ES2953498T3 - Método de espectrometría de masas para la detección y cuantificación de metabolitos - Google Patents

Abstract

Se describe un método para determinar la cantidad de uno o más analitos en una muestra mediante espectrometría de masas. El uno o más analitos se seleccionan del grupo que consiste en alfa-hidroxibutirato (2-HB), linoleoil LPC (LGPC), ácido oleico, 3-hidroxibutirato (3-HB), 4-metil-2-oxopentanoato (4-MOP), pantotenato y serina. El método incluye a) someter la muestra a una fuente de ionización en condiciones adecuadas para producir uno o más iones detectables mediante espectrometría de masas a partir de cada uno de uno o más analitos, en donde los analitos no se derivatizan antes de la ionización; b) medir, mediante espectrometría de masas en tándem, la cantidad de uno o más iones de cada uno de uno o más analitos; yc) usar la cantidad medida de uno o más iones para determinar la cantidad de cada uno de uno o más analitos en la muestra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método de espectrometría de masas para la detección y cuantificación de metabolitos

Antecedentes

La siguiente información para describir los antecedentes de la invención se proporciona para ayudar a la comprensión de la invención y no se admite que constituya o describa la técnica anterior de la invención.

La prediabetes está asociada con la obesidad y las dietas altas en calorías. La prediabetes puede progresar a diabetes tipo 2 pero, si se identifica a tiempo, la progresión se puede retrasar o prevenir mediante cambios en el estilo de vida y un manejo nutricional adecuado. Por lo tanto, el diagnóstico temprano y el seguimiento de la prediabetes son cruciales para reducir la epidemia de diabetes tipo 2. La prediabetes se define clínicamente utilizando uno o más criterios basados en la glucemia, incluidos los niveles de glucosa en plasma en ayunas (FPG), hemoglobina A1c y mediciones de glucosa en plasma de 2 horas de una prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT). Sin embargo, estos criterios identifican solo grupos de sujetos parcialmente superpuestos y posiblemente reflejan diferentes estados fisiopatológicos que conducen a la diabetes tipo 2. Las pruebas basadas en metabolitos son útiles para ayudar en el diagnóstico y la evaluación de trastornos metabólicos asociados con la prediabetes y la diabetes tipo 2, incluida la determinación de la resistencia a la insulina (IR) y la intolerancia a la glucosa (IGT). Para diagnosticar estados prediabéticos como la resistencia a la insulina (IR) y la intolerancia a la glucosa (IGT) de manera más precisa y temprana, se han identificado nuevos biomarcadores de metabolitos. En particular, siete biomarcadores de metabolitos, ácido 2-hidroxibutírico (2-HB), ácido 3-hidroxibutírico (3-HB), ácido 4-metil-2-oxopentanoico (4-MOP), 1-linoleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (LGPC), ácido oleico, pantotenato y serina medidos en muestras de sangre, tal como en plasma o suero, han demostrado ser biomarcadores útiles para la disglucemia y la prediabetes. La cantidad de uno o más de los biomarcadores de metabolitos es informativa para diagnosticar y controlar la prediabetes y para clasificar a los sujetos que tienen intolerancia a la glucosa (IGT) y/o resistencia a la insulina (IR). Usando cantidades de biomarcadores de prediabetes medidas en una muestra de sangre, se puede diagnosticar que un individuo tiene prediabetes o un trastorno relacionado con la prediabetes. Además, un individuo que tenga prediabetes o un trastorno relacionado con la prediabetes puede controlarse mediante el seguimiento de los niveles medidos de los biomarcadores de prediabetes.

En el presente documento se describen métodos para la detección y cuantificación de hasta siete analitos en una muestra biológica. Los siete analitos pueden incluir ácido 2-hidroxibutírico (2-HB), ácido 3-hidroxibutírico (3-HB), ácido 4-metil-2-oxopentanoico (4-MOP), 1-linoleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (LGPC), ácido oleico, pantotenato y serina. Ventajosamente, los ensayos de metabolitos requieren un tamaño de muestra pequeño y se pueden realizar utilizando métodos de análisis de espectrometría de masas. Los métodos pueden ser útiles para la detección e identificación de pacientes que pueden tener prediabetes, pero que pueden ser asintomáticos y/o tener resultados normales de FPG y hemoglobina A1c.

Los métodos descritos en el presente documento para cuantificar analitos son más eficientes que los métodos actuales. Usando los métodos actuales, se requieren al menos dos inyecciones separadas para medir los siete analitos. El tiempo del ciclo para cada inyección es de más de dos minutos. Además, la medición de más analitos requiere instrumentos adicionales y/o tiempo del ciclo adicional si las inyecciones se realizan en secuencia en el mismo instrumento. Los métodos descritos en este documento permiten la medición de dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, o siete analitos en una sola inyección de muestra (entendiendo que una sola inyección se realiza en un solo instrumento) y con un tiempo de total del ciclo de menos de 4 minutos.

J. Cobb et al. J. Diabetes Sci. Technol., 2015, 9, 69-76 divulga una prueba basada en todos los metabolitos que ha demostrado ser un marcador discriminado de intolerancia a la glucosa (IGT). La prueba requiere una sola extracción de sangre en ayunas y se dice que sirve como un sustituto más conveniente para la prueba de tolerancia oral a la glucosa (OGTT) o como un medio para identificar sujetos que probablemente sean IGT.

El documento WO 2014/120449 A1 divulga biomarcadores relacionados con la resistencia a la insulina y trastornos relacionados con la resistencia a la insulina, así como métodos para usar tales biomarcadores como biomarcadores para la resistencia a la insulina, disglucemia, diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular. También se divulgan métodos para controlar los respectivos trastornos o afecciones de un sujeto, y conjuntos de entidades de moléculas pequeñas como biomarcadores para resistencia a la insulina, disglucemia, diabetes tipo 2 y enfermedad cardiovascular.

El documento WO2016/081534 A1 divulga biomarcadores de NASH, NAFLD y fibrosis y métodos para el diagnóstico (o ayuda en el diagnóstico) de NAFLD, NASH y/o fibrosis. Además, se divulgan métodos para distinguir entre NAFLD y NASH, métodos para clasificar la etapa de fibrosis, métodos para determinar la gravedad de la enfermedad hepática, métodos para determinar la gravedad de la enfermedad hepática o fibrosis y métodos para monitorear la progresión/regresión de NASH, NAFLD y/o fibrosis.

A. M. Evans et al. Anal. Chem, 2009, 81, 6656-6667 divulga una plataforma de espectrometría de masas en tándem de cromatografía líquida de rendimiento ultra alto integrada, no dirigida/ionización por electroaspersión para la identificación y cuantificación relativa del complemento de moléculas pequeñas de sistemas biológicos.

W. E. Gall et al., PLoS ONE 2010, 5, e10883 divulga el hidroxibutirato como un marcador temprano tanto para la resistencia a la insulina como para la regulación alterada de la glucosa. Se divulga que los mecanismos bioquímicos subyacentes pueden implicar una mayor oxidación de lípidos y estrés oxidativo.

El documento US 2009/0047269 A1 divulga metabolitos que están presentes de forma diferencial en el cáncer de próstata y métodos para inhibir el crecimiento de una célula alterando el nivel de dichos metabolitos.

Resumen

La presente invención proporciona un método para determinar la cantidad de dos o más analitos seleccionados del grupo que consiste en ácido 2-hidroxibutírico (2-HB), ácido 3-hidroxibutírico (3-HB), ácido 4-metil-2-oxopentanoico (4-MOP), 1-linoleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (LGPC), ácido oleico y serina, en una muestra por espectrometría de masas en una sola inyección de muestra, en el que al menos uno de los dos o más analitos se selecciona del grupo que consta de 2-HB, LGPC, 3-HB, 4-MOP y ácido oleico y el segundo de los dos o más analitos es serina. También se proporcionan métodos para extraer los analitos de muestras biológicas y para separar cromatográficamente los analitos antes de la detección por espectrometría de masas.

En una realización en la que uno o más analitos comprenden 2-HB, uno o más iones de 2-HB pueden comprender uno o más iones que comprenden iones con una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 103.1 ± 0.5, 57.1 ± 0.5, 35.0 ± 0.5, 44.9 ± 0.5, 55.0 ± 0.5 o 84.9 ± 0.5.

En una realización en la que uno o más analitos comprenden LGPC, uno o más iones de LGPC pueden comprender uno o más iones que comprenden iones con una relación masa a carga (m/z) de aproximadamente 554.3 ± 0.5, 279.2 ± 0.5, 34.9 ± 0.5, 79.0 ± 0.5, 153.0 ± 0.5, 167.9 ± 0.5, 224.1 ± 0.5, 242.0 ± 0.5 o 504.4 ± 0.5.

En una realización en la que uno o más analitos comprenden 3-HB, uno o más iones de 3-HB pueden comprender uno o más iones que comprenden iones con una relación masa a carga (m/z) de aproximadamente 103.1 ± 0.5, 59.1 ± 0.5 o 41.1 ± 0.5.

En una realización en la que uno o más analitos comprenden 4-MOP, uno o más iones de 4-MOP pueden comprender uno o más iones que comprenden iones con una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 129.0 ± 0.5 o 85.1 ± 0.5.

En una realización en la que uno o más analitos comprenden ácido oleico, uno o más iones del ácido oleico pueden comprender uno o más iones que comprenden iones con una relación masa a carga (m/z) de aproximadamente 281.3 ± 0.5, 44.7 ± 0.5, 61.8 ± 0.5, 79.8 ± 0.5, 143,1 ± 0.5, 183.0 ± 0.5, 194.9 ± 0.5, 206.9 ± 0.5, 209.0 ± 0.5, 210.1 ± 0.5, 223.1 ± 0.5, 237.1 ± 0.5 o 251.1 ± 0.5.

En una realización en la que uno o más analitos comprenden además pantotenato, uno o más iones de pantotenato pueden comprender uno o más iones que comprenden iones con una relación masa/carga (m/z) de aproximadamente 218.1 ± 0.5, 88.0 ± 0.5, 42.0 ± 0.5, 44.0 ± 0.5, 45.1 ± 0.5, 59.0 ± 0.5, 71.0 ± 0.5, 72.0 ± 0.5, 98.1 ± 0.5, 98.9 ± 0.5, 100.9 ± 0.5, 116.0 ± 0.5, 129.1 ± 0.5 o 146.0 ± 0.5.

