CN113049697A - 同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒 - Google Patents

同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒，包括样品前处理步骤和进样检测步骤，其中，样品前处理包括如下步骤：向血液样本中加入孵育缓冲液，孵育设定时间后，加入pH值调节剂，净化后，得处理液，将处理液氮气吹干，后采用流动相复溶，得待测液；所述pH值调节剂为甲酸、氨水或乙酸铵；采用液相色谱串联质谱方法进行检测。本发明方法的优化方向一方面在于，针对血管紧张素I的物理性质，优化前处理过程，采用10～100mM的乙酸铵为pH值调节剂，降低其在待测溶液中的质子化解离，提高其在SPE处理中的回收率，大大提高了物质的检测灵敏度；另一方面，经SPE提取后，增加氮吹操作，复溶后进行上样，对检测信号的提高。

Description

同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测血液样品中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
肾素即血管紧张素原酶，一种蛋白水解酶，其与血管紧张素、醛固酮协同调节人体血压平衡，属于强升压物质，最早见于兔肾脏提取物中。肾素来源于体内或体外低活性肾素原的转化，除了体内酶的作用外，在体外含酸(pH值<3)及低温(4℃左右)的条件下，肾素原也可以转化为活性肾素。
当血压降低时，肾脏分泌出肾素，在人体内具有活性的肾素可催化分布在血液中的血管紧张素原转化为血管紧张素(angiotensin I，Ang I)，而血液和肺组织中的血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)使Ang I降解为Ang II。Ang II可增加醛固酮的生成，同时Ang II也可以通过有效收缩血管，从而升高血压。
醛固酮(即ALD)是肾上腺皮质分泌出的盐皮质激素，主要的作用是保钠排钾，通过调节血容量维持体液水盐平衡。与醛固酮相关的原发性醛固酮增多症(primaryaldosteronism，PA)是因肾上腺皮质病变导致醛固酮分泌增多，肾素-血管紧张素(reninangiotensinsystem，RAS)系统受抑制，是继发性高血压的常见病因，占到10％左右，临床表现为高血压和/或低血钾。
综上，血浆肾素活性(即PRA)，可作为原发性或继发性高血压的诊疗指标，对辅助诊断PA、嗜铬细胞瘤等循环系统疾病及指导高血压用药具有重要意义。目前，PRA主要通过监测AngI的产生速率来进行监测，而PA的临床诊疗指南则指出，应将ALD与PRA的比值作为PA的初级筛查指标，国际上ARR常用切点为30(ng/dl)/(ng/ml.h)，之后的确诊试验结果，若血浆ALD<5ng/dl排除PA，ALD>11.45ng/dl确诊PA。作为一种可以被治愈的高血压，如果能得到准确诊断，那么就可以与原发性高血压区分开来，从而有效治疗治愈。
但是发明人发现，传统的血浆PRA测定(即AngI产生速率)及ALD监测较多地应用了免疫法，再加上人体中的ALD的含量很低，不可避免地会受免疫交叉反应地干扰，尤其是对于女性患者而言，假如处在黄体期，肾素的浓度会降低，相对比男性的肾素浓度水平，更容易受到免疫交叉副产物干扰，造成肾素浓度波动，从而更容易出现交叉反应，此生理阶段醛固酮的浓度水平又会升高，导致假阳性率加大，准确性差，且无法同时检测AngI和ALD，不同实验室之间检测结果差异也较大。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法及试剂盒。
为解决以上技术问题，本发明的以下一个或多个实施例提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，包括样品前处理步骤和进样检测步骤，其中，
样品前处理包括如下步骤：向血液样本中加入孵育缓冲液，孵育设定时间后，加入pH值调节剂，净化后，得处理液，将处理液氮气吹干，后采用流动相复溶，得待测液；所述pH值调节剂为甲酸、氨水或乙酸铵；
