CN110702829B - 一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法。该方法包括如下步骤：在样本中加入内标物，加入硫酸锌溶液进行蛋白沉淀，再加入磷酸溶液进行稀释，离心，取上清液；采用固相萃取板对上清液进行富集，得到富集后的样本；采用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对富集后的样本进行检测，超高效液相色谱的条件为：色谱柱为反相C18柱，流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，梯度洗脱模式；四级杆质谱的条件为：负离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM。该检测方法无基质干扰，缩短了样本前处理时间，检测灵敏度高、精密度高、特异性强。

Description

一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法。
背景技术
醛固酮(ALD)是由肾上腺皮质球状带细胞合成和分泌的一种类固醇类激素，属于盐皮质激素家族。它有三个主要功能：1)和远端小管、集尿管的主细胞内的盐皮质激素受体结合，增加管腔膜对钾离子和钠离子的渗透性，同时激活基底侧的Na+/K+泵，增加对钠离子和水的重吸收，同时排出更多的钾离子到尿液中。2)刺激集尿管对氢离子的分泌，调控血浆中碳酸氢根的浓度，保持酸碱平衡。3)通过垂体后叶作用于中枢神经系统，刺激抗利尿激素(ADH)的释放，通过直接增加肾小管对水分的重吸收起到保水的作用。醛固酮是高血压实验室检测标志物的一种，属于肾素-血管紧张素-醛固酮(RAAS)系统的一部分，其分泌也是通过RAAS调节实现的。当血压降低时，肾小球旁细胞分泌肾素，肾素促进血管紧张素原转变成血管紧张素Ⅰ，血管紧张素Ⅰ经血管紧张素转化酶(ACE)转化成血管紧张素Ⅱ，血管紧张素Ⅱ促进血管收缩升高血压。同时血管紧张素Ⅱ作用于肾上腺皮质增加醛固酮的分泌，进而升高血压。
Figure BDA0002238793830000011
目前国内普遍采用免疫法检测醛固酮，但是免疫法普遍存在交叉反应性强，特异性差，灵敏度低，准确度低等问题，而ID-LC-MS/MS法是目前被广泛接受的小分子定量检测的金标准方法，它的优势在于灵敏度高，检测限低，选择性好及准确度和特异性高，它能够区别结构相似的化合物。但是由于人体内醛固酮含量低，结构类似物较多，且人体血液组成分复杂，因此采用质谱法检测仍然需要解决以下问题：1)严重的基质干扰，特异性差，灵敏度低；2)提高检测效率，有效缩段样本前处理时间；3)化合物在不同人群浓度相差大，特别是一些临床样本如AVS样本，要求线性范围宽。
为了降低基质干扰，提高特异性、灵敏度等，目前常采用方法为：样本经过液液萃取或者液固萃取后进行氮吹浓缩得到待测样本，样本经高效液相色谱、液相色谱串联质谱等进行检测；但是这种方法存在如下的问题：前处理复杂、处理时间长(一个样本约2.5小时)、通量低、试剂成本高、对操作人员要求高。
公开号为CN106770824A、发明名称为《利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法》专利中的方法前处理时间长，所需样本量及前处理试剂量大，回收率低。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法。该检测方法无基质干扰，缩短了样本前处理时间，检测灵敏度高、精密度好、特异性强。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法，包括如下步骤：
在样本中加入内标物，加入硫酸锌溶液进行蛋白沉淀，再加入磷酸溶液进行稀释，离心，取上清液；
采用固相萃取板对上清液进行富集，得到富集后的样本；
采用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对富集后的样本进行检测，得到定性或定量结果；超高效液相色谱的条件为：色谱柱为反相C18柱，流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，梯度洗脱模式为：
0min时，流动相A与流动相B的体积比为30:70；
0.5min时，流动相A与流动相B的体积比为30:70；
3.5min时，流动相A与流动相B的体积比为70：30；