En una realización en la que uno o más analitos comprenden serina, uno o más iones de serina pueden comprender uno o más iones que comprenden iones con una relación masa a carga (m/z) de aproximadamente 104.0 ± 0.5, 74.0 ± 0.5, 40.1 ± 0.5, 42.0 ± 0.5, 45.0 ± 0.5, 56.0 ± 0.5 o 58.1 ± 0.5.

El método incluye determinar la cantidad de una pluralidad de analitos, tal como, por ejemplo, la cantidad de dos o más analitos, tres o más analitos, cuatro o más analitos, cinco o más analitos, seis o más analitos o siete analitos seleccionados del grupo que consiste en ácido 2-hidroxibutírico (2-HB o AHB), ácido 3-hidroxibutírico (3-HB), ácido 4-metil-2-oxopentanoico (4-MOP), 1-linoleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (LGPC), ácido oleico y serina, en el que al menos uno de los dos o más analitos se selecciona del grupo que consiste en 2-HB, LGPC, 3-Hb , 4-MOP y ácido oleico y el segundo de los dos o más analitos es serina, en una muestra por espectrometría de masas utilizando una única inyección. La Tabla 10, que se encuentra a continuación (después de los Ejemplos), enumera posibles combinaciones de los 7 analitos. En algunas realizaciones relacionadas, los métodos incluyen además la determinación de la relación de los niveles de un analito con respecto a otro analito.

En una realización, se determina la cantidad de dos o más analitos y al menos uno de los dos o más analitos se selecciona del grupo que consiste en 2-HB y LGPC.

En otra realización, uno de los dos o más analitos es 2-HB y el segundo de los dos o más analitos es serina.

En otra realización más, uno de los dos o más analitos es LGPC y un segundo de los dos o más analitos es serina.

En una realización, el método incluye determinar la cantidad de analitos 2-HB y ácido oleico y determinar la cantidad de serina en una muestra mediante espectrometría de masas usando una sola inyección.

En un ejemplo de realización, el método incluye determinar la cantidad de analitos 2-HB y 3-HB y determinar la cantidad de serina en una muestra mediante espectrometría de masas usando una sola inyección.

En un ejemplo de realización, el método incluye determinar la cantidad de analitos 2-HB y 4-MOP y determinar la cantidad de serina en una muestra mediante espectrometría de masas usando una sola inyección.

En un ejemplo de realización, el método incluye determinar la cantidad de analitos 2-HB y serina en una muestra mediante espectrometría de masas usando una sola inyección. En algunas realizaciones, el método incluye determinar la cantidad de uno o más analitos adicionales seleccionados del grupo que consiste en 3-HB, 4-MOP, ácido oleico, pantotenato y LGPC en una muestra mediante espectrometría de masas usando una sola inyección.

En un ejemplo de realización, el método incluye determinar la cantidad de los analitos LGPC y ácido oleico y determinar la cantidad de serina en una muestra mediante espectrometría de masas usando una sola inyección.

En un ejemplo de realización, el método incluye determinar la cantidad de analitos LGPC y 3-HB y determinar la cantidad de serina en una muestra mediante espectrometría de masas usando una sola inyección.

En un ejemplo de realización, el método incluye determinar la cantidad de analitos LGPC y 4-MOP y determinar la cantidad de serina en una muestra mediante espectrometría de masas usando una sola inyección.

En un ejemplo de realización, el método incluye determinar la cantidad de analitos LGPC y serina en una muestra mediante espectrometría de masas usando una sola inyección. En algunas realizaciones, el método incluye determinar la cantidad de uno o más analitos adicionales seleccionados del grupo que consiste en 3-HB, 4-MOP, 2-HB, pantotenato y ácido oleico en una muestra mediante espectrometría de masas usando una sola inyección.

En una realización, el método comprende medir la cantidad de una pluralidad de analitos que tienen diferencias en la polaridad en una sola inyección usando una etapa de separación seguida de detección por MS. Por ejemplo, la serina difiere en polaridad de 2-HB, 3-HB, 4-MOP, LGPC y ácido oleico. Se puede usar una columna de UPLC por debajo del nivel de las micras y condiciones de cromatografía de fase inversa para permitir medir la cantidad de serina en combinación con uno o más analitos seleccionados del grupo que consta de 2-Hb , 3-HB, 4-MOP, LGPC y ácido oleico, en una sola inyección.

En realizaciones, la muestra puede ser una muestra de plasma o una muestra de suero. La muestra se puede recoger utilizando tubos de plasma con EDTA o tubos de plasma con heparina de litio. El volumen de la muestra puede ser de 10 ^|j L a 200 ^|j L. Por ejemplo, el volumen de la muestra puede ser 10 j L, 15, 20, 25, 30, 40, 50 j L, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180 o 200 ^j L o cualquier otro volumen entre 10 y 200 ^j L.

En algunas realizaciones, el método comprende medir una pluralidad de analitos mientras también se obtiene la separación del par crítico 4-MOP y 3-MO^p (véase, la Figura 8A, tiempo de retención de 1.09 y 1.04 minutos, respectivamente).

En una realización, el tiempo del ciclo del método es inferior a 3 minutos. Por ejemplo, el tiempo del ciclo del método es de aproximadamente 2 minutos. En otro ejemplo, el tiempo del ciclo del método es de aproximadamente 2.21 minutos.

En realizaciones, uno o más estándares internos detectables por separado se proporcionan en la muestra, cuya cantidad también se determina en la muestra. En estas realizaciones, la totalidad o una porción de uno o más analitos endógenos seleccionados del grupo que consiste en ácido 2-hidroxibutírico (2-HB), ácido 3-hidroxibutírico (3-HB), ácido 4-metil-2-oxopentanoico (4-MOP), 1-linoleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (LGPC), ácido oleico, pantotenato, serina y uno o más estándares internos presentes en la muestra se ionizan para producir una pluralidad de iones detectables en un espectrómetro de masas. En algunas realizaciones, la cantidad de iones generados a partir de un analito de interés puede estar relacionada con la presencia de una cantidad de analito de interés en la muestra en comparación con uno o más patrones internos.

En algunas realizaciones, la cantidad de un analito en una muestra puede determinarse mediante la comparación de la cantidad de uno o más iones del analito detectados por espectrometría de masas con la cantidad de uno o más iones estándar detectados por espectrometría de masas en un estándar de referencia externo. Los ejemplos de estándares de referencia externos pueden comprender plasma como blanco o suero enriquecido con una cantidad conocida de uno o más de los estándares internos y/o analitos de interés descritos anteriormente.

En algunas realizaciones, se puede usar un contraión para lograr el estado de ionización deseado para el análisis de MS. Por ejemplo, se puede usar un contraión para cambiar la polaridad de la ionización de LGPC para el análisis de MS en modo de ionización negativa. Los ejemplos de contraiones pueden incluir cloruro de amonio, acetato de amonio, formiato de amonio, bromuro de amonio, sulfato de amonio o nitrato de amonio. También se pueden usar contraiones alternativos adicionales.

En algunas realizaciones, LGPC puede medirse en el modo de monitorización de reacción múltiple positiva (MRM) implementando el cambio de polaridad en el instrumento de MS.

En algunas realizaciones, la concentración de ácido fórmico en la fase móvil A puede estar entre 0.001 % y 0.1 %.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 muestra ejemplos de picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de 2-HB.

La FIG. 2 muestra ejemplos de picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de 3-HB.

La FIG. 3 muestra ejemplos de picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de 4-MOP.

La FIG. 4 muestra ejemplos de picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de pantotenato.

La FIG. 5 muestra ejemplos de picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de ácido oleico.

La FIG. 6 muestra ejemplos de picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de LGPC.

La FIG. 7 muestra ejemplos de picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de serina.

La FIG. 8A muestra cromatogramas de serina, 3-HB, 2-HB, pantotenato, 4-MOP, LGPC y ácido oleico. Para cada analito, el pico de interés, con el tiempo de retención asociado, se indica mediante una estrella. Los datos se generaron usando el Método 4 como se describe en el Ejemplo 2.

La FIG. 8B muestra cromatogramas de los patrones internos de serina-d³ , 3-HB-d⁴ , 2-HB-d³ , pantotenato-¹³C³-¹⁵N, 4-MOP-d³ , LGPC-d^g y ácido oleico-¹³C¹⁸. Para cada estándar interno, el pico de interés, con el tiempo de retención asociado, se indica con una estrella. Los datos se generaron usando el Método 4 como se describe en el Ejemplo 2. La FIG. 9 muestra un gráfico de Bland-Altman que compara la cuantificación de serina determinada usando el método descrito en este documento para cuantificar dos o más analitos y el método de PFPA para serina.

Descripción detallada

Se describen métodos para medir la cantidad de dos o más analitos seleccionados del grupo de metabolitos que consiste en: ácido 2-hidroxibutírico (2-HB), ácido 3-hidroxibutírico (3-HB), ácido 4-metil-2-oxopentanoico (4-MOP), 1-linoleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (LGPC), ácido oleico (oleato) y serina en una muestra, en la que al menos uno de los dos o más analitos es seleccionado del grupo que consiste en 2-HB, LGPC, 3-HB, 4-MOP y ácido oleico y un segundo de los dos o más analitos es serina. Se describen métodos de espectrometría de masas para cuantificar analitos individuales y múltiples en una muestra usando un método de inyección única. Los métodos pueden usar una etapa de cromatografía líquida como UPLC para realizar una separación (purificación, enriquecimiento) de analitos seleccionados combinados con métodos de espectrometría de masas, proporcionando así un sistema de ensayo de alto rendimiento para cuantificar una pluralidad de analitos en una muestra que es susceptible a la automatización.

Los métodos presentados en el presente documento proporcionan ventajas sobre los métodos actuales para medir estos analitos. El método utiliza una sola inyección para medir uno o más y hasta siete analitos. Además, el método usa una sola inyección para medir analitos que tienen diferentes polaridades de ionización. Es decir, los analitos que normalmente se miden usando el modo de ionización positiva se pueden medir usando el modo de ionización negativa. La capacidad de medir, en una sola inyección, una pluralidad de analitos en varias combinaciones, incluida una realización para medir hasta siete analitos, reduce el tiempo requerido para obtener resultados de análisis, utiliza menos recursos en términos de materiales desechables de laboratorio (por ejemplo, tubos, puntas de pipeta, reactivos), instrumental de laboratorio y recursos humanos. Estas mejoras conducen a ahorros al disminuir los costes de los ensayos y aumentar la capacidad del laboratorio y del instrumento para el análisis de muestras.

