Cuando se determinan varios cientos de lípidos en cientos de muestras, puede suceder que la señal esperada no se detecte para algunas moléculas lipídicas debido a diversos motivos, y a continuación se debe informar de la concentración como "por debajo de LLOQ" de acuerdo con la práctica analítica establecida. Este enfoque analítico bien establecido no funciona bien en el caso de la cuantificación lipidómica, y el MDA en base a dicho enfoque proporcionaría una mala resolución de grupos sanos/enfermos, y puede que no proporcione una sensibilidad y selectividad aceptables para la detección de cáncer pancreático u otra enfermedad. Este enfoque se adapta a los casos en los que todas las señales faltantes corresponden a la situación de que la concentración real del analito está por debajo de LLOQ, por ejemplo, la determinación de un número bajo de analitos bien separados por cromatografía. Sin embargo, la situación en la cuantificación lipidómica es muy diferente, porque se cuantifican aprox. 150-400 lípidos por muestra y muchos de ellos (o todos en el caso de indiscriminada) son coeluyentes, lo que puede dar como resultado la ausencia de señal debido a otros motivos distintos a la concentración por debajo del LLOQ, principalmente debido a la supresión de iones u otros motivos que provocan la caída de la señal, incluyendo la contaminación del sistema, la impureza de la fase móvil, el sangrado de la columna cromatográfica, etc. La complejidad del análisis lipidómico es enorme, y es una situación natural que algunas señales no se registran y procesan de forma apropiada independientemente de la mejor práctica analítica y cuidadoso trabajo analítico. Por lo tanto, se ha desarrollado un nuevo enfoque de llenado con ceros donde los valores que faltan por cualquier motivo se reemplazan por de un 75 a un 85 %, preferentemente por un 80 %, de la concentración mínima observada para esta especie lipídica en todas las muestras. Este enfoque mejora significativamente la calidad del análisis estadístico posterior. Estos resultados preliminares muestran que cuando se descuida el enfoque de llenado con ceros, la calidad de la detección del cáncer es significativamente peor o imposible. Posteriormente se calcula el promedio y la desviación estándar de los duplicados.
La evaluación estadística se realiza preferentemente por análisis de datos multivariados (MDA). Los procedimientos MDA pueden ser procedimientos estadísticos no supervisados tales como análisis de componentes principales (PCA) o procedimientos estadísticos supervisados tales como proyecciones ortogonales para análisis discriminante de estructuras latentes (OPLS-DA).
El "patrón canceroso" quiere decir el patrón de concentraciones lipídicas típico para muestras de un fluido corporal obtenido de pacientes que padecen cáncer pancreático. El término "muestra cancerosa" o "muestra de cáncer" se refiere a la muestra de un fluido corporal obtenido de pacientes que padecen cáncer pancreático.
El "patrón no canceroso" quiere decir el patrón de concentraciones lipídicas típicas para muestras de un fluido corporal obtenido de voluntarios sanos, es decir, de sujetos que no padecen cáncer pancreático. El término "muestra no cancerosa" o "muestra distinta de cáncer' se refiere a una muestra de un fluido corporal obtenida de voluntarios sanos, es decir, de sujetos que no padecen cáncer pancreático.
Preferentemente, la evaluación estadística implica
- preprocesamiento de datos como centrado, escalado y/o transformación. El centrado correlaciona los cambios con relación al promedio del conjunto de datos. El escalado unifica el impacto de diferentes intervalos de concentración en el modelo (escalado UV y Pareto) de modo que las concentraciones bajas (quizás igualmente importantes) no queden enmascaradas por concentraciones muy abundantes. La transformación logarítmica reúne los datos para la distribución normal. Un preprocesamiento apropiado tiene una influencia significativa sobre la calidad de los resultados.
- Análisis PCA usado para la identificación de valores atípicos, fallos de medición así como otros factores influyentes. El análisis PCA también puede visualizar diferencias entre grupos así como agrupar las muestras de control de calidad (QC) en comparación con otras muestras.
- análisis de discriminación (OPLS-DA) para la separación de grupos de pacientes con cáncer pancreático y voluntarios sanos. El análisis de discriminación se realiza para hombres y mujeres por separado.
- asignación de los parámetros estadísticos así como evaluación del poder de predicción.
Los procedimientos estadísticos se usan en primer lugar para construir modelos estadísticos (patrones cancerosos y patrones no cancerosos) en base a perfiles lipidómicos de fluidos corporales de voluntarios sanos y pacientes con cáncer pancreático diagnosticado. Estos modelos estadísticos se usan a continuación para la determinación del nivel de probabilidad de que el paciente padezca cáncer pancreático en base a las concentraciones lipídicas determinadas en comparación con un patrón canceroso y un patrón no canceroso.
El rendimiento de muestras de la metodología de la invención es de al menos 4000 muestras por año y un aparato de espectrometría de masas al nivel actual de automatización de los laboratorios de espectrometría de masas estándar. Los procedimientos conocidos de multiplexación y una mayor automatización pueden incrementar además el rendimiento de muestras.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Modelo estadístico OPLS-DA para valores de UHPSFC/EM y datos indiscriminados, marcado por fase tumoral.
Figura 2. Modelo estadístico OPLS-DA para mujeres de UHPSFC/EM y datos indiscriminados, marcado por fase tumoral
Figura 3. Modelo estadístico OPLS-DA para hombres a partir de datos MALDI.
Figura 4. Modelo estadístico OPLS-DA para mujeres a partir de datos MALDI.
Figura 5. Predicción del modelo estadístico OPLS-DA de ser paciente con cáncer pancreático para mujeres a partir de UHPSFC/EM y datos indiscriminados para muestras desconocidas.
Figura 6. Predicción del modelo estadístico OPLS-DA de ser paciente con cáncer pancreático para hombres a partir de UHPSFC/EM y datos indiscriminados para muestras desconocidas.
Descripción detallada de la invención
Obtención de muestra:
Las muestras de fluido corporal humano de pacientes con cáncer pancreático y voluntarios sanos se obtienen en el hospital. La sangre de sujetos humanos se obtiene de la forma estándar y bien establecida usada en los hospitales en tubos con EDTA, a continuación el suero se aísla usando protocolos estandarizados bien conocidos para un experto en la técnica, almacenamiento a -80 °C en la clínica, transporte de la clínica al laboratorio analítico usando bolsas de transporte biológico con hielo seco (-20 °C), almacenamiento de nuevo a -80 °C hasta el análisis.
Preparación de un conjunto de patrones internos (mezcla de patrones internos):
En general, la mezcla de patrón interno se usa para la cuantificación de especies lipídicas. El patrón interno para cada clase lipídica se comporta de la misma forma que los compuestos objetivo que pertenecen a esta clase lipídica. Debido a la adición del patrón interno antes del procesamiento de muestra, las ligeras diferencias debidas, por ejemplo, a errores de pipeteo se pueden compensar ya que el patrón interno se ve afectado de la misma forma que los compuestos objetivo.
En un modo de realización particular, se pesan 2-4 mg de cada patrón en viales de vidrio de HPLC de 2 ml usando una balanza analítica y se disuelven en el volumen correspondiente (cloroformo : 2-propanol - 2:8) para obtener una concentración final de 2, 2,1 o 0,25 pg/pl. Los patrones para cada clase lipídica se mezclan juntos para formar mezclas de patrones internos como se describe en la tabla 2 para todos los tipos mostrados en el presente documento de análisis de EM.
Preferentemente, se prepara una mezcla de patrones internos en una cantidad suficiente para todo el experimento, para evitar variaciones en la cuantificación debido a ligeras diferencias en la concentración de los patrones internos cuando la mezcla se prepara en varios lotes. Se pueden preparar alícuotas de esta mezcla de patrones internos y almacenarse a -20 °C.
Tabla 2. Preparación de mezclas de patrones internos
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Procesamiento de muestra:
Todas las muestras se enriquecen antes de la extracción con la mezcla de patrón interno apropiada (dependiendo del procedimiento de espectrometría de masas que se use).
Las extracciones lipidómicas se realizaron por procedimientos bien establecidos usando sistemas de extracción cloroformo-metanol-agua como se publicó en nuestros trabajos anteriores [E. Cífková, M. Holcapek, M. Lísa, D. Vrána, J. Gaték, B. Melichar, Anal. Bioanal. Chem. 407 (2015) 991-1002; E. Cífková, M. Lísa, R. Hrstka, D. Vrána, J. Gaték, B. Melichar, M. Holcapek, Rapid Commun. Mass Spectrom. 31 (2017) 253-263]. El orden de las muestras para las extracciones es aleatorio.
Se transfieren 25 pl de suero y 17,5 pl de mezcla de patrón interno y 2 ml de cloroformo (2x 1 ml) y 1 ml de metanol a un vial de vidrio (4 ml). Las muestras biológicas también contienen proteínas, lo que puede dar lugar a muestras pegajosas y viscosas. Se debe garantizar que la pipeta extraiga los 25 pl de suero y no se bloquee con los componentes viscosos durante la extracción. Los viales de vidrio se cierran y se colocan durante 10 min en el baño ultrasónico a 40 °C para su homogeneización. Posteriormente, se deja que las muestras alcancen la temperatura ambiente para garantizar que no se evaporen los disolventes orgánicos al abrir los viales. Se añaden 600 pl de agua a cada muestra. Las muestras se cierran y se agitan en vórtex durante 1 min. Es importante realizar la etapa de extracción siempre de la misma forma para todas las muestras de un lote (un estudio). Los lípidos objetivo para la espectrometría de masas son mejor solubles en la capa orgánica (capa inferior). Posteriormente, las muestras se centrifugan durante 3 min a 3000 rpm para separar la capa orgánica y acuosa (entre estas dos capas se forma una capa de proteína en forma de precipitado blanco). La capa acuosa (capa superior) se retira por medio de una pipeta de vidrio. El disolvente orgánico que contiene los compuestos objetivo se evapora bajo una corriente de nitrógeno a 30 °C y los viales de vidrio que contienen el residuo (compuestos objetivo) se almacenan a -80 °C.
Preparación de muestras para análisis UHSFC/EM
Antes del análisis, se deja que las muestras alcancen la temperatura ambiente (de modo que no puedan extraer agua del aire al abrir los viales) y a continuación se disuelve el residuo de la extracción y evaporación (paso previo) en 500 pl de cloroformo : 2-propanol (1:1, v/v). Es recomendable preparar mezcla de disolventes suficiente de la mezcla de cloroformo : 2-propanol (1:1, v/v) para todas las muestras para evitar variaciones entre lotes individuales de la mezcla de disolventes. Las muestras se agitan en vórtex cuidadosamente durante 1 min para garantizar que los compuestos objetivo se disuelvan. La solución se filtra usando un filtro de jeringuilla de 0,2 pm para eliminar los componentes no disueltos, lo que puede bloquear la columna de UHPSFC y comprometer el análisis. Se transfieren 475 pl de hexano : 2-propanol : cloroformo 7:1,5:1,5 a un vial de HPLC y se añaden 25 pl de la muestra diluida. Se cierran los viales que contienen el filtrado con tapas normales de PTFE y se almacenan a -80 °C. Se cierran los viales de muestra diluida con tapones de hendidura para su análisis con UHPSFC/EM y se disponen en el inyector automático.
Preparación de muestras para análisis EM indiscriminada
Los residuos lipídicos de la extracción y evaporación con mezclas de patrón interno apropiadas se diluyen 10 veces dependiendo de las muestras por una mezcla por una mezcla de cloroformo-metanol-2-propanol (1:2:4, v/v/v) que contiene 7,5 mmol/l de acetato de amonio y 1 % de ácido acético.
Preparación de muestras para análisis MALDI-EM
La matriz de MALDI de 9-aminoacridina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.) se disuelve en una mezcla de metanol-agua (4:1, v/v) para proporcionar la concentración de 5 mg/ml y se mezcla con extractos lipídicos diluidos particulares. (1:1, v/v). La cantidad depositada de mezcla de extracto/matriz es 1 Di y la cristalización de gotitas secas se usa para el depósito de muestra en la placa objetivo. El depósito de una pequeña alícuota de cloroformo sobre las manchas de la placa MALDI antes de la aplicación de la mezcla de extracto/matriz diluida se aplica para evitar la propagación de la gota.
Desarrollo y validación del procedimiento de espectrometría de masas (EM)
En particular, se desarrollaron tres procedimientos principales basados en EM para la cuantificación lipidómica, que se describen con más detalle aquí. El procedimiento se beneficia del uso de muestras combinadas, que es una mezcla de volúmenes idénticos de todas las muestras para estudios más pequeños con menos de 100 sujetos. En este estudio, la muestra combinada se prepara a partir de volúmenes iguales de 60 pacientes con cáncer pancreático seleccionados aleatoriamente y muestras de voluntarios sanos, manteniendo la proporción de hombres y mujeres en la misma proporción que en el conjunto de muestras. La muestra combinada se usa para el desarrollo y optimización del procedimiento. La muestra combinada con la mezcla de patrón interno añadida por cada clase lipídica que se va a cuantificar se usa para la validación completa y el QC durante las mediciones. El orden de las muestras siempre se aleatoriza en las secuencias de muestras para evitar mediciones de muestras cancerosas y no cancerosas en una determinada parte de la secuencia.
La prueba de idoneidad del sistema se llevó a cabo antes del procedimiento de validación a tres niveles de concentración que típicamente se informan como niveles de concentración baja, media y alta. Todos los niveles de concentración deben estar dentro del intervalo dinámico lineal. El nivel de concentración bajo está cerca del límite inferior de cuantificación (LLOQ), el nivel de concentración media está en el medio del intervalo dinámico lineal, y el nivel de concentración alta está cerca del límite superior de cuantificación (ULOQ). En un modo de realización particular, se usan 5, 17.5 y 30 Di de mezcla de IS preparada de acuerdo con la tabla 2 para niveles de concentración baja, media y alta, respectivamente. Se determinaron parámetros de validación tales como selectividad, exactitud, precisión, curva de calibración, límites de detección y cuantificación, efecto de matriz, arrastre y estabilidad. Se determinaron los parámetros individuales para IS que representan propiedades de la clase lipídica. La selectividad se determinó usando 3 extractos de la muestra de suero combinada enriquecida antes de la extracción con la mezcla de IS a un nivel de concentración baja, media y alta y 6 extractos de muestras de suero no enriquecidas apropiadas. La exactitud y la precisión se estudiaron usando la muestra de suero combinada enriquecida después de la extracción a niveles de concentración baja, media y alta. La exactitud intradía y precisión intradía se estudiaron usando tres muestras por nivel de concentración. La exactitud interdía y precisión interdía se evaluaron entre tres ciclos independientes en dos días diferentes usando tres muestras al nivel de concentración baja, media y alta. El LLOQ y ULOQ correspondieron a los primer y último puntos del intervalo de linealidad, respectivamente. El límite de detección (LOD) se determinó en base a la proporción de señal con respecto a ruido (S/N = 3) observada a partir del cromatograma de iones reconstruido o del espectro de masas de iones precursores (PI) y de pérdida neutra (NL) (EM indiscriminada) de la mezcla de patrón interno. La recuperación de la extracción se determinó calculando la proporción de la respuesta de señal de las muestras enriquecidas antes y después de la extracción para concentración baja, media y alta. La eficacia del procedimiento se determinó calculando la proporción entre la respuesta de señal de las muestras enriquecidas antes de la extracción y el patrón puro a diferentes concentraciones. El efecto de matriz se calculó a partir de la proporción de la respuesta de señal de las muestras enriquecidas después de la extracción y el patrón puro. El arrastre se evaluó para cada IS por la inyección de la muestra en blanco con el disolvente puro después de la muestra de calibración a un nivel de concentración alto (factor de dilución de 10). La fiabilidad de los resultados obtenidos en el análisis de grandes conjuntos de muestras se evaluó por pruebas de estabilidad en el instrumento y de congelación y descongelación. La estabilidad del extracto de plasma enriquecido a un nivel de concentración media se midió en un inyector automático a determinados intervalos de tiempo: 0, 4, 8, 12, 16 y 24 horas (nota: las muestras de plasma no entran en el alcance de la invención). La muestra para el experimento de congelación y descongelación se analizó de inmediato después de la descongelación completa sin ayuda en el inyector automático.
