CN114965786B - 一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法 - Google Patents

一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于血液分析技术领域，公开了一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法，包括：以滤纸片微量干血斑为样本，先用萃取液萃取血斑中的微量酯类胆固醇代谢产物，再用高效液相色谱方法分离18‑羟基皮质酮、四氢‑11‑脱氢皮质醇或其他代谢产物，最后用质谱对分离后的18‑羟基皮质酮、四氢‑11‑脱氢皮质醇或其他代谢产物进行定性、定量分析，确定不同样本中18‑羟基皮质酮、四氢‑11‑脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度水平。本发明能实现在6分钟分离包含18‑羟基皮质酮、四氢‑11‑脱氢皮质醇的7种不同的酯类胆固醇中间代谢产物。

Description

一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法
技术领域
本发明属于血液分析技术领域，尤其涉及一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法。
背景技术
酯类胆固醇代谢中间产物的测定在临床疾病的诊治中有重要作用。许多疾病存在酯类胆固醇中间代谢产物的代谢异常，如儿童性早熟、肥胖、肾上腺皮质功能障碍等。据统计，全国儿童性早熟率约为1％，且正呈逐年上升趋势，过早发育，不仅引发家庭和社会担忧，更是严重影响儿童的身心健康和成长；研究还发现，肥胖儿童体内酯类胆固醇代谢中间产物水平呈现失常状态，影响青春期中晚期性激素分泌，导致发育异常；尤其是下丘脑-垂体-肾上腺轴和下丘脑-垂体-性腺轴疾病，一种疾病常伴有多种代谢产物异常。先天性肾上腺皮质增生症(Congenital adrenal hyperplasia,CAH)是一种由酯类胆固醇代谢产物肾上腺皮质激素合成过程中所需酶缺陷引起的一组常染色体隐性遗传病。按照酶缺陷类型的不同，可分为21-羟化酶缺乏症(21-OHD)、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症等多个类型。其中21-OHD最常见，约占CAH的90％～95％；其它类型占约5％。不同类型CAH发病特征有很多差别，酶的缺乏导致皮质醇和醛固酮合成不足，前体物质17α-羟孕酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、11-羟基皮质酮、18-羟基皮质酮、雄烯二酮、四氢-11-脱氢皮质醇等异常改变，患者未经治疗，可有男性化或失盐表现，出现低血钠、高血钾、循环衰竭、失盐危象，可发生于生后数周内，危及生命。对新生儿、儿童及青少年血清酯类胆固醇代谢中间产物进行早期监测，可及时发现遗传代谢缺陷、性早熟及肥胖倾向，及早预防和治疗，可确保患者能够正常生长和发育。
目前，酯类胆固醇代谢的中间产物可采用各种不同免疫分析方法，如基于血清样本的放射免疫分析法、荧光免疫分析法和时间分辨荧光免疫分析法等。由于血中代谢产物水平相对较低，对检测方法的要求较高，上述方法难以达到足够的准确度，存在不同分析物间的交叉反应、灵敏度和特异度相对不高的情况，使检测结果的假阳性率增加，且每种代谢物的测定需使用不同试剂盒，所需的血液样本总量和检测成本较高。液相色谱-质谱技术具有1次实验可检测多种物质、快速、特异和灵敏等优点。近几年，国内外一些实验室已将该技术应用到临床检验的其他领域，包括新生儿有机酸血症筛查，脂溶性维生素检测，以及部分类固醇激素的检测。但这些研究大部分是利用血清作为检测样品，所需样本量大，不利于标本递送及保存，不适用于新生儿群体的筛查，尚无基于液相色谱-质谱技术进行干血滤纸片18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇等多种酯类胆固醇中间代谢产物检测分析的报道。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有的酯类胆固醇中间代谢产物检测方法单一，单次实验只能检测一种物质，且检测灵敏度和特异度不高，假阳性率高，所需的血液样本量大、检测成本较高。
(2)现有的酯类胆固醇中间代谢产物检测方法不能有效分离干血斑中微量酯类胆固醇中间代谢产物混合组份，存在不同分析物间的交叉反应，假阳性率高。
(3)现有的基于外周血血清样本的液相色谱-质谱方法需要大量血液样本(大于200微升)，且不便于保存和标本递送，不适用于新生儿群体的筛查。
(4)尚无基于液相色谱-质谱技术进行干血滤纸片18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇等多种酯类胆固醇中间代谢产物检测分析以及鉴别分型的报道，也缺乏新生儿足跟血18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇等多种酯类胆固醇中间代谢产物正常参考区间。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法。
