CN111579703A - 基于lc-ms/ms对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法 - Google Patents
基于lc-ms/ms对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于高效液相色谱‑串联质谱(LC‑MS/MS)测定生物样本中三种胆红素氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid含量的方法。本发明利用高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用技术检测样品中胆红素氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid含量。样品经去蛋白处理，用LC‑MS/MS仪器MRM模式分析，外标法定量。本发明的方法具有简单快速、检测限低、稳定性好、检测灵敏度高和重复性好的优势，用于生物样本中胆红素的氧化产物的测定，能够满足生物样本中目标物的检测要求，具有高灵敏度和高选择性，抗干扰能力强，可以成为胆红素氧化产物定性定量分析的有效工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物样本的检测分析方法，特别是涉及一种脑脊液中胆红素的降解产物的检测分析方法，应用于生物样品目标化合物检测技术领域。
背景技术
脑卒中也称中风，是一种急性脑血管疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率的特点。脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中出血性脑卒中是大脑动脉血管破裂出血造成的，血液溢入脑组织，导致脑组织受损，从而产生大脑局部功能障碍。蛛网膜下腔出血是出血性脑卒中的一种，其病死率高于脑卒中的平均死亡率。
研究表明，蛛网膜下腔出血后的红细胞裂解是影响患者康复的主要原因。血液中的红细胞裂解释放血红蛋白，血红蛋白中的血红素进一步降解为胆绿素，胆绿素在胆绿素还原酶的作用下还原为胆红素。胆红素作为一种还原剂，可清除活性氧，由于其具有抗氧化性，可作为细胞发生氧化应激时的保护剂。研究表明，大脑出血会引起强烈的氧化应激，释放活性氧，胆红素作为还原剂，在遇到H2O2后氧化为小分子化合物，其中BOX A
(2-(3-ethenyl-1,5-dihydro-4-methyl-5-oxo-2H-pyrrol-2-ylidene)acetamide，bilirubin oxidizedA，CAS#329314-76-3)、BOX B
(2-(4-ethenyl-1,5-dihydro-3-methyl-5-oxo-2H-pyrrol-2-ylidene)acetamide，bilirubin oxidizedB，CAS#329314-75-2)和hematinic acid(2,5-dihydro-4-methyl-2,5-dioxo-1H-pyrrole-3-propanoic acid，CAS#487-65-0)是已报道的H2O2氧化下胆红素的降解产物。经实验验证，BOXA和BOX B可引起大鼠脑血管严重且持久的血管痉挛，具有重要的生理意义；hematinic acid是最早报道的胆红素氧化产物，至今还没有关于该化合物的生物学研究。而要研究胆红素氧化产物对脑出血并发症的贡献，最直接有效的方法是检测临床样本中各化合物的浓度，并评估各化合物浓度与疾病的关系。但到目前为止，依然缺少高灵敏度和高选择性的检测方法。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，通过使用液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪，建立胆红素氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid三个化合物的定性与定量方法，利用三种化合物的标准品进行仪器分析方法优化，包括液相色谱条件、质谱检测条件及质谱参数优化，达到测定三种化合物准确、快速、灵敏度高的检测要求。
为达到上述发明创造目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，检测分析步骤包括选取液相条件、设定质谱条件、制备标准溶液、优化分析方法、绘制标准曲线、样品前处理和脑脊液中产物的定性定量检测；通过所述检测分析方法，对脑脊液中BOX A、BOX B和hematinic acid三个化合物进行快速准确测定，同时，所述检测分析方法还用于测量细胞裂解液和血液样本信息。