Tabla 3. Esquema de dilución para calibración con muestra combinada (volúmenes en pl)
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UHPSFC/EM
La cromatografía de fluidos supercríticos es una herramienta para la separación de compuestos de diferente polaridad empleando dióxido de carbono supercrítico (fase móvil) como componente principal para retirar los compuestos de un adsorbente (fase estacionaria de columna). La adición de un disolvente orgánico (típicamente metanol) al dióxido de carbono supercrítico amplía el intervalo de aplicación de UHPSFC y permite la retirada de más compuestos polares de la columna. En general, los compuestos se pueden diferenciar si son mejor solubles en agua o alcoholes que si son de naturaleza polar o si son mejor solubles, por ejemplo, en hexano que si son de naturaleza apolar. Dependiendo de la naturaleza de la fase estacionaria, la fase móvil y los compuestos objetivo, como polar o apolar, se pueden forzar interacciones. Por ejemplo, los compuestos polares prefieren interactuar con las fases estacionarias polares y para retirarlas de la fase estacionaria, se puede usar una fase móvil polar para retirar los compuestos de la fase estacionaria. Un ajuste cuidadoso de estas interacciones por optimización de las propiedades de la fase móvil usando una determinada fase estacionaria permite la separación de compuestos. La optimización de dimensiones y propiedades de la fase estacionaria, tales como tamaño de partícula más pequeño y partículas esféricas de los sorbentes, permite una mayor eficacia y por lo tanto se denomina cromatografía de fluidos supercríticos de ultraalto rendimiento (UHPSFC).
La separación cromatográfica se puede optimizar para la separación de clases lipídicas, teniendo en cuenta en particular lo siguiente. Una clase lipídica tiene un resto estructural dominante (grupo de cabeza polar) en común que es el principal responsable de la interacción que gobierna el mecanismo de retención. Una clase lipídica puede comprender numerosas especies lipídicas que varían en la longitud y estructura de la cadena de hidrocarburos (por ejemplo, dobles enlaces). Los patrones internos se añaden para cada (sub)clase lipídica, por lo tanto es posible identificar y cuantificar todas las especies lipídicas dentro de una (sub)clase lipídica en particular comparándola con el patrón interno de clase.
Análisis de EM: El uso de un espectrómetro de masas exacto de alta resolución como detector permite la identificación y cuantificación de lípidos, ya que cada especie lipídica tiene un valor m/z definido y da una respuesta de señal dependiendo de la concentración en la muestra.
En un modo de realización particular, una descripción detallada de todos los parámetros aplicados para el procedimiento UHPSFC/EM para obtener los resultados presentados en el presente documento a continuación es como sigue: Instrumento: sistema de cromatografía de convergencia de ultraalto rendimiento Acquity (UPC2) unido al espectrómetro de masas con analizador del tiempo de vuelo de movilidad iónica de onda viajera de cuadrupolo híbrido Synapt G2 Si de Waters. Configuraciones cromatográficas: fase estacionaria: Columna Acquity BEH UPC2 (100 * 3 mm, 1,7 pm, Waters), el caudal fue de 1,9 ml/min, el volumen de inyección 1 pl, la temperatura de columna 60 °C, el regulador de contrapresión activo (ABPR) se fijó en 1800 psi, modo de gradiente: CO2 y metanol con acetato de amonio 30 mM y 1 % de agua. El gradiente comenzó con un modificador del 1 % y se incrementó al 51 % en 5 min, después de esto se mantuvo constante durante 1 min y se purgó de nuevo a las condiciones de partida con un tiempo de desarrollo total de 7,5 min, lavado con aguja de inyección: una mezcla de lavado de columna de hexano-2-propanolagua (1:2: 0,5, v/v) después de cada inyección de muestra biológica: se inyectó un blanco usando un gradiente rápido: 0 min-1 %, 1,4 min-51 %, 1,6 min-51 %, 1,8 min-1 % y 4,8 min-1 % de modificador., efluente de reposición: bomba HPLC 515 (Waters), caudal de reposición 0,25 ml/min de metanol con 1 % de agua.
Configuraciones de ESI-EM: un voltaje capilar de 3 kV, un cono de muestreo de 20 V, el desplazamiento de fuente de 90 V, una temperatura de fuente de 150 °C, una temperatura de secado de 500 °C, el flujo de gas del cono de 50 l h -1, el caudal de gas de secado de 1000 l h ’1 y el gas de nebulización de 4 bar. Modo de resolución en modo iónico positivo y un intervalo de masas de m/z 50-1200. El tiempo de exploración fue de 0,15 s y las mediciones se realizaron en modo continuo. El péptido leucina-encefalina se usó como masa de bloqueo con un tiempo de exploración de 0,1 s y un intervalo de 30 s.
Durante el análisis, las muestras en la secuencia se deben aleatorizar para que no se midan en una fila el mismo tipo de muestras, tal como solo muestras sanas (no cancerosas). Esto garantiza que en caso de error en un momento determinado no solo se vea afectado un tipo de muestra. Además, es importante medir las muestras de QC después de una cantidad predeterminada de muestras para verificar el rendimiento del instrumento.
Antes de medir las muestras biológicas, se miden muestras en blanco y QC sin inyección para comprobar el rendimiento del instrumento y después de esto se continúa con las muestras biológicas. Todas las muestras se miden por duplicado y después de 20 muestras o 40 40 inyecciones (muestra lavado), respectivamente, se miden las muestras de QC y en blanco. Durante todo el estudio, el control de la medición y preparación de muestras se realiza evaluando las áreas de pico de cada patrón interno de cada muestra y exportando los resultados en el archivo de Microsoft Excel. Las muestras de QC son alícuotas de un extracto de una mezcla de muestras de suero.
La masa de bloqueo se mide continuamente durante el análisis, sin embargo, la corrección de la masa de bloqueo no se aplica en línea, ya que los resultados preliminares mostraron que la exactitud de masa es peor usando la corrección en línea. Además, se aplica el modo continuo para que sea posible verificar la resolución del instrumento. Después de las mediciones, se reduce el ruido de los datos sin procesar por el software MassLynx de Waters. Esto mejora los espectros de masas así como reduce significativamente el tamaño del archivo, lo que permite un manejo más fácil de los archivos para su procesamiento adicional. Los archivos se procesan además aplicando la corrección de masa de bloqueo y convirtiendo los archivos del modo de perfil a centroide, lo que potencia la exactitud de masa y reduce además el tamaño del archivo. (El tamaño del archivo es importante para el procesamiento de datos. El programa informático de procesamiento difícilmente puede manejar archivos de gran tamaño y números de muestra, dando como resultado errores continuos que hacen que el procesamiento sea lento y engorroso).
Todas las investigaciones con respecto al control de medición, modo de perfil y corrección de masa de bloqueo fuera de línea, así como la reducción de ruido, mejoraron la calidad de los datos.
EM indiscriminada
Los experimentos como se presentan a continuación se realizaron en un espectrómetro de masas con trampa de iones lineal cuadrupolo 6500 q TrAP (Sciex, Concord, ON, Canadá) equipado con una sonda ESI con la siguiente configuración de parámetros de ajuste: el voltaje de nebulización de iones 5200 V, el gas de cortina 20 psi, la temperatura de la fuente 50 °C, el gas fuente de iones(7) 15 psi y el gas fuente de iones(2) 10 psi. Las exploraciones EM/EM se miden con una tasa de exploración de 1000 Da/s, el potencial de desagrupamiento de 80 V, el potencial de entrada de 10 V y la energía de colisión especificada en la tabla 4. Las muestras se introducen por una inyección de flujo usando un cromatógrafo de líquidos Agilent 1290 Series (Agilent Technologies) que consiste en una bomba binaria Agilent 1290 y un inyector automático Agilent 1260. Se inyectaron 50 pl de muestra en un caudal de 3 pl/min de la mezcla de cloroformo-metanol-2-propanol (1:2: 4, v/v/v) que contenía 7,5 mmol/l de acetato de amonio y un 1 % de ácido acético con el tiempo de análisis de 12 min y la temperatura del inyector automático 20 °C. El sistema CL/EM se lava después de cada análisis con una mezcla de metanol-2-propanol-agua (2:2:1, v/v/v) que contiene 7,5 mmol/l de acetato de amonio y 1 % de ácido acético. Los experimentos de datos medidos se extraen usando el programa informático LipidView con la tolerancia de masa de 0,3 Da, la S/N mínima = 5 y la intensidad mínima de un 1 %. Los datos brutos caracterizados por el tipo de exploraciones, los valores m/z y las intensidades pico se exportan como datos .txt y se procesan además usando el script de macros de Microsoft Excel para la detección y cuantificación de lípidos. Las clases lipídicas se caracterizan usando el tipo de exploraciones, y las especies lipídicas individuales en la exploración EM/EM seleccionada se detectan de acuerdo con los valores m/z con una tolerancia de masa de 0,3 Da en base a la base de datos compilada a partir de los lípidos identificados en la muestra combinada seguida de la corrección isotópica de intensidades de iones. La concentración de especies lipídicas se calcula a partir de la intensidad iónica corregida relacionada con la intensidad de los patrones internos de la clase lipídica.
Tabla 4. Caracterización de exploraciones EM/EM indiscriminadas y sus parámetros para clases lipídicas individuales. PI: exploración de iones precursores y NL: exploración de pérdida neutra.
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Espectrometría de masas MALDI
Los espectros de masas se midieron usando un espectrómetro de masas MALDI de ultraalta resolución LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) equipado con el láser UV de nitrógeno (337 nm, 60 Hz) con un diámetro de haz de aproximadamente 80 pm x 100 pm. El instrumento LTQ Orbitrap se opera en el modo iónico negativo en un intervalo de masa normal m/z 400-2000 y la resolución de masa se configura a R = 100.000 (ancho completo a la mitad de la definición máxima, a m/z 400). El movimiento de muestra en zig-zag (o en espiral hacia afuera) con un tamaño de etapa de 250 pm se usa durante la adquisición de datos individuales. La energía láser corresponde a un 15 % del máximo y se acumulan 2 microexploraciones/exploración con 2 disparos de láser por microexploración en 36 posiciones diferentes para cada medición para lograr una señal reproducible. Cada muestra (matriz manchada y mezcla de extracto de fluido corporal) se mancha cinco veces. El tiempo de adquisición total de una muestra incluyendo cinco puntos consecutivos es de alrededor de diez minutos. Cada medición se representa por un espectro MALDl-EM promedio con miles de valores m/z. Posteriormente se realiza la asignación automática de picos y los picos m/z particulares se comparan con moléculas desprotonadas a partir de una base de datos creada durante el procedimiento de identificación usando el script de macros de Excel. Esta asignación de picos da como resultado la generación de la lista de m/z presentes de lípidos estudiados con las intensidades promedio en espectros particulares para cada muestra que se usa para una evaluación estadística adicional.
Los valores de intensidades por debajo de LLOQ se reemplazan posteriormente por un 80 % del valor cuantificado más bajo para unificar valores estadísticamente insignificantes o cero y permitir un procesamiento adicional en base a cálculos logarítmicos. Las intensidades corregidas se normalizan posteriormente a IS o se generan proporciones particulares de intensidades dentro de una clase lipídica. Finalmente, se realiza la evaluación estadística y la comparación del conjunto de datos normalizados.
Procesamiento y cuantificación de datos
El procesamiento de datos comienza con la exportación de datos desde el programa informático del proveedor de EM (por ejemplo, Waters, Sciex o Thermo Scientific) a un programa informático de procesamiento de datos que puede ser Microsoft Excel para que las otras etapas se realicen de forma semiautomática usando, por ejemplo, un script avanzado de Excel, en particular corrección isotópica (tablas 5 y 6) y llenado de ceros. Las muestras de control de calidad (QC) se deben inyectar regularmente para comprobar la respuesta correcta y constante del espectrómetro de masas. La muestra de QC típica es una muestra combinada que contiene patrones internos para todas las clases lipídicas que se van a cuantificar, que se inyecta después de cada 20 inyecciones, y las respuestas de los patrones internos individuales se representan frente al tiempo. Si las respuestas de los patrones internos se reducen demasiado, entonces es una indicación de un problema instrumental, típicamente el espectrómetro de masas requiere limpieza debido a la inyección de demasiadas muestras. El intervalo de limpieza típico es de aproximadamente varios cientos de muestras, pero puede depender en gran medida de la calidad de los extractos de muestra preparados, la geometría de la fuente de iones y la configuración del sistema.
El siguiente ejemplo describe el ejemplo de medición UHPSFC/EM en el instrumento Synapt G2Si de Waters, pero un enfoque similar también es aplicable para otros procedimientos de EM y diferentes plataformas de EM de cualquier proveedor de instrumentos. Los archivos con ruido reducido, masa de bloqueo corregida y convertidos se procesan además con el programa informático MarkerLynx. La tabla de secuencia reducida que solo incluye muestras de suero y muestras de QC se debe preparar en MassLynx con el sufijo correspondiente en el nombre de muestra (sample_nr20_AFAMM). A continuación, se debe determinar el intervalo de exploración de tiempo para cada clase lipídica en toda la secuencia (por ejemplo, se usa m/z 250-350 para CE). Para cada clase lipídica, el procedimiento se crea en MarkerLynx con el intervalo de exploración correspondiente, que se combinará, la separación del pico de masa de 50 mDa y el umbral de intensidad del marcador de 3000. Se aplica el procedimiento para cada clase lipídica para la secuencia y se crea la tabla MarkerLynx con valores m/z frente a intensidades combinadas. Esta tabla se exporta a un archivo de texto y se importa a una base de datos casera para la identificación y cuantificación de especies lipídicas usando Microsoft Excel. Los valores m/z obtenidos de MarkerLynx se comparan con los valores m/z exactos depositados como base de datos para cientos de especies lipídicas para la identificación. La base de datos se creó evaluando las especies presentes en muestras de tejido y plasma. Las especies lipídicas identificadas se corrigen isotópicamente y se cuantifican calculando la concentración en relación con la intensidad y concentración de la (sub)clase IS obteniendo la tabla de concentraciones de especies lipídicas frente a muestras individuales. Se realiza el procedimiento de llenado de ceros. La matriz de datos final, donde las columnas son sujetos individuales y las líneas son lípidos individuales, se usan para una evaluación estadística de MDA adicional.
