CN112684020B - 一种用于评价个体锌营养状态的生物标志物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于评价个体锌营养状态的生物标志物及其应用。所述的生物标志物为谷胱甘肽转移酶Omega1(glutathione S‑transferase Omega1，GSTO1)。本发明通过基于高通量的色谱质谱联用的蛋白质组学和代谢组学等多组学联合的技术筛选锌缺乏大鼠血液和肝脏中的差异生物标志物(蛋白质和代谢产物)，多组学代谢通路富集分析筛选锌缺乏的最显著代谢通路并筛选锌缺乏候选生物标志物；通过锌缺乏敏感人群验证筛选的候选锌缺乏生物标志物；最后通过锌缺乏人群的随机对照补锌干预实验确定人群特异的锌缺乏生物标志物，基于筛选的生物标志物尝试建立可用于锌营养状态评价的快速的、灵敏的、特异的标准方法体系，为评估个体的锌营养状态和干预措施提供帮助。
Description
技术领域
本发明涉及一种可用于人群锌缺乏诊断的生物标志物及其应用。本发明属于医药技术领域。
背景技术
锌是人体必需的微量营养素，具有极其广泛和重要的生理功能，在多种涉及基因表达、细胞分裂和细胞生长，以及免疫和生殖功能的酶系中都具有重要的结构和功能作用。锌缺乏严重危害人体健康，例如影响儿童生长发育、性功能衰减、皮肤病、认知紊乱、厌食、增加感染的危险性和影响妊娠结局等。
WHO通过食物利用数据，推测国际上膳食锌缺乏的流行率大约达到31％ (4％-70％)。我国健康与营养调查显示，2009年中国儿童青少年和成年人的膳食锌摄入量低于平均需要量(EAR)的比例分别为79.6％和45.8％，锌摄入不足在我国普遍存在。世界范围内，大约有16％的下呼吸道感染、18％的疟疾、10％腹泻、 1.4％的全球人口死亡率与锌缺乏相关。鉴于锌缺乏的后果严重和补锌的巨大益处, 有必要在易感人群中量化锌缺乏的流行性和严重程度，制定合理补锌措施。遗憾的是，目前在国际上有关国家水平的锌缺乏流行率的数据非常有限。主要原因是，到目前为止国际上还没有能够敏感、特异的评价机体锌营养状况的指标。WHO、 UNICEF、国际原子能机构(IAEA)和国际锌营养顾问组(IZiNCG)发布评估人群锌营养状况的3种主要方法是:血清(血浆)锌,锌膳食摄入量和生理功能。血清锌是目前公认的人群锌缺乏的最佳指标，但不是评价个体锌营养状态的特异敏感指标。由于机体平衡调节作用，同时锌在体内分布广泛，如果锌供给缺乏，组织内锌将重新分布至血中，满足重要器官的需要，血清锌水平仅在体内平衡负担过度时才发生变化，对中、轻度缺锌无反应。此外，血清锌对外部刺激反应迅速，多种生理、病理状态皆可影响血清锌浓度，如进食、饥饿、体力活动、妊娠以及应激状态。还需要其他的生物标志物辅助确定血清锌降低是由锌缺乏引起的还是由机体其他状况导致的。因此，血清锌不能准确反映个体的锌营养状态，尤其是不能用于评价个体早期或轻度的锌缺乏。
除了血清锌以外，血清碱性磷酸酶、交换性锌池、发锌、尿锌等也用于锌缺乏的诊断。血清碱性磷酸酶缺乏特异性，胆道疾病、肝脏疾病、骨骼系统疾病、蛋白质摄人情况、钙营养状况等都可影响其活性。研究提示体内含锌量与交换性锌池(EZP)的大小有良好的相关性，与血清锌相比，EZP能更敏感更可靠地反应人体锌水平，但测定EZP需要昂贵的稳定性同位素及质谱分析。尿锌/肌苷比、 24h尿锌总量、发锌有作为评价机体锌缺乏指标的潜力，但个体差异较大，无法确定正常值范围，故不能用于个体锌缺乏的判断。单核细胞中金属硫蛋白mRNA 水平对补锌的反应比血清锌可靠，是评价锌缺乏的相对金标准，但其操作复杂，难以在临床上推广。
膳食摄入可吸收性锌不足，是锌缺乏的最主要原因之一。因此，24小时膳食回顾法或膳食称重法常用于评估人群锌摄入是否充足，锌摄入量低于估计平均需要量(EAR)的人群发生率可作为人群锌缺乏危险性的指标。但是，除了膳食调查误差比较大外，不同人群和不同食物中锌的生物利用率不同，影响锌的实际吸收量，因此膳食摄入量同样不能很好评价个体锌缺乏。