Antes de describir esta invención con mayor detalle, se definen los siguientes términos.

Definiciones:

El término "extracción en fase sólida" se refiere a un proceso de preparación de muestras en el que los componentes de una mezcla compleja (es decir, la fase móvil) se separan según sus propiedades físicas y químicas utilizando material de empaquetamiento cromatográfico de partículas sólidas (es decir, fase sólida o fase estacionaria). El material de empaquetamiento de partículas sólidas puede estar contenido en un dispositivo tipo cartucho (por ejemplo, una columna).

El término "separación" se refiere al proceso de separar una mezcla compleja en sus moléculas componentes o metabolitos. Los ejemplos de técnicas de separación de laboratorio comunes incluyen electroforesis y cromatografía.

El término "cromatografía" se refiere a un método físico de separación en el que los componentes (es decir, los constituyentes químicos) a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria) mientras que la otra (la fase móvil ) se mueve en una dirección definida. La fase móvil puede ser gas ("cromatografía de gases", "GC") o líquida ("cromatografía de líquidos", "LC"). Los datos cromatográficos de salida pueden usarse en realizaciones del método descrito en el presente documento.

El término "cromatografía líquida" o "LC" se refiere a un proceso de inhibición selectiva de uno o más componentes de una solución fluida cuando el fluido se mueve uniformemente a través de una columna de una sustancia finamente dividida o a través de conductos capilares. La inhibición resulta de la distribución de los componentes de la mezcla entre una o más fases estacionarias y la o las fases móviles a medida que la o las fases móviles se mueven con respecto a la o las fases estacionarias. Los ejemplos de "cromatografía líquida" incluyen "cromatografía líquida de fase inversa" o "RPLC", "cromatografía líquida de alto rendimiento" o "HPLC", "cromatografía líquida de ultra alto rendimiento" o "UPLC" o "UHPLC".

El término "tiempo de retención" se refiere al tiempo transcurrido en un proceso de cromatografía desde la introducción de la muestra en el dispositivo de separación. El tiempo de retención de un constituyente de una muestra se refiere al tiempo transcurrido en un proceso de cromatografía entre el momento de la inyección de la muestra en el dispositivo de separación y el momento en que el constituyente de la muestra eluye (por ejemplo, sale de) la porción del dispositivo de separación que contiene la fase estacionaria.

El término "índice de retención" de un componente de la muestra se refiere a un número, obtenido por interpolación (generalmente logarítmica), que relaciona el tiempo de retención o el factor de retención del componente de la muestra con los tiempos de retención de los estándares eluidos antes y después del pico del componente de la muestra, un mecanismo que utiliza las características de separación de estándares conocidos para eliminar el error sistemático.

El término "índice de separación" se refiere a una métrica asociada con constituyentes químicos separados por una técnica de separación. Para las técnicas de separación cromatográfica, el índice de separación puede ser el tiempo de retención o el índice de retención. Para las técnicas de separación no cromatográficas, el índice de separación puede ser la distancia física recorrida por el constituyente químico.

Como se usa en el presente documento, los términos "información de separación" y "datos de separación" se refieren a datos que indican la presencia o ausencia de constituyentes químicos con respecto al índice de separación. Por ejemplo, los datos de separación pueden indicar la presencia de un constituyente químico que tiene una masa particular que eluye en un momento particular. Los datos de separación pueden indicar que la cantidad del constituyente químico que eluye con el tiempo aumenta, alcanza su punto máximo y luego disminuye. Un gráfico de la presencia del constituyente químico trazado sobre el índice de separación (p. ej., tiempo) puede mostrar un pico gráfico. Por lo tanto, dentro del contexto de los datos de separación, los términos "información de pico" y "datos de pico" son sinónimos de los términos "información de separación" y "datos de separación".

El término "espectrometría de masas" (MS) se refiere a una técnica para medir y analizar moléculas que implica ionizar o ionizar y fragmentar una molécula objetivo, luego analizar los iones, en función de sus relaciones de masa/carga, para producir un espectro de masas que sirve como una "huella digital molecular". La determinación de la relación masa/carga de un objeto se puede realizar mediante la determinación de las longitudes de onda a las que ese objeto absorbe la energía electromagnética. Hay varios métodos comúnmente utilizados para determinar la relación masacarga de un ion, algunos miden la interacción de la trayectoria del ion con las ondas electromagnéticas, otros miden el tiempo que tarda un ion en viajar una distancia determinada, o una combinación de ambos. Los datos de estas mediciones de masa de fragmentos se pueden buscar en bases de datos para obtener identificaciones de moléculas objetivo.

Los términos "operar en modo negativo" u "operar en modo de MRM negativo" u "operar en modo de ionización negativa" se refieren a aquellos métodos de espectrometría de masas en los que se generan y detectan iones negativos. Los términos "operar en modo positivo" u "operar en modo de MRM positivo" u "operar en modo de ionización positiva" se refieren a aquellos métodos de espectrometría de masas en los que se generan y detectan iones positivos.

El término "analizador de masas" se refiere a un dispositivo en un espectrómetro de masas que separa una mezcla de iones por sus relaciones de masa a carga ("m/z").

El término "m/z" se refiere a la cantidad adimensional formada al dividir el número de masa de un ion por su número de carga. Durante mucho tiempo se ha llamado la relación "masa a carga".

Como se usa en este documento, el término "fuente" se refiere a un dispositivo en un espectrómetro de masas que ioniza una muestra a analizar. Los ejemplos de fuentes de iones incluyen ionización por electroaspersión (ESI), ionización química a presión atmosférica (APCI), ionización por electroaspersión calentada (HESI), fotoionización a presión atmosférica (APPI), detector de ionización de llama (FID), ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI), etc.

Como se usa en el presente documento, el término "detector" se refiere a un dispositivo en un espectrómetro de masas que detecta iones.

El término "ion" se refiere a cualquier objeto que contiene una carga, que se puede formar, por ejemplo, agregando o quitando electrones del objeto.

El término "espectro de masas" se refiere a un gráfico de datos producido por un espectrómetro de masas, que normalmente contiene valores de m/z en el eje x y valores de intensidad en el eje y.

El término "escanear" se refiere a un espectro de masas que está asociado con un índice de separación particular. Por ejemplo, los sistemas que usan una técnica de separación cromatográfica pueden generar múltiples escaneos, cada escaneo en un tiempo de retención diferente.

El término "tiempo del ciclo" se refiere al tiempo desde la inyección de la muestra hasta la generación de los datos del instrumento. El tiempo de total del ciclo incluye cromatografía y espectrometría de masas para la muestra.

El término "MS en tándem" se refiere a una operación en la que se realiza una primera etapa de MS, denominada "MS primaria", seguida de la realización de una o más de una etapa de MS posterior, denominada genéricamente "MS secundaria". En la MS primaria, un ion, que representa uno (y posiblemente más de un) constituyente químico, se detecta y registra durante la creación del espectro de masas primario. La sustancia representada por el ion se somete a una MS secundaria, en la que la sustancia de interés se fragmenta para hacer que la sustancia se rompa en ^{subcomponentes, que se detectan y registran como un espectro de masas secundario. En una verdadera} M^{s en} tándem, existe una relación inequívoca entre el ion de interés en la MS primaria y los picos resultantes creados durante la MS secundaria. El ion de interés en la MS primaria corresponde a un ion "padre" o precursor, mientras que los iones creados durante la MS secundaria corresponden a subcomponentes del ion padre y se denominan en el presente documento iones "hijo" o "producto".

Por lo tanto, MS en tándem permite la creación de estructuras de datos que representan la relación padre-hijo de constituyentes químicos en una mezcla compleja. Esta relación puede representarse mediante una estructura en forma de árbol que ilustra la relación de los iones padre e hijo entre sí, donde los iones hijo representan subcomponentes del ión padre. La MS en tándem puede repetirse en iones hijo para determinar los iones "nietos", por ejemplo. Por lo tanto, la MS en tándem no se limita a dos niveles de fragmentación, sino que se utiliza genéricamente para referirse a la MS multinivel, también denominada "MSn". El término "MS/MS" es sinónimo de "MS2". Para simplificar, el término "ión hijo" en adelante se refiere a cualquier ión creado por una MS secundaria o de orden superior (es decir, no la primaria).

El "nivel" de uno o más biomarcadores significa la cantidad o concentración absoluta o relativa del biomarcador medido en la muestra.

"Muestra" o "muestra biológica" significa material biológico aislado de un sujeto. La muestra biológica puede contener cualquier material biológico adecuado para detectar los biomarcadores deseados y puede comprender material celular y/o no celular del sujeto. La muestra se puede aislar de cualquier líquido o tejido biológico adecuado como, por ejemplo, sangre, plasma sanguíneo (plasma), suero sanguíneo (suero), orina, líquido cefalorraquídeo (CSF) o tejido.

"Sujeto" significa cualquier animal, pero es preferiblemente un mamífero, tal como, por ejemplo, un humano, mono, ratón, conejo o rata.

I. Preparación de muestras y control de calidad (QC)

Los extractos de muestras que contienen analitos se preparan aislando los analitos de las macromoléculas (por ejemplo, proteínas, ácidos nucleicos, lípidos) que pueden estar presentes en la muestra. Algunos o todos los analitos de una muestra pueden estar unidos a proteínas. Se pueden usar varios métodos para interrumpir la interacción entre ^{el o los analitos y la proteína antes del análisis de} M^s. ^{Por ejemplo, los analitos pueden extraerse de una muestra} para producir un extracto líquido, mientras que las proteínas que pueden estar presentes se precipitan y eliminan. Las proteínas se pueden precipitar usando, por ejemplo, una solución de acetato de etilo o metanol. Para precipitar las proteínas en la muestra, se agrega una solución de acetato de etilo o metanol a la muestra, luego la mezcla se puede centrifugar en una centrífuga para separar el sobrenadante líquido, que contiene los analitos extraídos, de las proteínas precipitadas.

En otras realizaciones, los analitos pueden liberarse de la proteína sin precipitar la proteína. Por ejemplo, se puede agregar una solución de ácido fórmico a la muestra para interrumpir la interacción entre la proteína y el analito. Alternativamente, se puede agregar a la muestra sulfato de amonio, una solución de ácido fórmico en etanol o una solución de ácido fórmico en metanol para interrumpir las interacciones iónicas entre la proteína y el analito sin precipitar la proteína.