Tabla 5. Base de datos de especies lipídicas verificadas durante la etapa de identificación en el modo iónico positivo c n n m n n l l l rr i n i i r i i i M+1 M+2 n min isotopado).
Figure imgf000012_0002
CE 16:0 D7 (IS) 376.3955 0.00% 0.00% CE 10:0 558.5244 0.00% 0.00% CE 12:0 586.5557 0.00% 0.00% CE 14:1 612.5714 0.00% 0.00% CE 14:0 614.5870 10.59% 0.00% CE 15:1 626.5532 0.00% 0.00% CE 15:0 628.6027 11.09% 0.00% CE 16:1 640.6027 0.00% 0.00% CE 16:0 642.6184 11.61% 0.00% CE 16:0 D7 (IS) 649.6623 0.00% 0.00% CE 17:1 654.6183 0.00% 0.00% CE 17:0 656.6340 12.14% 0.00% CE 18:4 662.5870 0.00% 0.00% CE 18:3 664.6027 12.64% 0.00% CE 18:2 666.6184 12.65% 0.00% CE 18:1 668.6340 12.67% 0.00% CE 18:0 670.6497 12.68% 0.00% CE 19:1 682.6497 0.00% 0.00% CE 19:0 684.6653 13.23% 0.00% CE 20:5 688.6027 0.00% 0.00% CE 20:4 690.6184 13.75% 0.00% CE 20:3 692.6340 13.76% 0.00% CE 20:2 694.6497 13.77% 0.00% CE 20:1 696.6653 13.78% 0.00% CE 20:0 698.6810 13.80% 0.00% CE 21:1 710.6809 0.00% 0.00% CE 21:0 712.6966 14.37% 0.00% CE 22:6 714.6184 14.39% 0.00% CE 22:5 716.6340 14.90% 0.00% CE 22:4 718.6496 14.91% 0.00% CE 22:3 720.6653 14.93% 0.00% CE22:2 722.6810 14.94% 0.00% CE 22:1 724.6966 14.95% 0.00% CE 22:0 726.7123 14.96% 0.00% CE 23:1 738.7122 0.00% 0.00% CE 23:0 740.7279 15.57% 0.00% CE 24:5 744.6653 0.00% 0.00% CE 24:4 746.6809 16.13% 0.00% CE 24:3 748.6966 16.14% 0.00% CE 24:2 750.7122 16.15% 0.00% CE 24:1 752.7279 0.00% 0.00% CE 24:0 754.7436 16.18% 0.00% CE 25:0 768.7592 0.00% 0.00% CE 26:5 772.6966 0.00% 0.00% CE 26:4 774.7122 17.39% 0.00% CE 26:3 776.7279 17.40% 0.00% CE 26:0 782.7748 0.00% 0.00% CE 27:0 796.7905 0.00% 0.00% CE 28:0 810.8061 0.00% 0.00% TG 35:0 642.5667 0.00% 0.00% TG 36:1 654.5667 0.00% 0.00% TG 36:0 656.5823 10.53% 0.00% TG 38:3 678.5667 0.00% 0.00% TG 38:2 680.5823 11.49% 0.00% TG 38:1 682.5980 11.50% 0.00% TG 38:0 684.6136 11.51% 0.00% TG 40:4 704.5823 0.00% 0.00% TG 40:3 706.5980 12.50% 0.00% TG 40:2 708.6136 12.51% 0.00% TG 40:1 710.6293 12.52% 0.00% TG 40:0 712.6449 12.54% 0.00% TG 41:1 724.6449 0.00% 0.00% TG 41:0 726.6606 13.07% 0.00% TG 42:4 732.6136 0.00% 0.00% TG 42:3 734.6293 0.00% 0.00%
Figure imgf000014_0001
Figure imgf000015_0001
TG 60:4 984.8954 25.41% 0.00% TG 60:3 986.9110 25.43% 0.00% TG 60:2 988.9267 25.45% 0.00% TG 60:1 990.9423 25.46% 0.00% TG 60:0 992.9580 25.48% 0.00% TG 62:12 996.8014 0.00% 0.00% TG 62:11 998.8171 26.86% 0.00% TG 61:4 998.9110 0.00% 0.00% TG 62:10 1000.8327 26.88% 0.00% TG 61:3 1000.9266 26.20% 0.00% TG 62:9 1002.8484 26.89% 0.00% TG 61:2 1002.9423 26.22% 0.00% TG 62:8 1004.8640 26.91% 0.00% TG 62:7 1006.8797 26.92% 0.00% TG 62:6 1008.8953 26.94% 0.00% TG 62:5 1010.9110 26.96% 0.00% TG 62:4 1012.9266 26.97% 0.00% TG 62:3 1014.9423 26.99% 0.00% TG 62:2 1016.9579 27.01% 0.00% TG 62:1 1018.9736 27.02% 0.00% TG 64:12 1024.8327 0.00% 0.00% TG 64:11 1026.8484 28.46% 0.00% TG 63:4 1026.9423 0.00% 0.00% TG 64:10 1028.8640 28.48% 0.00% TG 63:3 1028.9579 27.79% 0.00% TG 64:9 1030.8797 28.50% 0.00% TG 64:8 1032.8953 28.52% 0.00% TG 64:7 1034.9110 28.53% 0.00% TG 64:6 1036.9266 28.55% 0.00% TG 64:5 1038.9423 28.57% 0.00% TG 64:4 1040.9579 28.58% 0.00% TG 66:12 1052.8640 0.00% 0.00% TG 66:11 1054.8797 30.12% 0.00% TG 66:10 1056.8953 30.14% 0.00% TG 66:9 1058.9110 30.15% 0.00% TG 66:8 1060.9266 30.17% 0.00% TG 66:7 1062.9423 30.19% 0.00% TG 66:6 1064.9579 30.21% 0.00% MG 10:0 264.2169 0.00% 0.00% MG 12:0 292.2482 0.00% 0.00% MG 14:1 318.2639 0.00% 0.00% MG 14:0 320.2795 2.59% 0.00% MG 15:1 332.2795 0.00% 0.00% MG 15:0 334.2952 2.80% 0.00% MG 16:1 346.2952 0.00% 0.00% MG 16:0 348.3108 3.03% 0.00% MG 16:0 353.2662 0.00% 0.00% MG 17:1 360.3108 0.00% 0.00% MG 17:0 362.3265 3.27% 0.00% MG 17:0 367.2819 0.00% 0.00% MG 18:4 368.2795 0.00% 0.00% Chol 369.3516 0.00% 0.00% Chol D7 (IS) 376.3955 0.00% 0.00% Chol 404.3887 0.00% 0.00% Chol D7 (IS) 411.4326 0.00% 0.00% MG 18:3 370.2952 3.50% 0.00% MG 18:2 372.3108 3.51% 0.00% MG 18:1 374.3265 3.51% 0.00% MG 18:0 376.3421 3.52% 0.00% MG 18:1 379.2819 0.00% 0.00% MG 18:0 381.2975 3.42% 0.00% MG 19:1 (IS) 388.3421 0.00% 0.00% MG 19:0 390.3578 3.78% 0.00% MG 19:1 (IS) 393.2975 0.00% 0.00% MG 20:5 394.2952 0.00% 0.00% MG 20:4 396.3108 4.03% 0.00% MG 20:3 398.3265 4.04% 0.00% MG 20:2 400.3421 4.04% 0.00% MG 20:1 402.3578 4.05% 0.00% MG 21:1 416.3734 0.00% 0.00% MG 21:0 418.3891 4.34% 0.00% MG 22:6 420.3108 4.35% 0.00% MG 22:5 422.3265 4.61% 0.00% MG 22:4 424.3421 4.61% 0.00% MG 22:3 426.3587 4.62% 0.00% MG22:2 428.3734 4.63% 0.00% MG 22:1 430.3891 4.63% 0.00% MG 22:0 432.4047 4.64% 0.00% DG 24:2 (IS) 435.3469 0.00% 0.00% MG 23:1 444.4047 0.00% 0.00% MG 23:0 446.4204 4.95% 0.00% MG 24:1 458.4204 0.00% 0.00% MG 24:0 460.4360 5.27% 0.00% DG 24:2 (IS) 470.3840 0.00% 0.00% DG 28:0 530.4779 0.00% 0.00% DG 29:0 544.4935 0.00% 0.00% DG 30:2 554.4779 0.00% 0.00% DG 30:1 556.4935 7.67% 0.00% DG 30:0 558.5092 7.68% 0.00% DG 31:2 568.4935 0.00% 0.00% DG 31:1 570.5092 8.08% 0.00% DG 31:0 572.5248 8.09% 0.00% DG 32:3 580.4936 0.00% 0.00% DG 32:2 582.5092 8.50% 0.00% DG 32:1 584.5249 8.50% 0.00% DG 32:0 586.5405 8.51% 0.00% DG 33:3 594.5092 0.00% 0.00% DG 33:2 596.5248 8.93% 0.00% DG 33:1 598.5405 8.94% 0.00% DG 33:0 600.5561 8.95% 0.00% DG 34:4 606.5092 0.00% 0.00% DG 34:3 608.5249 9.36% 0.00% DG 34:2 610.5405 9.37% 0.00% DG 34:1 612.5562 9.38% 0.00% DG 34:0 614.5718 9.39% 0.00% DG 35:4 620.5248 0.00% 0.00% DG 35:3 622.5405 9.82% 0.00% DG 35:2 624.5561 9.83% 0.00% DG 35:1 626.5718 9.84% 0.00% DG 35:0 628.5875 9.85% 0.00% DG 36:5 632.5249 0.00% 0.00% DG 36:4 634.5405 10.28% 0.00% DG 36:3 636.5561 10.29% 0.00% DG 36:2 638.5718 10.30% 0.00% DG 36:1 640.5874 10.31% 0.00% DG 37:7 642.5092 0.00% 0.00% DG 36:0 642.6031 10.32% 0.00% DG 37:5 646.5405 0.00% 0.00% DG 37:4 648.5561 0.00% 0.00% DG 37:3 650.5718 10.77% 0.00% DG 37:2 652.5874 10.78% 0.00% DG 37:1 654.6031 10.79% 0.00% DG 38:7 656.5248 0.00% 0.00% DG 37:0 656.6188 10.80% 0.00% DG 38:6 658.5405 11.23% 0.00% DG 38:5 660.5561 11.24% 0.00% DG 38:4 662.5718 11.26% 0.00% DG 38:3 664.5874 11.27% 0.00% DG 38:2 666.6031 11.28% 0.00% DG 38:1 668.6187 11.29% 0.00% DG 38:0 670.6344 11.30% 0.00% DG 39:6 672.5562 11.31% 0.00% DG 39:5 674.5718 11.75% 0.00% DG 39:4 676.5875 11.76% 0.00%
DG 40:10; DG 39:3 678.5092 11.77% 0.00%
DG 40:9; DG 39:2 680.5249 12.223% 0.000%
DG 40:8; DG 39:1 682.5405 12.23% 0.00%
DG 40:7; DG 39:0 684.5562 12.25% 0.00%
DG 40:6 686.5718 12.26% 0.00% DG 40:5 688.5874 12.27% 0.00% DG 40:4 690.6031 12.28% 0.00% DG 40:3 692.6187 12.29% 0.00% DG 40:2 694.6344 12.30% 0.00% DG 40:1 696.6500 12.31% 0.00% DG 40:0 698.6657 12.32% 0.00% DG 41:6 700.5675 12.33% 0.00% DG 41:5 702.3603 12.80% 0.00% DG 41:4 704.6188 12.81% 0.00%
DG 42:10; DG 41:3 706.5405 12.82% 0.00%
DG 42:9; DG 41:2 708.5562 13.29% 0.00%
DG 42:8; DG 41:1 710.5718 13.30% 0.00%
DG 42:7; DG 41:0 712.5875 13.32% 0.00%
DG 42:6 714.6031 13.33% 0.00% DG 42:5 716.6188 13.34% 0.00% DG 42:4 718.6344 13.35% 0.00% DG 42:3 720.6501 13.36% 0.00% DG 42:2 722.6657 13.37% 0.00% DG 42:1 724.6814 13.39% 0.00% DG 42:0 726.6970 13.40% 0.00% DG 44:0 754.7283 0.00% 0.00% Coenzima Q10 880.7177 0.00% 0.00% Cer d30:1 (IS) 464.4462 0.00% 0.00% Cer d18:1/12:2 478.4255 0.00% 0.00% Cer d18:1/12:1 480.4411 6.08% 0.00% Cer d18:0/12:2 480.4412 0.00% 0.00% Cer d18:1/12:0 (IS) 482.4568 6.08% 0.00% Cer d18:0/12:1 (IS) 482.4568 6.08% 0.00% Cer d18:0/12:0 484.4725 6.09% 0.00% Cer d18:1/13:2 492.4411 0.00% 0.00% Cer d32:1 492.4775 0.00% 0.00% Cer d18:1/13:1; Cer d18:1/12:2 (1OH) 494.4568 6.45% 0.00%
Cer d18:0/13:2 494.4568 0.00% 0.00% Cer d18:1/13:0; Cer d18:1/12:1 (1OH) 496.4724 6.46% 0.00% Cer d 18:0/13:1; Cer d18:0/12:2 (1OH) 496.4725 6.46% 0.00% Cer d18:1/12:0 (1OH) 498.4517 6.46% 0.00% Cer d18:0/13:0; Cer d18:0/12:1 (1OH) 498.4881 6.46% 0.00% Cer d18:0/12:0 (1OH) 500.4674 6.47% 0.00% Cer d18:1/14:2 506.4568 0.00% 0.00% Cer d18:1/14:1; Cer d18:1/13:2 (1OH) 508.4724 6.83% 0.00%
Cer d18:0/14:2 508.4725 0.00% 0.00% Cer d 18:1/14:0; Cer d18:1/13:0 (1OH) 510.4808 6.84% 0.00% Cer d 18:0/14:1; Cer d18:0/13:2 (1OH) 510.4881 6.84% 0.00% Cer d18:1/13:0 (1OH) 512.4674 6.85% 0.00% Cer d18:0/14:0; Cer d18:0/13:0 (1OH) 512.4965 6.85% 0.00% Cer d18:0/13:0 (1OH) 514.4831 6.86% 0.00% Cer d34:2 518.4932 0.00% 0.00% Cer d18:1/15:2 520.4724 0.00% 0.00% Cer d34:1 520.5088 7.41% 0.00% Cer d18:0/15:2 522.4881 0.00% 0.00% Cer d18:1/15:1; Cer d18:1/14:2 (1OH) 522.4881 7.23% 0.00%
Cer d34:0 522.5245 7.42% 0.00% Cer d18:1/15:0; Cer d18:1/14:1 (1OH) 524.5037 7.24% 0.00% Cer d 18:0/15:1; Cer d18:0/14:2 (1OH) 524.5038 7.24% 0.00% Cer d18:1/14:0 (1OH) 526.4830 7.24% 0.00% Cer d18:0/15:0; Cer d18:0/14:1 (1OH) 526.5194 7.24% 0.00% Cer d i 8:0/14:0 (1OH) 528.4987 7.25% 0.00% Cer d i 8:1/16:2 534.4881 0.00% 0.00% Cer d35:1 534.5245 0.00% 0.00% Cer d18:1/16:1; Cer d18:1/15:2 (1OH) 536.5037 7.63% 0.00%
Cer d18:0/16:2 536.5038 0.00% 0.00% Cer d 18:0/16:1; Cer d18:0/15:2 (1OH) 538.5194 7.64% 0.00% Cer d 18:1/16:0; Cer d18:1/15:1 (1OH) 538.5194 7.64% 0.00% Cer d18:1/15:0 (1OH) 540.4987 7.65% 0.00% Cer d18:0/16:0; Cer d18:0/15:1 (1OH) 540.5351 7.65% 0.00% Cer d18:0/15:0 (1OH) 542.5144 7.66% 0.00% Cer d36:2 546.5245 0.00% 0.00% Cer d18:1/17:2 548.5037 0.00% 0.00% Cer d36:1 548.5401 8.27% 0.00% Cer d18:0/17:2 550.5194 0.00% 0.00% Cer d18:1/17:1; Cer d18:1/16:2 (1OH) 550.5194 8.05% 0.00%