4.5min时，流动相A与流动相B的体积比为95：5；
5.0min时，流动相A与流动相B的体积比为95：5；
5.5min时，流动相A与流动相B的体积比为30：70；
8.0min时，流动相A与流动相B的体积比为30：70；
四级杆质谱的条件为：负离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM。
在本发明中，定性判断和定量计算为：
(1)依据待测物、内标物的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断待测物的存在。
(2)采用内标标准曲线法定量，以待测物与内标物的峰面积比值计算样品中的待测物的含量。
作为优选，内标物为醛固酮的C13标记物或氘代标记物，醛固酮的氘代标记物为d4-醛固酮和/或d7-醛固酮。
作为优选，采用固相萃取板对上清液进行富集具体为：
用纯甲醇、超纯水依次对固相萃取板进行活化、平衡；
将上清液置于固相萃取板中，然后使固相萃取板中的液体逐滴流下，依次用磷酸水溶液、氨水甲醇水溶液和超纯水对板孔进行洗涤；
采用甲醇水溶液对醛固酮进行洗脱，收集洗脱液。
作为优选，固相萃取板为混合型强阴离子交换反相萃取板。
优选地，固相萃取板为
Figure BDA0002238793830000031
MAX μElution Plate。
作为优选，流动相的流速为0.2～0.6mL/min。
优选地，流动相的流速为0.3mL/min。
作为优选，目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：
醛固酮的定量离子对359.1＞189.0，定性离子对为359.1～331.0，359.1～297.2；
d4-醛固酮定量离子对为363.2＞190.2；
d7-醛固酮定量离子对为366.2＞338，定性离子对366.2＞194.1。
作为优选，四级杆质谱的条件还包括以下离子源参数：
离子源温度为150℃，电离源为电喷雾电离ESI源，脱溶剂气温度为450～600℃，碰撞气为氦气，电喷雾针电压为2.5～2.8kV，锥孔电压为30～50V。
优选地，离子源温度为150℃，脱溶剂气温度为600℃，电喷雾针电压为2.5kV，锥孔电压为30V。
作为优选，四级杆质谱的条件还包括：
醛固酮定量离子对的锥孔电压为28～32V，碰撞电压为16～20V；
醛固酮定性离子对的锥孔电压为28～32V，碰撞电压为16～20V。
优选地，醛固酮定量离子对的锥孔电压为30V，碰撞电压为18V；
醛固酮定性离子对的锥孔电压为30V，碰撞电压为18V。
作为优选，硫酸锌溶液中硫酸锌含量为0.08～0.12mol/L，硫酸锌溶液中的溶剂为体积百分含量50％的甲醇水溶液；氨水甲醇水溶液中氨水的体积百分含量为0.08％～0.12％，甲醇的体积百分含量为10％～15％；磷酸水溶液中磷酸的体积百分含量为0.04％～0.06％；洗脱所用甲醇水溶液的的体积百分含量为60％～80％。
优选地，硫酸锌溶液中硫酸锌含量为0.1mol/L；氨水甲醇水溶液中氨水的体积百分含量为0.1％，甲醇的体积百分含量为10％；磷酸水溶液中磷酸的体积百分含量为0.05％；洗脱所用甲醇水溶液的的体积百分含量为70％。
作为优选，96孔板活化甲醇体积为150～300μL，超纯水体积为150～300μL；样本处理时样本用量为150～350μL，硫酸锌溶液体积为150～250μL，磷酸水溶液体积为400～500μL；洗涤时磷酸溶液体积为150～250μL，氨水溶液体积为150～250μL，超纯水体积为150～250μL；洗脱分析物时洗脱液体积为30～100μL，上样体积为550～650μL。
在本发明提供的实施例中，96孔板活化甲醇体积为200μL，超纯水体积为200μL；样本处理时样本用量为200μL，硫酸锌溶液体积为200μL，磷酸水溶液体积为450μL；洗涤时磷酸溶液体积为200μL，氨水溶液体积为200μL，超纯水体积为200μL；洗脱分析物时洗脱液体积为50μL，上样体积为600μL。
作为优选，样品前处理中离心的条件为：温度4～25℃，转速11000～13000r/min，时间5～15min。
在本发明提供的实施例中，样品前处理中离心的条件为：室温，转速13000r/min，时间10min。