锌是一种典型的2型营养素(Type 2nutrients)，锌缺乏会对机体产生众多不利影响，但却没有特异的症状或者指标改变。例如，锌缺乏明显影响生长发育，但是低体重与锌缺乏无特异性，而可能归因于母亲身材矮小、频繁感染或其他营养素缺乏。有些类型的感染性疾病的发生率可通过补充锌而降低，但是其与特异病原体的暴露水平的相关性更强。因此，有关生理功能在评价个体锌缺乏方面的有效性，还需要进一步评估。
尽管目前有许多锌缺乏评价指标，但是尚缺乏敏感特异的指标。为了准确的评价个体的锌营养状态和维持人体正常的锌营养状态，非常有必要采用一种新的技术或方法筛选可靠的锌缺乏的生物标志物，蛋白质组学和代谢组学正是解决以上问题的关键技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于评价个体锌营养状态的生物标志物及其应用，所述的生物标志物可以灵敏且特异的反应出个体的锌营养状态。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
首先，本发明提出了谷胱甘肽转移酶Omega1(glutathione S-transferaseOmega1， GSTO1)作为分子标志物在评价个体的锌营养状态中的应用。
值得说明的是，本发明所述的应用中并不包含对锌缺乏导致的疾病的诊断。
其中，优选的，本发明通过检测个体空腹静脉血中谷胱甘肽转移酶Omega1 的浓度来评价个体的锌营养状态。
其中，优选的，所述的检测方法包括通过采用ELISA检测方法或Western Blot 检测方法对个体空腹静脉血中谷胱甘肽转移酶Omega1的浓度进行检测。
进一步的，本发明还提出了一种用于评价个体锌营养状态的试剂盒，所述的试剂盒中含有用于检测谷胱甘肽转移酶Omega1的试剂。
其中，优选的，所述的试剂为用于检测谷胱甘肽转移酶Omega1的ELISA检测试剂或Western Blot检测试剂。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明通过基于高通量的色谱质谱联用的蛋白质组学和代谢组学等多组学联合的技术筛选锌缺乏大鼠血液和肝脏中的差异生物标志物(蛋白质和代谢产物)，多组学代谢通路富集分析筛选锌缺乏的最显著代谢通路并筛选锌缺乏候选生物标志物；通过锌缺乏敏感人群验证筛选的候选锌缺乏生物标志物；最后通过锌缺乏人群的随机对照补锌干预实验确定人群特异的锌缺乏生物标志物，研究方法流程图如图15所示。基于筛选的确定生物标志物尝试建立可用于锌营养状态评价的快速的、灵敏的、特异的标准方法体系，为评估个体的锌营养状态和干预措施提供帮助。
附图说明
图1为肝脏和血液中发现的差异蛋白质；
其中，(A)肝脏；(B)血清；
图2为血液的代谢通路富集分析发现的差异代谢通路；
图3为血液联合的代谢通路富集分析发现的差异代谢通路；
图4为肝脏的代谢通路富集分析发现的差异代谢通路；
图5为血液单一的蛋白质组学、代谢组学、联合组学代谢通路分析和肝脏蛋白质组学代谢通路富集发现的差异代谢通路韦恩图；
图6为肝脏中GCLC,IDH1,PGD,G6PD四个差异表达蛋白质的Western blot 分析结果；
图7为血清中差异蛋白质与血清锌水平的相关性分析；
其中，(A)GSTO1；(B)GSTA4；(C)GSTM2；(D)GSH-PX；
图8为血清中甘氨酸、谷氨酸和谷胱甘肽的水平分析；
图9为血清中GSTO1、GSTA4和谷氨酸与血清锌的相关性分析(A)和ROC 分析(B)；
图10为血清中GSTO1和GSTA4在不同人群中的差异分析；
其中，(A)GSTO1:儿童；(B)GSTO1:中年人；(C)GSTA4:儿童；(D)GSTA4: 中年人；
图11为不同人群血清GSTO1、谷氨酸与血清锌的相关性分析和ROC分析
其中，竖列：(A)中年组血清GSTO1；(B)中年组血清谷氨酸；(C)儿童组血清 GSTO1；