Cer d36:0 550.5558 8.28% 0.00% Cer d18:1/17:0; Cer d18:1/16:1 (1OH) 552.5350 8.06% 0.00% Cer d 18:0/17:1; Cer d18:0/16:2 (1OH) 552.5351 8.06% 0.00% Cer d18:1/16:0 (1OH) 554.5143 8.07% 0.00% Cer d18:0/17:0; Cer d18:0/16:1 (1OH) 554.5507 8.07% 0.00% Cer d18:0/16:0 (1OH) 556.5300 8.08% 0.00% Cer d18:1/18:3 560.5037 0.00% 0.00% Cer d18:1/18:2 562.5193 8.48% 0.00% Cer d37:1 562.5558 0.00% 0.00% Cer d18:0/18:2 564.5350 0.00% 0.00% Cer d18:1/18:1; Cer d18:1/17:2 (1OH) 564.5350 8.49% 0.00% Cer d18:1/18:0; Cer d18:1/17:1 (1OH) 566.5506 8.50% 0.00% Cer d 18:0/18:1; Cer d18:0/17:2 (1OH) 566.5507 8.50% 0.00% Cer d18:1/17:0 (1OH) 568.5300 8.51% 0.00% Cer d18:0/18:0; Cer d18:0/17:1 (1OH) 568.5663 8.51% 0.00% Cer d18:0/17:0 (1OH) 570.5457 8.51% 0.00% Cer d38:2 574.5558 0.00% 0.00% Cer d18:1/19:2 576.5349 0.00% 0.00% Cer d38:1 576.5714 9.17% 0.00% Cer d18:0/19:2 578.5506 0.00% 0.00% Cer d18:1/19:1; Cer d18:1/18:2 (1OH) 578.5506 8.93% 0.00%
Cer d38:0 578.5871 9.18% 0.00% Cer d18:1/19:0; Cer d18:1/18:1 (1OH) 580.5662 8.94% 0.00% Cer d 18:0/19:1; Cer d18:0/18:2 (1OH) 580.5663 8.94% 0.00% Cer d18:1/18:0 (1OH) 582.5383 8.95% 0.00% Cer d18:0/19:0; Cer d18:0/18:1 (1OH) 582.5819 8.95% 0.00% Cer d18:0/18:0 (1OH) 584.5540 8.96% 0.00% Cer d18:1/20:2 590.5506 0.00% 0.00% Cer d39:1 590.5871 0.00% 0.00% Cer d 18:1/20:1; Cer d18:1/19:2 (1OH) 592.5662 9.39% 0.00%
Cer d18:0/20:2 592.5663 0.00% 0.00% Cer d18:0/20:1; Cer d18:0/19:2 (1OH) 594.5819 9.40% 0.00% Cer d18:1/20:0; Cer d18:1/19:1 (1OH) 594.5819 9.40% 0.00% Cer d18:1/19:0 (1OH) 596.5613 9.41% 0.00% Cer d18:0/20:0; Cer d18:0/19:1 (1OH) 596.5976 9.41% 0.00% Cer d18:0/19:0 (1OH) 598.5770 9.42% 0.00% Cer d40:2 602.5871 0.00% 0.00% Cer d18:1/21:2 604.5662 0.00% 0.00% Cer d40:1 604.6027 10.11% 0.00% Cer d18:0/21:2 606.5819 0.00% 0.00% Cer d18:1/21:1; Cer d18:1/20:2 (1OH) 606.5819 9.86% 0.00%
Cer d40:0 606.6184 10.13% 0.00% Cer d18:1/21:0; Cer d18:1/20:1 (1OH) 608.5975 9.87% 0.00% Cer d 18:0/21: 1; Cer d18:0/20:2 (1OH) 608.5976 9.87% 0.00% Cer d18:1/20:0 (OH) 610.5769 9.88% 0.00% Cer d18:0/21:0; Cer d18:0/20:1 (1OH) 610.6132 9.88% 0.00% Cer d18:0/20:0 (1OH) 612.5926 9.89% 0.00% Cer d18:1/22:2 618.5818 0.00% 0.00% Cer d41:1 618.6184 0.00% 0.00% Cer d18:0/22:2 620.5975 0.00% 0.00% Cer d 18:1/22:1; Cer d18:1/21:2 (1OH) 620.5975 10.34% 0.00% Cer d41:0 620.6340 10.62% 0.00% Cer d18:1/22:0; Cer d18:1/21:1 (1OH) 622.6131 10.35% 0.00% Cer d18:0/22:1; Cer d18:0/21:2 (1OH) 622.6132 10.35% 0.00% Cer d18:1/21:0 (1OH) 624.5926 10.36% 0.00% Cer d18:0/22:0; Cer d18:0/21:1 (1OH) 624.6288 10.36% 0.00% Cer d18:0/21:0 (1OH) 626.6083 10.37% 0.00% Cer d42:3 628.6027 0.00% 0.00% Cer d42:2 630.6184 11.10% 0.00% Cer d18:1/23:2 632.5974 0.00% 0.00% Cer d42:1 632.6340 11.11% 0.00% Cer d18:0/23:2 634.6131 0.00% 0.00% Cer d 18:1/23:1; Cer d18:1/22:2 (1OH) 634.6131 10.83% 0.00%
Cer d42:0 634.6497 11.12% 0.00% Cer d18:1/23:0; Cer d18:1/22:1 (1OH) 636.6287 10.84% 0.00% Cer d18:0/23:1; Cer d18:0/22:2 (1OH) 636.6288 10.84% 0.00% Cer d18:1/22:0 (1OH) 638.6082 10.85% 0.00% Cer d18:0/23:0; Cer d18:0/22:1 (1OH) 638.6444 10.85% 0.00% HexCer d18:1/12:2 640.4784 10.86% 0.00% Cer d18:0/22:0 (1OH) 640.6239 10.86% 0.00% HexCer d18:1/12:1 642.4940 9.58% 0.00% HexCer d18:0/12:2 642.4941 10.87% 0.00% HexCer d18:1/12:0 (IS) 644.5097 9.59% 0.00% HexCer d18:0/12:1 (IS) 644.5097 9.59% 0.00% Cer d43:2 644.6340 0.00% 0.00% HexCer d18:0/12:0 646.5254 9.60% 0.00% Cer d18:1/24:2 646.6131 9.60% 0.00% Cer d43:1 646.6497 11.63% 0.00% Cer d 18:1/24:1; Cer d18:1/23:2 (1OH) 648.6287 11.34% 0.00%
Cer d18:0/24:2 648.6288 9.61% 0.00% Cer d43:0 648.6653 11.64% 0.00% Cer d18:0/24:1; Cer d18:0/23:2 (1OH) 650.6444 11.35% 0.00% Cer d18:1/24:0; Cer d18:1/23:1 (1OH) 650.6444 11.35% 0.00% Cer d18:1/23:0 (1OH) 652.6239 11.36% 0.00% Cer d18:0/24:0; Cer d18:0/23:1 (1OH) 652.6601 11.36% 0.00% HexCer d18:1/13:2 654.4940 11.07% 0.00% Cer d18:0/23:0 (1OH) 654.6396 11.07% 0.00% HexCer d18:1/13:1; HexCer d18:1/12:2 (1OH) 656.5097 10.03% 0.00%
HexCer d18:0/13:2 656.5097 11.08% 0.00% Cer d44:3 656.6340 0.00% 0.00% HexCer d18:1/13:0; HexCer d18:1/12:1 (1OH) 658.5253 10.04% 0.00% HexCer d18:0/13:1; HexCer d18:0/12:2 (1OH) 658.5254 10.04% 0.00%
Cer d44:2 658.6497 12.15% 0.00% HexCer d18:1/12:0 (1OH); Cer d18:1/25:2 660.5046 10.05% 0.00% HexCer d18:0/13:0; HexCer d18:0/12:1 (1OH) 660.5410 10.05% 0.00%
Cer d44:1 660.6653 12.16% 0.00% HexCer d18:0/12:0 (1OH); Cer d18:0/25:2 662.5203 10.06% 0.00% Cer d 18:1/25:1; Cer d18:1/24:2 (1OH) 662.6444 10.06% 0.00%
Cer d44:0 662.6810 12.17% 0.00% Cer d18:1/25:0; Cer d18:1/24:1 (1OH) 664.6600 11.86% 0.00% Cer d18:0/25:1; Cer d18:0/24:2 (1OH) 664.6601 11.86% 0.00% Cer d18:1/24:0 (1OH) 666.6395 11.88% 0.00% Cer d18:0/25:0; Cer d18:0/24:1 (1OH) 666.6757 11.88% 0.00% HexCer d18:1/14:2 668.5097 11.58% 0.00% Cer d18:0/24:0 (1OH) 668.6552 11.89% 0.00% HexCer d18:1/14:1; HexCer d18:1/13:2 (1OH) 670.5253 10.49% 0.00%
HexCer d18:0/14:2 670.5254 11.59% 0.00% HexCer d18:1/14:0; HexCer d18:1/13:0 (1OH) 672.5337 10.50% 0.00% HexCer d18:0/14:1; HexCer d18:0/13:2 (1OH) 672.5410 10.50% 0.00% HexCer d18:0/14:0; HexCer d18:0/13:0 (1OH) 674.5494 10.51% 0.00% Cer d18:1/26:2; HexCer d18:1/13:0 (1OH) 674.6443 10.51% 0.00% Cer d18:0/26:2; HexCer d18:0/13:0 (1OH) 676.6600 10.52% 0.00% Cer d 18:1/26:1; Cer d18:1/25:2 (1OH) 676.6600 12.38% 0.00% Cer d18:1/26:0; Cer d18:1/25:1 (1OH) 678.6756 12.39% 0.00% Cer d18:0/26:1; Cer d18:0/25:2 (1OH) 678.6757 12.39% 0.00% Cer d i 8:1/25:0 (1OH) 680.6552 12.41% 0.00% Cer d18:0/26:0; Cer d18:0/25:1 (1OH) 680.6913 12.41% 0.00% HexCer d18:1/15:2 682.5253 12.11% 0.00% Cer d18:0/25:0 (1OH) 682.6709 12.42% 0.00% HexCer d18:0/15:2 684.5410 12.11% 0.00% HexCer d18:1/15:1; HexCer d18:1/14:2 (1OH) 684.5410 10.96% 0.00% HexCer d18:1/15:0; HexCer d18:1/14:1 (1OH) 686.5566 10.97% 0.00% HexCer d18:0/15:1; HexCer d18:0/14:2 (1OH) 686.5567 10.97% 0.00% HexCer d18:1/14:0 (1OH); Cer d18:1/27:2 688.5359 10.98% 0.00% HexCer d18:0/15:0; HexCer d18:0/14:1 (1OH) 688.5723 10.98% 0.00% HexCer d18:0/14:0 (1OH); Cer d18:0/27:2 690.5516 10.99% 0.00% Cer d 18:1/27: 1; Cer d18:1/26:2 (1OH) 690.6756 10.90% 0.00% Cer d18:1/27:0; Cer d18:1/26:1 (1OH) 692.6912 12.94% 0.00% Cer d18:0/27:1; Cer d18:0/26:2 (1OH) 692.6913 11.00% 0.00% Cer d18:1/26:0 (1OH) 694.6708 12.95% 0.00% Cer d18:0/27:0; Cer d18:0/26:1 (1OH) 694.7069 12.95% 0.00% HexCer d18:1/16:2 696.5410 12.63% 0.00% Cer d18:0/26:0 (1OH) 696.6865 12.96% 0.00% HexCer d18:1/16:1; HexCer d18:1/15:2 (1OH) 698.5566 11.44% 0.00%
HexCer d18:0/16:2 698.5567 12.64% 0.00% HexCer d18:0/16:1; HexCer d18:0/15:2 (1OH) 700.5723 11.45% 0.00% HexCer d18:1/16:0; HexCer d18:1/15:1 (1OH) 700.5723 11.45% 0.00% HexCer d18:0/16:0; HexCer d18:0/15:1 (1OH) 702.5880 11.46% 0.00% Cer d18:1/28:2; HexCer d18:1/15:0 (1OH) 702.6756 11.46% 0.00% Cer d 18:1/28:1; Cer d18:1/27:2 (1OH) 704.6912 13.48% 0.00% Cer d18:0/28:2; HexCer d18:0/15:0 (1OH) 704.6913 11.47% 0.00% Cer d18:0/28:1; Cer d18:0/27:2 (1OH) 706.7069 13.49% 0.00% Cer d18:1/28:0; Cer d18:1/27:1 (1OH) 706.7069 13.49% 0.00% Cer d18:1/27:0 (1OH) 708.6865 13.50% 0.00% Cer d18:0/28:0; Cer d18:0/27:1 (1OH) 708.7226 13.50% 0.00% HexCer d18:1/17:2 710.5566 13.17% 0.00% Cer d18:0/27:0 (1OH) 710.7022 13.51% 0.00% HexCer d18:0/17:2 712.5723 13.18% 0.00% HexCer d18:1/17:1; HexCer d18:1/16:2 (1OH) 712.5723 11.93% 0.00% HexCer d18:1/17:0; HexCer d18:1/16:1 (1OH) 714.5879 11.95% 0.00% HexCer d18:0/17:1; HexCer d18:0/16:2 (1OH) 714.5880 11.95% 0.00% HexCer d18:1/16:0 (1OH) 716.5672 11.96% 0.00% HexCer d18:0/17:0; HexCer d18:0/16:1 (1OH) 716.6036 11.96% 0.00% HexCer d18:0/16:0 (1OH) 718.5829 11.97% 0.00% Cer d 18:1/29:1; Cer d18:1/28:2 (1OH) 718.7069 11.97% 0.00% Cer d18:1/29:0; Cer d18:1/28:1 (1OH) 720.7225 14.06% 0.00% Cer d18:0/29:1; Cer d18:0/28:2 (1OH) 720.7226 11.98% 0.00% Cer d18:1/28:0 (1OH) 722.7201 14.07% 0.00% Cer d18:0/29:0; Cer d18:0/28:1 (1OH) 722.7382 14.07% 0.00% HexCer d18:1/18:2 724.5722 13.73% 0.00% Cer d18:0/28:0 (1OH) 724.7358 14.08% 0.00% HexCer d18:0/18:2 726.5879 13.74% 0.00% HexCer d18:1/18:1; HexCer d18:1/17:2 (1OH) 726.5879 12.44% 0.00% HexCer d18:1/18:0; HexCer d18:1/17:1 (1OH) 728.6035 12.45% 0.00% HexCer d18:0/18:1; HexCer d18:0/17:2 (1OH) 728.6036 12.45% 0.00% HexCer d18:1/17:0 (1OH) 730.5829 12.46% 0.00% HexCer d18:0/18:0; HexCer d18:0/17:1 (1OH) 730.6192 12.46% 0.00% HexCer d18:0/17:0 (1OH) 732.5986 12.47% 0.00% Cer d 18:1/30:1; Cer d18:1/29:2 (1OH) 732.7228 12.47% 0.00% Cer d18:1/30:0; Cer d18:1/29:1 (1OH) 734.7381 14.64% 0.00% Cer d18:0/30:1; Cer d18:0/29:2 (1OH) 734.7385 12.49% 0.00% Cer d18:1/29:0 (1OH) 736.7178 14.65% 0.00% Cer d18:0/30:0; Cer d18:0/29:1 (1OH) 736.7538 14.65% 0.00% HexCer d18:1/19:2 738.5878 14.29% 0.00% Cer d18:0/29:0 (1OH) 738.7335 14.66% 0.00% HexCer d18:0/19:2 740.6035 14.31% 0.00% HexCer d18:1/19:1; HexCer d18:1/18:2 (1OH) 740.6035 12.96% 0.00% HexCer d18:1/19:0; HexCer d18:1/18:1 (1OH) 742.6191 12.97% 0.00% HexCer d18:0/19:1; HexCer d18:0/18:2 (1OH) 742.6192 12.97% 0.00% HexCer d18:1/18:0 (1OH) 744.5912 12.98% 0.00% HexCer d i 8:0/19:0; HexCer d18:0/18:1 (1OH) 744.6348 12.98% 0.00% HexCer d18:0/18:0 (1OH) 746.6069 12.99% 0.00% HexCer d18:1/20:2 752.6035 12.99% 0.00% HexCer d18:1/20:1; HexCer d18:1/19:2 (1OH) 754.6191 13.49% 0.00%