本发明提供了一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法。该方法包括如下步骤：在样本中加入内标物，加入硫酸锌溶液进行蛋白沉淀，再加入磷酸溶液进行稀释，离心，取上清液；采用固相萃取板对上清液进行富集，得到富集后的样本；采用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对富集后的样本进行检测，得到定性或定量结果；超高效液相色谱的条件为：色谱柱为反相C18柱，流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，梯度洗脱模式；四级杆质谱的条件为：负离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM。上述准确测定血浆或血清中醛固酮含量的方法具有以下优点和有益效果：
(1)上述检测醛固酮的时间为8min。在UPLC上使用较长时间的梯度液相条件分离洗脱分析物，使分析物在3min后出峰，使分析物避免基质效应的影响，在验证结构类似物的时候，所有验证结构类似物均不会对分析物检测产生影响。
(2)前处理采用96孔萃取板来处理样本，在固相萃取的基础上，采用集合萃取小柱的方式，配合96孔板正压萃取装置，使样本前处理批量进行，大大缩短了样本前处理时间。
(3)上述检测方法通过对前处理的参数以及富集、分离和检测的各参数进行了大量实验研究进行优化，使最后得到的检测方法可以有效去除基质干扰，特异性、灵敏度好。定量限低，灵敏度高，精密度RSD小于5％，回收率高，可以准确的定性或定量检测出血浆或血清中极低浓度的醛固酮含量。即与常用的检测相比，本发明的检测方法检测灵敏度高、精密度高、特异性强。
附图说明
图1为实施例1人血浆样品中醛固酮和其内标物的TIC图；
图2为醛固酮的标准曲线图；
图3为醛固酮的标准曲线图；
图4为醛固酮的标准曲线配制过程图；
图5为醛固酮的特异性验证结果图；液质和DiaSorin分别检测临床梯度样本35份，做线性拟合及Bland–Altman分析y＝0.9464x+18.359，R2＝0.9811；其中，5-1为液质检测结果与DiaSorin结果线性相关性拟合图，5-2为液质检测结果与DiaSorin结果的Bland–Altman分析结果图；
图6为醛固酮的方法学比对结果图；液质和DRG分别检测临床梯度样本35份，做线性拟合及Bland–Altman分析y＝0.715x+39.916，R2＝0.931；其中，6-1为液质检测结果与DRG结果线性相关性拟合图，6-2为液质检测结果与DRG结果的Bland–Altman分析结果图；
图7为醛固酮2017年RELA比对结果反馈图；
图8为不同前处理方式质谱效果图。
具体实施方式
本发明公开了一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
具体的技术方案如下：
一种准确测定血浆或血清中醛固酮含量的方法，包括如下步骤：
样品前处理：在血浆/血清样本和校准液中加入同样体积一定浓度的内标，涡旋、平衡，加入硫酸锌溶液进行蛋白沉淀，再加入磷酸溶液稀释，涡旋，离心，上清液待用；
富集、分离和检测：对上述上清液中的分析物采用96孔固相萃取板进行富集、纯化、分离和检测；所述富集、纯化、分离和检测的步骤包括：
先用甲醇、超纯水依次对96孔固相萃取板进行活化、平衡；
将一定体积的上述上清液上分别上载到96孔固相萃取板不同的板孔里；
采用一定方式使固相萃取板中的液体逐滴流下，依次用磷酸水溶液、氨水甲醇水溶液和超纯水对所用的各个板孔进行洗涤；
最后用一定浓度的甲醇水溶液对目标物醛固酮进行洗脱，用96孔样本板对洗脱液进行收集，收集前预先在相应96孔样本板中加入一定体积的超纯水，96孔样本板收集分析物洗脱液后涡旋，然后将收集板中的样本用超高效液相色谱串联质谱进行检测；
其中，96孔固相萃取板为混合型强阴离子交换反相萃取板(
Figure BDA0002238793830000071
MAXμElutionPlate)，色谱柱为反相C18柱；
流动相：A相为甲醇，B相为超纯水，流速为0.2-0.6mL/min；流动相采用梯度洗脱模式：
0min时，流动相A与流动相B的体积比为30:70；
0.5min时，流动相A与流动相B的体积比为30:70；
3.5min时，流动相A与流动相B的体积比为70：30；
4.5min时，流动相A与流动相B的体积比为95：5；
5.0min时，流动相A与流动相B的体积比为95：5；
5.5min时，流动相A与流动相B的体积比为30：70；
