CN110907569A - 一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，包括血液样品的预处理，将处理后的待测样品进行超高效液相色谱‑串联质谱检测；所述血液样品的预处理的过程为：将血液样品与沉淀剂混合后，离心分离，将向分离后的上清液加入含有甲酸的水中混合均匀获得待测样品，所述沉淀剂为乙腈与乙醇的混合液，乙腈与乙醇的体积比为2:0.9～1.1；所述4种蛋白结合尿毒症毒素为CMPF、IS、PCS和HA。本发明能够降低检测4种蛋白结合尿毒症毒素检测的时间。

Description

一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法

技术领域

本发明属于蛋白结合尿毒症毒素检测技术领域，涉及一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

蛋白结合尿毒症毒素(protein-bound uremic toxins，PBUT)是尿毒症毒素中重要的一类物质，主要由肠道细菌分解氨基酸生成，由肾脏近端肾小管上皮细胞基底侧膜的有机阴离子通道分泌进入肾小管，最终随尿液排出体外，因此正常人群中血清蛋白结合尿毒症毒素浓度维持在较低的水平。而慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者随着肾功能进展，PBUT在体内的血清浓度逐渐升高，至CKD5期达到高峰，并且由于竞争白蛋白结合位点，这些毒素的游离浓度在血浆中增加，从而导致机体各个器官的损害，引发诸多疾病。研究表明蛋白结合尿毒症毒素水平对慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)和其多种并发症是一个有价值的诊断指标，尤其与CKD患者死亡的首要原因心血管事件(cadiovascular disease，CVD)密切相关。因此，为实现临床4种蛋白结合尿毒症毒素含量的监测管理，从而为肾脏疾病及其心血管并发症等相关疾病的诊断及为临床优化患者治疗方案等，建立一种快速同时检测四种蛋白结合尿毒症毒素的方法具有重要的意义。

蛋白结合尿毒症毒素(protein-bound uremic toxins，PBUT)是尿毒症毒素中重要的一类物质，其本身均为小分子物质(分子量＜500Da)，人体内该类物质易与人血清蛋白(human serum albumin，HAS)结合，形成中大分子，根据其与白蛋白结合的亲和力分为三类，即高蛋白结合力、中蛋白结合力及低蛋白结合力三种类型，本方法中的3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(3-carboxy-4-methyl-5-propyl-2-furan-propionic acid，CMPF)、硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate，IS)和硫酸对甲酚(p-cresyl sulfate，PCS)、马尿酸(hippuric acid，HA)为这三类蛋白结合类毒素的典型代表。

当前国内外所报道的蛋白结合尿毒症毒素检测方法多数采用酶联免疫吸附法(ELISA)、化学免疫法发光法、高效液相色谱法(HPLC)和超高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)等。免疫法检测种类比较单一，且检测时所用抗体，也可识别其他蛋白结合尿毒症毒素衍生物，抗体抗原反应通常不足100％，因此结果差异较大，特异性较差，应用于临床检测可靠性不高。液相色谱法由于检出限有限，血浆/血清成分复杂，在进行定量分析时，杂志严重影响检测结果的准确性，不适宜在临床普及。

超高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)能够避免上述缺陷，然而，本发明的发明人经过研究发现，目前采用HPLC-MS/MS检测多种蛋白结合尿毒症毒素检测的时间较长。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，能够降低检测4种蛋白结合尿毒症毒素检测的时间。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，包括血液样品的预处理，将处理后的待测样品进行超高效液相色谱-串联质谱检测；

所述血液样品的预处理的过程为：将血液样品与沉淀剂混合后，离心分离，将向分离后的上清液加入含有甲酸的水中混合均匀获得待测样品，所述沉淀剂为乙腈与乙醇的混合液，乙腈与乙醇的体积比为2:0.9～1.1；

所述4种蛋白结合尿毒症毒素为3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)、硫酸吲哚酚(IS)、硫酸对甲酚(PCS)和马尿酸(HA)。

本发明通过实验发现，当采用乙腈与乙醇的体积比为2:0.9～1.1作为沉淀剂处理血液样品时，能够加快检测这4种蛋白结合尿毒症毒素的速度，缩短检测这4种蛋白结合尿毒症毒素检测的时间。

本发明的有益效果为：

1.本发明通过对样本前处理方法和超高效液相色谱-质谱条件的优化，建立了一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，采用本发明可以同时检测人血清中4种蛋白结合尿毒症毒素：3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)、硫酸吲哚酚(IS)和硫酸对甲酚(PCS)和马尿酸(HA)的含量，并进行精确的定性分析和定量分析，是一种样本处理简单，通量高，结果可靠的检测方法。