HexCer d18:0/20:2 754.6192 13.01% 0.00% HexCer d18:0/20:1; HexCer d18:0/19:2 (1OH) 756.6348 13.50% 0.00% HexCer d18:1/20:0; HexCer d18:1/19:1 (1OH) 756.6348 13.50% 0.00% HexCer d18:1/19:0 (1OH) 758.6142 13.52% 0.00% HexCer d18:0/20:0; HexCer d18:0/19:1 (1OH) 758.6505 13.52% 0.00% HexCer d18:0/19:0 (1OH) 760.6299 13.53% 0.00% HexCer d18:1/21:2 766.6191 0.00% 0.00% HexCer d18:0/21:2 768.6348 0.00% 0.00% HexCer d18:1/21:1; HexCer d18:1/20:2 (1OH) 768.6348 14.04% 0.00% HexCer d18:1/21:0; HexCer d18:1/20:1 (1OH) 770.6504 14.05% 0.00% HexCer d18:0/21:1; HexCer d18:0/20:2 (1OH) 770.6505 14.05% 0.00% HexCer d18:1/20:0 (OH) 772.6298 14.06% 0.00% HexCer d18:0/21:0; HexCer d18:0/20:1 (1OH) 772.6661 14.06% 0.00% HexCer d18:0/20:0 (OH) 774.6455 14.07% 0.00% HexCer d18:1/22:2 780.6347 0.00% 0.00% HexCer d18:0/22:2 782.6504 0.00% 0.00% HexCer d18:1/22:1; HexCer d18:1/21:2 (1OH) 782.6504 14.59% 0.00% HexCer d18:1/22:0; HexCer d18:1/21:1 (1OH) 784.6660 14.60% 0.00% HexCer d18:0/22:1; HexCer d18:0/21:2 (1OH) 784.6661 14.60% 0.00% HexCer d18:1/21:0 (1OH) 786.6455 14.62% 0.00% HexCer d18:0/22:0; HexCer d18:0/21:1 (1OH) 786.6817 14.62% 0.00% HexCer d18:0/21:0 (1OH) 788.6612 14.63% 0.00% HexCer d18:1/23:2 794.6503 0.00% 0.00% HexCer d18:0/23:2 796.6660 0.00% 0.00% HexCer d18:1/23:1; HexCer d18:1/22:2 (1OH) 796.6660 15.16% 0.00% HexCer d18:1/23:0; HexCer d18:1/22:1 (1OH) 798.6816 15.17% 0.00% HexCer d18:0/23:1; HexCer d18:0/22:2 (1OH) 798.6817 15.17% 0.00% HexCer d18:1/22:0 (1OH) 800.6611 15.18% 0.00% HexCer d18:0/23:0; HexCer d18:0/22:1 (1OH) 800.6973 15.18% 0.00%
Hex2Cer d18:1/12:2 802.5314 14.84% 0.00% HexCer d18:0/22:0 (1OH) 802.6768 15.20% 0.00% Hex2Cer d18:1/12:1 804.5470 13.55% 0.00% Hex2Cer d18:0/12:2 804.5471 14.85% 0.00% Hex2Cer d18:0/12:1 (IS) 806.5627 13.56% 0.00% Hex2Cer d18:1/12:0 (IS) 806.5627 13.56% 0.00% Hex2Cer d18:0/12:0 808.5784 13.57% 0.00% HexCer d18:1/24:2 808.6660 13.57% 0.00% HexCer d18:1/24:1; HexCer d18:1/23:2 (1OH) 810.6816 15.74% 0.00%
HexCer d18:0/24:2 810.6817 13.58% 0.00% HexCer d18:0/24:1; HexCer d18:0/23:2 (1OH) 812.6973 15.75% 0.00% HexCer d18:1/24:0; HexCer d18:1/23:1 (1OH) 812.6973 15.75% 0.00% HexCer d18:1/23:0 (1OH) 814.6768 15.77% 0.00% HexCer d18:0/24:0; HexCer d18:0/23:1 (1OH) 814.7130 15.77% 0.00%
Hex2Cer d18:1/13:2 816.5470 15.41% 0.00% HexCer d18:0/23:0 (1OH) 816.6925 15.78% 0.00% Hex2Cer d18:0/13:2 818.5627 15.42% 0.00% Hex2Cer d18:1/13:1; Hex2Cer d18:1/12:2 (1OH) 818.5627 14.07% 0.00% Hex2Cer d18:1/13:0; Hex2Cer d18:1/12:1 (1OH) 820.5783 14.08% 0.00% Hex2Cer d18:0/13:1; Hex2Cer d18:0/12:2 (1OH) 820.5784 14.08% 0.00% Hex2Cer d18:1/12:0 (1OH); HexCer d18:1/25:2 822.5576 14.09% 0.00% Hex2Cer d18:0/13:0; Hex2Cer d18:0/12:1 (1OH) 822.5940 14.09% 0.00% Hex2Cer d18:0/12:0 (1OH); HexCer d18:0/25:2 824.5733 14.10% 0.00% HexCer d18:1/25:1; HexCer d18:1/24:2 (1OH) 824.6973 13.79% 0.00% HexCer d18:1/25:0; HexCer d18:1/24:1 (1OH) 826.7129 16.35% 0.00% HexCer d18:0/25:1; HexCer d18:0/24:2 (1OH) 826.7130 13.80% 0.00% HexCer d18:1/24:0 (1OH) 828.6924 16.36% 0.00% HexCer d18:0/25:0; HexCer d18:0/24:1 (1OH) 828.7286 16.36% 0.00%
Hex2Cer d18:1/14:2 830.5627 15.99% 0.00% HexCer d18:0/24:0 (1OH) 830.7081 16.37% 0.00% Hex2Cer d18:1/14:1; Hex2Cer d18:1/13:2 (1OH) 832.5783 14.60% 0.00%
Hex2Cer d18:0/14:2 832.5784 16.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/14:0; Hex2Cer d18:1/13:1 (1OH) 834.5867 14.61% 0.00% Hex2Cer d18:0/14:1; Hex2Cer d18:0/13:2 (1OH) 834.5940 14.61% 0.00% Hex2Cer d18:0/14:0; Hex2Cer d18:0/13:1 (1OH) 836.6024 14.63% 0.00% HexCer d18:1/26:2; Hex2Cer d18:1/13:0 (1OH) 836.6972 14.63% 0.00% HexCer d18:0/26:2; Hex2Cer d18:0/13:0 (1OH) 838.7129 14.64% 0.00% HexCer d18:1/26:1; HexCer d18:1/25:2 (1OH) 838.7129 16.94% 0.00% HexCer d18:1/26:0; HexCer d18:1/25:1 (1OH) 840.7285 16.95% 0.00% HexCer d18:0/26:1; HexCer d18:0/25:2 (1OH) 840.7286 16.95% 0.00% HexCer d18:1/25:0 (1OH) 842.7081 16.96% 0.00% HexCer d18:0/26:0; HexCer d18:0/25:1 (1OH) 842.7442 16.96% 0.00%
Hex2Cer d18:1/15:2 844.5783 16.59% 0.00% HexCer d18:0/25:0 (1OH) 844.7238 16.98% 0.00% Hex2Cer d18:0/15:2 846.5940 16.60% 0.00% Hex2Cer d18:1/15:1; Hex2Cer d18:1/14:2 (1OH) 846.5940 15.15% 0.00% Hex2Cer d18:1/15:0; Hex2Cer d18:1/14:1 (1OH) 848.6096 15.16% 0.00% Hex2Cer d18:0/15:1; Hex2Cer d18:0/14:2 (1OH) 848.6097 15.16% 0.00% Hex2Cer d18:1/14:0 (1OH); HexCer d18:1/27:2 850.5889 15.17% 0.00% Hex2Cer d18:0/15:0; Hex2Cer d18:0/14:1 (1OH) 850.6253 15.17% 0.00% Hex2Cer d18:0/14:0 (1OH); HexCer d18:0/27:2 852.6046 15.18% 0.00% HexCer d18:1/27:1; HexCer d18:1/26:2 (1OH) 852.7285 14.85% 0.00% HexCer d18:1/27:0; HexCer d18:1/26:1 (1OH) 854.7441 17.57% 0.00% HexCer d18:0/27:1; HexCer d18:0/26:2 (1OH) 854.7442 14.86% 0.00% HexCer d18:1/26:0 (1OH) 856.7237 17.58% 0.00% HexCer d18:0/27:0; HexCer d18:0/26:1 (1OH) 856.7598 17.58% 0.00%
Hex2Cer d18:1/16:2 858.5940 17.19% 0.00% HexCer d18:0/26:0 (1OH) 858.7394 17.59% 0.00% Hex2Cer d18:1/16:1; Hex2Cer d18:1/15:2 (1OH) 860.6096 15.71% 0.00%
Hex2Cer d18:0/16:2 860.6097 17.20% 0.00% Hex2Cer d18:0/16:1; Hex2Cer d18:0/15:2 (1OH) 862.6253 15.72% 0.00% Hex2Cer d18:1/16:0; Hex2Cer d18:1/15:1 (1OH) 862.6253 15.72% 0.00% Hex2Cer d18:0/16:0; Hex2Cer d18:0/15:1 (1OH) 864.6410 15.73% 0.00% HexCer d18:1/28:2; Hex2Cer d18:1/15:0 (1OH) 864.7285 15.73% 0.00% HexCer d18:1/28:1; HexCer d18:1/27:2 (1OH) 866.7441 18.18% 0.00% HexCer d18:0/28:2; Hex2Cer d18:0/15:0 (1OH) 866.7442 15.74% 0.00% HexCer d18:0/28:1; HexCer d18:0/27:2 (1OH) 868.7598 18.20% 0.00% HexCer d18:1/28:0; HexCer d18:1/27:1 (1OH) 868.7598 18.20% 0.00% HexCer d18:1/27:0 (1OH) 870.7394 18.21% 0.00% HexCer d18:0/28:0; HexCer d18:0/27:1 (1OH) 870.7755 18.21% 0.00%
Hex2Cer d18:1/17:2 872.6096 17.81% 0.00% HexCer d18:0/27:0 (1OH) 872.7551 18.22% 0.00% Hex2Cer d18:0/17:2 874.6253 17.82% 0.00% Hex2Cer d18:1/17:1; Hex2Cer d18:1/16:2 (1OH) 874.6253 16.28% 0.00% Hex2Cer d18:1/17:0; Hex2Cer d18:1/16:1 (1OH) 876.6409 16.29% 0.00% Hex2Cer d18:0/17:1; Hex2Cer d18:0/16:2 (1OH) 876.6410 16.29% 0.00% Hex2Cer d18:1/16:0 (1OH) 878.6202 16.30% 0.00% Hex2Cer d18:0/17:0; Hex2Cer d18:0/16:1 (1OH) 878.6566 16.30% 0.00% Hex2Cer d18:0/16:0 (1OH) 880.6359 16.31% 0.00% HexCer d18:1/29:1; HexCer d18:1/28:2 (1OH) 880.7598 15.96% 0.00% HexCer d18:1/29:0; HexCer d18:1/28:1 (1OH) 882.7754 18.84% 0.00% HexCer d18:0/29:1; HexCer d18:0/28:2 (1OH) 882.7755 15.97% 0.00% HexCer d18:1/28:0 (1OH) 884.7730 18.85% 0.00% HexCer d18:0/29:0; HexCer d18:0/28:1 (1OH) 884.7911 18.85% 0.00%
Hex2Cer d18:1/18:2 886.6252 18.44% 0.00% HexCer d18:0/28:0 (1OH) 886.7887 18.87% 0.00% Hex2Cer d18:0/18:2 888.6409 18.45% 0.00% Hex2Cer d18:1/18:1; Hex2Cer d18:1/17:2 (1OH) 888.6409 16.86% 0.00% Hex2Cer d18:1/18:0; Hex2Cer d18:1/17:1 (1OH) 890.6565 16.87% 0.00% Hex2Cer d18:0/18:1; Hex2Cer d18:0/17:2 (1OH) 890.6566 16.87% 0.00% Hex2Cer d18:1/17:0 (1OH) 892.6359 16.88% 0.00% Hex2Cer d18:0/18:0; Hex2Cer d18:0/17:1 (1OH) 892.6722 16.88% 0.00% Hex2Cer d18:0/17:0 (1OH) 894.6516 16.90% 0.00% HexCer d18:1/30:1; HexCer d18:1/29:2 (1OH) 894.7757 16.53% 0.00% HexCer d18:1/30:0; HexCer d18:1/29:1 (1OH) 896.7910 19.49% 0.00% HexCer d18:0/30:1; HexCer d18:0/29:2 (1OH) 896.7914 16.54% 0.00% HexCer d18:1/29:0 (1OH) 898.7707 19.51% 0.00% HexCer d i8:0/30:0; HexCer d18:0/29:1 (1OH) 898.8067 19.51% 0.00% Hex2Cer d18:1/19:2 900.6408 19.08% 0.00% HexCer d18:0/29:0 (1OH) 900.7864 19.52% 0.00% Hex2Cer d18:0/19:2 902.6565 19.09% 0.00% Hex2Cer d18:1/19:1; Hex2Cer d18:1/18:2 (1OH) 902.6565 17.45% 0.00% Hex2Cer d18:1/19:0; Hex2Cer d18:1/18:1 (1OH) 904.6721 17.47% 0.00% Hex2Cer d18:0/19:1; Hex2Cer d18:0/18:2 (1OH) 904.6722 17.47% 0.00% Hex2Cer d18:1/18:0 (1OH) 906.6442 17.48% 0.00% Hex2Cer d18:0/19:0; Hex2Cer d18:0/18:1 (1OH) 906.6878 17.48% 0.00% Hex2Cer d18:0/18:0 (1OH) 908.6599 17.49% 0.00% Hex2Cer d18:1/20:2 914.6565 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/20:1; Hex2Cer d18:1/19:2 (1OH) 916.6721 18.06% 0.00%
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Hex2Cer d18:1/20:0 (OH) 934.6828 18.70% 0.00% Hex2Cer d18:0/21:0; Hex2Cer d18:0/20:1 (1OH) 934.7191 18.70% 0.00%
Hex2Cer d18:0/20:0 (OH) 936.6985 18.72% 0.00% Hex2Cer d18:1/22:2 942.6877 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:0/22:2 944.7034 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/22:1; Hex2Cer d18:1/21:2 (1OH) 944.7034 19.31% 0.00% Hex2Cer d18:1/22:0; Hex2Cer d18:1/21:1 (1OH) 946.7190 19.32% 0.00% Hex2Cer d18:0/22:1; Hex2Cer d18:0/21:2 (1OH) 946.7191 19.32% 0.00% Hex2Cer d18:1/21:0 (1OH) 948.6985 19.34% 0.00% Hex2Cer d18:0/22:0; Hex2Cer d18:0/21:1 (1OH) 948.7347 19.34% 0.00% Hex2Cer d18:0/21:0 (1OH) 950.7142 19.35% 0.00% Hex2Cer d18:1/23:2 956.7033 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:0/23:2 958.7190 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/23:1; Hex2Cer d18:1/22:2 (1OH) 958.7190 19.95% 0.00% Hex2Cer d18:1/23:0; Hex2Cer d18:1/22:1 (1OH) 960.7346 19.97% 0.00% Hex2Cer d18:0/23:1; Hex2Cer d18:0/22:2 (1OH) 960.7347 19.97% 0.00% Hex2Cer d18:1/22:0 (1OH) 962.7141 19.98% 0.00% Hex2Cer d18:0/23:0; Hex2Cer d18:0/22:1 (1OH) 962.7503 19.98% 0.00% Hex2Cer d18:0/22:0 (1OH) 964.7298 19.99% 0.00% Hex2Cer d18:1/24:2 970.7190 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/24:1; Hex2Cer d18:1/23:2 (1OH) 972.7346 20.61% 0.00%