采用液相色谱串联质谱方法进行检测。
第二方面，本发明提供一种同时检测血样样本中醛固酮和肾素活性的试剂盒，包括混合标准溶液、孵育缓冲液、pH值调节剂、10％乙腈、纯甲醇、体积分数为5mM的氟化铵水溶液和质控品。
与现有技术相比，本发明的以上一个或多个技术方案取得了以下有益效果：
本发明通过对样本前处理方法和超高效液相色谱-质谱条件的优化，建立了一种同时检测血液样品中醛固酮、肾素活性的新方法，采用本发明可以同时检测人血清中醛固酮、肾素活性，并进行精确的定性和定量分析，是一种样本处理简单、通量高、结果可靠的检测方法。
本发明中使用的前处理方法，可以有效去除样品杂质，降低基质效应，并能最大程度确保回收率，保持回收率的稳定性和可重复性，同时对人血中物质浓度进行浓缩，提高检测灵敏度，降低基质效应，减少待检测血液样本量，操作简单快捷，检测结果精确。
本发明的方法针对每种激素分别选择一对定量离子和定性离子，以各种待测物的相对保留时间、定性离子和对应内标对作为定性依据，以标准品制作标准曲线定量。用两对离子分别进行定量和定性保证了检测物的特异性，降低了干扰物影响，该方法操作简便快速分析，通量高、成本低，可实现对人体醛固酮、肾素活性水平的实时监测。
同时，本方法应用三个水平的质控品考察方法的准确性、有效性，避免检测结果失真。
本发明的检测方法提供了一种PRA和ALD同时检测的液相串联质谱新方法，与蛋白沉淀法相比，灵敏度更高，时间更短：本方法使用固相萃取进行浓缩前处理，通过pH值调节剂的加入提高ALD的检出灵敏度，具有高特异性、抗干扰、检测灵敏度高以及检测成本低等特点。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1是本发明实施例的醛固酮色谱图；
图2为本发明实施例的血管紧张素I色谱图；
图3为本发明实施例的0.156-10ng/mL的标准品标准曲线；
图4为本发明实施例的0.469-30ng/mL的标准品标准曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
第一方面，本发明提供一种同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，包括样品前处理步骤和进样检测步骤，其中，
样品前处理包括如下步骤：向血液样本中加入孵育缓冲液，孵育设定时间后，加入pH值调节剂，净化后，得处理液，将处理液氮气吹干，后采用流动相复溶，得待测液；所述pH值调节剂为甲酸、氨水或乙酸铵；
采用液相色谱串联质谱方法进行检测。
现有方法的前处理方法是使用甲酸活化，未考虑到血管紧张素I的物理性质，因为从AngI多肽序列分析，序列中有赖氨酸、精氨酸、组氨酸等碱性氨基酸，这些氨基酸使其在酸性溶液中质子化，从而降低其在SPE上的回收率。本发明方法的优化方向一方面在于，针对血管紧张素I的物理性质，优化前处理过程，采用的浓度为10～100mM的乙酸铵，为pH值调节剂，降低其在待测溶液中的质子化解离，提高其在SPE处理中的回收率，大大提高了物质的检测灵敏度；另一方面，经SPE提取后，增加氮吹操作，复溶后进行上样，对检测信号的提高。
在一些实施例中，所述血液样本为血浆或血清，优选为血清。
在一些实施例中，甲酸的浓度为0.1～2％，优选为1％，％为质量百分数；
氨水的浓度为0.5～8％，优选为5％，％为质量百分数；
乙酸铵的浓度为10～100mM，优选为50mM。
进一步的，血液样本的pH值调节剂为10～100mM的乙酸铵。
在一些实施例中，所述孵育缓冲液为Tris-base(三(羟甲基)氨基甲烷)与EDTA的混合液，其中的pH值调节剂为冰醋酸，用以在孵育阶段调节孵育缓冲液pH保持在6.0～6.5，有利于肾素发挥最大活性催化Ang I的转化反应的进行。
进一步的，所述孵育缓冲液的pH值为6.0-6.5。
在一些实施例中，孵育的时间为2.5-3.5h，孵育的温度为36.5-37℃。
在一些实施例中，向血液样本中加入pH值调节剂后，采用Biotage EVOLUTEEXPRESS ABN进行纯化。