2.本发明中的预处理过程中，通过加入沉淀剂(乙腈与乙醇的体积比为2:0.9～1.1)，相对于单纯用甲醇或乙腈作为沉淀剂，蛋白沉淀更为完全，有效去除杂质，降低基质效应，不仅提高了沉淀效率，而且大大缩短检测时间，达到6.5分钟内可快速灵敏检测出4种蛋白结合尿毒症毒素的含量。

3.本发明的预处理中，沉淀后，取上清加入含甲酸的水，进一步对样品进行稀释，有效去除基质干扰的同时进一步抑制离子化，使检测物质在分离过程中保持单一状态，利于分离。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明是实施例的3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)色谱图；

图2为本发明是实施例的硫酸吲哚酚(IS)色谱图；

图3为本发明是实施例的硫酸对甲酚(PCS)色谱图；

图4为本发明是实施例的马尿酸(HA)色谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于HPLC-MS/MS检测多种蛋白结合尿毒症毒素检测的时间较长的缺陷，本发明提出了一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，包括血液样品的预处理，将处理后的待测样品进行超高效液相色谱-串联质谱检测；

所述血液样品的预处理的过程为：将血液样品与沉淀剂混合后，离心分离，将向分离后的上清液加入含有甲酸的水中混合均匀获得待测样品，所述沉淀剂为乙腈与乙醇的混合液，乙腈与乙醇的体积比为2:0.9～1.1；

所述4种蛋白结合尿毒症毒素为3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸(CMPF)、硫酸吲哚酚(IS)、硫酸对甲酚(PCS)和马尿酸(HA)。

本发明通过实验发现，当采用乙腈与乙醇的体积比为2:0.9～1.1作为沉淀剂处理血液样品时，能够加快检测这4种蛋白结合尿毒症毒素的速度，缩短检测这4种蛋白结合尿毒症毒素检测的时间。

该实施方式的一种或多种实施例中，血液样品为血浆或血清。一般采用血清进行检测，检测结果更好。

该实施方式的一种或多种实施例中，血液样品与沉淀剂的体积比为1:1.9～2.1。

该实施方式的一种或多种实施例中，上清液与含有甲酸的水的体积比为1:0.9～1.1。

该实施方式的一种或多种实施例中，含有甲酸的水中，甲酸的体积百分数为0.049～0.051％。

该实施方式的一种或多种实施例中，超高效液相色谱-串联质谱检测中，标准工作液的配制过程为：采用体积分数为98±0.5％的乙腈水溶液配置蛋白结合尿毒症毒素标准品储备液，采用5％±0.2％m/v BSA(牛血清白蛋白)溶液进行稀释。

该实施方式的一种或多种实施例中，超高效液相色谱-串联质谱检测中，色谱条件为：流动相A为含甲酸的水，流动相B为含甲酸的乙腈。流动相中加入甲酸,有利于提高分离度，使各检测物能够较好的分离。

该系列实施例中，流动相A为含有体积分数为0.049～0.051％甲酸的水，流动相B为含有体积分数为0.049～0.051％甲酸的乙腈。

该系列实施例中，梯度洗脱条件：0-1.5min,1％流动相B；1.5-2.5min,30％-98％流动相B；2.5-5.0min,98％流动相B；5.0-6.5min,1％流动相B，流速为0.35～0.45mL/min；进样量1.5～2.5μL。

该实施方式的一种或多种实施例中，超高效液相色谱-串联质谱检测中，色谱柱为C18色谱柱，柱温为40～45℃。

该实施方式的一种或多种实施例中，超高效液相色谱-串联质谱检测中，质谱采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测。优于其他质谱条件。

该系列实施例中，质谱条件为：雾化气为30～32kPa，加热气为7.5～8.5kPa，喷雾电压为3490～3510V，去溶剂温度为290～310℃。

该系列实施例中，MRM质谱参数为：

本发明采用“双离子对”进行定性定量，避免了内源性物质的干扰与出现假阳性判定结果的可能性，灵敏度高、精密度高、特异性强，实现准确测定。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

(1)制备待侧样本

向血清样本中加入两倍体积的沉淀剂(乙腈：乙醇＝2：1)，振荡混匀后离心，取上清液至离心管中，加入相同体积的水(含体积分数为0.05％的甲酸)，振荡混匀，获得待测样本。

(2)标准工作液的配制

以体积分数98％的乙腈水溶液配置1mg/ml的各蛋白结合尿毒症毒素标准品储备液，然后用5％m/v BSA(牛血清白蛋白)溶液制备6个梯度(IS、PCS和HA:0.032、0.16、0.8、4、20、100ug/mL；CMPF：0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20ug/mL)的混合标准品溶液分装于1.5mL棕色瓶中。-20℃保存备用。

(3)超高效液相色谱-质谱检测

将待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱分离，液相色谱参考条件：

色谱柱C18色谱柱

柱温：40℃；

流速：0.4mL/min；

进样量2uL.