Hex2Cer d18:0/24:2 972.7347 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:0/24:1; Hex2Cer d18:0/23:2 (1OH) 974.7503 20.62% 0.00% Hex2Cer d18:1/24:0; Hex2Cer d18:1/23:1 (1OH) 974.7503 20.62% 0.00% Hex2Cer d18:1/23:0 (1OH) 976.7298 20.64% 0.00% Hex2Cer d18:0/24:0; Hex2Cer d18:0/23:1 (1OH) 976.7660 20.64% 0.00% Hex2Cer d18:0/23:0 (1OH) 978.7455 20.65% 0.00% Hex2Cer d18:1/25:2 984.7346 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:0/25:2 986.7503 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/25:1; Hex2Cer d18:1/24:2 (1OH) 986.7503 21.28% 0.00% Hex2Cer d18:1/25:0; Hex2Cer d18:1/24:1 (1OH) 988.7659 21.29% 0.00% Hex2Cer d18:0/25:1; Hex2Cer d18:0/24:2 (1OH) 988.7660 21.29% 0.00% Hex2Cer d18:1/24:0 (1OH) 990.7454 21.30% 0.00% Hex2Cer d18:0/25:0; Hex2Cer d18:0/24:1 (1OH) 990.7816 21.30% 0.00% Hex2Cer d18:0/24:0 (1OH) 992.7611 21.32% 0.00% Hex2Cer d18:1/26:2 998.7502 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:0/26:2 1000.7659 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/26:1; Hex2Cer d18:1/25:2 (1OH) 1000.7659 21.96% 0.00% Hex2Cer d18:1/26:0; Hex2Cer d18:1/25:1 (1OH) 1002.7815 21.97% 0.00% Hex2Cer d18:0/26:1; Hex2Cer d18:0/25:2 (1OH) 1002.7816 21.97% 0.00% Hex2Cer d18:1/25:0 (1OH) 1004.7611 21.98% 0.00% Hex2Cer d18:0/26:0; Hex2Cer d18:0/25:1 (1OH) 1004.7972 21.98% 0.00% Hex2Cer d18:0/25:0 (1OH) 1006.7768 22.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/27:2 1012.7658 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:0/27:2 1014.7815 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/27:1; Hex2Cer d18:1/26:2 (1OH) 1014.7815 22.65% 0.00% Hex2Cer d18:1/27:0; Hex2Cer d18:1/26:1 (1OH) 1016.7971 22.66% 0.00% Hex2Cer d18:0/27:1; Hex2Cer d18:0/26:2 (1OH) 1016.7972 22.66% 0.00% Hex2Cer d18:1/26:0 (1OH) 1018.7767 22.68% 0.00% Hex2Cer d18:0/27:0; Hex2Cer d18:0/26:1 (1OH) 1018.8128 22.68% 0.00% Hex2Cer d18:0/26:0 (1OH) 1020.7924 22.69% 0.00% Hex2Cer d18:1/28:2 1026.7815 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/28:1; Hex2Cer d18:1/27:2 (1OH) 1028.7971 23.35% 0.00%
Hex2Cer d18:0/28:2 1028.7972 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:0/28:1; Hex2Cer d18:0/27:2 (1OH) 1030.8128 23.37% 0.00% Hex2Cer d18:1/28:0; Hex2Cer d18:1/27:1 (1OH) 1030.8128 23.37% 0.00% Hex2Cer d18:1/27:0 (1OH) 1032.7924 23.38% 0.00% Hex2Cer d18:0/28:0; Hex2Cer d18:0/27:1 (1OH) 1032.8285 23.38% 0.00% Hex2Cer d18:0/27:0 (1OH) 1034.8081 23.40% 0.00% Hex2Cer d18:1/29:1; Hex2Cer d18:1/28:2 (1OH) 1042.8128 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/29:0; Hex2Cer d18:1/28:1 (1OH) 1044.8284 24.08% 0.00% Hex2Cer d18:0/29:1; Hex2Cer d18:0/28:2 (1OH) 1044.8285 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/28:0 (1OH) 1046.8260 24.10% 0.00% Hex2Cer d18:0/29:0; Hex2Cer d18:0/28:1 (1OH) 1046.8441 24.09% 0.00% Hex2Cer d18:0/28:0 (1OH) 1048.8417 24.11% 0.00% Hex2Cer d18:1/30:1; Hex2Cer d18:1/29:2 (1OH) 1056.8287 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/30:0; Hex2Cer d18:1/29:1 (1OH) 1058.8440 24.81% 0.00% Hex2Cer d18:0/30:1; Hex2Cer d18:0/29:2 (1OH) 1058.8444 0.00% 0.00% Hex2Cer d18:1/29:0 (1OH) 1060.8237 24.83% 0.00% Hex2Cer d18:0/30:0; Hex2Cer d18:0/29:1 (1OH) 1060.8597 24.83% 0.00% Hex2Cer d18:0/29:0 (1OH) 1062.8394 24.84% 0.00% LPE 6:0 314.1363 0.00% 0.00% LPE 8:0 342.1676 0.00% 0.00% LPE 10:0 370.1989 0.00% 0.00% LPE 12:0 398.2302 0.00% 0.00% LPE 14:0 (IS) 426.2615 0.00% 0.00%
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LPE O-16:0; LPE 15:0 440.2772 3.95% 0.00%
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LPE O-18:0; LPE 17:0 468.3085 4.49% 0.00%
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PS P-42:3; PS 41:4 854.5906 15.95% 0.00%
PS 42:10; PS P-42:2; PS 41:3 856.5123 15.96% 0.00%
PS 42:9; PS P-42:1; PS 41:2 858.5280 16.10% 0.00%
PS 42:8; PS P-42:0; PS 41:1 860.5436 16.11% 0.00%
PS 42:7; PS 0-42:0 862.5593 16.12% 0.00%
PS 42:6; PS P-43:5 864.5749 16.14% 0.00%
PS 42:5; PS P-43:4 866.5906 16.15% 0.00%
PS 42:4; PS P-43:3 868.6062 16.16% 0.00%
PS 42:3; PS P-43:2 870.6219 16.18% 0.00%
PS 42:2; PS P-43:1 872.6375 16.19% 0.00%
PS 42:1; PS P-43:0 874.6532 16.20% 0.00%
PS 42:0; PS 0-43:0 876.6688 16.21% 0.00%
PS 44:0 904.7001 0.00% 0.00% LPG 6:0 362.1574 0.00% 0.00% LPG 8:0 390.1887 0.00% 0.00% LPG 10:0 418.2200 0.00% 0.00% LPG 12:0 446.2513 0.00% 0.00%
LPG 14:0 (IS) 474.2826 0.00% 0.00%
LPG P-16:0; LPG 0-16:1 486.3190 0.00% 0.00%
LPG 0-16:0; LPG 15:0 488.2983 4.65% 0.00%
LPG 16:2 498.2826 0.00% 0.00% LPG 16:1 500.2983 4.85% 0.00% LPG 16:0 502.3139 4.86% 0.00% LPG P-18:0; LPG 0-18:1; LPG 17:1 514.3508 0.00% 0.00%
LPG 0-18:0; LPG 17:0 516.3296 5.21% 0.00%
LPG 18:4 522.2826 0.00% 0.00% LPG 18:3 524.2983 5.40% 0.00% LPG 18:2 526.3139 5.41% 0.00% LPG 18:1 528.3296 5.42% 0.00% LPG 18:0 530.3452 5.42% 0.00%
LPG P-20:0; LPG 0-20:1 542.3816 0.00% 0.00%
LPG 0-20:0; LPG 19:0 544.3609 5.83% 0.00%
LPG 20:5 548.2977 0.00% 0.00% LPG 20:4 550.3134 6.01% 0.00% LPG 20:3 552.3290 6.02% 0.00% LPG 20:2 554.3452 6.02% 0.00% LPG 20:1 556.3609 6.03% 0.00% LPG 20:0 558.3765 6.04% 0.00%
LPG P-22:0; LPG 0-22:1 570.4129 0.00% 0.00%
LPG 0-22:0; LPG 21:0 572.3922 6.49% 0.00%
LPG 22:6 574.3139 6.50% 0.00% LPG 22:5 576.3290 6.67% 0.00% LPG 22:4 578.3446 6.67% 0.00% LPG 22:1 584.3922 0.00% 0.00% LPG 22:0 586.4078 6.70% 0.00%
LPG P-24:0; LPG 0-24:1 598.4442 0.00% 0.00%
LPG 0-24:0; LPG 23:0 600.4235 7.20% 0.00%
LPG 24:1 612.4235 0.00% 0.00% LPG 24:0 614.4391 7.41% 0.00% LPG 25:0 628.4548 0.00% 0.00% LPG 26:0 642.4704 0.00% 0.00% LPG 27:0 656.4861 0.00% 0.00% LPG 28:0 670.5017 0.00% 0.00% PG 28:0 684.4810 0.00% 0.00% PG 29:0 698.4966 0.00% 0.00% PG 30:1 710.4966 0.00% 0.00% PG 30:0 712.5123 10.06% 0.00%
PG P-32:1; PG-31:2 722.5330 0.00% 0.00%
PG P-32:0; PG-31:1 724.5123 10.74% 0.00%
PG 0-32:0; PG-31:0 726.5279 10.75% 0.00%
PG 32:3; PG P-33:2 734.4966 0.00% 0.00%
PG 32:2; PG P-33:1 736.5123 10.94% 0.00%
PG 32:1; PG P-33:0 738.5279 10.96% 0.00%
PG 32:0 PG 0-33:0 740.5436 10.97% 0.00%
PG P-34:1 PG 33:2 750.5279 0.00% 0.00%
PG P-34:0 PG 33:1 752.5436 11.70% 0.00%
PG O-34:0;PG 33:0 754.5592 11.71% 0.00%
PG 34:4 PG P-35:3 760.5123 0.00% 0.00%
PG 34:3 PG P-35:2 762.5279 11.89% 0.00%
PG 34:2 PG P-35:1 764.5436 11.90% 0.00%
PG 34:1 PG P-35:0 766.5592 11.91% 0.00%
PG 34:0 PG P-36:6 768.5749 11.92% 0.00%
PG P-36:5 PG 35:6 770.4967 12.65% 0.00%
PG P-36:4 PG 35:5 772.5123 12.66% 0.00%
PG P-36:3 PG 35:4 774.5279 12.67% 0.00%
PG P-36:2 PG 35:3 776.5436 12.68% 0.00%
PG P-36:1 PG 35:2 778.5592 12.69% 0.00%
PG P-36:0 PG 35:1 780.5749 12.70% 0.00%
PG 36:7; PG 0-36:0; PG 35:0 782.5905 12.72% 0.00%
PG 36:6 PG P-37:5 784.5123 12.86% 0.00%
PG 36:5 PG P-37:4 786.5279 12.87% 0.00%
PG 36:4 PG P-37:3 788.5436 12.88% 0.00%
PG 36:3 PG P-37:2 790.5592 12.90% 0.00%
PG 36:2 PG P-37:1 792.5749 12.91% 0.00%
PG 36:1 PG P-37:0 794.5905 12.92% 0.00%
PG 36:0 PG P-38:6 796.6062 12.93% 0.00%
PG P-38:5 PG 37:6 798.5273 13.70% 0.00%
PG P-38:4 PG 37:5 800.5430 13.71% 0.00%
PG P-38:3 PG 37:4 802.5586 13.72% 0.00%
PG P-38:2 PG 37:3 804.5749 13.73% 0.00%
PG P-38:1 PG 37:2 806.5905 13.75% 0.00%
PG P-38:0 PG 37:1 808.6062 13.76% 0.00%
PG 38:7; PG 0-38:0; PG 37:0 810.6218 13.77% 0.00%
PG 38:6 PG P-39:5 812.5436 13.91% 0.00%
PG 38:5 PG P-39:4 814.5593 13.92% 0.00%
PG 38:4; PG P-40:10; PG P-29:3 816.5749 13.94% 0.00% PG 38:3; PG P-40:9; PG P-39:2 818.5905 13.95% 0.00% PG 38:2; PG P-40:8; PG P-39:1 820.6062 13.96% 0.00% PG 38:1; PG P-40:7; PG P-39:0 822.6218 13.97% 0.00% PG 38:0; PG P-40:6, PG 0-39:0 824.6375 13.98% 0.00%
PG P-40:5 PG 39:6 826.5593 14.80% 0.00%
PG P-40:4 PG 39:5 828.5749 14.81% 0.00%
PG P-40:3 PG 39:4 830.5905 14.82% 0.00%
PG 40:10; PG P-40:2; PG 39:3 832.5123 14.84% 0.00% PG 40:9; PG P-40:1; PG 39:2 834.5280 14.98% 0.00% PG 40:8; PG P-40:0; PG 39:1 836.5436 14.99% 0.00% PG 40:7; PG 0-40:0; PG 39:0 838.5592 15.00% 0.00%
PG 40:6 PG P-41:5 840.5749 15.01% 0.00%
PG 40:5 PG P-41:4 842.5906 15.03% 0.00%
PG 40:4; PG P-42:10; PG P-41:3 844.6062 15.04% 0.00% PG 40:3; PG P-42:9; PG P-41:2 846.6219 15.05% 0.00% PG 40:2; PG P-42:8; PG P-41:1 848.6375 15.06% 0.00% PG 40:1; PG P-42:7; PG P-41:0 850.6531 15.07% 0.00% PG 40:0; PG P-42:6, PG 0-41:0 852.6688 15.09% 0.00%
PG P-42:5 PG 41:6 854.5905 15.96% 0.00%
PG P-42:4 PG 41:5 856.6062 15.97% 0.00%
PG P-42:3 PG 41:4 858.6218 15.99% 0.00%
PG 42:10; PG P-42:2; PG 41:3 860.5436 16.00% 0.00% PG 42:9; PG P-42:1; PG 41:2 862.5593 16.14% 0.00% PG 42:8; PG P-42:0; PG 41:1 864.5749 16.15% 0.00%
PG 42:7 PG 0-42:0 866.5905 16.16% 0.00%
PG 42:6 PG P-43:5 868.6062 16.17% 0.00%
PG 42:5 PG P-43:4 870.6218 16.19% 0.00%
PG 42:4 PG P-43:3 872.6375 16.20% 0.00%
PG 42:3 PG P-43:2 874.6531 16.21% 0.00%
PG 42:2 PG P-43:1 876.6688 16.23% 0.00%
PG 42:1 PG P-43:0 878.6844 16.24% 0.00%
PG 42:0 PG 0-43:0 880.7001 16.25% 0.00% * masa-carga (m/z) de [M+H]+; [M+Na]+; [M+NH4]+; o [M+NH4-H2O]+ dependiendo de la (sub)clase lipídica individual.