本发明是这样实现的，一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法，所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法包括：
以滤纸片微量干血斑为样本，先用萃取液萃取血斑中的微量酯类胆固醇代谢产物，再用高效液相色谱方法分离18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他代谢产物，最后用质谱对分离后的18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他代谢产物进行定性、定量分析，确定不同样本中18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度水平。
进一步，所述其他酯类胆固醇中间代谢产物包括21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、11-羟基皮质酮、17α-羟孕酮以及雄烯二酮。
进一步，所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法包括以下步骤：
步骤一，获取新生儿足跟血干血斑样本，并基于干血斑样本进行酯类胆固醇代谢产物的萃取；
步骤二，基于液相色谱分离干血斑中微量18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物；
步骤三，基于高分辨质谱或其他质谱设备定性、定量分析干血斑中微量18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物。
进一步，所述基于干血斑样本进行酯类胆固醇代谢产物的萃取包括：
首先，从获取的新生儿足跟血干血斑样本中取样2个DBS血斑，并将取样的DBS血斑放置于96孔板中；
其次，向所述过96孔板的每个孔中加入100μL的0.9％的氯化钠盐溶液室温密封孵育震荡30min；再向96孔板的每个孔中加入萃取液，室温密封孵育震荡30min；
最后，于2000G、4℃下离心10min，取上层萃取液，转入新的96孔板，用低速高纯氮气吹干；每孔加入100μL复溶液，复溶，转入0.22μm的96孔过滤板过滤，过滤液用新的96孔板收集，铝箔覆盖，备测。
进一步，所述萃取液由甲酸与乙酸乙酯按照1:1的比例混合而成；所述萃取液中包含3.0ng/mL-1内标溶液；所述复溶液由乙腈与水按1:2.5混合而成；所述复溶液含0.2％甲酸。
进一步，所述步骤二中液相色谱参数包括：
采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18、1.7mm*50mm的色谱柱；流动相A为含2.5mmol醋酸铵和0.2％甲酸的水，流动相B为含2.5mmol醋酸铵和0.2％甲酸的乙腈；采用梯度洗脱：0min,30％流动相B；0～0.5min,梯度增加到35％流动相B；0.5～1.0min，梯度增加36％流动相B；1.0～3.5min，梯度增加到40％流动相B；3.5～3.6min 98％流动相B；3.6～4.5min保持98％流动相B；4.5～5.0min降至30％流动相B；5.0～6.0min保持30％流动相B；6.0min停止；流速为0.30mL/min，柱温40℃，自动进样器环境温度8℃；进样体积为5μL。
进一步，所述基于高分辨质谱或其他质谱设备定性、定量分析干血斑中微量18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物包括：
首先，利用高分辨质谱技术对液相色谱分离后的18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物进行鉴定；
其次，采用基于内标归一化处理的标准曲线法定量计算18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度。
进一步，所述利用高分辨质谱技术对液相色谱分离后的18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物进行鉴定包括：
在电喷雾电离阳离子检测模式下，采用平行反应监测或多反应检测模式的质谱模式采集数据，对18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物采用不同的特征性离子以及不同的裂解电压进行质谱鉴定。
进一步，所述采用基于内标归一化处理的标准曲线法定量计算18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度包括：