En algunas realizaciones, el extracto puede someterse a varios métodos que incluyen cromatografía líquida, electroforesis, filtración, centrifugación y separación por afinidad como se describe en el presente documento para purificar o enriquecer la cantidad del analito seleccionado en relación con uno o más componentes de la muestra.

Para evaluar, por ejemplo, la precisión, la exactitud, el intervalo de calibración o la sensibilidad analítica de los métodos de detección y cuantificación de analitos, se pueden usar muestras de QC (QC). La concentración de un analito o analitos dados que se usará en una muestra de QC se puede determinar en función del límite inferior de cuantificación (LLOQ) o el límite superior de cuantificación (ULOQ) del o los analitos dados, según se detecte en una muestra. En un ejemplo, el LLOQ puede estar representado por la concentración de un estándar (por ejemplo, el Estándar A) y el ULOQ puede estar representado por la concentración de un segundo estándar (por ejemplo, el Estándar H). El valor de QC bajo se puede ajustar en una concentración de aproximadamente 3 X LLOQ, el valor de QC medio puede estar en una concentración de aproximadamente 25-50 % del QC alto y el valor de QC alto puede estar en una concentración de aproximadamente 80 % del ULOQ. Los niveles de concentración objetivo de QC se pueden elegir en función de una combinación del intervalo de medición analítica (AMR) y la frecuencia de los resultados de la muestra como se mide en un conjunto de muestras representativas.

II. Cromatografía

Antes de la espectrometría de masas, el extracto de analitos puede someterse a uno o más métodos de separación tales como electroforesis, filtración, centrifugación, separación por afinidad o cromatografía. En una realización, el método de separación puede comprender cromatografía líquida (LC), que incluye, por ejemplo, LC de rendimiento ultra alto (UHPLC).

En algunas realizaciones, la UHPLC se puede realizar usando un sistema cromatográfico en columna de fase inversa, cromatografía de interacción hidrófila (HILIC) o un sistema cromatográfico en columna de fase mixta.

El calentador de columna para LC se puede ajustar a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 80 °C. Por ejemplo, el calentador de columna se puede ajustar a aproximadamente 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C, etc.

En un ejemplo, la UHPLC se puede realizar usando un sistema cromatográfico de columna de fase inversa. El sistema puede comprender dos o más fases móviles. Las fases móviles pueden denominarse, por ejemplo, fase móvil A, fase móvil B, fase móvil A' y fase móvil B'.

En un ejemplo de realización que usa dos fases móviles, A y B, la fase móvil A puede comprender ácido fórmico, agua y NH4Cl, y la fase móvil B puede comprender metanol, acetonitrilo y NH4CL La concentración de ácido fórmico en la fase móvil A puede oscilar entre 0.001% y 0.1%. Además, la composición de la fase móvil A puede oscilar entre 0.01:1000:0.001 y 1.0:1000:0.01 (ácido fórmico: agua: NH4Cl, v/v/p). En un ejemplo de realización, la fase móvil A se puede preparar en una relación volumen/volumen/peso (v/v/p) de 0.025:1000:0.001. En realizaciones adicionales, la fase móvil B se puede preparar en una relación v/v/p de 2000:1000:0.001.

En un ejemplo, se puede usar la elución de gradiente lineal para la cromatografía. Las condiciones iniciales para la elución en gradiente lineal pueden incluir la concentración de una fase móvil (p. ej., fase móvil B) y/o el caudal de una fase móvil a través de la columna (p. ej., fase móvil B). Las condiciones iniciales pueden optimizarse para la separación y/o retención de uno o más analitos. Por ejemplo, las condiciones iniciales para el gradiente pueden optimizarse para la separación de 3-MOP y 4-MOP comenzando con no más del 5 % de la fase móvil B y un caudal que oscila entre 300 y 800 μL/min. En otro ejemplo, las condiciones iniciales para el gradiente también pueden optimizarse para la retención de 2-HB y 3-HB en la columna comenzando con no más del 5 % de la fase móvil B. Las condiciones del gradiente también pueden optimizarse para la separación y/o retención de analitos y puede variar según el caudal seleccionado. Por ejemplo, con condiciones iniciales de 5 % de fase móvil B y 650 μL/min de caudal, la fase móvil B puede aumentarse al 40 % en 0.8 min y luego al 99 % en 0.01 min y mantenerse durante 1.09 min. La fase móvil B puede volver al 5 % en 0.01 min para equilibrar la siguiente inyección de muestra. El caudal se puede cambiar de 650 a 800 μL/min de 1.50 a 1.55 min y luego volver a 650 μL/min de 2.20 a 2.21 min.

En otras realizaciones, la fase móvil A puede comprender ácido perfluoropentanoico (PFPA) y agua, y la fase móvil B puede comprender PFPA y acetonitrilo. La concentración de PFPA puede ser de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.500 %. Por ejemplo, la concentración de PFPA puede ser de aproximadamente 0.05 %. En otro ejemplo, la fase móvil A puede ser ácido perfluoropentanoico (PFPA) al 0.05 % en agua, y la fase móvil B puede ser PFPA al 0.05 % en acetonitrilo. La elución con gradiente lineal se puede usar para la cromatografía y se puede llevar a cabo con una condición inicial de 1 % de fase móvil B mantenida durante 0.5 min. La proporción de fase móvil B puede entonces aumentarse al 39 % en 1.1 min. La proporción de fase móvil B se puede aumentar al 80 % en 0.2 min y luego volver al 1 % en 0.1 min para equilibrar la siguiente inyección. El caudal se puede ajustar en 800 μL/min y el tiempo de total del ciclo puede ser inferior a 3 minutos.

En aún otras realizaciones, la fase móvil A puede comprender ácido fórmico y agua, y la fase móvil B puede comprender acetonitrilo y metanol. En un ejemplo de realización, la fase móvil A puede contener de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.100 % de ácido fórmico, y la fase móvil B puede contener cualquier cantidad de acetonitrilo de 0-100 %. En un ejemplo, la concentración de la fase móvil A puede ser de aproximadamente 0.0100 % de ácido fórmico en agua y la concentración de la fase móvil B puede ser de aproximadamente 50 % de acetonitrilo en metanol. La elución de gradiente lineal puede usarse para cromatografía y puede llevarse a cabo con condiciones iniciales de 1% de fase móvil B y un caudal de 800 μL/min. La fase móvil B puede mantenerse al 1 % a los 0.5 min, aumentar al 16 % a los 2.50 min, al 46 % a los 3.50 min y luego puede reducirse al 1.0 % a los 3.60 min y a los 4.50 min.

II. Espectrometría de masas y cuantificación

La espectrometría de masas se realiza usando un espectrómetro de masas que incluye una fuente de iones para ionizar la muestra fraccionada y crear moléculas cargadas para análisis posteriores. La ionización de la muestra se puede realizar, por ejemplo, mediante ionización por electroaspersión (ESI). Otras fuentes de iones pueden incluir, por ejemplo, ionización química a presión atmosférica (APCl), ionización calentada por electroaspersión (HESl), fotoionización a presión atmosférica (APPI), detector de ionización de llama (FID) o ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI). La elección del método de ionización puede determinarse en función de una serie de consideraciones. Los ejemplos de consideraciones incluyen el analito a medir, el tipo de muestra, el tipo de detector y la elección del modo positivo o negativo.

Los dos o más analitos se ionizan en modo negativo para crear dos o más iones. Por ejemplo, los analitos 2-HB, 3-HB, 4-MOP, serina, pantotenato, ácido oleico y LGPC se ionizan en modo negativo. Los analitos ionizados en modo negativo pueden analizarse en una sola inyección de muestra.

Los ajustes del instrumento del espectrómetro de masas pueden optimizarse para el método dado y/o para el espectrómetro de masas particular utilizado. El instrumento puede utilizar varios gases, por ejemplo, nitrógeno, helio, argón o aire cero. En un ejemplo, la espectrometría de masas se puede realizar utilizando espectrómetros de masas AB Sciex QTrap 5500. El instrumento puede funcionar en el modo de monitorización de reacciones múltiples negativas (MRM). Los ajustes de voltaje para atomización de iones pueden oscilar entre -4 kV y -5 kV; en una realización, el voltaje se puede ajustar en -4.5 kV. La temperatura de la fuente puede oscilar entre aproximadamente 500 °C y 600 °C; en una realización, la temperatura de la fuente se puede ajustar en 550 °C. El gas de cortina puede oscilar entre 20 y 40 u otro valor apropiado; en una realización, el gas de cortina se puede ajustar en 30. Los caudales de gas del nebulizador y de desolvatación pueden oscilar entre 60 y 80 u otro valor apropiado; en una realización, los caudales se pueden ajustar en 70. El gas de disociación activado por colisión (CAD) puede variar de alto a bajo. En una realización, el CAD se puede establecer, por ejemplo, en un nivel bajo. En la Tabla 1 se describen otros ejemplos de ajustes de MS.

Después de que se haya ionizado una muestra, los iones cargados positiva o negativamente pueden analizarse para determinar una relación de masa a carga. Los ejemplos de analizadores adecuados para determinar las relaciones de masa a carga incluyen analizadores de cuadrupolo, analizadores de trampa de iones y analizadores de tiempo de vuelo. Los iones pueden detectarse utilizando, por ejemplo, un modo selectivo o un modo de escaneo. Los ejemplos de modos de escaneo incluyen el monitoreo de reacciones múltiples (MRM) y el monitoreo de reacciones seleccionadas (SRM).

Los resultados del análisis pueden incluir datos producidos por MS en tándem. En ejemplos de realizaciones, la MS en tándem puede ser una M^s en tándem de masa precisa. Por ejemplo, la espectrometría de masas en tándem de masa precisa puede utilizar un analizador de tiempo de vuelo de cuadrupolo (Q-TOF). La MS en tándem permite la creación de estructuras de datos que representan la relación padre-hijo de componentes químicos en una mezcla compleja. Esta relación puede representarse mediante una estructura en forma de árbol que ilustra la relación de los iones padre e hijo entre sí, donde los iones hijo representan subcomponentes del ión padre.

Por ejemplo, un espectro de masas primario puede contener cinco iones distintos, que pueden representarse como cinco picos gráficos. Cada ion en el MS primario puede ser un ion padre. Cada ion padre puede someterse a un MS secundario que produce un espectro de masas que muestra los iones hijo para ese ion padre en particular.