进一步的，将血液样本上样Biotage EVOLUTE EXPRESS ABN后，分别经由纯水和10％乙腈淋洗后，采用纯甲醇洗脱，获得处理液。
在一些实施例中，还包括向血液样本中加入内标溶液的步骤。
进一步的，所述内标溶液为含有ALD-D7和Ang I-13C15N，其浓度分别为1ng/mL和3ng/mL。
更进一步的，血液样本、内标溶液和孵育缓冲液的体积比为8-12:8-12:5-7，优选为10:10:6。
在一些实施例中，血液样本与复溶溶液的体积比为4-6:2，优选为5:2。
在一些实施例中，液相色谱串联质谱系统为YS EXACT 9050MD、YS EXACT 9900MD、岛津LCMS-8050或AB 4500MD，正离子电喷雾离子化的多离子反应监测。
在一些实施例中，液相色谱的条件为：流动相A为含2-10mM氟化铵HPLC级水；流动相B为纯甲醇；梯度洗脱。
进一步的，液相色谱的色谱柱为C18脂溶性色谱柱子100mm×2.1mm，3.0μm，柱温：40℃
进一步的，梯度洗脱程序为：0-0.5min，流动相B的体积分数为30％；0.5-1min，流动相B的体积分数为30～50％；1-3min，流动相B的体积分数为50～60％；3-3.1min，流动相B的体积分数为30～95％；4-4.1min，流动相B的体积分数为95～30％；4.1-5min，流动相B的体积分数为30％。
在一些实施例中，质谱条件为：采用电喷雾ESI源，喷雾电压4500V，离子传输管温度300℃，蒸发温度350℃，鞘气40arb，辅气5arb，采用MRM模式采集数据。
进一步的，MRM的质谱参数为：
Ang I：极性为Positive，母离子(m/z)为433.1，子离子(m/z)为647.5，定性子离子(m/z)为70.33，碰撞能量(V)为35.6，射频电压(V)为78.75；
ALD：极性为Positive，母离子(m/z)为361.1，子离子(m/z)为322.5，定性子离子(m/z)为185.3，碰撞能量(V)为27.67，射频电压(V)为67.6。
在一些实施例中，还包括制作标准曲线的步骤。
第二方面，本发明提供一种同时检测血样样本中醛固酮和肾素活性的试剂盒，包括混合标准溶液、孵育缓冲液、pH值调节剂、10％乙腈、纯甲醇、体积分数为5mM的氟化铵水溶液和质控品。
在一些实施例中，所述质控品包括三个水平的质控血清，质控品为由活性炭净化的血清空白样本中添加混合标准物质制得，并通过检测确定靶值。
进一步的，质控品中的ALD和Ang I的低水平浓度分别为1ng/mL和3ng/mL；中水平浓度分别为2ng/mL和6ng/mL；高水平浓度分别为7.5ng/mL和22.5ng/mL。
在一些实施例中，所述混合标准溶液为含0.156～10ng/mL ALD和0.469～30ng/mLAng I的空白血清溶液。
实施例1
(1)样品前处理：将血浆、标准品、质控品、孵育反应缓冲液，pH值调节剂平衡至室温。向血清样本中加入孵育缓冲液，涡旋震荡37℃孵育3h，3h后加入含50mM乙酸铵的内标溶液，上样Biotage EVOLUTE EXPRESS ABN，分别经由纯水、10％乙腈淋洗后纯甲醇洗脱，获得处理液，氮气吹干，将样品复溶于初始流动相中，获得待测液；所述的血清、内标溶液、孵育缓冲液体积比为10：10：6，血浆与复溶液的体积比为5：2。孵育缓冲液配制：分别取121.1gTris-base与74g EDTA，纯水定容到1L，最后用冰醋酸调节pH值为6.0-6.5。
(2)液相串联质谱检测
待测样本通过梯度洗脱模式进入色谱柱分离，液相色谱参考条件：
色谱柱：色谱柱：C18柱(山东英盛生物技术有限公司提供，C18脂溶性色谱柱子100mm×2.1mm，3.0μm)；柱温：40℃；流动相A：含5mM氟化铵HPLC级水；流动相B：纯甲醇，梯度洗脱条件，如表1所示。
表1梯度洗脱条件
时间/min ％B
0.5 30
1.00 50
3 60
3.1 95
4 95
4.1 30
5 30
质谱参数参考条件：
采用电喷雾ESI源，喷雾电压4500V，离子传输管温度300℃，蒸发温度350℃，鞘气40arb，辅气5arb，采用MRM模式采集数据，MRM质谱参数如表2所示。
