CN113711030A - 用于通过lc-ms/ms检测11-氧代雄激素的方法和系统 - Google Patents
用于通过lc-ms/ms检测11-氧代雄激素的方法和系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113711030A CN113711030A CN202080029045.5A CN202080029045A CN113711030A CN 113711030 A CN113711030 A CN 113711030A CN 202080029045 A CN202080029045 A CN 202080029045A CN 113711030 A CN113711030 A CN 113711030A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- oxoandrogen
- ions
- mass spectrometry
- fragment ions
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
- G01N33/743—Steroid hormones
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/36—Control of physical parameters of the fluid carrier in high pressure liquid systems
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N2030/042—Standards
- G01N2030/045—Standards internal
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
- G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/575—Hormones
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
Abstract
公开了用于使用液相色谱法/串联质谱法(LC‑MS/MS)分析样品中内源性生物标志物、例如11‑氧代雄激素的方法、系统和计算机程序产品。11‑氧代雄激素可以包括11‑羟基雄烯二酮(11OHA)、11‑羟基睾酮(11OHT)或11‑酮基睾酮(11KT)中的至少一种。更具体地,描述了用于检测和定量样品中11‑氧代‑雄激素的量的方法、系统和计算机程序产品。
Description
相关申请
本申请要求2019年4月16日提交的发明名称为“用于通过LC-MS/MS检测11-氧代-雄激素的方法和系统(Methods and Systems for the Detection of 11-OXO-Andrgensby LC-MS/MS)”的美国临时专利申请号No.62/834,738的优先权。美国临时专利申请号No.62/834,738的公开内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本当前公开的主题涉及用于分析11-氧代雄激素的方法和系统。在某些实施方案中,11-氧代雄激素对人体受试者是内源性的,使得该测量可以用于临床诊断。
背景
11-氧化(11-氧代)雄激素是肾上腺来源的雄激素产生的新出现的生物标志物。11-氧代-雄激素包括11-羟基Δ4雄烯二酮(11OHA)、11-酮基睾酮(11KT)和11-羟基睾酮(11OHT)。11-氧代雄激素可以在于过量雄激素水平相关的各种病症中起作用(Bloem等人,Molecules,2013,18,13228-13244)。例如,11-氧代雄激素可能与多囊卵巢综合征(PCOS)(O’Reilly等人,2017,J.Clin.Endocrinol.Metab.,102:840-848),21-羟化酶去缺乏症(Turcu等人,2017,J.Clin.Endocrinol.Metab.)和去势抗性前列腺癌(CRPC)(Pretorius等人,2016年7月21日,PLOS ONE)相关。
尽管在类固醇骨架的11位上具有氧的雄激素的存在已经为人所知一段时间,但是这些雄激素的临床用途和流行率直到最近才被曝光。例如,已证明11KT在PCOS患者中以过量水平存在,并且显然为比睾酮或Δ4雄烯二酮更好的PCOS的生物标志物。导致先天性肾上腺增生(CAH)的酶缺乏(21-羟化酶缺乏症)也会导致由促肾上腺皮质激素(ACTH)驱动的肾上腺雄激素过量产生。主要的活性肾上腺衍生雄激素为11-氧代雄激素。消除肾上腺雄激素有助于治疗过量雄激素相关疾病,包括CRPC。因此,11-氧代雄激素可能对监测CAH、尤其是儿童和妇女的CAH具有重要意义。
在先已经描述了通过超高效合相色谱法(UPC2-MS/MS)(Quanson等人,2016,J.Chromatog.B,1031:131-138;O’Reilly等人,2017,J.Clin.Endocrinol.Metab.,102:840-848;Pretorius等人,2016年7月21日,PLOS ONE)和LC-MS/MS(Turcu等人,2017,J.Clin.Endocrinol.Metab.,2017年5月1日在先得到;Turcu等人,2015,J.Clin.Endocrinol.Metab.,100:2283-2290;Turcu等人,2016,Eur.J.Endocrinol,174:601-609)测量雄激素类固醇。
然而,对于提供用于临床诊断和/或预后的11-氧代雄激素的精确测量的商业化测定法存在需求。
概述
在某些实施方案中,公开了测定样品中至少一种关注的生物标志物的存在或量的方法,所述方法包括:提供认为含有至少一种关注的生物标志物的样品;以色谱方式将所述至少一种关注的生物标志物与样品中的其他组分分离;和通过质谱法分析所述以色谱方式分离的至少一种关注的生物标志物以测定样品中所述至少一种关注的生物标志物的存在或量。
在一些实施方案中,所述关注的生物标志物为11-氧代雄激素。在一些实施方案中,本公开的主题提供了用于定量分析某些11-氧代雄激素的方法和系统。在某些实施方案中,所述11-氧代雄激素可以包括11-羟基雄烯二酮(11OHA)、11-羟基睾酮(11OHT)或11-酮基睾酮(11KT)中的至少一种。在一个实施方案中,本发明的方法和系统能够测量这类激素而无需衍生方法。
例如,在一个实施方案中,公开了通过串联质谱法测定样品中至少一种11-氧代雄激素的存在或量的方法。所述方法可以包括下列步骤中的任一个:(a)从受试者得到样品;(b)任选地将稳定同位素标记的11-氧代雄激素添加到所述样品中作为内标;(c)进行HPLC;和(d)通过串联质谱法测量所述11-氧代雄激素(标记的和未标记的)。在一个实施方案中,所述串联质谱法可以包括下列步骤:(i)生成所述11-氧代雄激素的前体离子;(ii)生成所述前体离子的一种或多种碎片离子;和(iii)检测步骤(i)中生成的所述前体离子和/或步骤(ii)中生成的所述至少一种或多种碎片离子或两者的存在或量,并将检测到的离子与样品中11-氧代雄激素的存在或量相关联。在一个实施方案中,所述串联质谱法与HPLC偶联。HPLC步骤可直接先于串联质谱法分析(即LC-MS/MS)。在一些实施方案中,HPLC为高湍流液相色谱法(HTLC)。在一些实施方案中,所述方法不包括合相色谱。在一些实施方案中,在HPLC之前前,液-液萃取用于部分纯化11-氧代-雄激素。在一些实施方案中,在每批次中分析重复组的活性炭处理校准品。
本公开的另一个方面为用于实施所述方法的系统。在一些实施方案中,所述系统包含用于提供疑似含有一种或多种11-氧代雄激素的测试样品的工作站;用于将所述一种或多种11-氧代雄激素从样品中的其他组分中部分纯化的工作站;用于以色谱方式将一种或多种11-氧代雄激素与样品中的其他组分分离的工作站;和用于通过质谱法分析所述以色谱方式分离的一种或多种11-氧代雄激素以测定测试样品中所述一种或多种11-氧代雄激素的存在或量的工作站。
本公开的另一方面为有形地体现在非暂时性机器可读存储介质中的计算机程序产品,其包括配置为使一个或多个数据处理器执行操作以测量样品中至少一种11-氧代雄激素的存在或量的指令,所述操作包括下列步骤中的至少一个:(a)从受试者得到样品;(b)任选地将稳定同位素标记的11-氧代雄激素添加到所述样品中作为内标;(c)进行液-液萃取;和(d)通过串联质谱法测量11-氧代雄激素。
已经在上文中陈述的本公开的某些目的将随着结合如下文所述的附图和实施例进行的描述而变得更加显而易见。
附图简述
已经由此概括地描述了本发明,现在将参考非限制性附图,这些附图不一定按比例绘制。
图1显示为根据本公开的一个实施方案的用于定量分析11-氧代雄激素的方法的流程图。
图2显示为根据本公开的一个实施方案的用于定量分析11-氧代雄激素的系统。
图3显示根据本公开的一个实施方案的11-酮基睾酮、11-羟基-Δ4雄烯二酮和11-羟基睾酮各自在20ng/dL雄激素下的质谱图。
图4显示根据本公开的一个实施方案的11-酮基睾酮、11-羟基睾酮和11-羟基Δ4雄烯二酮的方法相关性。
图5显示根据本公开的一个实施方案的11-酮基睾酮(11KT)、11-羟基睾酮(11OHA)和11-羟基Δ4雄烯二酮(11OHT)在男性和女性中的参考区间。
详细描述
现在将在下文中参考所附描述和附图更全面地描述本公开的主题,其中显示了本公开的主题的一些但不是所有的实施方案。本公开的主题可以以许多不同的形式体现并且不应被解释为限于在本文中举出的实施方案;相反,提供这些实施方案,使得本公开将满足适用的法律要求。相同的数字自始至终是指相同的要素。
受益于在本公开主题所涉及的前述描述和相关附图中呈现的教导,本领域技术人员将想到本文举出的本公开的主题的许多变型和其他实施方案。因此,应当理解,本公开的主题不限于所公开的具体实施方案,并且变型和其他实施方案旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文使用了特定术语,但它们仅用于一般和描述性意义,而不是出于限制的目的。
定义
尽管认为本领域普通技术人员可以很好地理解以下术语,但举出以下定义在于有利于对本公开的主题的解释。在整个说明书中可以找到其他定义。除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与所描述的本公开主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
尽管阐述本发明宽范围的数值范围和参数为近似值,但在具体实施例中举出的数值尽可能精确地报道。然而,任何数值都固有地包含某些误差,这些误差必然由在其相应测试测量值中发现的标准偏差产生。此外,本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如,“1至10”的规定范围应被视为包括最小值1和最大值10之间(并包括在内)的任何和所有子范围;也就是说,所有子范围都以1或以上的最小值开始,例如1至6.1,并且以10或以下的最大值结束,例如5.5至10。此外,任何称作“并入本文”的涉及应被理解为以整体并入。
当在包括权利要求在内的本申请中使用时,术语“一个”、“一种”和“所述”是指“一个或多个”。因此,例如,所涉及的“一个单元格”包括多个这样的单元格,上下文中有明显相反指示的除外(例如,多个单元格)等。
术语“精确度”是指表示为绝对和/或相对偏差的测试结果与接受的参比值之间的一致性的紧密度。
术语“分析物”是指待测量或检测的化合物和/或以可测量的量的名称表示的组分。
术语“分析测量范围”(AMR)是指一种方法可以直接对样品测量而无需任何稀释、浓缩或其他不为通常分析过程组成部分的预处理的分析物值的范围。
术语“分析干扰”是指由于存在与检测试剂或信号本身发生特异性或非特异性反应的物质,分析物的表观浓度、活性或强度的人为增加或减少。
术语“生物样品”是指得自生物来源,包括但不限于动物、细胞培养物、器官培养物等的样品。适合的样品包括血液、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、脑脊液、器官、毛发、肌肉或其他组织样品。
术语“生物标志物”是可以提供有关生物体的生理状态的生物信息的任何生物分子。在某些实施方案中,生物标志物的存在或不存在可能会提供信息。在其他实施方案中,生物标志物的水平可以提供信息。
术语“特异性”是指当与样品中可能发现的物质一起出现时区分关注的分析物的测量方法的能力。在一个实施方案中,其表示为在不存在关注的分析物的情况下对除关注的分析物以外的物质的交叉反应性和/或响应的百分比(%)。
术语“选择性”是指测量方法准确测量关注的分析物的能力,而不会影响样品中可能发现的物质。在一个实施方案中,其表示为在关注的分析物存在下对除关注的分析物以外的物质的交叉反应性和/或响应的%。
如本文所用,“受试者”可以包含动物。因此,在一些实施方案中,样品或生物样品得自哺乳动物,包括、但不限于狗、猫、大鼠、猴子等。在一些实施方案中,样品或生物样品得自人体受试者。在一些实施方案中,受试者为患者,即诊断、预后或治疗疾病或病症的在临床环境中自身呈现的活人。在一些实施方案中,测试样品不为生物样品,而是包含非生物样品,例如在合成类固醇的制造或实验室分析过程中得到的,可以对其进行分析以确定制造和/或分析过程的组成和/或收率。
术语“纯化”或“分离”或其衍生物不一定是指从样品基质中除去非关注的分析物的所有材料。而是在一些实施方案中,术语“纯化”或“分离”是指相对于样品基质中存在的一种或多种其他组分富集一种或多种关注的分析物的量的方法。在一些实施方案中,可以使用“纯化”或“分离”方法去除样品中可能干扰分析物检测的一种或多种组分,例如,一种或多种可能干扰通过质谱法检测分析物的组分。