La relación padre/hijo se puede ampliar para describir la relación entre los componentes separados (p. ej., componentes que eluyen del estado de cromatografía) y los iones detectados en el MS primario, y la relación entre la muestra que se va a analizar y los componentes separados.

El espectrómetro de masas normalmente proporciona al usuario un escaneo de iones (es decir, una abundancia relativa de cada ion con una masa/carga particular en un intervalo dado). Los datos de espectrometría de masas pueden relacionarse con la cantidad del analito en la muestra original mediante varios métodos. En un ejemplo, se usa un estándar de calibración para generar una curva estándar (curva de calibración) de modo que la abundancia relativa de un ion determinado pueda convertirse en una cantidad absoluta del analito original. En otro ejemplo, el estándar de calibración puede ser un estándar externo y se puede generar una curva estándar basada en iones generados a partir de esos estándares para calcular la cantidad de un analito más. En otro ejemplo, el estándar externo puede ser un analito no marcado.

Se pueden añadir patrones internos a los patrones de calibración y/o a las muestras de ensayo. Se puede usar un estándar interno para tener en cuenta la pérdida de analitos durante el procesamiento de la muestra para obtener un valor más preciso de un analito medido en la muestra. La relación entre el área del pico del analito y el área del pico del estándar interno en los niveles de los estándares de calibración puede usarse para generar una curva de calibración y cuantificar las muestras. Uno o más análogos de analitos marcados isotópicamente, por ejemplo, 2-HB-d³ , 3-HB-d⁴ , 4-MOP-ds, serina-ds, pantotenato-¹³C³-¹⁵N, ácido oleico-¹³C¹⁸ y LGPC-d^g pueden usarse como estándares internos. Otros estándares internos adecuados incluyen, por ejemplo, D-3-HB-¹³C⁴ sódico, D-3-HB-2,4-¹³C² sódico, D-3-HB-4,4,4-d³ , (+/-)-3-HB-2,2-d² sódico, (+/-)-3-HB-2,4-13C² sódico, L-serina-¹³C³-d³-¹⁵N, DL-serina-¹³C³-¹⁵N, L-serina-¹³C³ , L-serina-¹³C³-¹⁵N, DL-serina-2,3,3-d³ , L-serina-2,3,3-d³-¹⁵N, DL-serina-3,3-d² , L-serina-3,3-d² , L-serina-d⁷ , ácido oleico-11,11 -d2, ácido oleico-9,10-d² y ácido oleico-d³³.

Los datos del análisis pueden enviarse a un ordenador y procesarse usando software de ordenador. En un ejemplo, las relaciones de área de pico del analito con respecto al estándar interno se ajustan frente a las concentraciones de los estándares de calibración utilizando un método de regresión estadística para la cuantificación. En otro ejemplo, la regresión estadística es una regresión lineal ponderada de mínimos cuadrados. La pendiente y el intercepto calculados usando la curva de calibración pueden usarse para calcular las concentraciones desconocidas de analitos en muestras experimentales.

Ejemplos

I. Métodos generales

A. Reactivos e instrumentos

El ácido fórmico (98 %) y el cloruro de amonio (99.5 %) de grado espectrométrico de masas se obtuvieron de Sigma-Aldrich; el metanol de grado HPLC y el agua se obtuvieron de Fisher Scientific; y el acetonitrilo y el etanol de grado HPLC se obtuvieron de Acros. Se utilizó un agitador Vortexer para múltiples tubos de VWR Scientific para mezclar. La centrifugación de las placas se llevó a cabo en una centrífuga Sorvall ST 40R de Thermo Scientific con un rotor de cubetas 3617. El plasma humano (K₂-EDTA) se obtuvo de Bioreclamation. Los intralípidos, la bilirrubina, la albúmina sérica bovina (libre de ácidos grasos) y el ácido perfluoropentanoico (PFPA) se obtuvieron de Sigma-Aldrich. L-serina, ácido (S)-2-hidroxibutírico, (±)-3-hidroxibutirato de sodio, ácido 4-metil-2-oxopentanoico, ácido oleico y ácido oleico-¹³C¹⁸ se adquirieron de Sigma-Aldrich; el D-pantotenato de calcio se obtuvo de MP Biochemicals; 1 -linoleoil-2-hidroxisn-glicero-3-fosfocolina y 1-linoleoil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina-N,N,N-trimetil-d⁹ se obtuvo de Avanti Polar Lipids; L-serina-2,3,3-d³ y pantotenato de calcio (p-alanina-¹³C³ , ¹⁵N) se obtuvieron de Cambridge Isotope Laboratories; ( ± )-2-hidroxibutirato-2,3,3-d³ de sodio, ( ± )-3-hidroxibutirato-3,4,4,4-d⁴ de sodio y 4-metil-d³-2-oxopentanoato de sodio se obtuvieron de CDN Isotopes.

B. Preparación de la muestra

La preparación de la muestra se llevó a cabo en una placa de polipropileno de 96 pocillos. Para los estándares de calibración, blancos y blancos con muestras con estándar interno, se transfirieron 50 μL de agua a los pocillos apropiados. Para las muestras de QC y de estudio, se transfirieron 50 μL de plasma (descongelado en hielo) a los pocillos apropiados. Para los estándares de calibración, se agregaron 40 μL de las soluciones de adición de calibración correspondientes. Todas las demás muestras se combinaron con 40 μL de una mezcla de acetonitrilo/agua/etanol (1:1:2). Se añadió una alícuota de 20 μL de solución con estándar interno de trabajo (WIS) a cada pocillo excepto a los blancos, a los que se añadieron 20 μL de mezcla de acetonitrilo/agua/etanol (1:1:2). La solución WIS puede estar compuesta por uno o más estándares internos y puede comprender uno o más estándares internos para cada uno de los siete analitos descritos en este documento. La extracción de metabolitos se realizó agregando una solución de ácido fórmico al 1% en metanol (200 μL) a cada pocillo. La placa se tapó, se agitó con vórtice durante 2 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó durante 5 minutos a 3000 rpm a 4 °C. Se transfirió una alícuota de 150 μL del sobrenadante a una placa nueva para el análisis de LC-MS/MS. Para evaluar la recuperación de la muestra, las muestras de QC se enriquecieron con una concentración equivalente al estándar de calibración D, que representa el valor medio de QC para el analito dado. Los estándares de calibración para cada analito se presentan a continuación en la Tabla 3 del Ejemplo 1; los valores de calibración para el estándar D se presentan en la columna encabezada "D". Las soluciones madre, las soluciones adicionales de calibración y las soluciones estándar internas se almacenaron a 4 °C.

Para 2-HB, las muestras de QC se enriquecieron con una concentración de 5.00 μg/mL de 2-HB, que era equivalente al estándar de calibración D.

Para 3-HB, las muestras de QC se enriquecieron con una concentración de 10.00 μg/mL de 3-HB, que era equivalente al estándar de calibración D.

Para 4-MOP, las muestras de QC se enriquecieron con una concentración de 5.00 μg/mL de 4-MOP, que era equivalente al estándar de calibración D.

Para la serina, las muestras de QC se enriquecieron con una concentración de 25.0 μg/mL de serina, que era equivalente al estándar de calibración D.

Para el pantotenato, las muestras de QC se enriquecieron con una concentración de 0.100 μg/mL de pantotenato, que era equivalente al estándar de calibración D.

Para el ácido oleico, las muestras de QC se enriquecieron con una concentración de 100 μg/mL de ácido oleico, que era equivalente al estándar de calibración D.

Para LGPC, las muestras de QC se enriquecieron con una concentración de 25.00 μg/mL de LGPC, que era equivalente al estándar de calibración D.

Se preparó una solución de WIS para 2-HB-d³ en acetonitrilo/agua/etanol (1:1:2) a una concentración de 40.0 μg/mL.

Se preparó una solución de WIS para 3-HB-d⁴ en acetonitrilo/agua/etanol (1:1:2) a una concentración de 30.0 μg/mL.

Se preparó una solución de WIS para 4-MOP-d³ en acetonitrilo/agua/etanol (1:1:2) a una concentración de 20.0 μg/mL.

Se preparó una solución de WIS para serina-d³ en acetonitrilo/agua/etanol (1:1:2) a una concentración de 50.0 μg/mL.

Se preparó una solución de WIS para pantotenato-¹³C³ ,¹⁵N en acetonitrilo/agua/etanol (1:1:2) a una concentración de 0.700 μg/mL.

Se preparó una solución de WIS para ácido oleico-¹³C¹⁸ en acetonitrilo/agua/etanol (1:1:2) a una concentración de 20.0 μg/mL.

Se preparó una solución de WIS para LGPC-d^g en acetonitrilo/agua/etanol (1:1:2) a una concentración de 20.0 μg/mL.

C. Cromatografía

Los sistemas de UHPLC Agilent 1290 Infinity, cada uno equipado con una unidad de bomba de disolvente binario, un inyector automático refrigerado (ajustado a 4 °C) y un calentador de columna (ajustado a 50 °C, a menos que se indique lo contrario) se utilizaron para cromatografía líquida con una columna de fase inversa (Waters ACQUITY UPLC® BEH C18, 1.7 μm, 2.1 x 100 mm). La fase móvil A era ácido fórmico/agua/NH⁴Cl (0.025:1000:0.001, v/v/p) y la fase móvil B era metanol/acetonitrilo/NH⁴Cl (2000:1000:0.001, v/v/p), a menos que se indique lo contrario. La elución en gradiente lineal se llevó a cabo con una condición inicial de 5 % de fase móvil B (95 % de fase móvil A) y un caudal de 650 μL/min, a menos que se indique lo contrario. La fase móvil B se aumentó del 5 % inicial al 40 % (60 % de fase móvil A) en 0.8 min y luego del 40 % al 99 % (1 % de fase móvil A) en 0.01 min y se mantuvo durante 1.09 min. Luego, la fase móvil B volvió al 5 % (95 % de fase móvil A) en 0.01 min para equilibrarse antes de inyectar la siguiente muestra. El caudal se aumentó de 650 μL/min a 800 μL/min de 1.50 a 1.55 min y luego se disminuyó de nuevo a 650 μL/min de 2.20 a 2.21 min. El tiempo del ciclo fue de 2.21 min. Se inyectó una única alícuota fija de 0.5 - 1.0 μL de la solución de extracción final en la columna de cromatografía para cada muestra analizada. El eluyente de la columna de cromatografía se introdujo directa y automáticamente en la fuente de electroaspersión de un espectrómetro de masas. Se usó isopropanol para el lavado de la aguja a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1: Medición de analitos por LC-MS/MS

Se realizó cromatografía líquida de fase inversa en muestras extraídas como se describió anteriormente en la descripción de la cromatografía en la sección de Métodos generales.