图12为血清锌水平、GSTO1水平和膳食锌摄入之间的相关性分析；
其中，(A)儿童血清锌与GSTO1相关性分析；(B)中年组血清锌与GSTO1相关性分析；(C)中年组血清锌与膳食锌相关性分析；(D)中年组膳食锌与GSTO1 相关性分析
图13为补锌后机体锌摄入水平、血清锌水平和GSTO1水平的相关性分析；
其中，(A)补锌1周后血清锌与GSTO1相关性分析；(B)补锌2周后血清锌与 GSTO1相关性分析；(C)补锌1周后血清锌与膳食锌相关性分析；(D)补锌2周后膳食锌与血清锌相关性分析；(E)补锌1周后血清GSTO1与膳食锌相关性分析； (F)补锌2周后血清GSTO1与膳食锌相关性分析；
图14为补锌后GSTO1的ROC分析；
其中，(A)补锌1周后血清锌ROC分析曲线；(B)补锌2周后血清锌ROC分析曲线；(C)补锌1周后GSTO1的ROC分析曲线；(D)补锌2周后GSTO1的ROC 分析曲线；
图15为本发明的研究方法流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1锌缺乏动物模型建立和多组学实验筛选候选生物标志物
1、锌缺乏大鼠喂养和样品采集：
3周龄体重为60-80g的雄性Wistar大鼠48只，单独代谢笼中适应性喂养7 天后，随机分为3组：对照组(15只)：正常锌膳食(锌含量为30mg/ml的纯合成饲料)；锌缺乏组(15只)：低锌膳食(锌含量为10mg/ml的纯合成饲料)；对喂组 (15只)：正常锌膳食(锌含量为30mg/ml的纯合成饲料)，饲料摄入量与低锌组一样。所有大鼠持续喂养4-6周。动态监控大鼠体重、进食量、尿量等基础指标，能量代谢检测能量和膳食消耗量。
2、相关指标检测：
实验结束后，禁食空腹麻醉处死所有大鼠，收集血样和组织样本，测量大鼠身长、尾长检测。检测大鼠血清相关指标：血清锌、碱性磷酸酶、尿肌酐、生长激素、白细胞介素1、胆固醇、甘油三酯等指标。收集保存的血样和肝脏样本准备多组学检测分析。
锌缺乏导致大鼠膳食摄入量降低，生长延缓，体重和骨密度降低，机体能量代谢、生长发育和免疫因子等指标发生变化。
血液代谢组学(液质联用仪和核磁共振波普仪)，血清和肝脏组织的蛋白质组学(iTRAQ、nano色谱和Orbitrap质谱)分析全面系统的分析锌缺乏对机体代谢的影响或改变；筛选可靠的锌缺乏生物标志物。然后通过血液和肝脏多组学联合分析的代谢通路富集分析筛选锌缺乏最显著的代谢通路，其显著差异的生物标志物为锌缺乏候选生物标志物。
2.1代谢组学实验
①代谢组学技术平台的建立
建立和优化代谢组学分析的超高效液相(UPLC)分离条件和四级杆串联飞行时间质谱仪(XEVO G2 SX Q-TOF MSMS)参数；用于血液的代谢组学检测。
②样品前处理
液质联用样本前处理方法：2倍体积的甲醇加入缓冻的血清中沉淀蛋白质，离心后取上清，氮气吹干后复溶待测。
③代谢组学数据采集
UPLC/Q-TOF-ESI-MS：分别在正负离子模式下，采集尿液和血液的质谱数据。
④数据前处理和分析
液相色谱质谱联用仪获得的数据经Progenesis QI软件进行色谱峰识别、峰匹配和峰面积标准化等预处理。所得数据采用Pareto scaling预处理后，利用EZ-info 软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS-DA)等多元统计分析，观察分类趋势。
⑤锌缺乏标志物的筛选标准
VIP值大于1.5，且P小于0.05的差异代谢产物为潜在的锌缺乏生物标志物。
⑥锌缺乏生物标志物的鉴定
采用四级杆/飞行时间质谱测定标志物的精确质量和二级质谱图，通过分子式或分子质量检索Chemspider、HMDB等化合物数据库，得到可能的化合物结构，最终通过与对照品对比色谱保留，确定标志物的化学结构。