如本文所用,“衍生”是指使两个分子反应形成一个新分子。衍生剂可以包括异硫氰酸酯基、丹磺酰基、二硝基氟苯基、硝基苯氧基羰基和/或邻苯二甲醛基。
如本文所用,术语“色谱法”是指这样一种方法,其中由液体或气体携带的化学混合物由于化学实体在固定的液相或固相周围或上方流动时的不同分布而被分离成组分。
术语“空白限值”(LOB)是指对于空白样品可能观察到的最高测量结果(具有规定的概率)。LOB典型地表示为平均值+空白测量值的1.645x SD(或2x SD)。
术语“检测限”(LOD)是指样品中可以检测到的最低分析物的量(具有规定的概率)。LOD典型地表示为LOB+低样品测量的1.645x SD(或2x SD)。
术语“定量下限”(LLOQ)是指样品中能够以规定的可接受的精密度和准确度定量测定的分析物的最低的量。
术语“定量上限”(ULOQ)是指无需稀释即可定量测定的样品中分析物的最高的量。
术语“运行内不精确”是指在相同测量条件下(相同分析运行)对相同待测量物进行连续测量的结果之间的紧密度。
术语“运行间不精确”是指在规定条件下(不同的分析运行和/或操作员、实验室、仪器、试剂批次、校准品等)获得的独立测试结果之间的紧密度。
术语“最大稀释度/浓度”是指为获得可报告的数字结果而进行的最大稀释度和/或浓度的既定实验室规范。
术语“参考区间”是指当应用于实验室服务的人群时正确地包括大部分具有与参考组相似特征的受试者并排除其他人的区间。
如本文所用,“液相色谱法”(LC)是指当流体均匀地渗透通过细碎物质柱或通过毛细管通道时选择性阻滞流体溶液的一种或多种组分的方法。阻滞是当流体相对于固定相移动时由一种或多种固定相与大量流体(即流动相)之间的混合物组分的分布引起。“液相色谱法”包括反相液相色谱法(RPLC)、高效液相色谱法(HPLC)和高湍流液相色谱法(HTLC)。如本文所用,术语“HPLC”或“高效液相色谱法”是指液相色谱,其中通过迫使流动相在压力下通过固定相(典型地为紧密填充柱)来增加分离度。
色谱柱典型地包括介质(即填充材料)以便有利于化学部分的分离(即分级分离)。介质可以包括微小颗粒。该颗粒可以包括键合的表面,其与不同化学部分发生相互作用以有利于化学部分例如本文实验中定量的生物标志物分析物的分离。一种适合的键合表面为疏水性键合表面,例如烷基键合表面。烷基键合表面可以包括C-4、C-8或C-18键合烷基,优选C-18键合基团。色谱柱包括用于接收样品的入口和用于排出包括分级分离的样品的流出物的出口。在所述方法中,样品(或预纯化的样品)可以在入口处施加到柱上,用溶剂或溶剂混合物洗脱,并在出口处排出。可以选择不同的溶剂模式来洗脱不同的关注的分析物。例如,液相色谱可以使用梯度模式、等度模式或多型(polytyptic)(即混合)模式进行。
如本文所用,“高湍流液相色谱”或“HTLC”或“湍流液相色谱”或“TFLC”分析依赖于柱填料,其中样品通过柱的湍流是从样品中分离关注的分析物的基础。在此类柱中,分离是一个扩散过程。湍流、例如由HTLC柱和方法提供的湍流可以提高质量转移速率,从而改善所提供的分离特性。例如,在典型的高湍流或湍流液相色谱系统中,可以将样品直接注射到填充有大(例如>25微米)颗粒的窄(例如0.5mm至2mm内径×20至50mm长)的柱上。当流速(例如每分钟3至500mL)施加于柱时,柱的相对较窄的宽度会导致流动相速度增加。柱中存在的大颗粒可以防止增加的速度引起背压并促进颗粒之间形成振荡涡流,从而在柱内产生湍流。
在高湍流液相色谱中,分析物分子可以快速结合到颗粒上并且典型地不会沿着柱的长度展开或扩散。这种减少的纵向扩散典型地可以提供关注的分析物从样品基质中更好且更快的分离。此外,柱内的湍流减少了典型地在分子通过颗粒时发生的摩擦。例如,在传统的HPLC中,最靠近颗粒的分子沿色谱柱移动的速度比流经颗粒之间路径中心的分子慢。这种流速差异导致分析物分子沿着色谱柱的长度展开。当将湍流导入柱中时,颗粒对分子的摩擦可以忽略不计,从而减少了纵向扩散。
如本文所用,术语“分析柱”是指具有足够的色谱板以实现测试样品基质的组分分离的色谱柱。优选地,从分析柱洗脱的组分以允许所测定的关注的分析物的存在或量的方式进行分离。在一些实施方案中,分析柱包含具有平均直径为约5μm的颗粒。在一些实施方案中,分析柱为官能化硅胶或聚合物-硅胶混合物,或聚合物颗粒或整体硅胶固定相,例如苯基-己基官能化分析柱。
分析柱可以区别于“提取柱”,“提取柱”典型地用于从非保留材料中分离或提取保留材料以获得用于进一步纯化或分析的“纯化”样品。在一些实施方案中,提取柱是官能化硅胶或聚合物-硅胶杂化或聚合物颗粒或整体硅胶固定相,例如Poroshell SBC-18柱。
如本文所用,术语“质谱法”或“MS”通常是指基于离子的质荷比或“m/z”过滤、检测和测量离子的方法。在MS技术中,一种或多种关注的分子被电离,然后这些离子被导入质谱仪,其中,由于电场的组合,离子在空间中遵循依赖于质量(“m”)和电荷(“z”)的路径。
在某些实施方案中,质谱仪使用“四极杆”系统。在“四极杆”或“四极杆离子阱”质谱仪中,振荡射频(RF)场中的离子经受与电极之间施加的直流(DC)电位、RF信号的振幅和m/z成正比的力。可以选择电压和振幅,以便只有具有特定m/z的离子穿过四极杆的长度,而所有其他离子都被偏转。因此,四极杆仪器可以作为注入仪器的离子的“质量过滤器”和“质量检测器”起作用。
在某些实施方案中,使用“串联质谱法”(MS/MS)。参见,例如美国专利No.6,107,623,发明名称为“用于串联质谱法的方法和仪器(Methods and Apparatus for TandemMass Spectrometry)”,其通过引用整体并入本文。串联质谱法(MS/MS)为给予一组质谱方法的名称,其中从样品中产生的“母体或前体”离子被裂解以产生一种或多种“碎片或产物”离子,随后通过第二个MS程序进行质量分析。MS/MS方法可用于分析复杂的混合物,尤其是生物样品,部分原因是MS/MS的选择性可以最大限度地减少分析前对样品进行广泛净化的需要。在MS/MS方法的实例中,前体离子从样品中产生并通过第一个质量过滤器(四极杆1或Q1)以选择那些具有特定质荷比的离子。然后,这些离子典型地通过与第二个四极杆(Q2)中的中性气体分子碰撞而碎裂,以产生在第三个四极杆(Q3)中选择的产物(碎片)离子,其质谱由电子倍增器检测器记录。如此产生的产物离子光谱表明前体离子的结构,而质量过滤的两个阶段可以从复杂混合物的常规质谱中存在的干扰种类中去除离子。
如本文所用,术语“电离”和“离子化”是指产生具有净电荷等于一种或多种电子单元的分析物离子的过程。负离子是带一种或多种电子单元的净负电荷的离子,而正离子是带一种或多种电子单元的净正电荷的那些离子。
如本文所用,术语“电子电离”是指气相或气相中的关注的标分析物与电子流相互作用的方法。电子与分析物的碰撞产生分析物离子,然后可将其用于质谱技术。如本文所用,术语“化学电离”是指反应气(例如氨)受到电子撞击且反应气离子与分析物分子相互作用形成分析物离子的方法。如本文所用,术语“场解吸”是指将非挥发性测试样品置于电离表面上并使用强电场产生分析物离子的方法。
如本文所用,术语“解吸”是指从表面去除分析物和/或分析物进入气相。
如本文所用,术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”是指将非挥发性样品暴露在激光照射下,通过各种电离途径(包括光电离、质子化、去质子化和簇衰变)解吸和电离样品中的分析物的方法。对于MALDI,样品与能量吸收基质混合,这有助于分析物分子的解吸。
如本文所用,术语“表面增强的激光解吸电离”或“SELDI”是指另一种方法,其中将非挥发性样品暴露在激光照射下,通过各种电离途径(包括光电离、质子化、去质子化和簇衰变)解吸和电离样品中的分析物。对于SELDI,样品典型地结合到优先保留一种或多种关注的分析物的表面。与MALDI一样,该过程也可以使用能量吸收材料来促进电离。
如本文所用,术语“电喷雾电离”或“ESI”是指一种方法,其中溶液沿毛细管的一小段通过,在毛细管的末端施加高正或负电位。在到达管的末端时,溶液可能被蒸发(雾化)成溶剂蒸气中非常小的溶液液滴的射流或雾流。这种液滴雾可以流过蒸发室,该室被适度加热以防止冷凝和蒸发溶剂。随着液滴变小,表面电荷密度增加,直到相同电荷之间的自然排斥导致离子以及中性分子被释放为止。
如本文所用,术语“大气压化学电离”或“APCI”是指类似于ESI的质谱方法,然而,APCI通过在大气压下等离子体内发生的离子分子反应产生离子。等离子体由喷雾毛细管和对电极之间的放电维持。然后,典型地使用一组差压泵送分离器阶段将离子提取到质量分析器中。干燥和预热的N2气体的逆流可以用于改善溶剂的去除。在分析极性较小的种类时,APCI中的气相电离比ESI更有效。
如本文所用,术语“大气压光电离”(“APPI”)是指质谱的形式,其中分子M的光电离机制为光子吸收和电子射出以形成分子M+。因为光子能量典型地恰好高于电离电位,所以分子离子不太容易解离。在许多情况下,能够在不需要色谱的情况下分析样品,从而节省大量时间和费用。在水蒸气或质子溶剂存在下,分子离子可以提取H形成MH+。如果M具有高质子亲和力,则往往会发生这种情况。这不会影响定量准确度,因为M+和MH+的总和是常数。质子溶剂中的药物化合物通常被测定为MH+,而非极性化合物例如萘或睾酮通常形成M+。(参见,例如Robb等人,2000,Anal.Chem.72(15):3653-3659)。
如本文所用,术语“电感耦合等离子体”是指样品在足够高的温度下与部分电离的气体相互作用以使大多数元素原子化和电离的方法。
如本文所用,术语“在线”是指纯化或分离步骤以这样的方式进行,即测试样品被处理,例如注射到系统中,在所述系统中,系统的各个组件可操作地连接,并且在一些实施方案中,彼此流体连通。
与术语“在线”相反,术语“离线”是指与先前和/或随后的纯化或分离步骤和/或分析步骤分开进行的纯化、分离或提取方法。在这样的离线方法中,关注的分析物典型地例如在提取柱上或通过液/液萃取与样品基质中的其他充分分离,然后收集用于随后等导入到另一个色谱或检测器系统中。离线方法典型地需要部分操作员的手动干预。
如本文所用,术语“免疫测定法”(IA)是指一种通过量化物质与抗体的结合或结合抑制来测量关注的分析物的量的方法。当酶用于检测物质(例如抗原)与抗体的结合量时,该测定法是酶联免疫测定(ELISA)。如本文所用,术语“放射免疫分析”(RIA)是指一种通过量化放射性标记的物质与抗体的结合或结合抑制来测量关注的分析物的量的方法。
如本文所用,术语“发生溶血的”是指红细胞膜破裂,导致血红蛋白和其他细胞内容物释放到血浆或血清中,且术语“脂血的”是指血液中脂肪或脂质过多。
通过LC-MS分析11-氧代雄激素的方法和系统
本公开的实施方案包括用于定量分析作为内源性生物标志物的11-氧代雄激素的方法和系统。这些生物标志物的测量可用于临床诊断。在一个实施方案中,所公开的方法和系统允许在不需要衍生过程的情况下测量此类激素。在某些实施方案中,适合通过本公开的方法和系统进行分析的测试样品可以包括任何液体样品,所述液体样品可以包含一种或多种关注的目标分析物。在一个实施方案中,生物标志物对受试者是内源性的。例如,在一些实施方案中,测试样品包含生物样品。本发明可以以多种方式实施。
方法
在一个实施方案中,本公开包含用于测定样品中关注的至少一种11-氧代雄激素的存在或量的方法,所述方法包括提供认为含有至少一种关注的11-氧代雄激素生物标志物的样品;以色谱方式将所述至少一种关注的11-氧代雄激素生物标志物与样品中的其他组分分离;和通过质谱法分析所述以色谱方式分离的至少一种关注的11-氧代雄激素生物标志物以测定样品中所述至少一种关注的生物标志物的存在或量。在一些实施方案中,生物样品为得自人或另一种哺乳动物的生物样品。
在某些实施方案中,所述11-氧代雄激素可以包括11-羟基雄烯二酮(11OHA)、11-羟基睾酮(11OHT)或11-酮基睾酮(11KT)中的至少一种。如本文所用,所述11-羟基雄烯二酮(11OHA)是指11-羟基Δ4雄烯二酮。
例如,在一个实施方案中,公开了通过串联质谱法测定生物样品中至少一种11-氧代雄激素的存在或量的方法。所述方法可以包括下列步骤中的任一个:(a)从受试者得到生物样品;(b)任选地将稳定同位素标记的11-氧代雄激素添加到所述生物样品中作为内标;(c)任选地进行液-液萃取;(d)进行HPLC;和(e)通过质谱法测定所述11-氧代雄激素(标记或未标记的)。在一个实施方案中,所述质谱法为串联质谱法(MS/MS)。例如,在一个实施方案中,所述串联MS/MS质谱法包含使用三重四极杆串联质谱仪。
在一个实施方案中,所述串联质谱法可以包括下列步骤:(i)生成所述11-氧代雄激素的前体离子;(ii)生成所述前体离子的一种或多种碎片离子;和(iii)检测步骤(i)中生成的所述前体离子和/或步骤(ii)中生成的所述至少一种或多种碎片连接或两者的存在或量,并将检测到的离子与样品中11-氧代雄激素的存在或量相关联。在某些实施方案中,串联质谱法使用正离子大气压化学电离(APCI)模式。此外,在某些实施方案中,关注的分析物和任选的内标的定量以选择反应监测模式(SRM)进行。
在一个实施方案中,所述串联质谱法与HPLC偶联。HPLC步骤可以直接先于串联质谱分析(即LC-MS/MS)。在一些实施方案中,HPLC为高湍流液相色谱法(HTLC)。在某些实施方案中,样品不进行合相色谱。在一些实施方案中,LC不为超高效液相色谱法(UPLC)。
在一个实施方案中,LC-MS/MS在线进行。例如,如本文所公开的,所述方法的任一步骤均可以由计算机控制。在一些实施方案中,计算机包含一个或多个数据处理器和/或包含指令(例如软件程序)的非暂时性计算机可读存储介质。因此,本文还公开了一种包含指令的非暂时性计算机可读存储介质,当在一种或多种计算机上执行该指令时,使一种或多种计算机执行包含本文公开的方法的至少一个步骤的操作。