Tabla 6. Base de datos de especies lipídicas verificadas durante la etapa de identificación en el modo iónico negativo
Corrección isotópica Lípido m/z M+2 M+1 oHexCer 78.5145 0.00% | 0.00% exCer 34: 92.4937 0.00% 0.00% oHexCer 92.5301 0.00% 0.00% exCer 34: 94.5094 17.5% 0.00% oHexCer 94.5458 17.5% 0.00% exCer 34: 96.5250 17.51% 0.00% oHexCer 04.5301 0.00% 0.00% oHexCer 06.5458 18% 0.00% exCer 36: 20.5250 0.00% 0.00% oHexCer 20.5614 0.00% 0.00% exCer 36: 22.5407 18.55% 0.00% oHexCer 32.5614 0.00% 0.00% oHexCer 34.5771 19.01% 0.00% oHexCer 48.5927 0.00% 0.00% exCer 38: 50.5720 19.65% 0.00% oHexCer 60.5927 0.00% 0.00% oHexCer 62.6084 20.19% 0.00% exCer 39: 64.5876 20.21% 0.00% oHexCer 74.6084 0.00% 0.00% exCer 40: 76.5876 20.78% 0.00% oHexCer 76.6240 20.78% 0.00% exCer 40: 78.6033 20.79% 0.00% exCer 40: 80.6189 20.44% 0.00% oHexCer 84.5927 0.00% 0.00% oHexCer 86.6084 21.34% 0.00% oHexCer 88.6240 21.35% 0.00% exCer 41: 90.6033 21.36% 0.00% oHexCer 90.6397 21.36% 0.00%
Figure imgf000039_0001
exCer 41: 92.6189 21.37% 0.00% u o exCer 41: 94.6346 21.02% 0.00% SulfoHexCer 40: 96.6138 21.03% 0.00% SulfoHexCer 42: 02.6033 0.00% 0.00% SulfoHexCer 02.6397 0.00% 0.00% SulfoHexCer 42: 04.6189 21.97% 0.00% SulfoHexCer 04.6553 21.97% 0.00% SulfoHexCer 42: 06.6346 21.98% 0.00% SulfoHexCer 42: 08.6502 21.61% 0.00% SulfoHexCer 41: 10.6295 21.62% 0.00% SulfoHexCer 14.6397 0.00% 0.00% SulfoHexCer 16.6553 22.57% 0.00% SulfoHexCer 43: 18.6346 22.58% 0.00% SulfoHexCer 18.6710 22.58% 0.00% SulfoHexCer 43: 20.6502 22.59% 0.00% SulfoHexCer 42: 22.6295 22.21% 0.00% SulfoHexCer 43: 22.6659 22.21% 0.00% SulfoHexCer 42: 24.6451 22.22% 0.00% SulfoHexCer 44 32.6502 0.00% 0.00% SulfoHexCer 44 34.6659 22.81% 0.00% SulfoHexCer 43: 36.6451 22.82% 0.00% SulfoHexCer 44: 36.6815 22.82% 0.00% SulfoHexCer 43: 38.6608 22.83% 0.00% SulfoHex2Cer 12.5360 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 26.5516 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 38.5516 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 40.5673 21.31% 0.00% SulfoHex2Cer
Figure imgf000039_0002
54.5829 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 34 56.5622 21.9% 0.00%
Figure imgf000039_0003
SulfoHex2Cer 36:2 966.5829 21.9% 0.00% SulfoHex2Cer 36:1 968.5986 22% 0.00% SulfoHex2Cer 37:1 982.6142 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 36:1 (OH) 984.5935 23.1% 0.00% SulfoHex2Cer 38:2 994.6142 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 38:1 996.6299 23.71% 0.00% SulfoHex2Cer 39:1 1010.6455 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 38:1 (OH) 1012.6248 24.35% 0.00% SulfoHex2Cer 40:3 1020.6299 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 40:2 1022.6455 24.96% 0.00% SulfoHex2Cer 40:1 1024.6612 24.97% 0.00% SulfoHex2Cer 41:3 1034.6455 24.97% 0.00% SulfoHex2Cer 41:2 1036.6612 24.98% 0.00% SulfoHex2Cer 40:2 (OH) 1038.6404 24.99% 0.00% SulfoHex2Cer 41:1 1038.6768 24.99% 0.00% SulfoHex2Cer 40:1 (OH) 1040.6561 25% 0.00% SulfoHex2Cer 40:0 (OH) 1042.6717 25.1% 0.00% SulfoHex2Cer 42:4 1046.6455 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 42:3 1048.6612 26.27% 0.00% SulfoHex2Cer 42:2 1050.6768 26.28% 0.00% SulfoHex2Cer 42:1 1052.6925 26.28% 0.00% SulfoHex2Cer 42:3 (OH) 1064.6561 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 43:2 1064.6925 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 42:2 (OH) 1066.6717 26.98% 0.00% SulfoHex2Cer 43:1 1066.7081 26.98% 0.00% SulfoHex2Cer 42:1 (OH) 1068.6874 26.99% 0.00% SulfoHex2Cer 42:0 (OH) 1070.7030 27% 0.00% SulfoHex2Cer 44:4 1074.6770 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 44:3 1076.6925 27.63% 0.00% SulfoHex2Cer 44:2 1078.7081 27.64% 0.00% SulfoHex2Cer 43:2 (OH) 1080.6874 27.65% 0.00% SulfoHex2Cer 44:1 1080.7238 27.65% 0.00% SulfoHex2Cer 42:1 (2*OH) 1084.6823 0.00% 0.00% SulfoHex2Cer 44:2 (OH) 1094.7030 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 34:1 1143.6467 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 38:1 1199.7093 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 40:2 1225.7249 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 40:1 1227.7406 31.93% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 41:2 1239.7406 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 41:1 1241.7562 32.69% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 42:4 1249.7249 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 42:3 1251.7406 33.43% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 42:2 1253.7562 33.44% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 42:1 1255.7719 33.45% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 44:3 1279.7719 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex2Cer 44:2 1281.7875 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex4Cer 38:1 1523.8149 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex4Cer 40:2 1549.8306 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex4Cer 40:1 1551.8462 44.15% 0.00% SulfoHexNAcHex4Cer 41:2 1563.8462 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex4Cer 41:1 1565.8619 45.05% 0.00% SulfoHexNAcHex4Cer 42:3 1575.8462 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex4Cer 42:2 1577.8618 45.95% 0.00% SulfoHexNAcHex4Cer 42:1 1579.8775 45.97% 0.00% SulfoHexNAcHex4Cer 42:2 (OH) 1593.8568 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex4Cer 42:1 (OH) 1595.8724 46.2% 0.00% SulfoHexNAcHex3Cer 40:1 1389.7934 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex3Cer 42:2 1415.8090 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex3Cer 42:1 1417.8246 39.48% 0.00% SulfoHexNAcHex3Cer 42:2 (OH) 1431.8039 0.00% 0.00% SulfoHexNAcHex3Cer 42:1 (OH) 1433.8196 39.72% 0.00%
GM332:1 1123.6746 0.00% 0.00% GM334:2 1149.6902 0.00% 0.00% GM334:1 1151.7059 24.68% 0.00% GM334:1 (OH) 1167.7008 0.00% 0.00%
Figure imgf000041_0001
* masa-carga (m/z) de [M-H]\ Evaluación estadística Las concentraciones medidas de lípidos individuales de todos los sujetos medidos se importan a un programa informático estadístico (por ejemplo, SIMCA de Umetrics, Suecia). Se eligen la transformación y el escalado apropiados, típicamente transformación logarítmica y escalado de Pareto o UV. El escalado y la transformación se basan en el análisis de PCA, donde es deseable la distribución normal de pacientes sanos y con cáncer pancreático. El análisis de PCA también se usa para encontrar posibles valores atípicos; de ser así, se somete a prueba la influencia del valor atípico en el modelo (se elimina el valor atípico y se comprueba el modelo) y se cuestionan los procedimientos de medición. Si se identifica un problema técnico en el caso de una medición atípica, a continuación esta medición se elimina del conjunto de datos. El procedimiento PCA se usa para encontrar otros factores influyentes, tales como sexo o edad. Las muestras de QC se deben agrupar muy juntas en el análisis de PCA, típicamente cerca de la mitad del gráfico de PCA.
La siguiente etapa es el uso del análisis de discriminación (OPLS-DA) para la separación de grupos de pacientes con cáncer pancreático y voluntarios sanos por separado para hombres y mujeres. El escalado y la transformación se basan en los resultados de PCA, pero se debe encontrar el modelo final. Los modelos se ajustan a todos los datos juntos y también a estratos separados para covariables influyentes. Se usan diferentes grupos de lípidos para construir el modelo y explorar la influencia en la separación de salud frente a cáncer. El modelo final se elige en función de múltiples factores como buen ajuste (todas las muestras conocidas se clasifican correctamente), en la estabilidad del modelo (sin observaciones demasiado influyentes), buena capacidad de predicción (por validación cruzada realizada automáticamente y a continuación manualmente con grupos aleatorios de observaciones) y el razonamiento biológico y la resistencia a eliminar lípidos sin importancia. Los modelos finales se usan para identificar muestras desconocidas y la sensibilidad y especificidad se estiman en base a estas predicciones. Para este propósito, se representan las curvas de eficacia diagnóstica (ROC). El modelo se somete a prueba de nuevo para determinar su buena capacidad de predicción por medio de la clasificación final. Tras esta última validación del modelo, los lípidos más regulados incorrectamente se identifican usando la curva S o la curva de carga. Los límites para identificar el lípido como regulado incorrectamente son los de la curva S con p mayor que 0,1 y pcorr mayor que 0,4. Para estos lípidos más regulados incorrectamente, los diagramas de caja que comparan los valores promedio en el grupo de pacientes con cáncer pancreático y sanos para diferentes estratos se usan para encontrar una interpretación biológica exacta.
Modelo de cáncer pancreático basado en una clasificación conocida usando datos indiscriminados y UHPSFC/EM: Estos modelos estadísticos se construyen en base a 292 muestras conocidas tanto para conjuntos de datos indiscriminados como de UHPSFC/EM. En primer lugar, el procedimiento PCA no supervisado se usa para comprobar la distribución regular de datos y ya muestra una separación parcial de las clases de pacientes con cáncer y sanos. A continuación, se preparan modelos OPLS-DA supervisados por separado para hombres y mujeres. Estos modelos incluyen todos los lípidos usados (lipidoma completo) y se calculan automáticamente por el programa informático SIMCA. La figura 1 (hombres) y la figura 2 (mujeres) muestran los modelos estadísticos de OPLS-DA de datos de UHPSFC/EM e indiscriminados. Este modelo funcionó bastante bien con un buen ajuste (1 clasificada erróneamente de 292 observaciones usadas para la construcción del modelo) y con una buena capacidad de predicción estimada por validación cruzada simple (1 predicción incorrecta de 16). Vale la pena señalar que existe la brecha entre ambos grupos, lo que resalta visualmente la fiabilidad del modelo para la clasificación del cáncer pancreático.
La lista de los 31 lípidos más regulados por incremento y regulados por disminución para hombres, mujeres y ambos grupos se muestra en la tabla 7.
Tabla 7. Lista de los 31 lípidos más regulados por incremento y regulados por disminución en suero humano de pacientes con cáncer pancreático en comparación con voluntarios sanos determinados para ambos sexos y por separado para hombres y mujeres.