表2MRM质谱参数
Figure BDA0002969643000000081
(3)计算结果
标准工作液的配制：以甲醇配制100μg/mL各激素标准品储备液，然后以经活性炭净化的血清空白样本制备7个梯度的混合标准溶液分装于1.5mL棕色瓶中，-20℃保存备用，标准品需参与样本提取。
标准曲线中各点浓度，见表3：
表3标准曲线中各点浓度
Figure BDA0002969643000000091
应用标准品制作标准曲线，以标准溶液浓度为X轴，标准品峰面积为Y轴；进行线性回归分析得回归方程。将相应峰面积代入标准曲线方程，分别计算血清样品中醛固酮、血管紧张素I(即ANG I)的浓度，然后根据下面的公式，结合孵育时间计算肾素活性(即PRA)：
Figure BDA0002969643000000092
如图3，用本发明方法测定0.156-10ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本睾酮含量为1.048ng/mL。
如图4，用本发明方法测定0.469-30ng/mL的标准品建立标准曲线，在此范围内的线性关系良好，通过方程可知该样本血管紧张素I含量为25.54ng/mL，未孵育前的血管紧张素I本底含量5.2ng/ml，经公式计算可得PRA为6.78ng/(ml.h)。
(4)检测方法的性能指标验证结果
本方法的定量下限，检测限，精密度及可检测的线性范围等指标验证结果，如表4所示。
表4检测方法的性能验证结果
Figure BDA0002969643000000093
Figure BDA0002969643000000101
对比了氨水、甲酸和乙酸铵三种pH值调节剂，浓度分别为5％氨水、1％甲酸、50mM乙酸铵，各pH值调节剂浓度在对比实验前进行优化，选取各自的最佳浓度参与对比，效果见下表5，可知50mM乙酸铵的提取效果是最佳的，对比原方法物质剂内标的信号有了7.4倍的提高。
表5pH值调节剂的提取效果对比表
Figure BDA0002969643000000102
获取的待测上清氮吹与否，对信号的影响，见下表6，其他参数均保持不变，可以看到氮吹可以明显提高血管紧张素I及内标的信号响应，提高在1.1-1.3倍之间。
表6氮吹对信号响应的影响
Figure BDA0002969643000000103
实施例2
一种同时检测血液样品中醛固酮、肾素活性试剂盒，具有7个梯度，见上表3，含混合标准溶液，孵育缓冲液，pH值调节剂，10％乙腈，纯甲醇，体积分数5mM的氟化铵水、质控品。
质控品包括三个水平的质控血清，质控品为由活性炭净化的血清空白样本中添加混合标准物质制得，并通过检测确定靶值。质控品中的ALD和Ang I的低水平浓度分别为1ng/mL和3ng/mL；中水平浓度分别为2ng/mL和6ng/mL；高水平浓度分别为7.5ng/mL和22.5ng/mL。
混合标准溶液为含0.156～10ng/mL ALD和0.469～30ng/mL Ang I的空白血清溶液。
孵育缓冲液为Tris-base(三(羟甲基)氨基甲烷)与EDTA的混合液，此混合液需要冰醋酸调节pH，用以在孵育阶段保持孵育缓冲液pH在6.0～6.5。
试剂盒所含pH值调节剂为孵育完成后，所用的pH调节剂，100mM的乙酸铵，用以提高ALD和Ang I在Biotage EVOLUTE EXPRESS ABN的挂柱率，进而提高方法的灵敏度。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：包括样品前处理步骤和进样检测步骤，其中，
样品前处理包括如下步骤：向血液样本中加入孵育缓冲液，孵育设定时间后，加入pH值调节剂，净化后，得处理液，将处理液氮气吹干，后采用流动相复溶，得待测液；所述pH值调节剂为甲酸、氨水或乙酸铵；
采用液相色谱串联质谱方法进行检测。
2.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：所述血液样本为血浆或血清，优选为血清。