在某些实施方案中,所述方法可以包含测量多个m/z前体-碎片转变。例如,在某些实施方案中,并且如本文中更详细地解释的,选择第一个碎片用于关注的11-氧代雄激素的定量,而可以选择一个或多个另外的碎片作为定性标准。
例如,对于11-羟基雄烯二酮(11OHA),可以测量303.401m/z的前体到121.150、121.100、121.050m/z的碎片(回波峰)的转变与105.100和/或97.100m/z的定性特征(qualifier)碎片峰。或者,可以测量121.100的m/z碎片。对于内标2H4-11β-羟基雄烯二酮,前体离子可以为308.400m/z,而碎片可以为122.200m/z。对于内标定性特征峰,前体离子可以为307.400m/z,而碎片可以为109.200m/z。
对于11-酮基睾酮(11KT),可以测量303.400m/z的前体到121.200、121.150或121.250m/z的碎片的转变与105.200和/或91.200m/z的定性特征碎片峰。或者,可以测量121.200的m/z碎片。对于内标2H3-11β-酮基睾酮,前体离子可以为306.400m/z,而碎片可以为121.20m/z。
对于11-羟基睾酮(11OHT),可以测量305.400m/z的前体到121.100、121.150或121.050m/z的碎片的转变与105.000和/或97.000m/z的定性特征碎片峰。或者,可以测量121.100的m/z碎片。对于内标2H4-11β-羟基睾酮,前体离子可以为309.200m/z,而碎片可以为121.100m/z。对于内标2H4-11β-羟基睾酮定性特征峰,前体离子可以为309.200m/z,而碎片可以为109.100和/或97.100m/z。
在一些实施方案中,本公开的方法包括在LC-MS/MS之前至少部分纯化关注的11-氧代雄激素。在一些实施方案中,所述方法可以包含至少一个纯化步骤,例如蛋白质沉淀、液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、免疫纯化及其任意组合。在某些实施方案中,样品经过萃取柱。在一个实施方案中,该柱为LLE柱。在一个实施方案中,LLE可以包含使用己烷:乙酸乙酯。或者,在一些实施方案中,该柱为SPE柱。在某些情况下,提取和质谱分析在线进行。所述方法还可以包括在通过LC-MS/MS进行分析之前稀释样品。部分纯化还可以包含稀释。在一些实施方案中,对每批重复组的活性炭处理校准品进行分析,并根据将已知量的每种纯化分析物掺入活性炭处理血清中生成的校准曲线确定样品中单个分析物的反算量,以便生成在约3.0至1,000ng/dL范围内的关注的纯化分析物的最终浓度。
本发明方法(2)的实例如图1中所示。因此,在一个实施方案中,所述方法可以包括提供样品的步骤,例如,认为含有关注的一种或多种11-氧代雄激素的血清样品(4)。在一些实施方案中,将适合的内标添加到样品中(6)。例如,在用于分析血清样品中的11-氧代雄激素的本公开的方法的一些实施方案中,添加2H3-11β-酮基睾酮、2H4-11β-羟基睾酮和/或2H4-11β-羟基雄烯二酮中的至少一种(购自King of Prussia,PA)作为分别测量11KT、11OHT和11OHA的内标。或者,可以使用11KT、11OHT或11OHA的其他稳定标记的同位素。
在另外的实施方案中,可以使用关注的11-氧代雄激素生物标志物的结构类似物。例如,这样的结构类似物可以包含其中第一个化学基团被第二个化学基团替代的化合物。通常,这些基团具有相似的化学反应性,但质量不同,例如,甲基(-CH3)基团被乙基(-CH2CH3)基团替代。
在一些实施方案中,在HPLC之前,通过样品(8)的LLE部分纯化关注的分析物。此外和/或可选地,可以在后续纯化步骤中在可用于LC或MS的溶剂中稀释样品。
在一个实施方案中,LLE用于浓缩和部分纯化分析物。例如,LLE可以从生物样品中除去脂质和/或纤维蛋白原。在一些实施方案中,可以用有机溶剂从血清样品中萃取11-氧代雄激素。例如,在一个实施方案中,使用混合了更具极性的溶剂的烷烃。例如,在某些实施方案中,将己烷与更具极性的溶剂混合。在一个实施方案中,极性溶剂包含乙酸乙酯或类似溶剂。在一个实施方案中,使用9:1的己烷:乙酸乙酯。或者,可以使用其他溶剂。在LLE后,可以离心样品(例如2000rpm或1207g)约1分钟,滗析上清液,并且蒸发沉淀的样品以去除残留溶剂,且然后用适合于LC或HPLC的溶剂(例如乙腈:水)重构。
仍然涉及图1,所述方法还可以包括液相色谱(9)作为从样品中的其他组分中分离关注的分析物的方式。在一个实施方案中,使用两个液相色谱步骤。例如,所述方法可以包含第一萃取柱液相色谱法,随后是将关注的生物标志物转移至第二HPLC分析柱。在其他实施方案中,仅使用一个HPLC步骤。
例如,可以将重构的萃取物施加到HPLC系统上,其中使用经萃取柱的等度分离洗脱分析物。在某些实施方案中,所用的流动相包含梯度。
在某些实施方案中,液相色谱法可以包含高湍流液相色谱法或流通量液相色谱法(HTLC)(有时称作湍流液相色谱法(TFLC)。参见,例如Zimmer等人,J.Chromatogr.A 854:23-35(1999);另外参见美国专利Nos.5,968,367;5,919,368;5,795,469;和5,772,874。在一些实施方案中,HTLC单独或与一种或多种纯化方法组合可以用于纯化关注的生物标志物,然后进行质谱。此外,在一些实施方案中,HTLC样品制备方法的应用可以消除对于其他样品制备方法包括液-液萃取的需求。因此,在一些实施方案中,可以处置测试样品,例如生物流体,例如直接注入到高湍流液相色谱法系统上。
例如,在一个实施方案中,使用由4-1100系列的四元泵、4-1100系类的二元泵、8-1100系列的真空脱气器或8-1200系列的二元泵、8-1200系类的真空脱气器组成的Aria TX4HTLC系统(Thermo Scientific MA)。在该实施方案中,用10%在试剂级水中的乙腈重构样品,然后施加到HTLC柱上。在一个实施方案中,泵A流动相为乙腈:甲醇:水(5:5:90),且泵B流动相为乙腈:甲醇:水(45:45:10)。
然后将分离的分析物导入质谱仪(MS)系统(10)。在一些实施方案中,使用串联MS/MS系统。在一个实施方案中,使用API 5000或API 5500(或等效物)串联质谱仪Danaher(Toronto,CA)。然后可以基于如本文详述的由串联MS测量的特征转变的量来量化关注的分析物。在一些实施中方案中,串联质谱仪包含三重四极杆质谱仪。
在质谱分析中,分析物被电离以产生适合在质量分析器中分辨的气相离子。电离发生在离子源中。本领域存在几种已知的离子源。在一些实施方案中,可以通过本领域已知的任何方法电离分析物。例如,可以使用以下任何离子源进行电离:大气压化学电离(APCI)、大气压光电离(APPI)、电子碰撞电离(EI)、电喷雾电离(ESI)、基质辅助激光解吸(MALDI)、表面增强激光解吸电离(SELDI)、热喷雾电离、电感耦合等离子体(ICP)和快速原子轰击(FAB)。11-氧代雄激素可以以正离子或负离子方式电离。
在某些实施方案中,串联质谱仪采用正离子大气压化学电离(APCI)模式操作。在一些实施方案中,分析物和内标的定量在选择反应监测模式(SRM)下进行。
在一些实施方案中,当对通过将已知量的纯化分析物材料添加到标准测试样品、例如活性炭处理人血清中产生的校准曲线进行内部标准化时,每个样品中每种分析物的反算量可以通过比较样品响应或响应比来测定。在一个实施方案中,当采用内标与浓度校准曲线时,校准物以已知浓度制备以产生响应或响应比。在一个实施方案中,该测定至少部分由计算机或数据分析系统和/或包含指令的非暂时性计算机可读存储介质执行,当在一个种或多个数据处理器上执行时,该指令导致一种或多种数据处理器执行操作以做出该操作。
在不同的实施方案中,所述方法包括详细审查原始数据、质量控制、审查和解释患者结果,然后发布到实验室系统。例如,在某些实施方案中,每批样品使用重复的校准曲线。如果回算的浓度在LLOQ下超过理论浓度>20%或在其他浓度下超过15%,则总计25%的标准点可以从合并曲线中排除。在一个实施方案中,结果可能会低于最低或高于剩余的最高标准报告。在一个实施方案中,标准曲线相关系数为(r)>0.98。此外,在某些实施方案中,对照池必须在本领域已知的可接受限度内。例如,在某些实施方案中,可以为11KT、11OHT和11OHA选择四个级别的对照。在一些实施方案中,每次运行的对照数据都记录在Levy-Jennings图上。可以检查对照图的变化或趋势。可以检查所有色谱峰形的一致性。例如,观察到峰值失真的地方;可能存在污染物。在一个实施方案中,所述方法包括通过确认积分峰的保留时间相应于校准品和质量控制样品来确保在色谱图中观察到多个峰的情况下积分正确的峰。例如,所述方法可以包括审查内标峰面积与指数图。在一个实施方案中,内标峰面积比相邻峰大50%以上可以提交重复分析和/或内标峰面积比相邻峰小33%以上可以提交重复分析。在一个实施方案中,这种审查和分析由计算机或数据分析系统和/或包含指令的非暂时性计算机可读存储介质进行,当在一个或多个数据处理器上执行时,该指令导致一个或多个数据处理器执行此分析和/或审查的操作。
用于分析11-氧代雄激素的系统
在其他实施方案中,公开了一种用于测定样品中一种或多种11-氧代雄激素生物标志物的存在或量的系统。例如,在一些实施方案中,所述系统可以包含:用于提供认为含有关注的至少一种11-氧代雄激素生物标志物的样品的工作站;用于以色谱方式将关注的所述至少一种11-氧代雄激素生物标志物与样品中的其他组分分离的工作站;和用于通过质谱法分析所述以色谱方式分离的关注的至少一种11-氧代雄激素生物标志物以确定样品中所述一种或多种生物标志物的存在或量的工作站。在一个实施方案中,样品为从人或其他哺乳动物得到的生物样品。
在一个实施方案中,所述质谱法为串联质谱法(MS/MS)。在一个实施方案中,所述质谱法以大气压化学电离(APCI)模式操作。在一个实施方案中,所述关注的11-氧代雄激素生物标志物的定量以选择反应监测模式(SRM)进行。例如,用于串联质谱法的工作站可以包含Applied Biosystems API5000或API5500串联质谱仪(或等效物)Danaher(Toronto,CA)。
在一个实施方案中,用于色谱分离的工作站包含至少一种进行液相色谱(LC)的装置。在一个实施方案中,用于液相色谱的工作站包含萃取色谱柱。另外或可替代地,用于液相色谱的工作站包含用于分析色谱的柱。在某些实施方案中,萃取色谱柱和分析色谱柱包含单工作站或单柱。本文描述了可用于萃取或分析液相色谱的包含固定相和流动相的各种柱。用于萃取液相色谱的柱可能因关注的生物标志物的不同而改变。在一些实施方案中,萃取柱是官能化硅胶或聚合物-硅胶混合物或聚合物颗粒或整体硅胶固定相,例如PoroshellSBC-18柱。用于分析液相色谱的柱可能因关注的生物标志物和/或用于萃取液相色谱步骤的色谱柱的不同而改变。例如,在某些实施方案中,分析柱包含平均直径约5μm的颗粒。在一些实施方案中,分析柱是官能化硅胶或聚合物-硅胶混合物,或聚合物颗粒或整体硅胶固定相,例如苯基-己基官能化分析柱。
在一些实施方案中,HPLC用于从在样品萃取和/或纯化后与11-氧代雄激素共同纯化的样品中的其他组分中纯化11-氧代雄激素。在一个实施方案中,HTLC用于从样品中的其他组分中纯化11-氧代雄激素。例如,在一个实施方案中,使用由4-1100系列的四元泵、4-1100系类的二元泵、8-1100系列的真空脱气器或8-1200系列的二元泵、8-1200系类的真空脱气器组成的Aria TX4 HPLC系统(Thermo Scientific MA)。
在一个实施方案中,所述系统可以进一步包含用于例如通过液-液萃取(LLE)和/或稀释从样品中的其他组分中部分纯化关注的所述至少一种11-氧代雄激素生物标志物的工作站。或者,在一些实施方案中,可以使用固相萃取(SPE)。因此,在某些实施方案中,所述系统还可以包含用于从测试样品中提取一种或多种11-氧代雄激素和/或稀释样品的工作站。用于部分纯化(例如LLE)的工作站可以包含设备和试剂,其用于向样品中添加溶剂和去除废物部分。在某些情况下,使用同位素标记的内标,例如2H3-11β-酮基睾酮、2H4-11β-羟基睾酮和/或2H4-11β-羟基雄烯二酮(购自King of Prussia,PA)来标准化在操作过程中可能发生的生物标志物丢失。因此,用于LLE的工作站可以包含与溶剂一起工作所需的罩或其他安全部件。
此外,在某些实施方案中,工作站的至少一种为自动化的和/或由计算机控制。例如,如本文所述,在某些实施方案中,至少有些步骤是自动化的,使得几乎不需要人工干预。例如,如本文所公开的,任何一个工作站都可以由数据处理器或计算机控制。本文还公开了一种数据处理器和/或包含指令的非暂时性计算机可读存储介质,当在一个或多个数据处理器或计算机上执行时,该指令导致一个或多个数据处理器或计算机执行系统的工作站的至少一个的操作。
图2显示本发明的系统(100)的实施方案。如图2中所示,所述系统可以包含用于将可以包含关注的生物标志物(例如一种或多种11-氧代雄激素)的样品(104)等分入采样容器中的工作站。在一个实施方案中,将样品等分入一个或多个容器中,以有利于液-液萃取或样品稀释。用于等分的工作站可以包含容器以丢弃分析中未使用的样品部分。
所述系统还可以包含用于向样品添加内标的工作站(108)。在一个实施方案中,内标包含用非天然同位素标记的关注的生物标志物(例如一种或多种11-氧代雄激素)。因此,添加内标的工作站可以包含安全部件,以有利于向样品添加同位素标记的内标溶液。在一些实施方案中,所述系统还可以包含用于LLE和/或样品稀释的工作站(110)。