Se realizó espectrometría de masas en las muestras utilizando espectrómetros de masas AB Sciex QTrap 5500. Los instrumentos se operaron en modo de monitoreo de reacción múltiple negativa (MRM). El voltaje de atomización de iones se fijó en -4.5 kV, la temperatura de la fuente en 550 °C, el gas de cortina (p. ej., nitrógeno) en 30, y los caudales del nebulizador y del gas de desolvatación (p. ej., nitrógeno) en 70, gas de disociación activada por colisión (CAD) (p. ej., nitrógeno) a baja temperatura. La configuración detallada de MS para cada analito se describe en la Tabla 1.

Tabla 1. Configuraciones del método con el espectrómetro de masas

Los datos sin procesar se adquirieron del instrumento y se procesaron utilizando el software Analyst 1.6.2 (AB Sciex). Para la cuantificación, se ajustaron las relaciones del área de los picos del analito con respecto al estándar interno frente a las concentraciones de los estándares de calibración mediante regresión lineal de mínimos cuadrados ponderada (1/x2). La pendiente resultante y la intersección de la curva de calibración se usaron para calcular las concentraciones desconocidas en las muestras experimentales. Los iones padre e hijo utilizados en este ejemplo para la cuantificación de cada analito se enumeran en la Tabla 2 bajo las columnas tituladas "ion padre (m/z)" y "ion hijo para cuantificación (m/z)", respectivamente. Con la excepción del ácido oleico, se seleccionó el ión hijo más intenso de cada analito para utilizarlo en la cuantificación. Para el ácido oleico, ninguno de los iones hijo tenía suficiente sensibilidad para abarcar el intervalo de calibración.

Tabla 2. Proporciones de masa de iones primarios y secundarios

Se determinó el intervalo de calibración de cada analito. Para cada analito, el LLOQ representa el extremo inferior del intervalo de calibración y el extremo superior del intervalo de calibración está representado por el ULOQ. Se utilizaron ocho calibradores (estándares A-H) para cubrir los intervalos de calibración. Las concentraciones finales de analito en cada calibrador se enumeran en la Tabla 3. Las soluciones de adición de calibración se prepararon en acetonitrilo/agua/etanol (1:1:2) a 1.25 veces las concentraciones de calibración correspondientes.

Tabla 3. Intervalos de calibración para analitos

Los niveles de QC se determinaron con base en LLOQ y ULOQ. Las muestras de QC de nivel bajo, medio y alto se prepararon a partir de la combinación de mezclas de plasma humano de concentraciones de analitos adecuadas con el enriquecimiento de los analitos según fuera necesario. Las muestras de LLOQ se prepararon en una solución de BSA libre de ácidos grasos (50 mg/mL en PBS) a las mismas concentraciones que el estándar A en la Tabla 3 para todos los analitos. Las muestras de QC se almacenaron a -80 °C.

Las Figuras 1-7 muestran espectros de masas resultantes de la fragmentación de los iones padre indicados en la Tabla 2.

Las transiciones de MRM que se controlaron para la cuantificación de 2-HB en modo de ionización negativa incluyen las producidas por la fragmentación de un ion padre que tiene una m/z de aproximadamente 103.1 ± 0.5 para producir iones hijo que tienen una m/z de aproximadamente 57.1 ± 0.5, 35.0 ± 0.5, 44.9 ± 0.5, 55.0 ± 0.5, 84.9 ± 0.5 y 101.0 ± 0.5. En la Figura 1 se ilustran estos picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de 2-HB. En este ejemplo, el ion hijo utilizado para la cuantificación de 2-HB tiene una relación m/z de aproximadamente 57.1 ± 0.5. Se determinó que el intervalo de calibración para 2-HB era de 0.500 a 40.0 |jg/mL.

Las transiciones de MRM que se controlaron para la cuantificación de 3-HB en modo de ionización negativa incluyen aquellas producidas por la fragmentación de un ion padre que tiene una m/z de aproximadamente 103.1 ± 0.5 para producir iones hijo que tienen una m/z de aproximadamente 59.1 ± 0.5 y 41.1 ± 0.5. Estos picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de 3-HB se ilustran en la Figura 2. En este ejemplo, el ion hijo utilizado para la cuantificación de 3-HB tiene una relación m/z de aproximadamente 59.1 ± 0.5. Se determinó que el intervalo de calibración para 3-HB era de 1.00 a 80.0 jg/mL.

Las transiciones de MRM que se controlaron para la cuantificación de 4-MOP en modo de ionización negativa incluyen las producidas al fragmentar un ion padre que tiene una m/z de aproximadamente 129.0 ± 0.5 en un ion hijo que tiene una m/z de aproximadamente 85.1 ± 0.5. Estos picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de 4-MOP se ilustran en la Figura 3. En este ejemplo, el ion hijo utilizado para la cuantificación de 4-MOP tiene una relación m/z de aproximadamente 85.1 ± 0.5. Se determinó que el intervalo de calibración para 4-MOP era de 0.500 a 20.0 jg/mL.

Las transiciones MRM que se controlaron para la cuantificación de pantotenato en modo de ionización negativa incluyen aquellas producidas al fragmentar un ion padre que tiene una m/z de aproximadamente 218.1 ± 0.5 para producir iones secundarios que tienen una m/z de aproximadamente 88.0 ± 0.5, 42.0 ± 0.5, 44.0 ± 0.5, 45.1 ± 0.5, 59.0 ± 0.5, 71.0 ± 0.5, 72.0 ± 0.5, 98.1 ± 0.5, 98.9 ± 0.5, 100.9 ± 0.5, 116.0 ± 0.5, 129.1 ± 0.5 y 146.0 ± 0.5. En la Figura 4 se ilustran estos picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de pantotenato. En este ejemplo, el ion hijo utilizado para la cuantificación de pantotenato tiene una relación m/z de aproximadamente 88.0 ± 0.5. Se determinó que el intervalo de calibración para el pantotenato era de 0.0100 a 0.800 jg/mL.

Las transiciones de MRM que se controlaron para la cuantificación de ácido oleico en modo de ionización negativa incluyen las producidas por la fragmentación de un ion padre que tiene una m/z de aproximadamente 281.3 ± 0.5 para producir iones hijo que tienen una m/z de aproximadamente 44.7 ± 0.5, 61.8 ± 0.5, 79.8 ± 0.5, 143.1 ± 0.5, 183.0 ± 0.5, 194.9 ± 0.5, 206.9 ± 0.5, 209.0 ± 0.5, 210.1 ± 0.5, 223.1 ± 0.5, 237.1 ± 0.5 y 251.1 ± 0.5. En la Figura 5 se ilustran estos picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de ácido oleico. Para este ejemplo, se utilizó la transición de padre a padre de 281.3 ± 0.5 a 281.3 ± 0.5 para la cuantificación del ácido oleico. Se determinó que el intervalo de calibración para el ácido oleico era de 10.0 a 400 jg/mL.

Las transiciones de MRM que se controlaron para la cuantificación de LGPC en modo de ionización negativa incluyen las producidas por la fragmentación de un ion padre que tiene una m/z de aproximadamente 554.3 ± 0.5 para producir iones hijo que tienen una m/z de aproximadamente 279.2 ± 0.5, 34.9 ± 0.5, 79.0 ± 0.5, 153.0 ± 0.5, 167.9 ± 0.5, 224.1 ± 0.5, 242.0 ± 0.5 y 504.4 ± 0.5. En la Figura 6 se ilustran estos picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de LGPC. Debido a la naturaleza zwitteriónica de LGPC, se utilizó un contraión para cuantificar el analito en modo de ionización negativa. En este ejemplo, se seleccionó el cloruro para su uso como contraión al incluir una pequeña cantidad de cloruro de amonio en la fase móvil y se seleccionó la transición del ion padre [M+Cl]' al ion secundario m/z 279 ± 0.5 para cuantificación de LGPC. Se determinó que el intervalo de calibración para LGPC era de 2.50 a 100 jg/mL.

Las transiciones de MRM que se controlaron para la cuantificación de serina en modo de ionización negativa incluyen las producidas por la fragmentación de un ion padre que tiene una m/z de aproximadamente 104.0 ± 0.5 para producir iones hijo que tienen una m/z de aproximadamente 74.0 ± 0.5, 40.1 ± 0.5, 42.0 ± 0.5, 45.0 ± 0.5, 56.0 ± 0.5 y 58.1 ± 0.5. En la Figura 7 se ilustran estos picos de iones padre e hijo generados a partir de la fragmentación espectrométrica de masas en tándem de serina. En este ejemplo, el ion hijo utilizado para la cuantificación de serina tiene una relación m/z de aproximadamente 74.0 ± 0.5. Se determinó que el intervalo de calibración para la serina era de 2.50 a 100 |jg/mL.

Como se puede ver en el escaneo de iones producto en las Figuras 1-7, se puede generar una pluralidad de iones hijo tras la fragmentación de los iones padre indicados. Uno cualquiera o más de estos iones hijo indicados en las Figuras 1-7 o enumerados en la Tabla 2 en la columna titulada "Iones hijo adicionales" pueden seleccionarse para reemplazar o aumentar los iones hijo utilizados en los ejemplos descritos anteriormente y en la Tabla 2 en el columna titulada "Ion hijo para cuantificación (m/z)".

Como método alternativo para medir la serina, se usó la cromatografía en condiciones de emparejamiento de iones (PFPA), y el espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo positivo. En estas condiciones, la serina se retuvo cromatográficamente y no se sometió a una supresión de matriz de alto nivel. Para el método de PFPA para serina, el calentador de columna se ajustó a 60 °C. La fase móvil A era ácido perfluoropentanoico (PFPA) al 0.05 % en agua y la fase móvil B era PFPA al 0.05 % en acetonitrilo. La elución en gradiente lineal se llevó a cabo con una condición inicial de 1 % de fase móvil B mantenida durante 0.5 min y luego aumentada al 39 % en 1.1 min. La proporción de fase móvil B se aumentó al 80 % (20 % de fase móvil A) en 0.2 min y luego de nuevo al 1 % (99 % de fase móvil A) en 0.1 min para equilibrar la siguiente inyección. El caudal fue de 800 jL/min y el tiempo de total del ciclo fue de 2.21 min. Se inyectó una alícuota de 1.5 jL de la solución de extracción final para cada muestra.