3.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：甲酸的浓度为0.1～2％，优选为1％，％为质量百分数；
氨水的浓度为0.5～8％，优选为5％，％为质量百分数；
乙酸铵的浓度为10～100mM，优选为50mM；
进一步的，血液样本的pH值调节剂为10～100mM的乙酸铵。
4.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：所述孵育缓冲液为Tris-base与EDTA的混合液，其中的pH值调节剂为冰醋酸；
进一步的，所述孵育缓冲液的pH值为6.0-6.5；
在一些实施例中，孵育的时间为2.5-3.5h，孵育的温度为36.5-37℃。
5.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：向血液样本中加入pH值调节剂后，采用Biotage EVOLUTE EXPRESS ABN进行纯化；
进一步的，将血液样本上样Biotage EVOLUTE EXPRESS ABN后，分别经由纯水和10％乙腈淋洗后，采用纯甲醇洗脱，获得处理液；
在一些实施例中，还包括向血液样本中加入内标溶液的步骤；
进一步的，所述内标溶液为含有ALD-D7和Ang I-13C15N，其浓度分别为1ng/mL和3ng/mL；
更进一步的，血液样本、内标溶液和孵育缓冲液的体积比为8-12:8-12:5-7，优选为10:10:6；
进一步的，血液样本与复溶溶液的体积比为4-6:2，优选为5:2。
6.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：液相色谱串联质谱系统为YS EXACT 9050MD、YS EXACT 9900MD、岛津LCMS-8050或AB4500MD，正离子电喷雾离子化的多离子反应监测；
在一些实施例中，液相色谱的条件为：流动相A为含2-10mM氟化铵HPLC级水；流动相B为纯甲醇；梯度洗脱；
进一步的，液相色谱的色谱柱为C18脂溶性色谱柱子100mm×2.1mm，3.0μm，柱温：40℃；
进一步的，梯度洗脱程序为：0-0.5min，流动相B的体积分数为30％；0.5-1min，流动相B的体积分数为50％；1-3min，流动相B的体积分数为60％；3-3.1min，流动相B的体积分数为95％；4-4.1min，流动相B的体积分数为30％；4.1-5min，流动相B的体积分数为30％。
7.根据权利要求1所述的同时检测血液样本中醛固酮和肾素活性的方法，其特征在于：质谱条件为：采用电喷雾ESI源，喷雾电压4500V，离子传输管温度300℃，蒸发温度350℃，鞘气40arb，辅气5arb，采用MRM模式采集数据；
进一步的，MRM的质谱参数为：
Ang I：极性为Positive，母离子m/z，433.1；子离子m/z，647.5；定性子离子m/z，70.33；碰撞能量V，35.6；射频电压V，78.75；
ALD：极性为Positive，母离子m/z，为361.1；子离子m/z，322.5；定性子离子m/z，185.3；碰撞能量V，27.67；射频电压V，67.6。
8.一种同时检测血样样本中醛固酮和肾素活性的试剂盒，其特征在于：包括混合标准溶液、孵育缓冲液、pH值调节剂、10％乙腈、纯甲醇、体积分数为5mM的氟化铵水溶液和质控品。
9.根据权利要求8所述的同时检测血样样本中醛固酮和肾素活性的试剂盒，其特征在于：所述质控品包括三个水平的质控血清，质控品为由活性炭净化的血清空白样本中添加混合标准物质制得，并通过检测确定靶值；
进一步的，质控品中的ALD和Ang I的低水平浓度分别为1ng/mL和3ng/mL；中水平浓度分别为2ng/mL和6ng/mL；高水平浓度分别为7.5ng/mL和22.5ng/mL。
10.根据权利要求8所述的同时检测血样样本中醛固酮和肾素活性的试剂盒，其特征在于：所述混合标准溶液为含0.156～10ng/mL ALD和0.469～30ng/mL Ang I的空白血清溶液。
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