8.0min时，流动相A与流动相B的体积比为30：70；
整个梯度时间为8.0min。
目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：
醛固酮的定量离子对359.1＞189.0，定性离子对为359.1～331.0，359.1～297.2；
d4-醛固酮定量离子对为363.2＞190.2；
d7-醛固酮定量离子对为366.2＞338，定性离子对366.2＞194.1。
在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：
电离源为电喷雾电离ESI源，脱溶剂气温度为450～600℃，碰撞气为氦气，电喷雾针电压为2.5～2.8kV，锥孔电压为30～50V。
在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件还包括：
醛固酮定量离子对的碰撞电压为28-32V，锥孔电压为16～20V；
醛固酮定性离子对的碰撞电压为28-32V，锥孔电压为16～20V。
在其中一些实施例中，所述96孔板活化甲醇体积为150～300μL，纯水体积为150～300μL；样本处理时样本用量为150～350μL，硫酸锌溶液体积为150～250μL，磷酸水溶液体积为400～500μL；洗涤时磷酸溶液体积为150～250μL，氨水溶液体积为150～250μL，超纯水体积为150～250μL；洗脱分析物时洗脱液体积为30～100μL，上样体积为550～650μL。
在其中一些实施例中，硫酸锌溶液中硫酸锌含量为0.08～0.12mol/L，甲醇含量为50％(v:v)；氨水水溶液中氨水含量0.08～0.12％(v:v)，甲醇含量为10～15％(v:v)；磷酸水溶液中磷酸含量为0.04～0.06％(v:v)；洗脱液中甲醇含量为60～80％(v:v)。
在其中一些实施例中，所述样品前处理中离心的条件为：温度4～25℃，转速11000～13000r/min，时间5～15min。
本发明提供的测定血浆或血清中醛固酮含量的方法中所用试剂或仪器均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
本实施例的血浆或血清中醛固酮的检测方法，包括以下步骤：
一、样品前处理
取200μL样本(标准曲线点与质控同步处理)于1.5mL离心管中，加入10μL内标工作液d4-ALD(2ng/mL)，涡旋混匀1.5min；室温平衡40min；加入200μL 0.1mol/L的硫酸锌溶液，涡旋30s；加入450μL上述0.05％磷酸溶液，涡旋混匀1.5min；室温，13000rpm/min离心10min；分别用200μL纯甲醇、纯水对即将使用的96孔板进行活化；用移液器取625μL离心后的上清液上载到活化后的96孔萃取板上，使用96孔正压萃取装置使样本稀释液逐滴流下；分别用200μL上述0.05％磷酸溶液、0.1％氨水甲醇(10％)溶液和去离子水对96孔板进行洗涤；预先在96孔样品板里加入40μL超纯水；将萃取板放到样品板上，在萃取板上加入50μL70％的甲醇水溶液对分析物进行洗脱；将样品板混匀20s，上机检测。
二、流动相条件
流动相：A相为甲醇，B相为超纯水，流速为0.3mL/min；流动相采用梯度洗脱模式：
0min时，流动相A与流动相B的体积比为30:70；
0.5min时，流动相A与流动相B的体积比为30:70；
3.5min时，流动相A与流动相B的体积比为70：30；
4.5min时，流动相A与流动相B的体积比为95：5；
5.0min时，流动相A与流动相B的体积比为95：5；
5.5min时，流动相A与流动相B的体积比为30：70；
8.0min时，流动相A与流动相B的体积比为30：70；
整个梯度时间为8.0min。
流动相的梯度洗脱如表1所示。
表1流动相的洗脱梯度
Figure BDA0002238793830000091
上述梯度下，醛固酮的保留时间为：3.60min。
本实施例LC-MS/MS采用具有电喷雾电离源(ESI)的watersTQ-S串联四级杆质谱分析仪作为检测器进行分析。其中，离子源温度为150℃；脱溶剂气温度为600℃；碰撞气为高纯氮气；电喷雾针电压为2.5kV。
其它质谱条件：采用负离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描MRM，其条件参见表2。
表2多反应监测离子扫描MRM条件