所述系统还可以包含用于样品的液相色谱(LC)的工作站(112)。如本文所述,在一个实施方案中,用于液相色谱的工作站可以包含萃取液相色谱柱,或者该工作站可以包含HPLC而没有萃取柱。或者,如下文更详细讨论的,可以使用其他类型的液相色谱法,例如高湍流液相色谱法(HTLC)。例如,在一个实施方案中,使用由4-1100系列的四元泵、4-1100系类的二元泵、8-1100系列的真空脱气器或8-1200系列的二元泵、8-1200系类的真空脱气器组成的Aria TX4 HTLC系统(Thermo Scientific MA)。在该实施方案中,样品可以在施加到HTLC柱上之前用在试剂级水中10%的乙腈中重构。在一个实施方案中,泵A流动相为乙腈:甲醇:水(5:5:90),泵B流动相为乙腈:甲醇:水(45:45:10)。
因此,用于液相色谱的工作站可以包括含有固定相的柱,以及含有用作流动相的溶剂的容器或贮器。该工作站可以包含适当的管线和阀门,以调整施加到一个或多个柱上的各溶剂的量。此外,该工作站可以包含一种方法来从LC中去除和丢弃那些不包含关注的生物标志物的级分。在一个实施方案中,不包含关注的生物标志物的级分被不断地从柱中去除并送到废物容器进行去污和丢弃。
此外,所述系统可以包含用于表征和量化关注的11-氧代-雄激素的工作站。在一个实施方案中,所述系统可以包含用于11-氧代-雄激素生物标志物的质谱法(MS)工作站(116)。在一个实施方案中,用于质谱法的工作站包含串联质谱法(MS/MS)工作站。此外,表征和量化工作站可以包含用于数据分析的工作站(118)。用于数据分析的工作站可以是MS/MS工作站的组成部分,也可以是单独的工作站,并且可以包含用于分析MS/MS结果的计算机和/或软件。在一个实施方案中,用于数据分析的工作站包含计算机或数据处理器和/或含有指令的非暂时性计算机可读存储介质(例如软件),当在一个或多个数据处理器上执行时,该指令导致一个或多个数据处理器来执行数据分析。在一个实施方案中,分析包含对关注的生物标志物的鉴定和量化。
在一些实施方案中,纯化或分离步骤的一种或多种可以“在线”进行。在线系统可以包含自动进样器,其用于从一个容器中取出等分部分并将这些等分部分转移到另一个容器中。例如,可使用自动进样器将萃取后的样品转移到LC萃取柱上。在线系统可以包含用于将从LC萃取柱中分离出来的级分注入LC分析柱的一个或多个进样口和/或一种或多种用于将LC纯化样品注入MS系统的进样口。因此,在线系统可以包含一个或多个柱,包括但不限于一个HTLC柱。在这样的“在线”系统中,测试样品和/或关注的分析物可以从系统的一个组件传递到另一个组件而无需退出系统,例如不必收集且然后将其处置到系统的另一个组件中。
在一些实施方案中,在线纯化或分离方法高度自动化。在这样的实施方案中,一旦该过程被设置和启动,则可以在不需要操作员干预的情况下执行这些步骤。例如,在一个实施方案中,系统或系统的部分可以由计算机控制(102)。因此,在某些实施方案中,所述系统可以包含用于控制系统的各个部件的软件,包括泵、阀门、自动进样器等。此类软件可用于通过精确计时样品和溶质添加以及流速来优化提取过程。
尽管所述方法中的一些或所有步骤和包括所述系统的工作站可以是在线的,但是在某些实施方案中,一些或所有步骤可以“离线”进行。
因此,本公开提供了用于应用液相色谱法和质谱法作为将关注的生物标志物分析物(例如11-氧代雄激素)与可能存在于样品中的其他组分分离的方式的方法和系统。所述方法和系统可以包含离线液-液萃取和/或样品稀释步骤,作为在HTLC和串联质谱之前部分纯化样品的方式。所述方法和系统可用于临床诊断。
在某些实施方案中,所述系统和方法可以提供多路测定。例如,本发明的某些实施方案可以包含多路液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)或二维或串联液相色谱-串联质谱(LC)-LC-MS/MS)方法,以便对样品中的一种或多种11-氧代雄激素进行定量分析。
实施方案可以提供某些优势。在一个实施方案中,已开发出一种准确、精确、简单和快速的HPLC-MS/MS同位素稀释商购方法,其能够定量测量血清中的11-酮基睾酮、11-羟基睾酮和11-雄烯二酮。所述方法通过对三种11-氧化雄激素进行多路分析来保存血清样品。可以为成年男性和成年女性制定参考区间。男性和女性的相似分布突出了11-氧雄激素的肾上腺来源。此外,在一个实施方案中,与其他检测系统的良好相关性将允许使用已发表的数据对先天性肾上腺增生、多囊卵巢综合征和前列腺癌的疾病状态进行结果解释。
在某些实施方案中,这些方法和系统可以提供比以前对许多被测分析物可达到的灵敏度更高的灵敏度。此外,所述方法和系统的实施方案可以提供之前对于许多被测量的分析物来说无法达到的快速流通量。
作为另一个优点,所公开的方法和系统提供的特异性和灵敏度可以允许分析来自多种材料的分析物。例如,所公开的方法可以应用于复杂样品基质中关注的分析物的定量,所述复杂样品基质包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、唾液等。此外,使用所公开的方法和系统允许在没有衍生物的情况下以低至13ng/dL的水平测量11-氧代雄激素。因此,所述方法和系统适用于临床应用和/或临床试验。
作为另外潜在的优势,在某些实施方案中,所公开的系统和方法提供用于解决同量异序干扰、变化的样品含量,包括溶血和脂血样品、同时获得目标分析物的低ng/dL定量限(LLOQ)的方法。因此,所公开的方法和系统的实施方案可以提供用于临床诊断的临床生物标志物的定量、灵敏度和特异性检测。
实施例
已经包括以下实施例以为本领域普通技术人员实施本公开的主题的代表性实施方案提供指导。根据本公开和本领域技术人员的一般水平,本领域技术人员可以理解以下实施例仅是示例性的,并且在不脱离本公开主题范围的情况下可以采用多种改变、变型和变更。
实施例1-LC-MS/MS对11-氧代雄激素的验证
使用具有1200泵(Agilent Technologies,Inc.)和5000(Danaher)三重四极杆质谱仪的TX-4HPLC系统(Thermo-Fisher)开发分析方法。为废弃血清(Golden West Biologicals)中的每种分析物制备独立的校准曲线。样品制备由使用三种氘代重同位素内标(IsoSciences)的混合物进行同位素稀释、然后是LLE组成。使用反相C8分析柱(3.0x 50mm,2.7um)和水/甲醇/乙腈溶剂梯度,在4分钟内实现所有同量异位素的色谱分离。正模式大气压化学电离(APCI)用于在多反应监测(MRM)模式下进行检测。MRM为将SRM应用于来自一种或多种前体离子的多个产物离子。
验证数据
每种分析物的分析灵敏度在1-3ng/dL之间,分析测量范围高达1,000ng/dL(稀释时高达10,000ng/dL)。批间分析精密度范围在:在LLOQ,对于11-酮基甲酮(11KT)为4.6-14.9%CV;在LLOQ,对于11-羟基雄烯二酮(11OHA)为6.4-13.4%CV;和在LLOQ,对于11-羟基睾酮(11OHT)为6.1-10.7%。精确度范围在:对于11KT,100.7-106.4%;对于11OHA,99.3-113%;和对于11OHT,98.5-101%。对于11KT(女性,5.0-60.6ng/dL;男性9.5-70.8ng/dL),11OHA(女性,19.2-333ng/dL;男性,36.4-313ng/dL)和11OHT(女性,<39.8ng/dL;男性,5.2-43.4ng/dL)制定了女性和男性成人的参考区间。
所公开的方法和系统的验证结果概述如表1中所示。
表1
报告的计量单位 | ng/dL |
ULOQ值 | 1000 |
LLOQ值 | 1.0(11KT,11OHT)和3.0(11OHA) |
AMR(实际用于生产的分析测量范围) | 3.0-1000ng/dL |
稀释限度 | 1/10 |
最小/最大浓度 | 3.0ng/dL/10,000ng/dL |
使用的主要样品类型 | 人血清 |
实施例2-精确度和准确度
分别用d3-11-酮基睾酮、d4-11-羟基睾酮和d4-11-羟基雄烯二酮(d=氘)进行同位素稀释后,通过LC-MS/MS分析11-酮基睾酮、11-羟基睾酮和11-羟基雄烯二酮。使用己烷:乙酸乙酯溶液从血清样品、标准品和测定对照中提取分析物和内标。将有机级分与水层分离并蒸发至干。将重构的样品、标准品和对照转移到96-孔板中,并使用ARIA TX4HPLC系统和SCIEX API 5000或5500质谱仪通过LC-MS/MS进行分析。当使用0.5mL样品体积时,该测定的分析测量范围为3.0ng/dL至1000ng/dL。实施例质谱图如图3中所示。
11KT 11-酮基睾酮
11OHA 11-羟基雄烯二酮
11OHT 11-羟基睾酮
AMR 分析测量范围
CV 变异系数
LC 液相色谱法
LLOQ 定量下限
MS/MS 串联质谱法
SD 标准偏差
SOP 标准操作程序
ULOQ 定量上限
工作原液由可商购的纯化的11KT、11OHT和11OHA制备,该11KT、11OHT和11OHA从溶解在乙醇中的粉末中称重,并在活性炭处理血清中稀释至1.0-1000ng/dL的工作标准浓度。
生物分析和临床测定质量控制库(n=25)作为典型地在验证中进行的使用。11KT和11OHA和OHT的每个对照均用标准基质和/或人血清中制备。根据所有25项测定中均按照标准操作程序,11-酮基睾酮满足验收标准,11-羟基雄烯二酮满足25项测定中的22项临床验收标准,且11-羟基睾酮满足25项测定中的24项临床验收标准。
通过将计算体积的含有已知浓度的11KT、11OHT和11OHA的溶液掺入活性炭处理血清中来确定准确度。在一个测定中测量每个处理血清样品的20个重复,以确定批内分析的准确度和不精确度。在每次额外的测定运行中测量两次重复,总计24次重复,以确定批间分析的准确度和不精确度。
准确度:批内分析和批间分析准确度为85-115%(在LLOQ为80-120%)且不精确度(%CV)为≤15%(在LLOQ 20%)。
对于11KT,浓度为1.0ng/dL时的批内分析准确度为107.7%,且不精确度为10.0%CV。其他水平的批内分析准确度范围在101.1%-104.7%,且批内分析不精确度范围在3.5-5.9%CV。
对于11OHA,浓度为1.0ng/dL时的批内分析准确度为113.5%,且不精确度为19.9%。其他水平的批内分析准确度范围在97.8-103.7%,且批内分析不精确度范围在5.5-11.2%CV。
对于11OHT,浓度为1.0ng/dL时的批内分析准确度为110.9%,且不精确度为19.4%CV。其他水平的批内分析准确度范围在101.1-103.7%,且批内分析不精确度范围在3.7-8.9%CV。
对于11KT,浓度为1.0ng/dL时的批间分析准确度为106.4%,且不精确度为17.9%CV。其他水平的批间准确度范围在100.7-102.8%,且批间分析不精确度范围在4.1-9.4%CV。
对于11OHA,浓度为1.0ng/dL时的批间分析准确度为113.0%,且不精确度为21.2%,在3.0ng/dL的LLOQ,准确度为103.9%,且不精确度为14.3%。其他水平的批间准确度范围在99.3-100.6%,且批间分析不精确度范围在5.8-6.7%CV。
对于11OHT,浓度为1.0ng/dL时的批间分析准确度为98.5%,且不精确度为18.8%CV。其他水平的批间准确度范围在95.6-101.0%,且批间分析不精确度范围在4.9-16.5%CV。
两个不同测试实验室之间的相关性如图4中所示。比较两个不同测试实验室(实验室1和实验室2)的LC-MS/MS结果的Deming回归分析显示斜率介于0.81-0.88之间(图4)。11KT的Deming回归为y=0.81x+0.38,其中R2值为0.9931。11OHA的Deming回归为y=0.88x+5.59,其中R2值为0.985。11OHT的Deming回归为y=0.82x-0.15,R2值为0.9985。
样品矩阵不精确度验收标准:批内分析和批间分析不精确度(%CV)为≤15%。
对于11KT,批内分析不精确度范围在2.4-4.2%CV。对于11OHA,批内分析不精确度范围在2.9-7.8%CV。对于11OHT,批内分析不精确度范围在2.5-10.9%CV。
对于11KT,批间分析不精确度范围在4.6-9.5%CV。对于11OHA,去除异常数据后的批间分析不精确度范围在6.0-13.0%CV。对于11OHT,批间分析不精确度范围在6.0-10.0%CV。
实施例3-定量下限
将定量下限(LLOQ)定义为在批内分析和批间分析准确度(80-120%)和不精确度(≤20%CV)方面均满足验收标准的最低浓度。
验收标准:批内分析和批间分析准确度为80%-120%且%CV为≤20%。此外,LLOQ处的色谱响应至少是平均空白响应的5倍。
对于11KT,满足LLOQ的验收标准的最低浓度为1.0ng/dL。对于11OHA,满足LLOQ的验收标准的最低浓度为3.0ng/dL。对于11OHT,满足LLOQ的验收标准的最低浓度为1.0ng/dL。
对于11KT,平均色谱响应与来自批内分析准确度数据的平均空白(S0)之比为23.4。来自批间分析准确度数据的色谱响应与空白(S0)之比范围在3.1-56.8,平均值为10.0。
对于11OHA,平均色谱响应与来自批内分析准确度数据的平均空白(S0)之比为8.0。来自批间分析准确度数据的色谱响应与空白(S0)之比范围在4.7-21.8,平均值为9.1。
对于11OHT,平均色谱响应与来自批内分析准确度数据的平均空白(S0)之比为32.5。来自批间分析准确度数据的色谱响应与空白(S0)之比范围在5.1-17.8,平均值为8.9。
实施例4-定量上限
将定量上限(ULOQ)定义为在批内分析和批间分析准确度(85-115%)和不精确度(≤15%CV)方面均满足验收标准的最高浓度。
验收标准:批内分析和批间分析准确度为85-115%且%CV为≤15%。