首先，确定18-羟基皮质酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、四氢-11-脱氢皮质醇以11-脱氧皮质醇-D5为内标；11-羟基皮质酮、17α-羟孕酮以17α-羟孕酮-d8为内标；雄烯二酮以双氢睾酮-13C3为内标；
其次，将不同浓度水平的分析物标准品与分析物标准品所在检查孔对应内标物的质谱检测值比较，再将归一化所得的不同比率进行关系拟合，得到拟合方程；
所述拟合方程如下：
y＝ax+b；
其中，y表示分析物浓度；x表示分析物质谱检查值同内标检查值的比率；a表示拟合线性方程的斜率，b表示拟合线性方程的截距；
最后，利用根据得到的拟合方程计算干血斑样本中18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度。
本发明的另一目的在于提供一种用于筛查、鉴别21-羟化酶缺乏症、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症的试剂盒，所述用于筛查、鉴别21-羟化酶缺乏症、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症的试剂盒采用所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明进行干血斑微量酯类胆固醇代谢中间产物的萃取，并利用高效液相色谱，实现在6分钟分内离7种不同的酯类胆固醇中间代谢产物；采用基于内标归一化处理的标准曲线法计算每种分析的浓度，可规避多种结构类似物的干扰，结果特异性高，准确度高；样本用量少、线性范围宽；经萃取离心后氮气吹干复溶进样，检测过程简便快速，成本降低；基于质谱技术的干血斑微量酯类胆固醇代谢中间产物精确分型，可以用于21-羟化酶缺乏症(21-OHD)、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症的筛查和鉴别诊断，无需进一步的免疫分析；以新生儿足跟干血斑为样本，便于标本递送及保存，适用于新生儿群体的筛查，易于实现和推广使用。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明的干血斑中微量酯类胆固醇中间代谢产物的液相色谱高效分离萃取方法，解决了干血斑中微量酯类胆固醇及其中间代谢产物混合组份的分离难题，从源头上避免了常规生化免疫方法存在交叉反应的弊端。
本发明的干血斑中微量酯类胆固醇代谢中间产物的质谱定性、定量分析方法，解决了干血斑中微量酯类胆固醇中间代谢产物混合组份难以精确定量及准确分型的难题，在液相分离基础上的，利用质谱技术的高选择性、高灵敏度及精准定量的特点，实现各混合组份的同时定性、定量分析，解决了常规方法难以实现的多种代谢产物同时鉴别分型的难题。
本发明提供了新生儿足跟血酯类胆固醇中间代谢产物的正常参考区间，解决了目前尚缺乏新生儿足跟血18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇等多种酯类胆固醇中间代谢产物正常参考区间的问题。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
新生儿CAH早期筛查是出生缺陷三级预防环节新生儿疾病筛查项目的重要内容，2021年我国新生儿生产量超过1000万，按100元/人次算，每年新生儿筛查市场规模超过10亿。然而以往的生化筛查方法，主要筛查21-羟化酶缺乏症一种类型，对其它类型的CAH不能筛查。本发明所述技术方案能过够筛查多种类型CAH，较传统方法具有明显优势，有望成为CAH筛查的首选方法，极具商业转化前景。
(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：
本发明弥补了现有技术没有检测新生儿足跟血18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇的技术空白。
(3)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
本发明解决了新生儿各型CAH早期高效筛查难的问题，为实现多种类型CAH的早期同时筛查提供方法参考。全血样本不便于储存和运输；而足跟干血斑样本便于收集、储存和递送，适合于包括新生儿在内的各类人群。新生儿疾病筛查时可与其他项目共用一份干血斑样本，无需额外采血，使以筛查实验室为中心的广地域、集中化新生儿各型CAH筛查模式成为可能。
附图说明
图1是本发明实施例提供的检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明实施例提供的检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法包括：
以滤纸片微量干血斑为样本，先用萃取液萃取血斑中的微量酯类胆固醇代谢产物，再用高效液相色谱方法分离18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他代谢产物，最后用质谱对分离后的18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他代谢产物进行定性、定量分析，确定不同样本中18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度水平。