作为本发明优选的技术方案，一种基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，包括如下步骤：
S1：选取液相色谱柱并设定质谱条件和参数：
a.设置高效液相色谱条件：
色谱柱：Agilent Poroshell EC-C18色谱柱，2.1×100mm，2.7μm；柱温：30℃；设定流动相及流动相梯度，其中，水相A：水和0.1％(v/v)甲酸，有机相B：甲醇和0.1％(v/v)甲酸、甲醇、乙腈或乙腈和0.1％(v/v)甲酸，流速为0.3mL/min，设置LC-MS/MS进样体积1-20μL；
b.设置质谱条件：
选择电喷雾离子源(ESI)，根据化合物的响应，选择合适的离子扫描模式；
c.设定质谱定性定量检测模式：
多反应监测方法(MRM)，设定多反应监测模式参数；
S2：制备标准溶液：
a.分别称取2mg的BOX A、BOX B和hematinic acid溶于1.1mL水中，制得10mM母液；
b.用水稀释，配制成摩尔浓度为500μM的hematinic acid溶液、分别为10μM的BOXA和BOX B，避光储存于4℃冰箱中，备用；
S3：使用标准溶液进行仪器分析方法优化，获得优化后的LC-MS/MS定量分析方法，其中，所述仪器为液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪；
S4：绘制标准曲线：
将在所述S2步骤中配制好的hematinic acid标准母液按比例稀释后配成摩尔浓度分别为1、5、10、50、100、150、200μM的hematinic acid标准溶液，分别将BOX A和BOX B标准母液按比例稀释成摩尔浓度为5、10、50、100、200、400、600、800、1000nM的BOX A和BOX B标准溶液，进样体积1μL；以峰面积对目标物的摩尔量绘制标准曲线，其中峰面积对应纵坐标y参数，目标物的摩尔量对应横坐标x参数；
S5：样品前处理：
将脑脊液样品加入9倍体积的冰乙醇，于冰上放置30-60min，在15000rpm下离心处理15-45min，取上清液；将上清液用离心浓缩仪浓缩干，重溶；过0.22μm滤膜，对滤液进行上机测试；
S6：外标法定量：
通过在所述步骤S5对样品进行前处理后，根据绘制的色谱图，计算出脑脊液中各化合物的峰面积，并通过在步骤S4中得到所述标准曲线计算出样品溶液中BOX A、BOX B和hematinic acid的浓度，BOX A和BOX B在5-1000fmol范围内，hematinic acid在1-200pmol范围内的线性关系，并计算仪器的计算仪器的方法检出限(LOD)、定量检测限(LOQ)和检测重复性信息，同时计算日内和日间精密度。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤S1的步骤a中，选用的LC-MS/MS仪器为Agilent1290高效液相色谱系统和AB SCIEX 4500三重四级杆质谱系统。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤S1的步骤b中，设置质谱条件如下：
选择电喷雾离子源(ESI)，并根据离子响应，BOX A和BOX B为正离子模式扫描，hematinic acid为负离子模式扫描，采用半自动进样方式，以7-20μL/min的流速将300μg/L的标准储备液分别注入离子源，选取对应的母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，建立MRM扫描方法及参数。
作为本发明优选的技术方案，直接注入离子源的标准储备液用50％(v/v)甲醇和50％(v/v)水混合溶剂配制。
作为本发明优选的技术方案，基于LC-MS/MS对脑脊液中胆红素的降解产物的检测分析方法，建立MRM扫描方法及参数时，设置各化合物监测离子参数包括母离子、子离子、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)。
作为本发明优选的技术方案，在所述步骤S1的步骤c中，所述LC-MS/MS的MRM检测模式分析的其他条件为：离子源温度500℃，离子喷雾电压5500V，碰撞气medium，接口加热on，碰撞室入口电压(EP)10V，碰撞室出口电压(CXP)11V，气帘气压力40psi，喷雾气压力50psi，辅助加热气压力50psi。
作为本发明优选的技术方案，在所述S5步骤中，离心处理时间为20-60min。
作为本发明优选的技术方案，在所述S6步骤中，以信噪比S/N＝3计算仪器的检出限(LOD)，以S/N＝10作为仪器的定量检测限(LOQ)，以标准品峰面积的RSD％表示检测重复性。