结果：代谢组学实验发现，锌缺乏导致血液中代谢产物发生显著变化，在血液中共发现140个差异代谢产物，71个升高，69个降低。代谢产物的代谢通路富集分析发现氨基酸代谢和合成、谷胱甘肽代谢、鞘磷脂代谢、胆汁酸合成和嘧啶代谢、氮新陈代谢等9条显著差异的代谢通路。肝脏和血液中发现的差异蛋白质如图1所示，血液的代谢通路富集分析发现的差异代谢通路如图2所示。
2.2蛋白质组学实验
通过iTRAQ技术，对血清样品进行同位素标记，将nano-液相色谱与Orbitrap 质谱联用，通过生物信息分析鉴定蛋白(含差异蛋白)和比较差异蛋白的表达量。
具体步骤：样品蛋白的提取(高丰度蛋白的去除)；对富集的低丰度蛋白进行酶解消化；对酶解得到的肽段进行同位素标记；检测标记结果，以确定标记成功；将待分析的样品进行混合，经过SCX/RPLC分离；串联质谱鉴定蛋白质；数据分析(MASCOT)：差异蛋白的相对定量信息列表；go分类和功能分析；差异蛋白的Pathway富集分析；差异蛋白互作网络构建、转录因子预测等。分子生物学、细胞实验和实时定量PCR验证构建的差异蛋白网络预测的蛋白和转录因子。
结果：高通量的色谱质谱联合蛋白质组学发现，锌缺乏显著影响血清和肝脏中蛋白质，共检测锌缺乏大鼠肝脏蛋白5194个，筛选差异蛋白1650个(P＜0.05)；血清检测蛋白1212个，筛选出差异蛋白275个(P＜0.05)。代谢通路富集分析发现19条差异的代谢通路。
多组学代谢通路富集分析结果显示：血清差异代谢产物pathway分析富集的差异代谢通路为9条，差异蛋白pathway分析中共富集差异代谢通路19条(P＜ 0.05)；血清差异代谢产物和蛋白质联合的pathway分析显示富集53条差异的代谢通路，如图3所示；肝脏差异蛋白pathway分析显示富集差异代谢通路61条 (P＜0.05)，如图4所示；综合以上发现共同变化的显著差异代谢通路共5条(P ＜0.05)，分别为谷胱甘肽代谢通路、药物代谢-细胞色素P450通路、细胞色素P450 对异生物素的代谢通路、氨基酸的生物合成通路、补体和凝血级联通路，其中最显著的代谢通路为谷胱甘肽代谢通路。
图5血液单一的蛋白质组学、代谢组学、联合组学代谢通路分析和肝脏蛋白质组学代谢通路富集发现的差异代谢通路韦恩图。
由以上结果可知，谷胱甘肽代谢通路为锌缺乏大鼠最显著的差异代谢通路，该通路的差异蛋白质和代谢产物有作为锌缺乏诊断的潜力。
3、重复的动物实验验证筛选的生物标志物
完全重复锌缺乏大鼠实验，采集血液和肝脏，利用ELISA，Western blot和 UPLC/TSQ MSMS定量分析上述动物筛选的候选生物标志物，确定可靠的锌缺乏大鼠生物标志物。
ELISA试剂盒检测：在每个孔中添加50μL稀释液。添加标准品，对照品或样品：将50μL标准液，对照液或样品添加到每个孔中。用封板膜封上96孔板，在37℃孵育30分钟。加入洗涤液清洗。加入200μLHRP，用封板膜封上96孔板，在37℃孵育30分钟。加入洗涤液清洗。加入50μL显色液A和50μL显色液B，避光37℃孵育15分钟。加入50μL终止液，在OD值为560nm读取，记录实验结果。
3.1谷胱甘肽蛋白代谢通路相关差异蛋白及验证结果
谷胱甘肽蛋白代谢通路上表达差异的相关蛋白有：GSTO1、GSTA4、GSTM2、 GSH-PX、GR、GSS、TG、GCLC、IDH1、PGD、G6PD。其中，用ELISA试剂盒检测GSTO1、GSTA4、GSTM2、GSH-PX、GR、GSS、TG在血清和肝脏中的浓度，Western Blot检测GCLC、IDH1、PGD、G6PD在肝脏中的表达。
ELISA试剂盒检测肝脏结果显示，锌缺乏组分别与对照组和对喂组大鼠GSTO1、GSTA4、GSH-PX、GSS的差异有统计学意义(P＜0.05)，对照组和对喂组大鼠差异无统计学意义(P＞0.05)；三组大鼠的GSTM2、GR、TG的差异无统计学意义(P＞0.05)，结果如表1所示。
表1.大鼠肝脏中潜在蛋白质标志物ELISA试剂盒检测结果
注:NZG:对照组；PZG:对喂组；LZG:锌缺乏组*:LZG vs NZG and PZG, P<0.05.