本发明实施例提供的其他酯类胆固醇中间代谢产物包括21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、11-羟基皮质酮、17α-羟孕酮以及雄烯二酮。
如图1所示，本发明实施例提供的检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法包括以下步骤：
S101，获取新生儿足跟血干血斑样本，并基于干血斑样本进行酯类胆固醇代谢产物的萃取；
S102，基于液相色谱分离干血斑中微量18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物；
S103，基于高分辨质谱或其他质谱设备定性、定量分析干血斑中微量18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物。
本发明实施例提供的基于干血斑样本进行酯类胆固醇代谢产物的萃取包括：
首先，从获取的新生儿足跟血干血斑样本中取样2个DBS血斑，并将取样的DBS血斑放置于96孔板中；
其次，向所述96孔板的每个孔中加入100μL的0.9％的氯化钠盐溶液室温密封孵育震荡30min；再向96孔板的每个孔中加入萃取液，室温密封孵育震荡30min；
最后，于2000G、4℃下离心10min，取上层萃取液，转入新的96孔板，用低速高纯氮气吹干；每孔加入100μL复溶液，复溶，转入0.22μm的96孔过滤板过滤，过滤液用新的96孔板收集，铝箔覆盖，备测。
本发明实施例提供的萃取液由甲酸与乙酸乙酯按照1:1的比例混合而成；所述萃取液中包含3.0ng/mL-1内标溶液；所述复溶液由乙腈与水按1:2.5混合而成；所述复溶液含0.2％甲酸。
本发明实施例提供的步骤S102中液相色谱参数包括：
采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18、1.7mm*50mm的色谱柱；流动相A为含2.5mmol醋酸铵和0.2％甲酸的水，流动相B为含2.5mmol醋酸铵和0.2％甲酸的乙腈；采用梯度洗脱：0min,30％流动相B；0～0.5min,梯度增加到35％流动相B；0.5～1.0min，梯度增加36％流动相B；1.0～3.5min，梯度增加到40％流动相B；3.5～3.6min 98％流动相B；3.6～4.5min保持98％流动相B；4.5～5.0min降至30％流动相B；5.0～6.0min保持30％流动相B；6.0min停止；流速为0.30mL/min，柱温40℃，自动进样器环境温度8℃；进样体积为5μL。
本发明实施例提供的基于高分辨质谱或其他质谱设备定性、定量分析干血斑中微量18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物包括：
首先，利用高分辨质谱技术对液相色谱分离后的18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物进行鉴定；
其次，采用基于内标归一化处理的标准曲线法定量计算18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度。
本发明实施例提供的利用高分辨质谱技术对液相色谱分离后的18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物进行鉴定包括：
在电喷雾电离阳离子检测模式下，采用平行反应监测或多反应检测模式的质谱模式采集数据，对18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物采用不同的特征性离子以及不同的裂解电压进行质谱鉴定。
本发明实施例提供的采用基于内标归一化处理的标准曲线法定量计算18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度包括：
首先，确定18-羟基皮质酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、四氢-11-脱氢皮质醇以11-脱氧皮质醇-D5为内标；11-羟基皮质酮、17α-羟孕酮以17α-羟孕酮-d8为内标；雄烯二酮以双氢睾酮-13C3为内标；
其次，将不同浓度水平的分析物标准品与分析物标准品所在检查孔对应内标物的质谱检测值比较，再将归一化所得的不同比率进行关系拟合，得到拟合方程；
最后，利用根据得到的拟合方程计算干血斑样本中18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度。
本发明实施例提供的拟合方程如下：
y＝ax+b；
其中，y表示分析物浓度；x表示分析物质谱检查值同内标检查值的比率；a表示拟合线性方程的斜率，b表示拟合线性方程的截距；