进一步地，所述步骤S3中仪器分析方法优化包括液相色谱条件优化、质谱检测条件及质谱参数优化，使得质谱能够准确定性，且定量灵敏度达到最优。
进一步地，在上述步骤S5中处理的脑脊液的量不限制，重溶体积不限制。
进一步地，在上述步骤S5中处理的生物样品除脑脊液外，还可以为其他生物样品。
进一步地，在上述步骤S6的的日内和日间精密度以1μM的BOX A和BOX B溶液，以及200μM的hematinic acid溶液连续测定3天，每天测定3次得到。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明通过利用三种化合物的标准品进行仪器分析方法优化，包括液相色谱条件优化、质谱检测条件及质谱参数优化，使得质谱能够准确定性，定量灵敏度达到最优；
2.本发明采用LC-MS/MS，使用高效液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪，建立了胆红素的三种氧化产物在脑脊液中的定性和定量方法，该方法具有简单快速、样品量少、检测限低、重复性好且灵敏度高的优势；
3.本发明方法简单易行，成本低，适合推广使用。
附图说明
图1是本发明实施例二的hematinic acid标准溶液的色谱图。
图2是本发明实施例二的BOX A标准溶液的色谱图。
图3是本发明实施例二的BOX B标准溶液的色谱图。
图4是本发明实施例二的脑脊液中负离子模式检测的色谱图(测到hematinicacid)。
图5是本发明实施例二的脑脊液中正离子模式检测的色谱图(测到BOX A和BOXB)。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域内用此方法检测脑脊液、血液和其他生物样品中的BOX A、BOX B和hemanitic acid都属于本发明保护的范围。
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
实施例一：
在本实施例中，一种基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于，检测分析步骤包括选取液相条件、设定质谱条件、制备标准溶液、优化分析方法、绘制标准曲线、样品前处理和脑脊液中产物的定性定量检测；通过所述检测分析方法，对脑脊液中BOX A、BOX B和hematinic acid三个化合物进行快速准确测定，同时，所述检测分析方法还用于测量细胞裂解液和血液样本信息。
本实施例方法利用LC-MS/MS，建立一种测定脑脊液中BOX A、BOX B和hemaniticacid含量的方法。LC-MS/MS具有高灵敏度和高选择性，抗干扰能力强，可以成为胆红素氧化产物定性定量分析的有效工具。
实施例二：
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，仪器选用Agilent 1290高效液相色谱系统和AB SCIEX 4500三重四级杆质谱系统。一种基于LC-MS/MS对脑脊液中胆红素的降解产物的检测分析方法，包括如下步骤：
S1：选取液相色谱柱并设定质谱条件和参数：
a.设置高效液相色谱条件：
色谱柱：Agilent Poroshell EC-C18色谱柱，2.1×100mm，2.7μm；柱温：30℃；设定流动相及流动相梯度，其中，水相A：水和0.1％(v/v)甲酸，有机相B：甲醇和0.1％(v/v)甲酸，流速为0.3mL/min，设置LC-MS/MS进样体积1-20μL；
表1流动相梯度参数
b.设置质谱条件，设定质谱定性定量检测模式：
选择电喷雾离子源(ESI)，根据化合物的响应，选择合适的离子扫描模式；采用多反应监测方法(MRM)，设定多反应监测模式参数；具体如下：
选择电喷雾离子源，BOX A和BOX B为正离子模式扫描，hematinic acid为负离子模式扫描，采用半自动进样方式，以7μL/min的流速将300μg/L的标准储备液分别注入离子源；选取对应的母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，建立三个化合物的MRM质谱检测方法；
表2三个化合物的MRM质谱检测参数
在上述方案中所述质谱分析过程中，离子源温度为500℃，离子喷雾电压5500V，碰撞气medium，接口加热on，EP为10V，CXP为11V，气帘气压力40psi，喷雾气压力50psi，辅助加热气压力50psi；
S2：制备标准溶液：
a.分别称取2mg的BOX A、BOX B和hematinic acid溶于1.1mL水中，制得10mM母液；
b.用水稀释，配制成摩尔浓度为500μM的hematinic acid溶液、分别为10μM的BOXA和BOX B，避光储存于4℃冰箱中，备用；