Figure BDA0002238793830000092
待测物随流动相流出色谱柱后，在压力的作用下进入质谱仪离子源，由六通阀控制进入离子源的样品通道，和进入切换时间。在离子源内液体样品被汽化并且电离为带电分子，带电分子在电压和真空作用下，进入Q1、Q2和Q3，其中，Q1和Q3为质量分析器，只允许根据醛固酮及其内标物的质荷比选择的母离子和子离子通过，Q2为碰撞池单元，母离子在此处与惰性气体原子碰撞，产生特定的碎片离子。质谱仪的第一个四极杆(Q1)选择具有待测物及其内标物的特定质荷比m/z的母离子，具有这些m/z比的母离子被允许进入Q2，Q2产生的碎片离子进入到Q3，其中待测物及其内标物的碎片离子(子离子)被选择通过，而其它离子被除去。参见表3，显示了被用于定性鉴别和定量测定的待测物的离子对的质荷比m/z。
表3待测物的质量转变表
离子对名称 MRM离子对
醛固酮定量离子对 359.1＞189.0
醛固酮定性离子对 359.1＞331.0
D4醛固酮定量离子对 363.2＞190.2
随着离子与检测器碰撞，它们将捕获到的离子数转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图，即得总离子流图(TIC图)(如图1所示)。
三、定性判断和定量计算
(1)依据待测物、内标物的相对保留时间和检测的定量离子对的丰度比判断待测物的存在。在相同试验条件下，检测样品中被测目标物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间一致。
(2)采用内标标准曲线法定量，以待测物与内标物的峰面积比值计算样品中的待测物的含量。
配置系列浓度的含有待测物的血清标准样品，用本实施例的上述方法进行样品前处理以及分离检测，以血清标准样品中待测物和内标物的峰面积的比值构建内标标准曲线，醛固酮的标准曲线见图2，曲线的方程Y＝0.0104861X+0.00268166，R2＝0.9993；然后利用该标准曲线计算待测样品中的待测物的浓度。
实施例2方法学验证实验
本实施例对实施例1中的醛固酮的检测方法进行方法学验证实验。
1、精密度(Precision)实验
选取三个梯度浓度的样品，在三天内做了六组实验，每组每个水平2个重复，求取组内、组间及总变异。具体数据参见表4。
表4醛固酮精密度实验数据(单位：pg/mL)
Figure BDA0002238793830000111
2、分析灵敏度和线性范围
2.1方法的检出限和定量限
逐级稀释低浓度样本，每个浓度的样本平行处理6个，分别检测一次，计算各浓度样本的平均值、RSD和回收率；
方法检出限的确定标准：RSD小于10％，信噪比S/N≥3且回收率在85％-115％范围内的最低浓度点视为检出限浓度，即LOD；
方法定量限的确定标准：RSD小于10％，信噪比S/N≥10且回收率在85％-115％范围内的最低浓度点视为检出限浓度，即LOQ；
表5醛固酮检出限和定量限实验数据
信噪比(S/N) CV,％(n＝5) 浓度(pg/mL)
LOD ≥3 3.83％ 5
LOQ ≥10 4.60％ 10
2.2方法的线性范围
方法的线性浓度点为：20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、2000pg/mL，配制基质为4％的BSA磷酸盐缓冲液，具体配制方法见图3。
2.3结论
经实验验证该方法的检出限为5pg/mL，定量限为10pg/mL，线性范围为20-2000pg/mL线性相关系数R2＝0.9993。
3.回收实验
收集一批混合血清样本，测得基础浓度，分别加标至高、中、低三水平的样本，进行加标回收率实验；未加标及加标样品，每个平行处理3个，分别进行检测，计算加标样品的回收率结果，回收率在85-115％范围内，认为方法准确。
表6醛固酮加标回收率试验结果
Figure BDA0002238793830000121
4.基质效应
基质效应为选取7个不同来源的生物样本，采用提取后添加的方式，分成两组分别向其中加入标准品和内标，另一组加入内标，对照组为纯溶剂基质样本。从结果可以看出，基质偏差在5％以内。
表7基质效应验证结果
Figure BDA0002238793830000131
5.特异性
在本实验中根据目标物的性质和检测仪器的特点，我们选取了以下11种可能对目标物产生干扰的物质对所建立目标物检测方法进行验证。在醛固酮液相分离条件的基础上，分别建立了11种要验证的潜在干扰物的质谱条件，并对这些物质进行了检测。每种验证物及分析物醛固酮的出峰时间及位置如图4所示。