锌缺乏组与对照组和对喂组大鼠相比，血清中GSTO1、GSTA4、GSTM2、 GSH-PX、GR的差异有统计学意义(P＜0.05)，对照组和对喂组大鼠差异无统计学意义(P＞0.05)；三组大鼠的GSS、TG差异无统计学意义(P＞0.05)，结果如表 2所示。
表2.大鼠血液中潜在蛋白质标志物ELISA试剂盒检测结果
注:*:LZG vs NZG and PZG,P<0.05.
Western Blot实验结果显示，锌缺乏组与正常组两组间蛋白表达量的差异均有统计学意义(P＜0.05)，对喂组与正常组两组间蛋白表达量的差异无统计学意义(P＞0.05)，结果如图6所示。此结果中4个差异蛋白质的变化趋势和变化倍数与蛋白质组学结果一致(表3)，证明蛋白质组学结果的可靠性。
表3四个差异蛋白质在两种分析方法中的变化倍数
4、血清锌与谷胱甘肽蛋白代谢通路中差异蛋白的相关性分析
相关性分析是指对两个或多个具备相关性的变量元素进行分析，从而衡量两个变量因素的相关密切程度。本研究通过相关性分析来判断选择的蛋白与体内血清锌浓度的相关性。如图7所示，血清中GSTO1、GSTA4、GSTM2、GSH-PX的浓度与血清锌浓度显著相关(P＜0.05)，GR、GSS、TG与血清锌无相关性(P＞ 0.05)。
5、谷胱甘肽蛋白代谢通路中差异蛋白的ROC曲线分析结果
ROC曲线能够反映检测方法的预测性以及对检测方法的灵敏度和特异度之间关系从而进行描述的指标。所得出的结果能够判断某种因素对于某种疾病的诊断是否有诊断价值。AUC代表ROC曲线下的面积，表示预测准确率。AUC值取值在0-1之间，数值越大，代表正确率越高。为了判断蛋白的诊断效果，将血清中GSTO1、GSTA4、GSTM2、GSH-PX、GR、GSS均做了ROC曲线分析，结果显示，GSTO1、GSTA4、GSTM2、GSH-PX具有诊断意义(P＜0.01)，诊断能力的强弱即AUC曲线下面积为GSTO1＞GSTM2＞GSTA4＞GSH-PX，而GR、GSS、 TG无诊断意义(P＞0.05)，结果如表4以及所示。
表4.血清中差异蛋白质的ROC曲线分析
谷胱甘肽代谢通路上的差异代谢产物经定量分析后，与正常组大鼠相比，锌缺乏组大鼠血清甘氨酸、谷氨酸显著降低，谷胱甘肽没有变化，结果如图8所示。但是经相关性分析发现，谷氨酸与血清锌水平显著相关，甘氨酸与血清锌水平没有相关性，结果如图9所示。
基于上述结果，我们筛选出GSTO1，GSTA4，谷氨酸三个在血清有显著差异，且有高的诊断学价值的蛋白质和代谢产物，作为锌缺乏大鼠的诊断标志物。
实施例2锌缺乏生物标志物的锌缺乏人群验证
通过两个锌缺乏易感人群：4-6岁儿童，低收入体力劳动者(45-58岁)，以血清锌分组，验证动物实验筛选的候选标志物，确定人群锌缺乏生物标志物。锌缺乏人群的随机对照的补锌干预实验，进一步确定人群的锌缺乏生物标志物。扩大样本量，进行全人群实验，定量检测生物标志物的浓度，确定生物标志物的正常值范围。
预期达到的最终目标是建立锌缺乏营养评价的标准方法。
研究招募儿童(4-6岁)即儿童组和低收入体力劳动中年人(40-58岁)即中年组，按照血清锌的水平将其分为正常组(＞70μg/dL)和锌缺乏组(＜70μg/dL)，检测生物标志物，验证其种属特异性。并在此过程中对人群进行膳食问卷的调查。
1、参与者纳入标准