S3：使用标准溶液进行仪器分析方法优化，获得优化后的LC-MS/MS定量分析方法，其中，所述仪器为液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪；
S4：绘制标准曲线：
将在所述S2步骤中配制好的hematinic acid标准母液按比例稀释后配成摩尔浓度分别为1、5、10、50、100、150、200μM的hematinic acid标准溶液，分别将BOX A和BOX B标准母液按比例稀释成摩尔浓度为5、10、50、100、200、400、600、800、1000nM的BOX A和BOX B标准溶液，进样体积1μL；以峰面积对目标物的摩尔量绘制标准曲线，其中峰面积对应纵坐标y参数，目标物的摩尔量对应横坐标x参数；得到的标准曲线如表3中结果所示。
表3三种化合物的LC-MS/MS定量分析方法结果
S5：样品前处理：
取6个脑脊液样品各5mL，分别加入9倍体积的冰冷的乙醇，于冰上放置30min，15000rpm离心30min，取上清液，离心浓缩至5mL，发现还有蛋白存在，再加入9倍体积的冰乙醇，于冰上放置40min，15000rpm离心30min，取上清液，离心浓缩干，加入50μL水重溶，待LC-MS/MS测定；
S6：外标法定量：
通过在所述步骤S5对样品进行前处理后，根据绘制的色谱图，计算出脑脊液中各化合物的峰面积，并通过在步骤S4中得到所述标准曲线计算出样品溶液中BOX A、BOX B和hematinic acid的浓度，以在LC-MS/MS仪器上建立的BOX A、BOX B和hematinic acid的MRM检测方法，检测6个样品。得到的峰面积以相应的工作曲线折算，再乘以浓缩的倍数(100倍)，得到6个样品中各化合物的浓度；其中一个样品的LC-MS/MS图谱如图4与图5所示；6个样品的检测结果汇总如表4；
表4脑脊液中测得各产物的浓度
实验测试分析：
对本实施例方法的技术效果节能型测试分析，图1是本发明实施例二的hematinicacid标准溶液的色谱图。图2是本发明实施例二的BOX A标准溶液的色谱图。图3是本发明实施例二的BOX B标准溶液的色谱图。实验验证具体如下：
1.流动相的选择：为优化流动相条件，本实验中BOX A和BOX B采用ESI+模式，hematinic acid采用ESI-模式，分别用乙腈-水、乙腈(含0.1％甲酸)-水(含0.1％甲酸)、甲醇-水、甲醇(含0.1％甲酸)-水(含0.1％甲酸)作为流动相，对BOX A、BOX B和hematinicacid的分离效果进行比较，结果发现以甲醇-水为流动相时目标物峰的质谱响应和分离度比乙腈-水溶液更好，而添加甲酸可维持峰的稳定，也可维持pH稳定，有助于延长色谱柱的寿命，因此选择甲醇(含0.1％甲酸)-水(含0.1％甲酸)为流动相。
2.洗脱程序的选择：比较了不同起始浓度，不同斜率的洗脱程序，最后选择表1所示洗脱程序。
本实施例方法利用高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术检测样品中胆红素氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid含量。样品经去蛋白处理，用LC-MS/MS仪器MRM模式分析，外标法定量。本发明的方法具有简单快速、检测限低、稳定性好、检测灵敏度高和重复性好的优势，用于脑脊液中胆红素的氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid的测定，能够满足脑脊液中目标物的检测要求。本实施例利用LC-MS/MS，建立一种测定脑脊液中BOX A、BOX B和hemanitic acid含量的方法。LC-MS/MS具有高灵敏度和高选择性，抗干扰能力强，可以成为胆红素氧化产物定性定量分析的有效工具。
实施例三：
基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，除用于脑脊液检测外，还可以检测血液和细胞裂解液等其他生物样本中BOX A、BOX B和hematinic acid的浓度。
胆红素氧化产物能引起脑血管痉挛，表明其可能具有生理毒性。血液中存在大量的红细胞，受到氧化应激时可能产生BOX A、BOX B和hematinic acid，在血液中含量过高时可能会引起其他疾病。
用此检测方法检测血液样品中各化合物浓度，具体包括以下步骤：
S1：选取液相色谱柱并设定质谱条件、参数：
a.高效液相色谱条件：色谱柱：Agilent Poroshell EC-C18色谱柱，2.1×100mm，2.7μm；柱温：30℃；设定流动相及流动相梯度，其中，水相A：水和0.1％(v/v)甲酸、有机相B：甲醇和0.1％(v/v)甲酸，流速为0.3mL/min；