Para la espectrometría de masas con el método de PFPA para serina, los instrumentos se operaron en modo de MRM positivo con pares de iones 106.1/60.1 y 109.1/63.1 para serina y serina-d³ , respectivamente. El voltaje de atomización de iones se fijó en 3.0 kV, la temperatura de la fuente en 550 °C y el gas de cortina en 20; los caudales del nebulizador y del gas de desolvatación se fijaron en 70 y el gas CAD en alto. El potencial de desagrupamiento se fijó en 41 V, la energía de colisión en 45 eV, el potencial de entrada en 10 V y el potencial de salida de la celda de colisión en 8 V.

En otro ejemplo, se desarrollaron métodos alternativos para medir analitos individuales. En los métodos que se ejemplifican a continuación, se realizó cromatografía líquida con una columna de fase inversa (Waters ACQUITY UPLC® BEH C18, 1.7 jm , 2.1 x 100 mm) en muestras extraídas utilizando sistemas de UHPLC Agilent 1290 Infinity, cada uno equipado con una unidad de bomba de solvente binario, un inyector automático refrigerado (ajustado a 4 °C) y un calentador de columna (ajustado a 60 °C). Se inyectó una única alícuota fija de 0.5-1.0 jL de la solución de extracción final en la columna de cromatografía para cada muestra en cada lote. El eluyente de la columna de cromatografía se introdujo directa y automáticamente en la fuente de electroaspersión de un espectrómetro de masas. Se usó metanol para el lavado de las agujas. Se utilizaron espectrómetros de masas AB Sciex QT rap 5500 con fuente Turbo V (ESI).

Para estos métodos, los ejemplos de iones que se controlaron para la cuantificación de 2-HB, 3-HB, 4-MOP, ácido oleico, LGPC, serina y pantotenato se enumeran en la Tabla 4.

T l 4. I n il r l nifi i n n li

continuación

Por ejemplo, se desarrollaron métodos que midieron la cantidad de 2-HB, 3-HB, 4-MOP, LGPC o ácido oleico. Para estos métodos, la fase móvil A era ácido fórmico al 0.0100 % en agua y la fase móvil B era acetonitrilo/metanol (1:1). La elución en gradiente lineal se llevó a cabo con una condición inicial de 5 % de fase móvil B. La fase móvil B se aumentó al 25 % a los 0.8 min, al 37 % a los 1.40 min, al 99 % a los 1.50 y 2.60 min, y luego al 0.5 % a los 2.70 min. El caudal fue de 550 μL/min. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de MRM negativo para 2-HB, 3-HB, 4-MOP o ácido oleico y en modo de MRM positivo para LGPC.

En otro ejemplo, se desarrollaron métodos que midieron la cantidad de pantotenato o serina. Para estos métodos, la fase móvil A era ácido perfluoropenanoico (PFPA) al 0.0500 % en agua y la fase móvil B era PFPA al 0.0500 % en acetonitrilo. La elución en gradiente lineal se llevó a cabo con una condición inicial de 1 % de fase móvil B. La fase móvil B se mantuvo al 1 % a los 0.5 min, se aumentó al 16 % a los 2.50 min, al 46 % a los 3.50 min y se disminuyó al 1.0 %. a los 3.60 min y a los 4.50 min. El caudal fue de 800 μL/min. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de MRM positivo.

Ejemplo 2: Medición por LC-MS/MS de una pluralidad de analitos

Se desarrollaron métodos para medir una pluralidad de analitos en una muestra utilizando una sola inyección de un extracto de muestra; es decir, se determinó la cantidad de dos o más analitos en la misma muestra usando la misma inyección (única). En todos los métodos que se ejemplifican a continuación, se realizó cromatografía líquida con una columna de fase inversa (Waters ACQUITY UPLC® BEH C18, 1.7 μm, 2.1 x 100 mm) en muestras extraídas utilizando sistemas de UHPL Agilent 1290 Infinity C, cada uno equipado con una unidad de bomba de solvente binaria, un inyector automático refrigerado (ajustado a 4 °C) y un calentador de columna (ajustado a 50 °C a menos que se indique lo contrario).

Método 1 de LC-MS/MS de referencia: serina y pantotenato

Por ejemplo, se desarrolló un método que medía la cantidad de pantotenato y serina en la misma inyección. En este método, el calentador de la columna se ajustó a 60 °C, la fase móvil A era ácido perfluoropenanoico (PFPA) al 0.0500 % en agua y la fase móvil B era PFPA al 0.0500 % en acetonitrilo. La elución en gradiente lineal se llevó a cabo con una condición inicial de 1 % de fase móvil B. La fase móvil B se mantuvo al 1 % a los 0.5 min, se aumentó al 16 % a los 2.50 min, al 46 % a los 3.50 min y se disminuyó al 1.0 %. a los 3.60 min ya los 4.50 min. El caudal fue de 800 μL/min. Para cada muestra analizada, se inyectó en la columna de cromatografía una única alícuota fija de 0.5-1.0 μL de la solución de extracción final. El eluyente de la columna de cromatografía se introdujo directa y automáticamente en la fuente de electroaspersión de un espectrómetro de masas. Se usó metanol para el lavado de las agujas. Se utilizaron espectrómetros de masas AB Sciex QTrap 5500 con fuente Turbo V (ESI) operados en modo de MRM positivo. Los ejemplos de iones que se pueden monitorear para la cuantificación de serina y pantotenato en modo de MRM positivo se enumeran en la Tabla 4. La cuantificación se realizó utilizando un análisis de regresión de mínimos cuadrados lineales ponderados generado a partir de estándares de calibración fortificados preparados inmediatamente antes de cada ciclo. En este ejemplo, se analizaron muestras de plasma de 64 personas y los niveles de analitos obtenidos mediante el método descrito se muestran en la Tabla 5.

Método 2 de LC-MS/MS de referencia: (2-HB, 3-HB, 4-MOP, LGPC y ácido oleico)

En otro ejemplo, se desarrolló un método que midió la cantidad de uno o más, dos o más, y hasta los cinco analitos seleccionados de 2-HB, 3-HB, 4-MOP, LGPC y ácido oleico, en una sola inyección con el espectrómetro de masas operado en modo de MRM positivo y modo de MRM negativo. Para este método, el calentador de la columna se ajustó a 60 °C, la fase móvil A era ácido fórmico al 0.0100 % en agua y la fase móvil B era acetonitrilo/metanol (1:1). La elución en gradiente lineal se llevó a cabo con una condición inicial de 5 % de fase móvil B. La fase móvil B se aumentó al 25 % a los 0.8 min, al 37 % a los 1.40 min, al 99 % a los 1.50 y 2.60 min, y luego al 0.5 % a los 2.70 min. El caudal fue de 550 μL/min. Se inyectó una única alícuota fija de 0.5 - 1.0 μL de la solución de extracción final en la columna de cromatografía para cada muestra. El eluyente de la columna de cromatografía se introdujo directa y automáticamente en la fuente de electroaspersión de un espectrómetro de masas. Se usó metanol para el lavado de las agujas. Se utilizaron espectrómetros de masas AB Sciex QTrap 5500 con fuente Turbo V (ESI) operados en modo de MRM negativo para 2-HB, 3-HB, 4-MOP y ácido oleico y en modo de MRM positivo para LGPC. En la Tabla 4 se enumeran ejemplos de iones que pueden monitorearse para la cuantificación de 2-HB, 3-HB, 4-MOP, ácido oleico y LGPC.

Método 3 de LC-MS/MS de referencia: (2-HB, 3-HB, 4-MOP, LGPC y ácido oleico)

Se desarrolló otro método para medir la cantidad de uno o más, dos o más y hasta los cinco analitos seleccionados de 2-HB, 3-HB, 4-MOP, LGPC y ácido oleico en una sola inyección con el espectrómetro de masas operado únicamente en modo de MRM negativo. Las muestras de plasma de 64 individuos se enriquecieron con estándares internos marcados isotópicamente y se sometieron a precipitación de proteínas con metanol. Después de la centrifugación, se inyectó una alícuota del sobrenadante en un sistema de LC/MS/MS Agilent 1290/AB Sciex QTrap 5500 equipado con una columna de fase inversa Cis y se operó en modo de MRM negativo. Las áreas de los picos de los respectivos iones de producto se midieron frente a las áreas de los picos de los respectivos iones de producto del estándar interno. Los ejemplos de iones que se pueden monitorear para la cuantificación de 2-HB, 3-HB, 4-MOP, ácido oleico y LGPC en modo de MRM negativo se enumeran en la Tabla 2. La cuantificación se realizó utilizando un análisis de regresión de mínimos cuadrados lineales ponderados generado a partir de estándares de calibración fortificados preparados inmediatamente antes de cada ciclo. Los niveles de analito obtenidos utilizando el método descrito se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Concentraciones de analitos medidas en plasma utilizando el Método 1 (serina, pantotenato) y el Método 3

2-HB 3-HB 4-MOP LGPC ácido oleico

continuación

Método 4 de LC-MS/MS: (2-HB, 3-HB, 4-MOP, LGPC, ácido oleico, serina y pantotenato)

En otro ejemplo, se desarrolló un método que midió la cantidad de uno o más, dos o más y hasta los siete analitos seleccionados de 2-HB, 3-HB, 4-MOP, LGPC, ácido oleico, serina, y pantotenato, en una sola inyección con el espectrómetro de masas operado en modo de MRM negativo. Se prepararon muestras de plasma de 73 individuos y muestras de suero de 30 individuos y se sometieron a cromatografía líquida de fase inversa como se describió anteriormente en los Métodos generales. El método de cromatografía de fase inversa descrito separó una pluralidad de hasta siete analitos con buenas formas de pico. Los picos de los siete analitos se muestran en la Figura 8A, y los picos de los estándares internos correspondientes se muestran en la Figura 8B. El método descrito obtuvo la separación de los metabolitos 4-MOP y 3-MOP, como se muestra en la Figura 8A, con un tiempo de retención de 1.09 min para 4-MOP y 1.04 min para 3-MO^p . El tiempo de retención para el pico de interés de cada analito (y el estándar interno correspondiente) se indica con una estrella.