长期居住在哈尔滨市，4-6岁儿童和40-58岁的低收入体力劳动中年人。其中，40-58岁的低收入体力劳动中年人选择哈尔滨医科大学和哈尔滨市社区的保洁人员，符合低收入体力劳动者要求。排除标准：无慢性病或过敏反应史，干预前两周无急性疾病或用药，不食用维生素或矿物质补充剂，不食用市售的锌强化食品。本实验经过哈尔滨医科大学伦理委员会批准，伦理审查编号为 ChiCTR1900028162，在实验开始前，参与人员均签署知情同意书。
2、样品收集
在通宵禁食后收取参与者的空腹静脉血样本，将止血带放置标准化时间(0.1 分钟)，参与者保持坐姿，每次抽血时，使用一次性针头从肘前静脉抽取5mL血液，并收集到凝血管中，抽血后立即将试管置于冰上，并在采血1小时内通过5000 转/分离心10分钟，收集上层血清，分离后放入﹣80℃储存备用。检测的指标：血清锌、生物标志物浓度及相关的生化指标，包括金属硫蛋白(Metallothionein， MT)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)、尿酸(uric acid，UA)、钙(calcium，Ca)、空腹血糖(fasting blood glucose，GLU)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)、总胆固醇(total cholesterol，TCHO)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白 (highdensity lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL- C)、肌酐(creatinine，CRE)、镁(magnesium，Mg)、铁(iron，Fe)、铜(copper， Cu)。
3、锌摄入量计算
通过食物摄入频次调查法(FFQ)对相关食物调查，通过食物成分表(2002 年)计算每人每天的膳食锌摄入量，在试验期间，每周间隔2天对人群进行膳食问卷调查，每周的膳食锌摄入量的计算值为该周膳食调查问卷膳食锌摄入量的平均值。干预前，锌摄入量为膳食锌摄入量；干预后，锌摄入量为膳食锌摄入量和锌制剂的总和。
4、锌缺乏易感人群验证实验结果
研究招募儿童组93人和中年组210人，检测血清锌水平后，儿童组正常组 61人，锌缺乏组32人；中年组正常组127人，锌缺乏组83人。其中，在幼儿组中＜50μg/dL人数占总人数的为25％，而中年组中的占为91％，中年组缺锌的人严重于儿童组。
5、锌缺乏易感人群候选生物标志物验证结果
儿童组和中年组人群GSTO1、GSTA4的ELISA试剂盒检测，结果如图10所示，儿童组正常组和锌缺乏组的GSTO1差异均有统计学意义(P＜0.05)，两组间 GSTA4差异无统计学意义(P＞0.05)；中年组正常组和锌缺乏组的GSTO1差异均有统计学意义(P＜0.05)，两组间GSTA4差异无统计学意义(P＞0.05)。
6、锌缺乏易感人群(中年组)相关指标结果比较
人群各指标结果的比较如表5所示，正常组和锌缺乏组的锌、GSTO1、MT、 ALT、AST、UA、Ca差异均有统计学差异(P＜0.05)，GLU、BUN、TCHO、TG、 HDL-C、LDL-C、CRE、Mg、Fe、Cu、摄入锌在两组间差异无统计学差异(P＞0.05)。
表5.锌缺乏易感人群的血清指标结果(中年组)
注:NG:正常组.ZDG:锌缺乏组.*:NG vs ZDG,P<0.05.