b.质谱条件：选择电喷雾离子源，BOX A和BOX B为正离子模式扫描，hematinicacid为负离子模式扫描，采用半自动进样方式，以7μL/min的流速将300μg/L的标准储备液分别注入离子源；选取对应的母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息；
c.设定质谱定性定量检测模式：MRM模式，设定参数：离子源温度为500℃，离子喷雾电压5500V，碰撞气medium，接口加热on，EP为10V，CXP为11V，气帘气压力40psi，喷雾气压力50psi，辅助加热气压力50psi；
S2：制备标准溶液：
a.分别称取2mg的BOX A、BOX B和hematinic acid溶于1.1mL水中，制得10mM母液；
b.用水稀释，配制成摩尔浓度为500μM(91.5μg/mL)的hematinic acid溶液、10μM(1.79μg/mL)BOX A和BOX B，避光储存于4℃冰箱中备用；
S3：使用标准溶液进行仪器分析方法优化，获得优化后的LC-MS/MS定量分析方法，其中，所述仪器为液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪；
S4：绘制标准曲线：
将S2中hematinic acid标准母液按比例稀释后配成摩尔浓度为1、5、10、50、100、150、200μM的hematinic acid标准溶液，分别将BOX A和BOX B标准母液按比例稀释成摩尔浓度为5、10、50、100、200、400、600、800、1000nM的BOX A和BOX B标准溶液，进样体积1μL；
以峰面积(y)对目标物的摩尔量(x)绘制标准曲线；
S5：样品前处理：
将新鲜的4mL血样取血清后，加入9倍体积冰冷的乙醇，于冰上放置30min，15000rpm离心30min，取上清液，重复此步骤，直到上清液中没有蛋白沉淀；
将上清液用离心浓缩仪浓缩干，以40μL水重溶；
过0.22μm滤膜，对滤液进行上机测试；
S6：外标法定量：通过步骤S5分析后，根据绘制的色谱图计算出血清中各化合物的峰面积，并通过步骤S4所述的标准曲线计算出样品溶液中的BOX A、BOX B和hematinicacid的浓度，BOX A和BOX B在5-1000fmol范围内，hematinic acid在1-200pmol范围内呈良好的线性关系，以信噪比S/N＝3计算仪器的LOD，以信噪比S/N＝10计算仪器的LOQ，同时用1μM的BOX A和BOX B溶液，200μM hematinic acid溶液连续测定3天，每天测定3次得到日内和日间精密度。
本实施例方法基于高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定生物样本中三种胆红素氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid含量的方法。本发明利用高效液相色谱-三重四级杆质谱联用技术检测样品中胆红素氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid含量。样品经去蛋白处理，用LC-MS/MS仪器MRM模式分析，外标法定量。本实施例方法具有简单快速、检测限低、稳定性好、检测灵敏度高和重复性好的优势，用于生物样本中胆红素的氧化产物BOX A、BOX B和hematinic acid的测定，能够满足脑脊液中目标物的检测要求。
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于，检测分析步骤包括选取液相条件、设定质谱条件、制备标准溶液、优化分析方法、绘制标准曲线、样品前处理和脑脊液中产物的定性定量检测；通过所述检测分析方法，对脑脊液中BOX A、BOX B和hematinic acid三个化合物进行快速准确测定，同时，所述检测分析方法还用于测量细胞裂解液和血液样本信息。
2.根据权利要求1所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：选取液相色谱柱并设定质谱条件和参数：
a.设置高效液相色谱条件：
色谱柱：Agilent Poroshell EC-C18色谱柱，2.1×100mm,2.7μm；柱温：30℃；设定流动相及流动相梯度，其中，水相A：水和0.1％(v/v)甲酸，有机相B：甲醇和0.1％(v/v)甲酸、甲醇、乙腈或乙腈和0.1％(v/v)甲酸，流速为0.3mL/min，设置LC-MS/MS进样体积1-20μL；
b.设置质谱条件：
选择电喷雾离子源(ESI)，根据化合物的响应，选择合适的离子扫描模式；