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
本发明的应用实施例提供的检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法可以用于21-羟化酶缺乏症(21-OHD)、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症的筛查和鉴别诊断，无需进一步的免疫分析，本发明也可适用于新生儿群体的筛查，易于实现和推广使用；此外，对儿童及青少年血清酯类胆固醇代谢中间产物进行早期监测，可及时发现性早熟及肥胖倾向，及早预防和治疗，可确保患者能够正常生长和发育。
本发明的应用实施例提供了一种用于筛查、鉴别21-羟化酶缺乏症、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症的试剂盒，用于筛查、鉴别21-羟化酶缺乏症、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症的试剂盒采用所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
(一)所需仪器
仪器：液相色谱-高分辨质谱仪(Thermo sentific Q Exactive)一台、液相色谱仪(Thermo sentific UltiMate 3000)一台、色谱柱(Waters ACQUITY UPLC BEH C18 1.7mm*50mm)、3.2mm打孔钳一把、离心机(Gnencompany 1580R)一台、计算机一台、移液器(EPPENDORF)
(二)试剂盒组成
耗材：PVC 96孔板、1.5ml玻璃进样瓶，具有0.22μm孔径过滤功能的96孔板、移液器枪头、96孔板专用铝箔覆膜、96孔板封口膜、识别条形码。
试剂：
试剂A：萃取液A，用于酯类胆固醇代谢产物的萃取。
0.9％氯化钠盐溶液，
试剂B：萃取液B，用于酯类胆固醇代谢产物的萃取。
甲酸:乙酸乙酯1:1,含3.0ng/mL-1内标溶液
试剂C：复溶液，用于酯类胆固醇代谢产物复溶。
乙腈:水1:2.5，含0.2％甲酸
试剂D：流动相A，用于酯类胆固醇代谢产物分离。
水，含2.5mmol醋酸铵和0.2％甲酸
试剂E：流动相B，用于样品复溶。
乙腈，含2.5mmol醋酸铵和0.2％甲酸
所有液体试剂均为HPLC或质谱纯级。
质量控制：
内标：各酯类胆固醇代谢产物的同位素内标物，标准浓度已知。
质控品：阴阳性对照物及正常标品、新生儿CAH确诊患者足跟血干血斑样本。
(三)实施方案
(1)新生儿足跟血干血斑样本
样本采集要求为：出生满3天；充分哺乳；采集足跟血50～100μL，滴于whatman903#滤纸片，自然晾干，血斑直径5～8mm。收集信息：性别、民族、出生地、出生日期、孕周、出生体重、家族史等信息。
(2)酯类胆固醇代谢中间产物萃取
直径3.2mm打孔器取样2个DBS血斑，置于96孔过滤筛板中；每孔加入100μL试剂A(0.9％氯化钠盐溶液)，室温密封孵育震荡30min；每孔加入100μL试剂B(甲酸:乙酸乙酯1:1，含3.0ng/mL-1内标溶液)，室温密封孵育震荡30min；2000G，4℃,离心10min，取上层萃取液，转入新的96孔反应板，用低速高纯氮气吹干；每孔加入100μL试剂C(乙腈:水1:2.5，含0.2％甲酸)复溶，转入0.22μm的96孔过滤板过滤，过滤液用新的96孔板收集，铝箔覆盖，待测。
(3)基于液相色谱高效分离干血斑中微量酯类胆固醇中间代谢产物的方法
采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18、1.7mm*50mm的色谱柱；流动相A为含2.5mmol醋酸铵和0.2％甲酸的水，流动相B为含2.5mmol醋酸铵和0.2％甲酸的乙腈；采用梯度洗脱：0min,30％流动相B；0～0.5min,梯度增加到35％流动相B；0.5～1.0min，梯度增加36％流动相B；1.0～3.5min，梯度增加到40％流动相B；3.5～3.6min 98％流动相B；3.6～4.5min保持98％流动相B；4.5～5.0min降至30％流动相B；5.0～6.0min保持30％流动相B；6.0min停止；流速为0.30mL/min，柱温40℃，自动进样器环境温度8℃；进样体积为5μL。
(4)基于高分辨质谱技术定性、定量分析干血斑中微量酯类胆固醇中间代谢产物的方法
在电喷雾电离(ESI)阳离子(+)检测模式下，采用平行反应监测(PRM)的质谱模式采集数据，离子源参数如下：
酯类胆固醇中间代谢产物液相色谱分离、质谱鉴定(PRM模式)的特征性离子对及裂解电压参数设置：
化合物名称 PRM离子对(m/z) (N)CE(eV)
18-羟基皮质酮 363.22/147.02 35
21-脱氧皮质醇 347.26/311.02 20
11-脱氧皮质醇 347.24/109.12 35
11-脱氧皮质醇-D5 352.49/114.02 35
雄烯二酮 287.26/97.04 25