7、锌缺乏易感人群GSTO1、血清谷氨酸和血清锌的相关性分析
GSTO1与血清锌和MT均有相关性，经过偏相关回归排除MT的干扰，发现 GSTO1、谷氨酸和血清锌之间存在相关(P＜0.05)，如图11所示，GSTO1与血清锌的相关性高于谷氨酸和血清锌之间存在相关。在筛选步骤，为了判断生物标志物的诊断能力，对血清GSTO1和谷氨酸的浓度进行ROC曲线分析。GSTO1对锌缺乏易感人群儿童组和中年组有较高的诊断能力，AUC值均大于0.9；血清谷氨酸在中年组具有一定的诊断能力，AUC为0.691，儿童组没有检测。表5表示的为血清锌和GSTO1的AUC的结果。从结果中可看出，基于血清锌为指标的GSTO1灵敏度和特异度均较好。
在儿童组和中年组中，经过偏相关回归排除MT的干扰，均发现GSTO1与血清锌有相关性(P＜0.05)，如图12A、B所示。在中年组，发现摄入锌和血清锌之间不存在相关性(P＞0.05，图12C)，而摄入锌与GSTO1之间存在相关性(P ＜0.05，图12D)。
由以上结果可知，经不同年龄的锌缺乏易感人群验证，血清GSTO1为潜在的人群锌缺乏诊断的生物标志物。
实施例3锌缺乏人群补锌干预实验
在中年组人群中选取低锌人群进行补锌干预实验，该研究为一项随机双盲对照试验，实验时间共2周，研究人员分别在第1周、2周抽取参与者的空腹静脉血以检测血清锌、生物标志物浓度，验证生物标志物的敏感特异程度。在整个实验过程中，均对人群进行膳食问卷调查以计算膳食锌摄入量。同时排除其余干扰因素，通过相关性分析来评估生物标志物、血清锌水平和摄入锌水平三者变化情况以及ROC曲线分析生物标志物的诊断能力。
实验流程：补锌干预实验招募中年组的低锌人群，用随机数字表法将低锌人群分为两组：干预组和对照组。研究人员向干预组参与者每天提供一瓶葡萄糖酸锌口服液(3.5mg锌/d)，对照组给予等体积的葡萄糖口服液干预。干预组和对照组均干预半个月，在实验开始前，告知参与者进食同往常一样，但要避免食用任何锌强化食品和任何维生素矿物质补充剂，研究人员在第1周、2周抽取参与者的空腹静脉血以及定期进行膳食问卷调查来评估方案的依从性。从研究中删除不合规矩的参与者以及2天内缺席的参与者。
根据锌摄入情况、血清锌浓度与生物标志物的浓度进行相关性分析，明确不同人群锌营养状态生物标志物的浓度范围，尝试建立评价人体锌缺乏状态的标准。
补锌干预第一周，膳食摄入锌与血清锌、GSTO1均存在相关性(P＜0.05)，但摄入锌与血清锌的相关性小于摄入锌与GSTO1的相关性(图13A、图13C、 13E)。干预第二周，摄入锌与血清锌、GSTO1同样存在相关性(P＜0.05)，摄入锌与血清锌的相关性同样小于摄入锌与GSTO1的相关性(图13B、图13D、13F)。
为了比较血清锌和GSTO1的诊断能力，对两者在补锌后进行ROC曲线分析。补锌干预后第一周、第二周，GSTO1对补锌干预有良好的诊断价值，且GSTO1 的敏感度特异度均高于血清锌(表6、图14)。
表6补锌后血清锌和GSTO1诊断学价值比较分析
综上，谷胱甘肽转移酶Omega1(GSTO1)可用于人群锌缺乏的诊断，对机体锌营养状态的响应高于血清锌水平，与膳食锌的相关性高于与血清锌与膳食锌的相关性，价格适中，检测速度快。
Claims (3)
1.谷胱甘肽转移酶Omega1(glutathione S-transferase Omega1，GSTO1)作为分子标志物在制备评价个体的锌营养状态试剂盒中的应用，所述的应用中不包含与锌相关的疾病的诊断和治疗。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过检测个体空腹静脉血中谷胱甘肽转移酶Omega1的浓度来评价个体的锌营养状态。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，检测方法包括通过采用ELISA检测方法或Western Blot检测方法对个体空腹静脉血中谷胱甘肽转移酶Omega1的浓度进行检测。
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