表8 11种潜在干扰物质的质谱条件
Figure BDA0002238793830000141
从图4可以看出醛固酮及干扰测试物的出峰时间先后顺序为：醛固酮、泼尼松、可的松、氢化泼尼松、皮质醇、21脱氧可的松、肾上腺酮、11脱氧可的松、雌二醇、去氧皮质酮、睾酮和孕酮。从结果可以看出测试的11种干扰物未对分析物产生干扰。
6.携带污染
选取的两个高浓度的测试样本对后续样本的检测几乎没有影响。Carryover(％)＝(L3-L2)/(H-L2)分别测试两个高值样品2PPB和5PPB，携带污染污染率很小。
表9携带污染验证结果
Figure BDA0002238793830000151
7.干扰实验
选取三种临床检测中可能遇到的特殊干扰样本，分别以三种高浓度干扰物存在的情况下，测试低中高三浓度水平的添加样本。添加三种干扰物的回收水平可达到94.7％-104.99％。
表10干扰实验验证结果
Figure BDA0002238793830000152
8.方法比较
选取具梯度临床样本35份，分别用本发明方法和两种商品化的免疫方法检测所选样本，对结果进行分析，做线性拟合及Bland–Altman分析，分析结果如图5、图6所示。结果显示相关性方程分别为y＝0.9464x+18.359，R2＝0.9811，y＝0.715x+39.916，R2＝0.931。该方法与两种免疫方法检测结果一致性较高。
9.国际比对
方法发明后，为验证方法的准确性，参与了由国际临床化学和实验室医学联合会(IFCC)等组织的国际能力验证活动(RELA)。使用本发明的参与者编号为134，如表11所示，两个样本A和B与均值的偏差分别为1.65％和0.39％。组织方反馈信息见图7。
表11国际RELA比对结果
Figure BDA0002238793830000161
对比例
方法开发过程中，对于前处理方式、液相条件、质谱条件等进行了摸索和优化，现就前处理方式摸索的一些结论做一个展示和说明。
1、前处理方式摸索：
表12不同前处理方式对比
Figure BDA0002238793830000162
本发明通过考核比较几种不同的前处理方法，表12对这几种的情况进行了总结和说明，从图8可以看出，使用不同前处理方法对检测样本进行检测时，实际的分离效果有较大不同，相比C18小柱和液液萃取，96孔板分离效果更好，基线噪声更小，所以我们最终选择96孔固相萃取板来作为前处理方法。
2、内标条件优化
方法开发过程中，摸索尝试了不同的内标，在前期方法摸索过程中使用了d7-醛固酮，做性能验证时发现回收率一直处于70％左右的水平，如表13所示。做了大量的摸索和优化，但是一直没有明显的改善，后来进行内标优化时发现使用d4-醛固酮，对于回收率有较大改善，随后在此基础上又进行了许多细节上的优化和改进，最终把回收实验做到较好的程度，回收率如表6所示，回收率范围为100.07％-102.05％。
表13d7-醛固酮做内标优化前回收率
Figure BDA0002238793830000171
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种测定血浆或血清中醛固酮含量的方法，其特征在于，具有如下步骤：
在样本中加入d4-醛固酮，加入硫酸锌溶液进行蛋白沉淀，再加入磷酸溶液进行稀释，离心，取上清液；
采用混合型强阴离子交换反相萃取板对所述上清液进行富集，得到富集后的样本；
采用超高效液相色谱串联四级杆质谱法对所述富集后的样本进行检测，得到定性或定量结果；所述超高效液相色谱的条件为：色谱柱为反相C18柱，流动相A为甲醇，流动相B为超纯水，梯度洗脱模式为：
0min时，流动相A与流动相B的体积比为30:70；
0.5min时，流动相A与流动相B的体积比为30:70；
3.5min时，流动相A与流动相B的体积比为70：30；
4.5min时，流动相A与流动相B的体积比为95：5；
5.0min时，流动相A与流动相B的体积比为95：5；
5.5min时，流动相A与流动相B的体积比为30：70；
8.0min时，流动相A与流动相B的体积比为30：70；
所述四级杆质谱的条件为：负离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；
所述负离子模式中，目标定量离子对包括醛固酮离子对和d4-醛固酮的定量离子对；