流动相A：含体积分数为0.05％甲酸的水，

流动相B：含体积分数为0.05％甲酸的乙腈；

梯度洗脱条件如表1所示

表1

时间	A相比例(100％)	B相比例(100％)
			0-1.5	99	1
1.5-2.5	70-2	30-98
			2.5-5	2	98
5-6.5	99	1
			stop

质谱参数参考条件：

负离子电喷雾离子化的多离子反应监测模式，

雾化气：31kPa,

加热气：8kPa，

喷雾电压：35000V

去溶剂温度：300℃

MRM质谱参数如表2所示。

表2

(3)计算结果

记录检测样品中各分析物及内标的色谱图和峰面积。通过计算样品中各蛋白结合尿毒症毒素与相应内标峰面积的比值，以校准品的靶值浓度为横坐标，以校准品峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线并拟合线性方程，将样品中各蛋白结合尿毒症毒素峰面积比代入标准曲线方程，计算出样品中相应蛋白结合尿毒症毒素浓度。

CMPF的色谱图如图1所示，利用本发明方法测定0.0064～20μg/ml CMPF的标准品建立标准曲线，在此范围内的线形关系良好，通过方程可知该样本CMPF的含量为5.04μg/ml。

IS的色谱图如图2所示，利用本发明方法测定0.032～100μg/ml IS的标准品建立标准曲线，在此范围内的线形关系良好，通过方程可知该样本IS的含量为42.19μg/ml。

PCS的色谱图如图3所示，利用本发明方法测定0.032～100μg/ml PCS的标准品建立标准曲线，在此范围内的线形关系良好，通过方程可知该样本PCS的含量为29.62μg/ml。

HA的色谱图如图4所示，利用本发明方法测定0.032～100μg/ml HA的标准品建立标准曲线，在此范围内的线形关系良好，通过方程可知该样本HA的含量为21.81μg/ml。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，其特征是，包括血液样品的预处理，将处理后的待测样品进行超高效液相色谱-串联质谱检测；

所述血液样品的预处理的过程为：将血液样品与沉淀剂混合后，离心分离，将向分离后的上清液加入含有甲酸的水中混合均匀获得待测样品，所述沉淀剂为乙腈与乙醇的混合液，乙腈与乙醇的体积比为2:0.9～1.1；

所述4种蛋白结合尿毒症毒素为3-羧基-4-甲基-5-丙基-2-呋喃丙酸、硫酸吲哚酚、硫酸对甲酚和马尿酸。

2.如权利要求1所述的同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，其特征是，血液样品为血浆或血清。

3.如权利要求1所述的同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，其特征是，血液样品与沉淀剂的体积比为1:1.9～2.1。

4.如权利要求1所述的同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，其特征是，上清液与含有甲酸的水的体积比为1:0.9～1.1。

5.如权利要求1所述的同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，其特征是，含有甲酸的水中，甲酸的体积百分数为0.049～0.051％。

6.如权利要求1所述的同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，其特征是，超高效液相色谱-串联质谱检测中，标准工作液的配制过程为：采用体积分数为98±0.5％的乙腈水溶液配置蛋白结合尿毒症毒素标准品储备液，采用5％±0.2％m/v BSA溶液进行稀释。

7.如权利要求1所述的同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，其特征是，超高效液相色谱-串联质谱检测中，色谱条件为：流动相A为含甲酸的水，流动相B为含甲酸的乙腈；

或，色谱柱为C18色谱柱，柱温为40～45℃。

8.如权利要求7所述的同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，其特征是，流动相A为含有体积分数为0.049～0.051％甲酸的水，流动相B为含有体积分数为0.049～0.051％甲酸的乙腈；

或，梯度洗脱条件：0-1.5min,1％流动相B；1.5-2.5min,30％-98％流动相B；2.5-5.0min,98％流动相B；5.0-6.5min,1％流动相B，流速为0.35～0.45mL/min；进样量1.5～2.5μL。

9.如权利要求1所述的同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，其特征是，超高效液相色谱-串联质谱检测中，质谱采用负离子电喷雾离子化的多离子反应监测。

10.如权利要求9所述的同时检测血液样品中4种蛋白结合尿毒症毒素的方法，其特征是，质谱条件为：雾化气为30～32kPa，加热气为7.5～8.5kPa，喷雾电压为3490～3510V，去溶剂温度为290～310℃；

或，MRM质谱参数为：

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