对于11KT,满足验收标准的测量的最高浓度为1000ng/dL。对于11OHA,满足验收标准的测量的最高浓度为1000ng/dL。对于11OHT,满足验收标准的测量的最高浓度为1000ng/dL。
实施例5-分析干扰(脂血症、溶血和黄疸病)
测试高浓度汇集样品的脂血症、溶血和黄疸的干扰。将高浓度样品与各种体积的血清样品混合,其中包括高脂血症样品、加料至20%(v/v)的红细胞的样品,以及加料至16mg/dL缀合的和16mg/dL未-缀合的胆红素的样品。将结果与原始纯样品进行比较。
验收标准:在每个干扰物浓度下,每个样品的至少2/3重复中的分析物收率为85-115%。对于11KT、11OHA和11OHT中的每一个,在每个浓度下所有重复的脂血症、溶血和胆红素都在验收标准内。这表明这些基质组分对11KT、11OHA或11OHT的分析没有影响。
实施例6-样品类型
红顶(red-top)血清、SST血清、EDTA血浆和肝素血浆的样品采集自三个志愿者供体。每种样品类型一式三份进行分析,并将SST血清、EDTA血浆和肝素血浆的个体和平均结果与红顶血清结果进行比较。
验收标准:与基线(红顶血清)相比,平均结果和每种样品类型2/3重复的分析物回收百分比为85-115%。
实施例7-人血清和标准基质中的选择性
通过将已知浓度的分析物(0、50、200和800ng/dL)添加到人血清样品中来证明所述方法的选择性。纯样品和加料样品一式三份进行分析,并将结果与纯平均结果进行比较。
验收标准:分析物的收率在预期值的85-115%内(纯平均结果+加料浓度)。对于11KT、11OHA和11OHT中的每一种,每个浓度的所有重复都在预期结果的85-115%内。
标准基质中的选择性也通过用已知浓度的分析物(0、50、200和800ng/dL)加入活性炭处理血清,然后一式三份分析纯样品和加料样品以及与基线(纯)相比的结果来证明。
验收标准:分析物的收率在预期值的85-115%内(纯平均结果+加料浓度)。对于11KT、11OHA和11OHT中的每一种,每个浓度的所有重复都在预期结果的85-115%内。
实施例8-内标干扰
分析物转变中的内标干扰量通过分析掺入水中的内标的工作浓度,并将分析物转变中的响应与测定的低标准(1.0ng/dL)和准确度样品1(1.0ng/dL)进行比较来证明。
验收标准:内标的分析物响应小于低标准。
对于11KT,内标对分析物转换的平均贡献为低标准响应的26.6%。
对于11OHA,内标对分析物转换的平均贡献为低标准响应的9.5%。
对于11OHT,内标对分析物转变的平均贡献为低标准响应的22.3%。
实施例9-稀释线性
稀释线性通过将三个样品加料至高浓度并用试剂级水稀释它们的1/2、1/5和1/10,然后一式三份进行分析来证明。将稀释结果与纯样品进行比较。
验收标准:每次稀释时,2/3等分部分的收率为85-115%。对于11KT、11OHA和11OHT中的每一个,每个浓度的所有重复都在预期结果的85-115%内,允许样品稀释至多1/10。
实施例10-特异性
所述方法的特异性通过分析潜在干扰类固醇化合物的生理学显著性浓度(1,000ng/dL)来证明。
验收标准:分析物转变响应低于LLOQ。
对于11KT,所有潜在干扰化合物(添加1,000ng/dL的浓度)的分析响应均小于1.0ng/dL的LLOQ(≤0.25ng/dL)。
对于11OHA,所有潜在干扰化合物的分析响应均小于3.0ng/dL的LLOQ(≤0.23ng/dL)。
对于11OHT,所有潜在干扰化合物的分析响应均小于1.0ng/dL的LLOQ(≤0.25ng/dL)。
所评价的潜在干扰化合物如下所示。
实施例11-人血清和处理血清中的短期稳定性和三个月稳定性
A.血清
通过抽取6名健康志愿者并使他们的血清的等分部分经受各种稳定性条件测定血清中的短期稳定性,包括:在低于-55℃下冷冻17天,以及在室温(15-30℃)下冷冻2小时、1天、3天、14天;在低于(<)-10摄氏度下冷冻14天,维持在2-8摄氏度(2小时、3天或14天),或6个冻融循环。在每种稳定性条件下储存的血清一式三份进行分析,并将结果与抽取当天分析的血清的平均结果进行比较。
验收标准:分析物的稳定后浓度在平均基线的85-115%内会导致至少2/3的重复来自至少2/3的供体。
对于11KT,在如下条件显示稳定性:在<-55℃下至少17天,在<-10℃下至少14天,在2-8℃下冷藏14天,在15-30℃下室温下14天,6次冷冻/解冻周期,全血在2-8℃下至少保存1天,全血在15-30℃下保存至少2小时。
11OHA在如下条件显示稳定性:在<-55℃下至少17天,在<-10℃下14天,在2-8℃下冷藏14天,在室温在15-30℃下14天,6次冷冻/解冻循环,全血在2-8℃下至少保存3天,全血在15-30℃下保存至少3天。
11OHT在如下条件显示稳定性:在<-55℃下至少28天,在<-10℃下14天,在2-8℃下冷藏14天,在室温15-30℃下14天,6次冷冻/解冻循环,在2-8℃的全血中至少保存1天,在15-30℃的全血中至少保存2天。
B.处理血清
通过在活性炭处理血清中制备3种浓度的每种分析物并使等分部分经受各种稳定性条件来测定处理血清中的短期稳定性。在每种稳定性条件下储存的处理血清一式三份进行分析,并将结果与制备当天分析的平均基线结果进行比较。
验收标准:分析物的稳定后浓度在平均基线的85-115%内会导致至少2/3的重复来自至少2/3的供体。对于11KT、11OHA和11OHT中的每一种,在如下条件显示稳定性:在<-55℃下至少17天,在<-10℃下14天,在2-8℃下冷藏14天,在室温在15-30℃下14天,和6次冷冻/解冻循环。
C.三个月稳定性
将用于短期稳定性的来自健康志愿者的血清等分部分在<-10℃下储存三个月。每种血清一式三份进行分析,并将结果与抽取当天分析的血清的平均结果进行比较。
验收标准:分析物的稳定后浓度在平均基线的85-115%内会导致至少2/3的重复来自至少2/3的供体。对于11KT、11OHA和11OHT中的每一种,显示在<-10℃下至少3个月的稳定性。
实施例12-自动采样器稳定性
自动进样器的稳定性通过制备测定物并在当天用LC-MS/MS对其进行分析将处理后的测定物在自动进样器中在10℃下放置至少48小时且然后重新分析它来证明。
验收标准:分析物的稳定后浓度在平均基线的85-115%内导致至少2/3的测试样品。自动进样器稳定性实验使用10%乙腈水溶液作为储存缓冲液进行84小时。11KT满足验收标准,其中68个中的65个(95.6%)后稳定性结果在原始的85-115%内,平均收率为100.1%。11OHA满足验收标准,68个中的60个(88.2%)后稳定性结果在原始结果的85-115%内,平均收率为105.1%。11OHT满足验收标准,68个中的47个(69.1%)在原始结果的85-115%内,平均收率为107.1%。
实施例13-平台稳定性
通过制备2种测定物并在当天用LC-MS/MS分析一种,将另一种测定物在15-30℃的平台上放置至少48小时,且然后对其进行分析来证明平台稳定性。最初的测试使用甲醇:水作为重构缓冲液,但发现11KT和11OHA在乙腈:水中更稳定。
验收标准:分析物的稳定后浓度在平均基线的85-115%内产生至少2/3的测试样品。
11KT满足验收标准,68个中的64个(94.1%)后稳定性结果在原始的85-115%内,平均收率为101.3%。
11OHT满足验收标准,68个中的52个(76.5%)后稳定性结果在原始的85-115%内,平均收率为106.6%。
11OHA也满足验收标准,68个中的60个(88.2%)后稳定结果在原始结果的85-115%内,平均收率为100.9%。
实施例14-标准曲线准确度和不精确度
标准准确度和不精确度通过编译6次测定中标准的反算浓度来证明。每次运行包括八个标准点来定义校准曲线。通过排除不超过25%的超过目标浓度±15%(LLOQ为±20%)的数据点来调整标准曲线。
验收标准:有效的标准曲线需要每条标准曲线至少有6个可接受的点,并且在目标浓度的±15%(LLOQ下为±20%)范围内的反向计算精度。批间分析准确度为85%-115%(LLOQ为80%-120%),%CV为≤15%(在LLOQ≤20%)。
对于11KT,LLOQ下6次测定内批间分析准确度为102.9%,且其他浓度范围在97.4%-101.8%。LLOQ的批间分析不精确度为11.5%CV,且其他浓度的CV范围在2.9%-4.8%。所有6条标准曲线均满足验收要求。
对于11OHA,低标准的6次测定内的批间分析准确度为102.9%,且其他浓度范围在97.6%-103.1%。LLOQ的批间不精确度为17.2%CV,且其他浓度范围在2.8-8.1%CV。所有6条标准曲线均满足验收要求。
对于11OHT,低标准下6种测定内的批间分析准确度为100.6%,且其他浓度在96.5%-102.5%。LLOQ的批间不精确度为19.7%CV,且其他浓度的CV范围在2.4%-7.4%。所有6条标准曲线均满足验收要求。
实施例15-参考区间
11KT、11OHA和11OHT的参考区间通过分析在该测定的参考区间中最少120个成年女性和120个成年男性血清样品的促甲状腺激素结果来确定。验证批次包含用于确定男性和女性参考区间的患者样品,但未筛选这些样品以确定它们是否为可接受的参考区间样品。对额外的患者血清样品进行了睾酮和雄烯二酮筛查。仅将结果在睾酮和雄烯二酮参考区间内的样品用于11-氧类固醇参考区间测试。
测试了123个成年男性样品和137个成年女性样品的11-氧类固醇参考区间(图5)。11KT的成年女性参考区间为5.0-60.6ng/dL。11KT的成年男性参考区间为9.5-70.8ng/dL。11OHA的成年女性参考区间为19.2-333ng/dL。11OHA的成年男性参考区间为36.4-313ng/dL。11OHT的成年女性参考区间为<39.8ng/dL。11OHT的成年男性参考区间为5.2-43.4ng/dL。
实施例16-实施方案
A.1.用于通过串联质谱法测定样品中至少一种11-氧代雄激素的存在或量的方法,包括:
(a)从受试者得到样品;
(b)任选地将稳定同位素标记的11-氧代雄激素添加到所述样品中作为内标;
(c)进行液相色谱法以纯化所述样品;和
(d)通过串联质谱法测量所述11-氧代雄激素。
A.2.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述样品为生物样品。
A.3.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述生物样品包括血液、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、脑脊液、器官、毛发、肌肉或其他组织样品中的一种。
A.4.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述串联质谱法包括下列步骤:(i)生成所述11-氧代雄激素的前体离子;(ii)生成所述前体离子的一种或多种碎片离子;和(ii)检测步骤(i)中生成的所述前体离子和/或步骤(ii)中生成的所述至少一种或多种碎片离子或两者的存在或量;并将检测到的离子与样品中11-氧代雄激素的存在或量相关联。
A.5.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)。
A.6.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述液相色谱法包括高湍流液相色谱法(HTLC)。
A.7.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述11-氧代雄激素可以包括11-羟基雄烯二酮(11OHA)、11-羟基睾酮(11OHT)或11-酮基睾酮(11KT)中的至少一种。
A.8.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,还包括质谱法之前的至少一个纯化步骤。
A.9.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述纯化步骤为液-液萃取(LLE)。
A.10.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述串联质谱法使用正离子大气压化学电离(APCI)模式。
A.11.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,还包括通过将已知量的每种纯化的11-氧代雄激素添加到活性炭处理血清中以产生校准曲线来测定样品中11-氧代雄激素的反算量。
A.12.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,还包括分析每批次中重复组的活性炭处理校准品。
A.13.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中将已知量的所述至少一种11-氧代雄激素添加到活性炭处理校准品中以产生最终浓度在约3.0至1,000ng/dL范围内的纯化的关注的分析物。
A.14.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述串联质谱法以测量所述至少一种11-氧代雄激素的多个前体-碎片转变的方式进行。
A.15.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述串联质谱法包括选择一种或多种碎片离子用于定量所述至少一种11-氧代雄激素和选择一种或多种另外的定性特征碎片离子作为定性标准。
A.16.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-羟基雄烯二酮(11OHA)。