Lípido Todos Hombres Mujeres HexCer d18:1/16:0; HexCer d18:1/15:1 (1OH) incremento incremento
SM 34:1 incremento
HexCer d18:1/24:1; HexCer d18:1/23:2 (1OH) incremento incremento
PE 34:1; PE P-35:0 incremento
PC 32:0; PC O-33:0 incremento incremento
PE 36:4; PE P-37:3 incremento
PC 34:1; PC P-35:0 incremento incremento
PE 34:2; PE P-35:1 incremento
PC P-34:0; PC 33:1 incremento
DG 36:2 incremento incremento
Cer d18:1/24:1; Cer d18:1/23:2 (1OH) incremento incremento
CE 16:0 incremento incremento SM 41:1 disminución disminución disminución SM 41:2 disminución disminución disminución PC 34:4; PC P-35:3 disminución disminución
HexCer d18:1/24:0; HexCer d18:1/23:1 (1OH) disminución disminución PE P-36:3; PE 35:4 disminución
PE P-38:4; PE 37:5 disminución disminución disminución PE P-38:5; PE 37:6 disminución disminución
PE P-36:2; PE 35:3 disminución disminución SM 32:1 disminución
HexCer d18:1/22:0; HexCer d18:1/21:1 (1OH) disminución
PE P-38:3; PE 37:4 disminución
PC P-38:2; PC 37:3 disminución
PE P-40:5; PE 39:6 disminución disminución
PE 36:0; PE P-38:6 disminución
PE 38:0; PE P-40:6, PE O-39:0 disminución
PE P-36:3; PE 35:4 disminución disminución PC P-34:1; PC 33:2 disminución PC P-36:2; PC 35:3 disminución DG 34:3 disminución
Tabla 8. Asignación de sujetos humanos masculinos con clasificación desconocida en base a 4 modelos estadísticos (n.° 1 OPLS-DA de EM indiscriminada, n.° 2 OPLS-DA de UHPSFC/EM, n.° 3 OPLS-DA de todos los datos y n.° 4 SVM de todos los datos) y el promedio de los 4 modelos usados para la asignación final (N = normal, T = tumor, T1, T2, T3, T4 = fases tumorales (T1, T2 son fases tumorales precoces), Tx = tumor pero fase no informada). Estado real = estado de salud/diagnóstico confirmado por procedimientos de examen estándar (imagen y/o biopsia).
N.° Predicción final Estado real Modelo 1 Modelo 2 Modelo 3 Modelo 4 Promedio de 4 muestra modelos
21 T Tx 1.00 1.00 1.00 0.99 1.00
29 T T4 0.99 1.00 1.00 1.00 1.00
40 N N 0.19 0.23 0.23 0.08 0.18
44 N N 0.15 0.36 0.18 0.12 0.20
46 N N 0.26 0.22 0.26 0.13 0.22
50 N N 0.33 0.15 0.27 0.61 0.34
64 (T) T4 0.31 0.89 0.40 0.66 0.57
89 T Tx 0.76 0.70 0.80 0.89 0.79
106 T T3 1.00 1.00 0.99 1.00 1.00
110 T T3 0.66 0.44 0.58 0.96 0.66
115 N N 0.14 0.48 0.14 0.32 0.27
118 N N 0.37 0.36 0.34 0.09 0.29
120 N N 0.11 0.42 0.11 0.08 0.18
133 T Tx 0.95 0.73 0.91 1.00 0.90
142 T T3 0.97 0.81 0.95 1.00 0.93
149 N T2 0.37 0.39 0.38 0.27 0.35
166 N N 0.44 0.30 0.45 0.43 0.41
168 N N 0.21 0.48 0.23 0.19 0.28
173 N N 0.09 0.46 0.15 0.03 0.18
177 (N) N 0.54 0.38 0.59 0.28 0.45 184 T T1 0.87 0.93 0.90 0.95 0.91
194 T Tx 0.82 1.00 0.89 0.99 0.93 203 T T3 1.00 0.83 1.00 1.00 0.96 247 T Tx 0.62 0.92 0.61 0.73 0.72
251 T T3 1.00 0.65 1.00 0.99 0.91
255 T T4 0.81 0.97 0.89 0.98 0.91
258 T Tx 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 264 T T2 0.68 0.69 0.60 0.84 0.70 267 T Tx 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
271 T T4 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 275 T T3 0.98 1.00 1.00 1.00 1.00 305 T T4 0.92 0.96 1.00 1.00 0.97 310 T Tx 0.83 0.81 0.85 1.00 0.87 317 T Tx 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 322 T T3 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 347 T T3 1.00 0.71 1.00 0.97 0.92
351 T T3 0.85 0.74 0.90 0.95 0.86 355 T Tx 0.94 0.73 0.84
Tabla 9. Asignación de sujetos humanos femeninos con clasificación desconocida en base a 4 modelos estadísticos (n.° 1 OPLS-DA de EM indiscriminada, n.° 2 OPLS-DA de UHPSFC/EM, n.° 3 OPLS-DA de todos los datos y n.° 4 SVM de todos los datos) y el promedio de los 4 modelos usados para la asignación final (N = normal, T = tumor, T1, T2, T3, T4 = fases tumorales, Tx = tumor pero fase no informada). Estado real = estado de salud/diagnóstico confirmado por procedimientos de examen estándar (imagen y/o biopsia)._____________________________________ N.° Predicción Estado real Modelo Promedio de 4 muestra final 1 Modelo 2 Modelo 3 Modelo 4 modelos
17 T T1 0.89 1.00 0.88 1.00 0.94
25 T T4 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
34 T T3 1.00 0.98 1.00 0.99 0.99
55 T T4 1.00 0.90 1.00 1.00 0.97
68 T Tx 0.92 1.00 1.00 1.00 0.98
73 T T3 0.85 1.00 0.89 0.99 0.93
78 T Tx 0.82 0.71 0.68 0.95 0.79
83 T T3 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
93 T T4 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
98 T T3 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00
104 N Tx 0.16 0.52 0.40 0.23 0.33
125 T T3 1.00 0.75 1.00 1.00 0.94
130 T T3 0.94 1.00 1.00 0.86 0.95
157 T T4 0.61 0.49 0.51 0.96 0.64
161 T Tx 0.92 0.68 0.72 0.88 0.80
181 T Tx 0.96 1.00 1.00 0.96 0.98
190 T T3 0.65 0.97 0.67 0.56 0.71
199 N T2 0.47 0.52 0.44 0.11 0.38
208 T T4 0.76 0.73 0.96 0.97 0.85
218 T T2 0.98 0.87 0.89 1.00 0.93
226 N N 0.13 0.32 0.22 0.21 0.22
230 N N 0.25 0.36 0.25 0.02 0.22
235 N N 0.36 0.00 0.31 0.07 0.19
239 (N) N 0.64 0.30 0.48 0.40 0.46
280 (T) T3 0.33 0.70 0.47 0.56 0.51
283 N N 0.41 0.19 0.30 0.59 0.37
288 N N 0.16 0.55 0.35 0.22 0.32
292 N N 0.15 0.00 0.00 0.03 0.04
293 N N 0.00 0.02 0.00 0.01 0.01
296 N N 0.27 0.19 0.20 0.13 0.20
327 N N 0.13 0.08 0.11 0.21 0.13
331 T N 0.76 0.33 0.73 0.82 0.66
335 N N 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
344 T Tx 1.00 1.00 1.00 0.99 1.00
359 T Tx 0.59 0.64 0.61 0.54 0.59
Cálculo del rendimiento de muestra para cribado precoz y verificación del tratamiento de pacientes con cáncer pancreático en base al análisis lipidómico de suero humano
Cálculo para 100 muestras de suero humano
Instrumental:
- 1 sistema EM (EM indiscriminada, UHPSFC/EM o MALDI-EM)
- laboratorio para preparación de muestras en régimen de Nivel de Seguridad Biológica (BSL) 2
Tiempo:
Tabla 10. Cálculo del tiempo de etapas individuales en esta metodología para cuantificación lipidómica de alto rendimiento
Figure imgf000045_0001
Cálculo para 1000 muestras:
7 * 10 = 70 días de trabajo - reducción debido a alguna multiplexación y posible operación automatizada durante los fines de semana = aprox. 3 meses
Cuántas muestras por año para 1 sistema EM:
1000 (por 3 meses) * 4 = aprox. 4000 muestras/año
La automatización adicional de preparación de muestras, procesamiento de datos, multiplexación de tareas y reducción del tiempo de análisis podrían incrementar además el rendimiento de muestra al menos dos veces.
Aplicabilidad industrial
El procedimiento de la invención se puede usar para el cribado de población de toda la población o grupos de población seleccionados en base a factores de riesgo tales como edad, sexo, índice de masa corporal, predisposiciones genéticas, comportamiento de riesgo, etc. Los sujetos que tienen la probabilidad de padecer cáncer pancreático por encima de un umbral predeterminado se pueden someter a continuación a exámenes y pruebas adicionales (por ejemplo, tomografía computarizada u otros procedimientos de obtención de imágenes avanzados). Ya que el presente procedimiento de cribado no es invasivo, se puede realizar en un modo de alto rendimiento y puede detectar fases precoces de cáncer pancreático, es el primer procedimiento conocido adecuado para cribado rutinario de cáncer pancreático. La metodología analítica está totalmente validada de conformidad con las recomendaciones de organizaciones autorizadas, tales como la Administración de Alimentos y Medicamentos o la Agencia Europea de Medicamentos (EMEA).

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de diagnóstico de cáncer pancreático en base al análisis lipidómico de un suero obtenido del cuerpo de un paciente humano, caracterizado por que comprende las etapas de:
- enriquecimiento de la muestra con un conjunto de patrones internos que comprenden al menos un patrón interno para cada clase lipídica presente en la muestra,
- procesamiento posterior de la muestra por extracción lipidómica líquido-líquido,
- medición de la muestra procesada por un procedimiento de espectrometría de masas,
- determinación de concentraciones para al menos 60, preferentemente al menos 120 o al menos 230, más preferentemente para todos los lípidos presentes en un nivel por encima del umbral de detección del procedimiento de espectrometría de masas, usando los patrones internos para las clases lipídicas correspondientes para la cuantificación, o usando concentraciones relativas de lípidos, o usando proporciones de concentraciones y/o intensidades de señal,
en el que los lípidos para los que se determinan las concentraciones incluyen los siguientes lípidos:
HexCer d18:1/16:0; HexCer d18:1/15:1 (1OH)
SM 34:1
HexCer d18:1/24:1; HexCer d18:1/23:2 (1OH)
PE 34:1; PE P-35:0
PC 32:0; PC O-33:0
PE 36:4; PE P-37:3
PC 34:1; PC P-35:0
PE 34:2; PE P-35:1
PC P-34:0; PC 33:1
DG 36:2
Cer d18:1/24:1; Cer d18:1/23:2 (1OH)
CE 16:0
SM 41:1
SM 41:2
PC 34:4; PC P-35:3
HexCer d18:1/24:0; HexCer d18:1/23:1 (1OH)
PE P-36:3 PE 35:4
PE P-38:4 PE 37:5
PE P-38:5 PE 37:6
PE P-36:2 PE 35:3
SM 32:1
HexCer d18:1/22:0; HexCer d18:1/21:1 (1OH)
PE P-38:3; PE 37:4
PC P-38:2; PC 37:3
PE P-40:5; PE 39:6
PE 36:0; PE P-38:6
PE 38:0; PE P-40:6, PE O-39:0
PE P-36:3; PE 35:4
PC P-34:1; PC 33:2
PC P-36:2; PC 35:3
DG 34:3
- evaluación estadística de las concentraciones determinadas de los lípidos, determinando dicha evaluación estadística el nivel de probabilidad de que el paciente padezca cáncer pancreático en base a las concentraciones lipídicas determinadas en comparación con un patrón canceroso y un patrón no canceroso, en el que el patrón canceroso y el patrón no canceroso se determinan por análisis estadístico de las concentraciones lipídicas para un grupo de muestras de cáncer y muestras distintas de cáncer conocidas, en el que la evaluación estadística se realiza por separado para hombres y mujeres.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los patrones internos son compuestos lipídicos exógenos, que tienen la estructura de cabeza polar típica para la clase lipídica pertinente y que contienen acilos grasos con cadenas más cortas que los lípidos naturales, preferentemente cadenas 12:0 o 14:0, o acilos grasos con número impar de átomos de carbono, preferentemente cadenas 17:0, 17:1 o 19:1, o los patrones internos son análogos marcados isotópicamente de los lípidos de la clase lipídica pertinente, preferentemente D7-Chol, D7-CE16:0; en los que la notación de compuestos lipídicos es como sigue: abreviatura de la clase de los compuestos, número de carbonos: número de dobles enlaces, precedida por información sobre marcaje isotópico.
3. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que un conjunto de patrones internos contiene:
D7-CE 16:0 MG 19:1
Cer d18:1/12:0 PA 14:0/14:0
DG 12:1/12:1 PC 14:0/14:0
Hex2Cer d18:1/12:0 PE 14:0/14:0
HexCer d18:1/12:0 PG 14:0/14:0
D7-Chol PS 14:0/14:0 LPC 17:0 SM d18:1/12:0 LPE 14:0 SulfoHexCer d18:1/12:0
LPG 14:0 TG 19:1/19:1/19:1
LPA 14:0 LPS 17:1
en los que la notación de compuestos lipídicos es como sigue: abreviatura de la clase de los compuestos, número de carbonos: número de dobles enlaces, precedida por información sobre marcaje isotópico.
4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el procedimiento de espectrometría de masas se selecciona de espectrometría de masas indiscriminada, cromatografía de líquidos de ultraalto rendimiento-espectrometría de masas, cromatografía de fluidos supercríticos de ultraalto rendimientoespectrometría de masas y espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz.
5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que se prepara una muestra combinada mezclando volúmenes idénticos de varias muestras que incluyen muestras de pacientes con cáncer pancreático y voluntarios sanos, y dicha muestra combinada se usa y se procesa de la misma forma que las muestras medidas;
preferentemente, la muestra combinada se usa para observar la exactitud intradía y precisión intradía, así como la exactitud interdía y precisión interdía, y/o para determinar el límite inferior de cuantificación y el límite superior de cuantificación, y/o para el control de calidad durante las mediciones del conjunto de muestras.
6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el orden de las muestras se aleatoriza en secuencias de medición de muestras.
7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la etapa de determinar las concentraciones para todos los lípidos presentes en un nivel por encima del límite inferior de cuantificación del procedimiento de espectrometría de masas, usando los patrones internos para las clases lipídicas correspondientes para la cuantificación, comprende uno o más de los siguientes procedimientos y correcciones: - corrección isotópica,
- procedimiento de llenado con ceros en el que las señales de especies lipídicas que no se detectan para una muestra particular, se reemplazan por de un 50 a un 100 %, preferentemente por de un 70 a un 100 %, más preferentemente por de un 80 a un 90 % o por un 80 %, de la concentración mínima observada para dichas especies lipídicas en todas las muestras.
8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la evaluación estadística implica
- preprocesamiento de datos como centrado, escalado y/o transformación;
- análisis de componentes principales (PCA) para la identificación de factores influyentes tales como valores atípicos o fallos de medición,
- análisis de discriminación por proyecciones ortogonales para análisis discriminante de estructuras latentes (OPLS-DA) para la separación de grupos de pacientes con cáncer pancreático y voluntarios sanos, realizado para hombres y mujeres por separado,
- asignación de los parámetros estadísticos así como evaluación del poder de predicción.
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