Se realizó MS/MS en las muestras separadas utilizando espectrómetros de masas AB Sciex QTrap 5500. Los instrumentos se operaron en modo de monitoreo de reacciones múltiples negativas (MRM), y el método se dividió en dos períodos, comenzando el segundo período en 1,33 min. El primer período detectó 2-HB, 3-HB, 4-MOP, serina y pantotenato, y el segundo período detectó ácido oleico y LGPC. Para ambos períodos, el voltaje de atomización de iones se fijó en -4.5 kV, la temperatura de la fuente en 550 °C, el gas de cortina en 30 y los caudales de gas del nebulizador y de desolvatación en 70, gas de disociación activado por colisión (CAD) en bajo. Los ajustes detallados de MS se describen en la Tabla 1. Se encontró que todos los analitos se ionizaban bien en modo negativo en condiciones de electroaspersión, lo cual era inesperado ya que la serina, LGPC y pantotenato normalmente se miden en condiciones de modo positivo. Los iones monitoreados para la cuantificación en este método son los iones hijo enumerados en la Tabla 2, excepto para el ácido oleico donde se monitoreó el ion padre. En la Tabla 2 (columna "Iones hijo adicionales") se enumeran de ejemplos de iones adicionales que pueden monitorearse para la cuantificación de 2-HB, 3-HB, 4-MOP, ácido oleico, LGPC, pantotenato y serina en modo de MRM negativo.

Los datos sin procesar se adquirieron y procesaron utilizando el software Analyst 1.6.2 (SciEx). Para la cuantificación, se ajustaron las proporciones del área de los picos del analito al estándar interno frente a las concentraciones de los estándares de calibración mediante regresión lineal de mínimos cuadrados ponderada (1/x2). La pendiente resultante y la intersección de la curva de calibración se usaron para calcular las concentraciones en muestras experimentales. Los iones padre e hijo para la cuantificación de analitos y los estándares internos correspondientes se muestran en la Tabla 2. El método de LC-MS/MS descrito en este ejemplo resultó en la cuantificación de una pluralidad de hasta siete analitos en una sola inyección con un tiempo del ciclo de 2.21 minutos. Los niveles de analitos obtenidos para las 30 muestras de suero utilizando el Método 4 de LC-MS/MS se muestran en la Tabla 6. Los niveles de analitos fueron similares para las muestras de plasma y suero.

Tabla 6. Concentraciones de analitos medidas muestras de suero

Validación analítica del método 4 de LC-MS/MS

El rendimiento analítico del método 4 de LC-MS/MS se validó en tres sistemas de LC-MS/MS idénticos usando muestras de plasma.

La precisión del método para medir una pluralidad de los siete analitos en una sola inyección se evaluó en tres niveles de QC (bajo, medio y alto) en muestras de plasma. La evaluación se realizó utilizando tres sistemas de instrumentos idénticos y la precisión obtenida para cada nivel de QC se determinó para cada instrumento individualmente y para los tres instrumentos en conjunto. Se analizaron cinco réplicas por nivel de QC en cada serie, con cinco series analizadas por instrumento. Se incluyeron un total de 25 réplicas por nivel de QC en los cálculos de CV entre ciclos para cada instrumento individual y las 75 réplicas incluidas por nivel de QC para los cálculos generales de CV entre ciclos. Para los cálculos de CV generales (los tres instrumentos), los CV entre ciclos fueron inferiores al 5.8 % en cada nivel de QC. Los resultados se presentan en la Tabla 7. Los CV entre ciclos para todos los analitos en cada instrumento fueron inferiores al 5.5 % para cada nivel de QC. Se observaron respuestas lineales (R2 >0.99) en un intervalo de 40 veces para 4-MOP, LGPC, ácido oleico y serina, y en un intervalo de 80 veces para 2-HB, 3-HB y pantotenato. Los intervalos de calibración se seleccionaron con base en los análisis de más de 2500 muestras individuales.

Tabla 7. Precisión entre ciclos para una pluralidad de analitos en tres sistemas de LC/MS.

Se evaluaron la exactitud y la precisión en el LLOQ en los tres sistemas de instrumentos de LC/MS. La relación señalruido para cada analito fue superior a 5:1. Se analizaron cinco réplicas de las muestras de LLOQ (preparadas en solución de BSA libre de ácidos grasos) en cada ciclo, con cinco ciclos analizados por instrumento. Se incluyeron un total de 25 réplicas del LLOQ en los cálculos entre ciclos por instrumento, con 75 réplicas incluidas en los datos combinados del instrumento. Todas las imprecisiones intra y entre ciclos fueron inferiores al 16 % y los CV inferiores al 9.9 %; los datos se muestran en la Tabla 8. Estos resultados indicaron que la cuantificación de la pluralidad de analitos en el límite inferior fue muy exacta y precisa.

Tabla 8. Exactitud^ recisión intra entre ciclos en el LLOQ.

continuación

Para evaluar la recuperación de analitos durante la extracción, las muestras de QC de plasma se reforzaron con concentraciones conocidas de analitos. Se extrajeron y analizaron seis réplicas de las muestras de QC de plasma enriquecido junto con las muestras de QC de plasma regulares. La recuperación de la cantidad enriquecida se calculó después de restar la cantidad en las muestras regulares de QC. Se determinó que las recuperaciones eran del 96.3 al 103% para los siete analitos. Los datos se presentan en la Tabla 9.

Para evaluar la interferencia del tipo de muestra en la cuantificación de los analitos, se realizó un experimento de infusión posterior a la columna con una solución estándar interna simultáneamente con el análisis de diez muestras de plasma extraídas sin estándares internos. La supresión o mejora de la señal del estándar interno en el tiempo de retención de los analitos se evaluó comparándolo con un extracto de agua como blanco. Tres de los analitos, ácido oleico, LGPC y serina, demostraron interferencia con la señal del estándar interno. Los analitos LGPC y ácido oleico mostraron una modesta supresión de la señal en las diez muestras de plasma. Dado que los estándares internos que eluyen conjuntamente en este ensayo están marcados isotópicamente, cualquier efecto de tipo de muestra leve debería ocurrir de manera similar para el analito y el estándar interno. Al utilizar la relación del área del pico del analito con respecto al estándar interno para la cuantificación, el efecto del tipo de muestra se compensa en el cálculo final.

Sin embargo, debido a su polaridad, la serina eluyó conjuntamente con los compuestos en la muestra que no fueron retenidos por la columna de fase inversa (es decir, el frente del solvente) y mostró una supresión de señal significativa. Aunque el estándar interno marcado con isótopos debe rastrear la serina para la ionización, la cuantificación aún puede verse afectada por la posible interferencia de elución conjunta.

Se realizaron experimentos adicionales para abordar la precisión de la cuantificación de serina cuando se utiliza un método de múltiples analitos. Se utilizó un método desarrollado y validado para la cuantificación de serina sola en combinación con los métodos MS/MS de cromatografía líquida de fase inversa para la medición de una pluralidad de analitos (método para múltiples analitos).

Se analizó un total de 318 muestras de plasma de pacientes en cinco lotes utilizando el método de PFPA solo para serina (PFPA solo para serina, Método 1 de LC-Ms /MS) y el método para múltiples analitos. Los resultados se compararon usando diagramas de Bland-Altman como se muestra en la Figura 9. El eje x muestra la concentración de serina cuando se mide usando el método de PFPA para serina. El eje Y muestra la diferencia porcentual entre el método para múltiples analitos y el método de PFPA para serina, calculado como (100*(método para múltiples analitos - PFPA para serina) / PFPA para serina). Para más del 99 % de las muestras, la diferencia en la cuantificación de serina entre el método de PFP^a para serina y el método para múltiples analitos fue inferior al 14 %, y ninguna muestra tuvo una diferencia de cuantificación de serina superior al 22 %.

Tabla 10. Se muestran combinaciones de 2 3 4 5 6 analitos.

continuación

continuación

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar en una muestra, por espectrometría de masas, la cantidad de dos o más analitos seleccionados del grupo que consiste en alfa-hidroxibutirato (2-HB), linoleoilLPC (LGPC), ácido oleico, 3-hidroxibutirato (3- HB), 4-metil-2-oxopentanoato (4-MOP) y serina comprendiendo el método:

a) someter la muestra a una fuente de ionización en condiciones adecuadas para producir uno o más iones detectables por espectrometría de masas a partir de cada uno de los dos o más analitos, en el que los analitos no se derivatizan antes de la ionización;

b) medir, por espectrometría de masas, la cantidad de uno o más iones de cada uno de los dos o más analitos; y c) usar la cantidad medida de uno o más iones para determinar la cantidad de cada uno de los dos o más analitos en la muestra;

en el que al menos uno de los dos o más analitos se selecciona del grupo que consiste en 2-HB, LGPC, 3-HB, 4-MOP y ácido oleico y el segundo de los dos o más analitos es serina; y

en el que la cantidad de cada uno de los dos o más analitos se determina en una sola inyección y en el que el espectrómetro de masas funciona en modo negativo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que se determina la cantidad de alfa-hidroxibutirato (2-HB, AHB), linoleoil LPC (LGPC), ácido oleico, 3-hidroxibutirato (3-HB), 4-metil-2-oxopentanoato (4-MOP), pantotenato y serina.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra ha sido purificada por cromatografía líquida antes de ser sometida a una fuente de ionización.

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicha cromatografía líquida se selecciona del grupo que consiste en cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía líquida de ultra alta resolución y cromatografía líquida de flujo turbulento.

5. El método de la reivindicación 1, en el que se utiliza un estándar interno para determinar la cantidad de los dos o más analitos en la muestra.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el estándar interno comprende un análogo marcado isotópicamente de al menos uno de los dos o más analitos a medir.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el estándar interno comprende 2-HB-d³ , 3-HB-d⁴ , 4-MOP-d³ , serina-ds, pantotenato-¹²³C³-¹⁵N, ácido oleico-¹³C¹⁸ o LGPC-d^g .

8. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra comprende una muestra biológica.

9. El método de la reivindicación 8, en el que la muestra se selecciona del grupo que consiste en sangre, plasma y suero.

10. El método de la reivindicación 1, en el que uno de los dos o más analitos es 2-HB y el segundo de los dos o más analitos es serina.

11. El método de la reivindicación 1, en el que uno de los dos o más analitos es LGPC y el segundo de los dos o más analitos es serina.

12. El método de la reivindicación 1, en el que el tiempo del ciclo es inferior a 3 minutos.

13. El método de la reivindicación 1, en el que los dos o más analitos comprenden además pantotenato.