A.17.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中对于11OHA,所述前体离子具有约303.401的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.100的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.100和/或约97.100的m/z的碎片离子。
A.18.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,还包括添加2H4-11β-羟基雄烯二酮作为内标。
A.19.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中对于2H4-11β-羟基雄烯二酮,所述串联质谱法生成具有约308.400的质荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约122.200的m/z的碎片离子。
A.20.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-酮基睾酮(11KT)。
A.21.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中对于11KT,所述前体离子具有约303.400的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.200的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.200和/或约91.200的m/z的碎片离子。
A.22.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,还包括添加2H3-11β-酮基睾酮作为内标。
A.23.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中对于2H3-11β-酮基睾酮,所述串联质谱法生成具有约306.400的质/荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约121.200的m/z的碎片离子。
A.24.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-羟基睾酮(11OHT)。
A.25.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中对于11OHT,所述前体离子具有约305.400的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.100的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.000和97.000的m/z的碎片离子。
A.26.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,还包括添加2H4-11β-羟基睾酮作为内标。
A.27.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,其中对于2H4-11β-羟基睾酮,所述质谱法生成具有约309.200m/z的质/荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约121.100的m/z的碎片离子。
A.28.上述和/或后续实施方案中任一项的方法,包括检测3.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11OHA和/或检测1.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11OHT和/或检测1.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11KT。
B.1.用于测定测试样品中至少一种关注的生物标志物的存在或量的系统,所述系统包含:
用于提供疑似含有一种或多种11-氧代雄激素的测试样品的工作站;
用于将所述一种或多种11-氧代雄激素从样品中的其他组分中部分纯化的工作站;
用于以色谱方式将一种或多种11-氧代雄激素与样品中的其他组分分离的工作站;和
用于通过质谱法分析所述以色谱方式分离的一种或多种11-氧代雄激素以测定测试样品中所述一种或多种11-氧代雄激素的存在或量的工作站。
B.2.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,还包含用于添加所述至少一种关注的生物标志物的至少一种内标的工作站。
B.3.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中用于部分纯化一种或多种11-氧代雄激素的工作站包含进行液-液萃取、固相萃取或蛋白质沉淀中的至少一种的工作站。
B.4.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中用于以色谱方式分离一种或多种11-氧代雄激素的工作站包含进行高效液相色谱法(HPLC)或高湍流液相色谱法(HTLC)的工作站。
B.5.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中用于分析以色谱方式分离的一种或多种11-氧代雄激素的工作站包含串联质谱仪。
B.6.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中工作站中的至少一个由计算机控制。
B.7.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述样品为生物样品。
B.8.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述生物样品包括血液、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、脑脊液、器官、毛发、肌肉或其他组织样品中的一种。
B.9.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述串联质谱法包括下列步骤:(i)生成所述11-氧代雄激素的前体离子;(ii)生成所述前体离子的一种或多种碎片离子;和(ii)检测步骤(i)中生成的所述前体离子和/或步骤(ii)中生成的所述至少一种或多种碎片离子或两者的存在或量;并将检测到的离子与样品中11-氧代雄激素的存在或量相关联。
B.10.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述11-氧代雄激素可以包括11-羟基雄烯二酮(11OHA)、11-羟基睾酮(11OHT)或11-酮基睾酮(11KT)中的至少一种。
B.11.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述纯化步骤为液-液萃取(LLE)。
B.12.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述串联质谱法使用正离子大气压化学电离(APCI)模式。
B.13.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,还包含通过将已知量的每种纯化的11-氧代雄激素添加到活性炭处理血清中以产生校准曲线来测定样品中11-氧代雄激素的反算量的工作站。
B.14.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中将已知量的所述至少一种11-氧代雄激素添加到活性炭处理校准品中以产生最终浓度在约3.0至1,000ng/dL范围内的纯化的关注的分析物。
B.15.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述串联质谱法以测量所述至少一种11-氧代雄激素的多个前体-碎片转变的方式进行。
B.16.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述串联质谱法包括选择一种或多种碎片离子用于定量所述至少一种11-氧代雄激素和选择一种或多种另外的定性特征碎片离子作为定性标准。
B.17.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-羟基雄烯二酮(11OHA)。
B.18.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中对于11OHA,所述前体离子具有约303.401的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.100的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.100和/或约97.100的m/z的碎片离子。
B.19.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,还包含添加2H4-11β-羟基雄烯二酮作为内标。
B.20.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中对于2H4-11β-羟基雄烯二酮,所述串联质谱法生成具有约308.400的质荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约122.200的m/z的碎片离子。
B.21.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-酮基睾酮(11KT)。
B.22.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中对于11KT,所述前体离子具有约303.400的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.200的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.200和/或约91.200的m/z的碎片离子。
B.23.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,还包含添加2H3-11β-酮基睾酮作为内标。
B.24.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中对于2H3-11β-酮基睾酮,所述串联质谱法生成具有约306.400的质/荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约121.200的m/z的碎片离子。
B.25.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-羟基睾酮(11OHT)。
B.26.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中对于11OHT,所述前体离子具有约305.400的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.100的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.000和97.000的m/z的碎片离子。
B.27.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,还包含添加2H4-11β-羟基睾酮作为内标。
B.28.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,其中对于2H4-11β-羟基睾酮,所述质谱法生成具有约309.200m/z的质/荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约121.100的m/z的碎片离子。
B.29.上述和/或后续实施方案中任一项的系统,包含检测3.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11OHA和/或检测1.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11OHT和/或检测1.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11KT。
C.1.一种有形地体现在非暂时性机器可读存储介质中的计算机程序产品,包括配置为使一种或多种数据处理器执行操作以测量样品中至少一种11-氧代雄激素的存在或量的指令,所述操作包括下列步骤中的至少一个:
(a)从受试者得到样品;
(b)任选地将稳定同位素标记的11-氧代雄激素添加到所述样品中作为内标;
(c)进行液相色谱法;和
(d)通过串联质谱法测量所述11-氧代雄激素。
C.2.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述样品为生物样品。
C.3.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述生物样品包括血液、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、脑脊液、器官、毛发、肌肉或其他组织样品中的一种。
C.4.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述串联质谱法包括下列步骤:(i)生成所述11-氧代雄激素的前体离子;(ii)生成所述前体离子的一种或多种碎片离子;和(ii)检测步骤(i)中生成的所述前体离子和/或步骤(ii)中生成的所述至少一种或多种碎片离子或两者的存在或量;并将检测到的离子与样品中11-氧代雄激素的存在或量相关联。