所述目标定量离子对的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：
醛固酮的定量离子对359.1＞189.0，定性离子对为359.1＞331.0，359.1＞ 297.2；
d4-醛固酮定量离子对为363.2＞190.2；
所述四级杆质谱的条件还包括以下离子源参数：
离子源温度为150℃，电离源为电喷雾电离ESI源，脱溶剂气温度为450~600℃，碰撞气为氦气，电喷雾针电压为2.5~2.8kV，锥孔电压为30~50V；醛固酮定量离子对的锥孔电压为28~32V，碰撞电压为16~20V；醛固酮定性离子对的锥孔电压为28~32V，碰撞电压为16~20V。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用反相萃取板对所述上清液进行富集具体为：
用纯甲醇、超纯水依次对反相萃取板进行活化、平衡；
将上清液置于反相萃取板中，然后使反相萃取板中的液体逐滴流下，依次用磷酸水溶液、氨水甲醇水溶液和超纯水对板孔进行洗涤；
采用甲醇水溶液对醛固酮进行洗脱，收集洗脱液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相的流速为0.2~0.6mL/min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述硫酸锌溶液中硫酸锌含量为0.08mol/L~0.12mol/L，硫酸锌溶液中的溶剂为体积百分含量50%的甲醇水溶液；氨水甲醇水溶液中氨水的体积百分含量为0.08%~0.12%，甲醇的体积百分含量为10%~15%；磷酸水溶液中磷酸的体积百分含量为0.04%~0.06%；洗脱所用甲醇水溶液的体积百分含量为60%~80%。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112014509A (zh) * 2020-09-03 2020-12-01 复旦大学附属中山医院 同步测定样品中血管紧张素i和醛固酮的方法
CN115267015A (zh) * 2022-05-26 2022-11-01 天津国科医工科技发展有限公司 用于质谱检测的样本前处理组合物及应用、前处理方法
CN118362675B (zh) * 2024-06-18 2024-09-13 中国医学科学院阜外医院 一种lc-ms/ms同时检测血浆中原醛症相关5种类固醇激素的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106770824A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法
CN107462653A (zh) * 2017-07-03 2017-12-12 广西壮族自治区妇幼保健院 干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106770824A (zh) * 2016-12-21 2017-05-31 河南出入境检验检疫局检验检疫技术中心 利用高分辨质谱仪检测血浆中痕量醛固酮的方法
CN107462653A (zh) * 2017-07-03 2017-12-12 广西壮族自治区妇幼保健院 干血斑中7种类固醇激素的液相色谱串联质谱检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Establishment of a rapid and simple liquid chromatography tandem mass spectrometry method for measuring aldosterone in urine;Yicong Yin et al;《Journal of Chromatography B》;20190314;第1113卷;84-90 *
液相串联质谱法检测血浆醛固酮的方法学建立和性能评价;秦嘉倩 等;《中华检验医学杂志》;20170430;第40卷(第4期);247-252 *
血清、尿液醛固酮液相色谱串联质谱法的建立及其应用;尹逸丛;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（工程科技I辑）》;20190215(第2期);B014-1131 *

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