c.设定质谱定性定量检测模式：
多反应监测方法(MRM)，设定多反应监测模式参数；
S2：制备标准溶液：
a.分别称取2mg的BOX A、BOX B和hematinic acid溶于1.1mL水中，制得10mM母液；
b.用水稀释，配制成摩尔浓度为500μM的hematinic acid溶液、分别为10μM的BOX A和BOX B，避光储存于4℃冰箱中，备用；
S3：使用标准溶液进行仪器分析方法优化，获得优化后的LC-MS/MS定量分析方法，其中，所述仪器为液相色谱-串联三重四极杆质谱联用仪；
S4：绘制标准曲线：
将在所述S2步骤中配制好的hematinic acid标准母液按比例稀释后配成摩尔浓度分别为1、5、10、50、100、150、200μM的hematinic acid标准溶液，分别将BOX A和BOX B标准母液按比例稀释成摩尔浓度为5、10、50、100、200、400、600、800、1000nM的BOX A和BOX B标准溶液，进样体积1μL；以峰面积对目标物的摩尔量绘制标准曲线，其中峰面积对应纵坐标y参数，目标物的摩尔量对应横坐标x参数；
S5：样品前处理：
将脑脊液样品加入9倍体积的冰乙醇，于冰上放置30-60min，在15000rpm下离心处理15-45min，取上清液；将上清液用离心浓缩仪浓缩干，重溶；过0.22μm滤膜，对滤液进行上机测试；
S6：外标法定量：
通过在所述步骤S5对样品进行前处理后，根据绘制的色谱图，计算出脑脊液中各化合物的峰面积，并通过在步骤S4中得到所述标准曲线计算出样品溶液中BOX A、BOX B和hematinic acid的浓度，BOX A和BOX B在5-1000fmol范围内，hematinic acid在1-200pmol范围内的线性关系，并计算仪器的计算仪器的方法检出限(LOD)、定量检测限(LOQ)和检测重复性信息，同时计算日内和日间精密度。
3.根据权利要求2所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于：在所述步骤S1的步骤a中，选用的LC-MS/MS仪器为Agilent 1290高效液相色谱系统和AB SCIEX 4500三重四级杆质谱系统。
4.根据权利要求2所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于：在所述步骤S1的步骤b中，设置质谱条件如下：
选择电喷雾离子源(ESI)，并根据离子响应，BOX A和BOX B为正离子模式扫描，hematinic acid为负离子模式扫描，采用半自动进样方式，以7-20μL/min的流速将300μg/L的标准储备液分别注入离子源，选取对应的母离子峰，对其子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，建立MRM扫描方法及参数。
5.根据权利要求4所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于：直接注入离子源的标准储备液用50％(v/v)甲醇和50％(v/v)水混合溶剂配制。
6.根据权利要求4所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于：建立MRM扫描方法及参数时，设置各化合物监测离子参数包括母离子、子离子、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)。
7.根据权利要求2所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于，在所述步骤S1的步骤c中，所述LC-MS/MS的MRM检测模式分析的其他条件为：离子源温度500℃，离子喷雾电压5500V，碰撞气medium，接口加热on，碰撞室入口电压(EP)10V，碰撞室出口电压(CXP)11V，气帘气压力40psi，喷雾气压力50psi，辅助加热气压力50psi。
8.根据权利要求2所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于，在所述S5步骤中，离心处理时间为20-60min。
9.根据权利要求2所述基于LC-MS/MS对生物样本中胆红素的降解产物的检测分析方法，其特征在于，在所述S6步骤中，以信噪比S/N＝3计算仪器的检出限(LOD)，以S/N＝10作为仪器的定量检测限(LOQ)，以标准品峰面积的RSD％表示检测重复性。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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