C.5.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)。
C.6.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述液相色谱法包括高湍流液相色谱法(HTLC)。
C.7.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述11-氧代雄激素可以包括11-羟基雄烯二酮(11OHA)、11-羟基睾酮(11OHT)或11-酮基睾酮(11KT)中的至少一种。
C.8.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,还包含质谱之前的用于至少一个纯化步骤的指令。
C.9.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述纯化步骤为液-液萃取(LLE)。
C.10.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品方法,其中所述串联质谱法使用正离子大气压化学电离(APCI)模式。
C.11.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,还包含用于通过将已知量的每种纯化的11-氧代雄激素添加到活性炭处理血清中以产生校准曲线来测定样品中11-氧代雄激素的反算量的指令。
C.12.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,还包含用于分析每批次中重复组的活性炭处理校准品的指令。
C.13.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,还包含用于将已知量的所述至少一种11-氧代雄激素添加到活性炭处理校准品中以产生最终浓度在约3.0至1,000ng/dL范围内的纯化的关注的分析物的指令。
C.14.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述串联质谱法以测量所述至少一种11-氧代雄激素的多个前体-碎片转变的方式进行。
C.15.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述串联质谱法包括选择一种或多种碎片离子用于定量所述至少一种11-氧代雄激素和选择一种或多种另外的定性特征碎片离子作为定性标准。
C.16.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-羟基雄烯二酮(11OHA)。
C.17.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中对于11OHA,所述前体离子具有约303.401的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.100的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.100和/或约97.100的m/z的碎片离子。
C.18.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,还包含用于添加2H4-11β-羟基雄烯二酮作为内标的指令。
C.19.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中对于2H4-11β-羟基雄烯二酮,所述串联质谱法生成具有约308.400的质荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约122.200的m/z的碎片离子。
C.20.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-酮基睾酮(11KT)。
C.21.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中对于11KT,所述前体离子具有约303.400的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.200的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.200和/或约91.200的m/z的碎片离子。
C.22.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,还包含用于添加2H3-11β-酮基睾酮作为内标的指令。
C.23.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中对于2H3-11β-酮基睾酮,所述串联质谱法生成具有约306.400的质/荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约121.200的m/z的碎片离子。
C.24.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-羟基睾酮(11OHT)。
C.25.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中对于11OHT,所述前体离子具有约305.400的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.100的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.000和97.000的m/z的碎片离子。
C.26.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,还包含用于添加2H4-11β-羟基睾酮作为内标的指令。
C.27.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,其中对于2H4-11β-羟基睾酮中,质谱法生成具有约309.200m/z的质/荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约121.100的m/z的碎片离子。
C.28.上述和/或后续实施方案中任一项的计算机-程序产品,包含检测3.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11OHA和/或检测1.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11OHT和/或检测1.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11KT。
本说明书中涉及的所有文献均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下,对本发明所述实施方案的各种变型和改变对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方案描述了本发明,但是应当理解,所要求保护的本发明不应被过度地限于这些特定的实施方案。实际上,对本领域技术人员来说显而易见的实施本发明的所述模式的各种变型旨在被本发明覆盖。
Claims (35)
1.用于通过串联质谱法测定样品中至少一种11-氧代雄激素的存在或量的方法,包括:
(a)从受试者得到样品;
(b)任选地将稳定同位素标记的11-氧代雄激素添加到所述样品中作为内标;
(c)进行液相色谱法以纯化所述样品;和
(d)通过串联质谱法测量所述11-氧代雄激素。
2.权利要求1的方法,其中所述样品为生物样品。
3.权利要求2的方法,其中所述生物样品包括血液、血浆、血清、尿液、唾液、泪液、脑脊液、器官、毛发、肌肉或其他组织样品中的一种。
4.权利要求1的方法,其中所述串联质谱法包括下列步骤:(i)生成所述11-氧代雄激素的前体离子;(ii)生成所述前体离子的一种或多种碎片离子;和(ii)检测步骤(i)中生成的前体离子和/或步骤(ii)中生成的所述至少一种或多种碎片离子或两者的存在或量,并将检测到的离子与样品中11-氧代雄激素的存在或量相关联。
5.权利要求1的方法,其中所述液相色谱法包括高效液相色谱法(HPLC)。
6.权利要求1的方法,其中所述液相色谱法包括高湍流液相色谱法(HTLC)。
7.权利要求1的方法,其中所述11-氧代雄激素可以包括11-羟基雄烯二酮(11OHA)、11-羟基睾酮(11OHT)或11-酮基睾酮(11KT)中的至少一种。
8.权利要求1的方法,还包括质谱法之前的至少一个纯化步骤。
9.权利要求8的方法,其中所述纯化步骤为液-液萃取(LLE)。
10.权利要求1的方法,其中所述串联质谱法使用正离子大气压化学电离(APCI)模式。
11.权利要求1的方法,还包括通过将已知量的每种纯化的11-氧代雄激素添加到活性炭处理血清中以产生校准曲线来测定样品中11-氧代雄激素的反算量。
12.权利要求11的方法,还包括分析每批次中重复组的活性炭处理校准品。
13.权利要求11的方法,其中添加已知量的所述至少一种11-氧代雄激素以产生最终浓度在约3.0至1,000ng/dL范围内的纯化的关注的分析物。
14.权利要求1的方法,其中所述串联质谱法以测量所述至少一种11-氧代雄激素的多个前体-碎片转变的方式进行。
15.权利要求14的方法,其中所述串联质谱法包括选择一种或多种碎片离子用于定量所述至少一种11-氧代雄激素和选择一种或多种另外的定性特征碎片离子作为定性标准。
16.权利要求15的方法,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-羟基雄烯二酮(11OHA)。
17.权利要求16的方法,其中所述前体离子具有约303.401的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.100的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.100和/或约97.100的m/z的碎片离子。
18.权利要求16的方法,还包括添加2H4-11β-羟基雄烯二酮作为内标。
19.权利要求18的方法,其中串联质谱法生成具有约308.400的质荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约122.200的m/z的碎片离子。
20.权利要求15的方法,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-酮基睾酮(11KT)。
21.权利要求20的方法,其中所述前体离子具有约303.400的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.200的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.200和/或约91.200的m/z的碎片离子。
22.权利要求20的方法,还包括添加2H3-11β-酮基睾酮作为内标。
23.权利要求22的方法,其中串联质谱法生成具有约306.400的质/荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约121.200的m/z的碎片离子。
24.权利要求15的方法,其中所述至少一种11-氧代-雄激素为11-羟基睾酮(11OHT)。
25.权利要求24的方法,其中所述前体离子具有约305.400的质/荷比(m/z);所述一种或多种用于定量的碎片离子包括具有约121.100的m/z的碎片离子;且所述一种或多种另外的定性特征碎片离子包括具有约105.000和97.000的m/z的碎片离子。
26.权利要求24的方法,还包括添加2H4-11β-羟基睾酮作为内标。
27.权利要求26的方法,其中质谱法生成具有约309.200m/z的质/荷比(m/z)的用于内标的前体离子和具有约121.100的m/z的碎片离子。
28.权利要求1的方法,包括检测3.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11OHA和/或检测1.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11OHT和/或检测1.0ng/dL至1,000ng/dL范围内的11KT。
29.用于测定测试样品中至少一种关注的生物标志物的存在或量的系统,所述系统包含:
用于提供疑似含有一种或多种11-氧代雄激素的测试样品的工作站;
用于将所述一种或多种11-氧代雄激素从样品中的其他组分中部分纯化的工作站;
用于以色谱方式将一种或多种11-氧代雄激素与样品中的其他组分分离的工作站;和
用于通过质谱法分析所述以色谱方式分离的一种或多种11-氧代雄激素以测定测试样品中所述一种或多种11-氧代雄激素的存在或量的工作站。
30.权利要求29的系统,还包含用于添加所述至少一种关注的生物标志物的至少一种内标的工作站。
31.权利要求29的系统,其中用于部分纯化一种或多种11-氧代雄激素的工作站包含进行液-液萃取、固相萃取或蛋白质沉淀中的至少一种的工作站。
32.权利要求29的系统,其中用于以色谱方式分离一种或多种11-氧代雄激素的工作站包含进行高效液相色谱法(HPLC)的工作站。
33.权利要求29的系统,其中用于分析以色谱方式分离的一种或多种11-氧代雄激素的工作站包含串联质谱仪。
34.权利要求29的系统,其中工作站中的至少一个由计算机控制。