11-羟基皮质酮 331.24/109.02 30
17α-羟孕酮 331.24/97.04 35
17α-羟孕酮-d8 339.46/100.06 30
双氢睾酮-13C3 294.42/258.02 20
四氢-11-脱氢皮质醇 351.36/315.24 20
采用基于内标归一化处理的标准曲线法计算每种分析的浓度。其中18-羟基皮质酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、四氢-11-脱氢皮质醇以11-脱氧皮质醇-D5为内标；11-羟基皮质酮、17α-羟孕酮以17α-羟孕酮-d8为内标；雄烯二酮以双氢睾酮-13C3为内标。计算时，不同浓度水平的分析物标准品先与自己所在检查孔对应内标物的检测值比较，再将归一化所得的不同比率进行关系拟合，得到拟合方程y＝ax+b(y表示分析物浓度；x表示分析物质谱检查值同内标检查值的比率，a表示拟合线性方程的斜率，b表示拟合线性方程的截距)，用于样本中各酯类胆固醇中间代谢产物浓度的最终计算。
(5)参照值区间设定
按照本发明上述技术方案，分析200例正常新生儿，分别建立各分析物的参考值区间(2.5％～97.5％)。
(6)方法评价
评估方法的稳定性及性能。分别选取一例正常标本，21-羟化酶缺乏症(21-OHD)、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症各一例，每个样本3次重复，每天做3批，连续做3天，做批次内及批次间重复试验，计算均值及标准差，评估筛查方法的精密度和重复性；计算检测方法的检测限、定量限、回收率，确定检测指标的线性范围；同200例正常新生儿样本一起，检测20例不同类型CAH患者酯类胆固醇中间代谢产物浓度，计算本发明区分患者与正常个体的灵敏度与特异度。
(7)结果
(一)本发明具有较好的线性拟合
化合物名称 线性范围(ng/mL) R2
18-羟基皮质酮 0.1-1000 0.99
21-脱氧皮质醇 0.01-100 0.99
11-脱氧皮质醇 0.01-100 0.99
雄烯二酮 0.01-100 0.99
11-羟基皮质酮 0.01-100 0.99
(二)本发明各分析物具有较低的检测限和定量限
(三)本发明各分析物具有较高的回收率
(四)本发明各分析物具有较低的批内及批间误差
(五)分析200例正常新生儿，确定干血斑样本中各分析物的参考值区间(2.5％～97.5％)如下：
(六)基于200例正常新生儿及20例不同类型CAH患者统计的检测灵敏度及特异度：
本发明建立了干血斑微量酯类胆固醇代谢中间产物的萃取方法，并利用高效液相色谱，实现在6分钟分内离7种不同的酯类胆固醇中间代谢产物；采用基于内标归一化处理的标准曲线法计算每种分析的浓度，可规避多种结构类似物的干扰，结果特异性高，准确度高；实验过程样本用量少、线性范围宽；经萃取离心后氮气吹干复溶进样，检测过程简便快速，实验成本降低；基于质谱技术的干血斑微量酯类胆固醇代谢中间产物精确分型，可以用于21-羟化酶缺乏症(21-OHD)、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症的筛查和鉴别诊断，无需进一步的免疫分析；以新生儿足跟干血斑为样本，便于标本递送及保存，适用于新生儿群体的筛查，易于实现和推广使用；此外，对儿童及青少年血清酯类胆固醇代谢中间产物进行早期监测，可及时发现性早熟及肥胖倾向，及早预防和治疗，可确保患者能够正常生长和发育。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法，其特征在于，所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法包括：
以滤纸片微量干血斑为样本，先用萃取液萃取血斑中的微量酯类胆固醇代谢产物，再用高效液相色谱方法分离18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇以及其他代谢产物，最后用质谱对分离后的18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他代谢产物进行定性、定量分析，确定不同样本中18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度水平；
所述其他酯类胆固醇中间代谢产物包括21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、11-羟基皮质酮、17α-羟孕酮以及雄烯二酮；
所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法包括以下步骤：
步骤一，获取新生儿足跟血干血斑样本，并基于干血斑样本进行酯类胆固醇代谢产物的萃取；
步骤二，基于液相色谱分离干血斑中微量18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇以及其他酯类胆固醇中间代谢产物；
步骤三，基于高分辨质谱或其他质谱设备定性、定量分析干血斑中微量18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物；
萃取液由甲酸与乙酸乙酯按照1:1的比例混合而成；所述萃取液中包含3.0ng/mL-1内标溶液；复溶液由乙腈与水按1:2.5混合而成；所述复溶液含0.2％甲酸；
所述步骤二中液相色谱参数包括：
采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18、1.7mm*50mm的色谱柱；流动相A为含2.5mmol醋酸铵和0.2％甲酸的水，流动相B为含2.5mmol醋酸铵和0.2％甲酸的乙腈；采用梯度洗脱：
0min,30％流动相B；0～0.5min,梯度增加到35％流动相B；0.5～1.0min，梯度增加36％流动相B；1.0～3.5min，梯度增加到40％流动相B；3.5～3.6min 98％流动相B；3.6～4.5min保持98％流动相B；4.5～5.0min降至30％流动相B；5.0～6.0min保持30％流动相B；6.0min停止；
流速为0.30mL/min，柱温40℃，自动进样器环境温度8℃；进样体积为5μL。
2.如权利要求1所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法，其特征在于，所述基于干血斑样本进行酯类胆固醇代谢产物的萃取包括：
首先，从获取的新生儿足跟血干血斑样本中取样2个DBS血斑，并将取样的DBS血斑放置于96孔板中；
其次，向过滤筛板的每个孔中加入100μL的0.9％的氯化钠盐溶液室温密封孵育震荡30min；再向过滤筛板的每个孔中加入萃取液，室温密封孵育震荡30min；
最后，于2000G、4℃下离心10min，取上层萃取液，转入新的96孔反应板，用低速高纯氮气吹干；每孔加入100μL复溶液，复溶，转入0.22μm的96孔过滤板过滤，过滤液用新的96孔板收集，铝箔覆盖，备测。
3.如权利要求1所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法，其特征在于，所述基于高分辨质谱或其他质谱设备定性、定量分析干血斑中微量18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物包括：
首先，利用高分辨质谱技术对液相色谱分离后的18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物进行鉴定；
其次，采用基于内标归一化处理的标准曲线法定量计算18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度。
4.如权利要求3所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法，其特征在于，所述利用高分辨质谱技术对液相色谱分离后的18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物进行鉴定包括：
在电喷雾电离阳离子检测模式下，采用平行反应监测或多反应检测模式的质谱模式采集数据，对18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物采用不同的特征性离子以及不同的裂解电压进行质谱鉴定。
5.如权利要求3所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法，其特征在于，所述采用基于内标归一化处理的标准曲线法定量计算18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度包括：
首先，确定18-羟基皮质酮、21-脱氧皮质醇、11-脱氧皮质醇、四氢-11-脱氢皮质醇以11-脱氧皮质醇-D5为内标；11-羟基皮质酮、17α-羟孕酮以17α-羟孕酮-d8为内标；雄烯二酮以双氢睾酮-13C3为内标；
其次，将不同浓度水平的分析物标准品与分析物标准品所在检查孔对应内标物的质谱检测值比较，再将归一化所得的不同比率进行关系拟合，得到拟合方程；
所述拟合方程如下：
y＝ax+b；
其中，y表示分析物浓度；x表示分析物质谱检查值同内标检查值的比率；a表示拟合线性方程的斜率，b表示拟合线性方程的截距；
最后，利用根据得到的拟合方程计算干血斑样本中18-羟基皮质酮、四氢-11-脱氢皮质醇或其他酯类胆固醇中间代谢产物的浓度。
6.一种用于筛查、鉴别21-羟化酶缺乏症、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症的试剂盒，其特征在于，所述用于筛查、鉴别21-羟化酶缺乏症、17α-羟化酶缺乏症、11β-羟化酶缺乏症、皮质酮甲基氧化酶Ⅱ缺乏症、11β-羟类固醇脱氢酶缺乏症的试剂盒采用如权利要求1-5任意一项所述检测干血斑中酯类胆固醇多种中间代谢产物的方法。
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