35.一种有形地体现在非暂时性机器可读存储介质中的计算机程序产品,包括配置为使一台或多台计算机执行操作以测量样品中至少一种11-氧代雄激素的存在或量的指令,所述操作包括下列步骤中的至少一个:
(a)从受试者得到样品;
(b)任选地将稳定同位素标记的11-氧代雄激素添加到所述样品中作为内标;
(c)进行液相色谱法;和
(d)通过串联质谱法测量所述11-氧代雄激素。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962834738P | 2019-04-16 | 2019-04-16 | |
US62/834,738 | 2019-04-16 | ||
PCT/US2020/028513 WO2020214811A1 (en) | 2019-04-16 | 2020-04-16 | Methods and systems for the detection of 11-oxo androgens by lc-ms/ms |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113711030A true CN113711030A (zh) | 2021-11-26 |
Family
ID=70680586
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080029045.5A Pending CN113711030A (zh) | 2019-04-16 | 2020-04-16 | 用于通过lc-ms/ms检测11-氧代雄激素的方法和系统 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11536733B2 (zh) |
EP (1) | EP3956669A1 (zh) |
JP (1) | JP2022528979A (zh) |
CN (1) | CN113711030A (zh) |
CA (1) | CA3134234A1 (zh) |
WO (1) | WO2020214811A1 (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114965786A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-08-30 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113711030A (zh) * | 2019-04-16 | 2021-11-26 | 美国控股实验室公司 | 用于通过lc-ms/ms检测11-氧代雄激素的方法和系统 |
WO2022129119A2 (en) * | 2020-12-17 | 2022-06-23 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Lc-ms method for detecting and quantifying 11-oxygenated steroids |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080128606A1 (en) * | 2006-05-26 | 2008-06-05 | Russell Philip Grant | Methods and systems for the quantitative analysis of biomarkers |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5772874A (en) | 1995-11-02 | 1998-06-30 | Cohesive Technologies, Inc. | High performance liquid chromatography method and apparatus |
ES2140209T3 (es) | 1996-01-19 | 2000-02-16 | Cohesive Tech Inc | Procedimiento y dispositivo de cromatografia de liquidos de alto rendimiento. |
GB9717926D0 (en) | 1997-08-22 | 1997-10-29 | Micromass Ltd | Methods and apparatus for tandem mass spectrometry |
US20110306080A1 (en) * | 2001-11-05 | 2011-12-15 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Determination of lamotrigine by mass spectrometry |
US7745226B2 (en) * | 2005-04-06 | 2010-06-29 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods for detecting vitamin D metabolites |
US20090134325A1 (en) * | 2007-11-27 | 2009-05-28 | Goldman Mildred M | Methods for detecting estradiol by mass spectrometry |
US7893399B2 (en) * | 2008-09-09 | 2011-02-22 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods for detecting dehydroepiandrosterone by mass spectrometry |
US7804063B2 (en) * | 2008-10-06 | 2010-09-28 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods for detecting dihydrotestosterone by mass spectrometry |
US20100155594A1 (en) * | 2008-12-23 | 2010-06-24 | Goldman Mildred M | Mass spectrometry assay for estrogenic compounds |
US9146219B2 (en) * | 2014-01-27 | 2015-09-29 | National Medical Services, Inc. | Sensitive method for measuring cis-diol containing compounds in plasma using 2D-LC-MS/MS |
CN107850568A (zh) * | 2015-05-27 | 2018-03-27 | 奎斯特诊断投资有限公司 | 用于质谱定量由微量取样装置提取的分析物的方法 |
CN113711030A (zh) * | 2019-04-16 | 2021-11-26 | 美国控股实验室公司 | 用于通过lc-ms/ms检测11-氧代雄激素的方法和系统 |
-
2020
- 2020-04-16 CN CN202080029045.5A patent/CN113711030A/zh active Pending
- 2020-04-16 CA CA3134234A patent/CA3134234A1/en active Pending
- 2020-04-16 EP EP20725273.5A patent/EP3956669A1/en active Pending
- 2020-04-16 JP JP2021560857A patent/JP2022528979A/ja active Pending
- 2020-04-16 US US16/850,786 patent/US11536733B2/en active Active
- 2020-04-16 WO PCT/US2020/028513 patent/WO2020214811A1/en unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080128606A1 (en) * | 2006-05-26 | 2008-06-05 | Russell Philip Grant | Methods and systems for the quantitative analysis of biomarkers |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
ADINA F TURCU 等: "Adrenal-derived 11-oxygenated 19-carbon steroids are the dominant androgens in classic 21-hydroxylase deficiency" * |
JOHAN JUHL WEISSER 等: "Two simple cleanup methods combined with LC-MS/MS for quantification of steroid hormones in in vivo and in vitro assays" * |
MICHAEL W. O’REILLY 等: "11-oxygenated C19 steroids are the predominant androgens in polycystic ovary syndrome" * |
THERINA DU TOIT 等: "Profiling adrenal 11β-hydroxyandrostenedione metabolites in prostate cancer cells, tissue and plasma: UPC2-MS/MS quantification of 11β-hydroxytestosterone, 11keto-testosterone and 11keto-dihydrotestosterone" * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114965786A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-08-30 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法 |
CN114965786B (zh) * | 2022-06-07 | 2023-11-03 | 重庆医科大学附属儿童医院 | 一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2020214811A1 (en) | 2020-10-22 |
US11536733B2 (en) | 2022-12-27 |
US20200333361A1 (en) | 2020-10-22 |
CA3134234A1 (en) | 2020-10-22 |
JP2022528979A (ja) | 2022-06-16 |
EP3956669A1 (en) | 2022-02-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2231297B2 (en) | Methods for detecting estradiol by mass spectrometry | |
EP2799554B1 (en) | Methods for detecting estrone by mass spectrometry | |
US8563922B2 (en) | Methods for detecting dihydrotestosterone by mass spectrometry | |
WO2007139956A2 (en) | Methods and systems for the quantitative analysis of biomarkers | |
US11536733B2 (en) | Methods and systems for the detection of 11-oxo androgens by LC-MS/MS | |
CA2794391A1 (en) | Measurement of 25-hydroxyvitamin d3 and c3-epi-25-hydroxyvitamin d3 | |
US11624737B2 (en) | Methods for detecting lacosamide by mass spectrometry | |
US20230273226A1 (en) | Mass spectrometric determination of testosterone in multiplexed patient samples | |
US20230128672A1 (en) | Methods and Systems for Measuring Progesterone Metabolites | |
AU2017272277B2 (en) | Methods for detecting dihydrotestosterone by mass spectrometry |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |