CN108027361B - 冠心病生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了冠心病生物标志物及其应用。具体地，本发明提供了一种生物标志物集合，所述的集合包括多种冠心病生物标志物，可以用于评估待测对象的CHD患病风险或待测对象CHD诊断。本发明还提供了包含所述生物标志物集合的试剂盒以及所述生物标志物集合在CHD患病风险评估和诊断中的应用。

Description

冠心病生物标志物及其应用

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2015年8月20日提交PCT专利申请(申请号 PCT/CN2015/087664)的优先权，通过引用并入此处。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及心血管疾病生物标志物及其应用，更具体地涉及冠心病(CHD)生物标志物及其应用。

背景技术

冠心病(CHD)是现代社会的的最大的健康影响因素，其每年造成的死亡人数超过其他所有类型癌症之和。通过对MaGiCAD群体5年的跟踪研究，证实大多数心血管疾病患者的死亡都与其对自身健康状况的意识程度不足，以及治疗不及时有关。(Graninger，D.J.&Mosedale，D.E.Metabolomics in coronary heart disease.Heart.Metab.55，8-12(2012)，通过引用并入本文)。早期诊断和预防CHD的挑战在于缺乏可靠的无创生物标志物。目前，诊断CHD的“金标准”仍为冠状动脉造影，这种诊断方式是侵入性的，并具有多种致命副作用的风险。这限制了对大群体进行CHD筛查以及CHD的早期风险预测。

许多研究指出脂肪酸在心脏代谢中起到的重要作用，它们是在正常生理条件下心脏通过线粒体氧化磷酸化生成ATP的主要底物，约占到心脏ATP合成的 60-90％。像CHD和心力衰竭等心血管疾病(CVD)，会经历“代谢改变”的过程，这是内在和外在扰动引起的结果。以前，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的增加被认为是CHD的主要危险因素之一。事实上，在心血管疾病的核心缺陷是脂质代谢 (Fernandez，C.et al.Plasma lipid composition andrisk of developing cardiovascular disease.PLoS ONE 8，e71846(2013)，通过引用并入本文)，这使得代谢组学成为研究这类疾病的一个特别有前途的方法。

代谢组学是一个创新和高通量生物分析方法，旨在对存在于任何生物系统或任何特定生理状态的小分子(分子量小于1500道尔顿)进行鉴定和定量。在过去十年中，两个主要的分析技术，核磁共振(NMR)和质谱(MS)，在测量内源性化合物的应用中呈指数式的增长。自2005年以来，基于MS技术有了长足的发展，并因比NMR具有以下优势使得其得到更频繁地使用：灵敏度更高；代谢组覆盖度更高；代谢物鉴定和辨别能力更高；以及组分-分类-特异分析的模块化 (Griffiths，W.J.et al.Targeted metabolomics for biomarkerdiscovery. Angew.Chem.Int.Ed.49，5426-5445(2010)，通过引用并入本文)。MS主要与层析方法如气相色谱质谱(GC-MS)和液相色谱质谱(LC-MS)结合使用。

目前，冠心病的代谢组学研究还有许多不足，本领域迫切需要对冠心病代谢组学，尤其是冠心病生物标志物进行进一步的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供冠心病(CHD)生物标志物及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种生物标志物集合，所述的集合包括一种或多种选自下表的生物标志物：

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1～b37。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物bm、和一个或多个选自子集X的生物标志物，其中子集X由生物标志物b1～b(m-1)和生物标志物b(m+1)～b37构成， m为整数且1≤m≤37，较佳地1≤m≤7，更佳地1≤m≤5。

在另一优选例中，m为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、或37；

其中，当m为1时，所述的生物标志物b1～b(m-1)不存在；

当m为2时，所述的生物标志物b1～b(m-1)表示生物标志物b1；

当m＝3-35中任一整数时，子集X由生物标志物b1～b(m-1)和生物标志物 b(m+1)～b37构成；

当m为36时，所述的生物标志物b(m+1)～b37表示生物标志物b37；

当m为37时，所述的生物标志物b(m+1)～b37不存在。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1～b7、和一个或多个选自子集 Y的生物标志物，其中子集Y由生物标志物b8-b37构成。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1～b5、和一个或多个选自子集 Z的生物标志物，其中子集Z由生物标志物b6-b37构成。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1和b5。

在另一优选例中，所述的集合包括选自下组的生物标志物：

生物标志物b1、生物标志物b2、生物标志物b3、生物标志物b4、生物标志物b5、生物标志物b6、生物标志物b7、或其组合。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1和一个或多个选自子集A的生物标志物，其中子集A由生物标志物b2～b7构成。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b2和一个或多个选自子集B的生物标志物，其中子集B由生物标志物b1和生物标志物b3～b7构成。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b3和一个或多个选自子集C的生物标志物，其中子集C由生物标志物b1～b2和生物标志物b4～b7构成。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b4和一个或多个选自子集D的生物标志物，其中子集D由生物标志物b1～b3和生物标志物b5～b7构成。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b5和一个或多个选自子集E的生物标志物，其中子集E由生物标志物b1～b4和生物标志物b6～b7构成。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b6和一个或多个选自子集F的生物标志物，其中子集F由生物标志物b1～b5和生物标志物b7构成。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b7和一个或多个选自子集G的生物标志物，其中子集G由生物标志物b1～b6构成。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1～b7。

在另一优选例中，所述的集合包括选自下组的生物标志物：

生物标志物b1、生物标志物b2、生物标志物b3、生物标志物b4、生物标志物b5、或其组合。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1～b5。

在另一优选例中，所述的集合包括生物标志物b1和b5。

在另一优选例中，所述的集合包括选自下组的生物标志物：生物标志物b1、生物标志物b3、生物标志物b4、生物标志物b6、或其组合。

在另一优选例中，所述的生物标志物或生物标志物集合来源于血液、血浆、或血清样品。

在另一优选例中，与一参考值进行比较，一个或多个选自子集H的生物标志物增加，表明待测对象具有CHD患病风险或患有CHD，

其中子集H包括生物标志物b2、b4、b5、b6、b8、b10、b15、b16、b17、b18、 b21、b22、b23、b24、b26、b27、b31、b32、b33、b34、和b35。

在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b2、b4、b5、和b6。

在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b2、b4和b5。

在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b5。

在另一优选例中，与一参考值进行比较，一个或多个选自子集K的生物标志物减少，表明待测对象具有CHD患病风险或患有CHD，

其中子集K包括生物标志物b1、b3、b7、b9、b11、b12、b13、b14、b19、b20、 b25、b28、b29、b30、b36、和b37。

在另一优选例中，所述的子集K包括生物标志物b1、b3、和b7。

在另一优选例中，所述的子集K包括生物标志物b1和b3。

在另一优选例中，所述的子集K包括生物标志物b1。

在另一优选例中，通过质谱法对各个生物标志物进行鉴定，较佳地，通过色谱质谱联用，如气相色谱-质谱法(GC-MS)或液相色谱-质谱(LC-MS)。

在另一优选例中，所述的集合用于评估待测对象的CHD患病风险或待测对象CHD诊断。

在另一优选例中，所述的评估待测对象的CHD患病风险包括CHD的早期筛查。

在本发明的第二方面，提供了一种用于CHD患病风险评估或诊断的试剂组合，所述试剂组合包括用于检测本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物的试剂。

在另一优选例中，所述的试剂包括用于质谱法检测本发明第一方面所述的集合中各个生物标志物的物质。

在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒包括本发明第一方面所述的集合和/或本发明第二方面所述的试剂组合。

在另一优选例中，本发明第一方面所述的集合中各个生物标记物用作标准品。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一说明书，所述的说明书记载了来源于CHD患者和/或健康对照者的如本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平的参考数据集(例如，表7所示的数据)。

在本发明的第四方面，提供了一种本发明第一方面所述的集合和/或本发明第二方面所述的试剂组合的用途，用于制备一试剂盒，所述的试剂盒用于评估待测对象的CHD患病风险或待测对象CHD诊断。

在另一优选例中，所述的评估或诊断包括步骤：

(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；

(2)将步骤(1)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较；

较佳地，所述的参考数据集包括来源于CHD患者和健康对照者的如本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平。

在另一优选例中，所述的样品选自下组：血液、血浆、和血清。

在另一优选例中，所述的将步骤(1)测得的水平与一参考数据集进行比较，还包括建立一多元统计模型从而输出患病可能性的步骤，较佳地，所述的多元统计模型为随机森林模型。

在另一优选例中，如果所述的患病可能性≥0.5，所述的对象被判定为具有CHD 患病风险或患有CHD。

在另一优选例中，当与一参考值进行比较时，一个或多个选自子集H的生物标志物增加，表明待测对象具有CHD患病风险或患有CHD，

其中子集H包括生物标志物b2、b4、b5、b6、b8、b10、b15、b16、b17、b18、 b21、b22、b23、b24、b26、b27、b31、b32、b33、b34、和b35。

在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b2、b4、b5、和b6。

在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b2、b4和b5。

在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b5。

在另一优选例中，与一参考值进行比较，一个或多个选自子集K的生物标志物减少，表明待测对象具有CHD患病风险或患有CHD，

其中子集K包括生物标志物b1、b3、b7、b9、b11、b12、b13、b14、b19、b20、 b25、b28、b29、b30、b36、和b37。

在另一优选例中，所述的子集K包括生物标志物b1、b3、和b7。

在另一优选例中，所述的子集K包括生物标志物b1和b3。

在另一优选例中，所述的子集K包括生物标志物b1。

在另一优选例中，通过质谱法对各个生物标志物的水平进行检测，较佳地，通过色谱质谱联用，如气相色谱-质谱法(GC-MS)或液相色谱-质谱(LC-MS)。

在另一优选例中，在步骤(1)之前，所述的方法还包括对样品进行处理的步骤。

在本发明的第五方面，提供了一种评估待测对象的CHD患病风险或待测对象 CHD诊断的方法，包括步骤：

(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；

(2)将步骤(1)测得的水平与一参考数据集或一参考值(如健康对照者的参考值)进行比较；

较佳地，所述的参考数据集包括来源于CHD患者和健康对照者的如本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平。

在本发明的第六方面，提供了一种筛选治疗CHD的候选化合物的方法，包括步骤：

(1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样品中本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平V1；在对照组中，向待测对象施用空白对照(包括溶媒)，检测对照组中来源于所述对象的样品中本发明第一方面所述集合中各个生物标记物的水平V2；

(2)比较上一步骤检测得到的水平V1和水平V2进行比较，从而确定所述测试化合物是否是治疗CHD的候选化合物。

在另一优选例中，所述的待测对象为CHD患者。

在另一优选例中，如果一个或多个选自子集H的生物标志物的水平V1显著低于水平V2，表明测试化合物为治疗CHD的候选化合物，

其中子集H包括生物标志物b2、b4、b5、b6、b8、b10、b15、b16、b17、b18、 b21、b22、b23、b24、b26、b27、b31、b32、b33、b34、和b35。

在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b2、b4、b5、和b6。

在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b2、b4和b5。

在另一优选例中，所述的子集H包括生物标志物b5。

在另一优选例中，所述“显著低于”指水平V1/水平V2的比值≤0.8，较佳地≤0.6。

在另一优选例中，如果一个或多个选自子集K的生物标志物的水平V1显著高于水平V2，表明测试化合物为治疗CHD的候选化合物，

其中子集K包括生物标志物b1、b3、b7、b9、b11、b12、b13、b14、b19、b20、 b25、b28、b29、b30、b36、和b37。

在另一优选例中，所述的子集K包括生物标志物b1、b3、和b7。

在另一优选例中，所述的子集K包括生物标志物b1和b3。

在另一优选例中，所述的子集K包括生物标志物b1。

在另一优选例中，所述“显著高于”指水平V1/水平V2的比值≥1.2，较佳地≥1.5。

在本发明的第七方面，提供了一种本发明第一方面所述的集合和/或本发明第二方面所述的试剂组合的用途，用于筛选治疗CHD的候选化合物和/或用于评估候选化合物对CHD的治疗效果。

在本发明的第八方面，提供了一种建立评估CHD患病风险或用于CHD诊断的质谱模型的方法，所述的方法包括识别患者和健康对照者之间，血液样品中差异表达物质的步骤,其中，所述的差异表达物质包括一种或多种本发明第一方面所述集合中的生物标记物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1示出了QC样品和测试样品的二维PCA得分图。图中每个点代表一个样品，其中黑色菱形点代表测试样品，白色圆点代表QC样品。

图2示出了2588种代谢产物的云状图。图中的背景灰线代表各样品的总离子色谱图；每个气泡代表一种代谢物，气泡的位置代表代谢物的保留时间(x坐标) 和质荷比(y坐标)。图的上半部分示出了在CHD患者中增加(变化倍数>1.2)的808 种代谢产物的增加强度；下半部分示出了在CHD患者中降低(变化倍数<0.8)的 793种代谢物的降低强度。

图3示出了40个CHD患者和43个健康对照之间的PCA得分图。图中的每个点代表一个样本，其中黑色圆点代表健康对照，白色矩形点代表CHD患者。

图4示出了血浆样品的三维(3D)PLS-DA图。其中黑色菱形点和白色矩形点代表分别为CHD患者及健康对照。PLS-DA的PC1(42.86％)、PC2(10.72％)、PC3(13.68％) 表明，CHD患者和健康对照的血浆样品的代谢谱存在明显差异。模型是利用10 折交叉验证建立的，其中R2为61.26％，Q2为48.32％。

图5示出了对血浆样品的PLS-DA模型进行置换检验的R2分布图。该模型的R2 值(右边的粗竖线)与H0随机分类器置换分布(左侧一系列竖线，N＝1000)显著地分离。因此，该模型随机发生的概率低于0.001。

图6示出了包含散点图中PLS-DA模型的模型协方差(x轴)和模型相关性(y轴) 的S图。白色三角形代表VIP>1的代谢物，黑色三角形代表VIP≤1的代谢物。

图7示出了包含散点图中代谢物的统计检验结果(y轴：-log(q值))和变化幅度情况(Log2(FC))的火山图。虚线两边的点代表q值<0.05，FC>1.2或FC<0.8的代谢物。虚线中间的点代表q值<0.05，FC值介于0.8和1.2之间的代谢物。横线下面的点代表q值<0.05的代谢产物。

图8示出了利用火山图和S图结果作出的维恩图，结果显示，有83种代谢物在CHD患者中显著改变。左边的椭圆代表火山图中显著改变的1140种代谢产物(q值＜0.05，FC＞1.2或FC＜0.8)。右边的椭圆代表S图中显著改变的138种代谢产物 (VIP＞1)。这两个椭圆的重叠区域代表83代谢物，同时满足：q值＜0.05，FC＞1.2 或FC＜0.8，VIP＞1。

图9示出了7种潜在生物标志物的强度之间的相关性。每个矩形代表一个特定的代谢物。位于竖线的左侧代谢物的水平在CHD患者增加，位于竖线右侧的代谢物的水平在CHD患者明显下降。连接代谢物的线代表显著相关(Spearman相关性调整p值＜0.05)。实线代表正相关，虚线代表负相关。

图10示出了鉴定出的5种潜在血浆生物标志物在验证集中的接收者操作特征(ROC)分析曲线。

图11示出了利用随机森林分类器鉴定出的5种代谢物生物标志物在训练集中的接收者操作特征(ROC)分析曲线。

图12示出了5种代谢物生物标志物分别在训练集中的ROC曲线。

图13示出了5种代谢物生物标志物分别在训练集的CHD患者和健康对照样品中的丰度水平的箱线图。

图14示出了2种代谢物生物标志物结合在验证集中的ROC曲线。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现了冠心病(CHD)生物标志物。具体地，本发明发现了一种生物标志物集合，所述的集合包括多种冠心病生物标志物，可以用于评估待测对象的CHD患病风险或待测对象CHD诊断，具有高灵敏性、高特异性的优点，具有重要的应用价值。

术语

本发明所用术语具有相关领域普通技术人员通常理解的含义。然而，为了更好地理解本发明，对一些定义和相关术语的解释如下：

根据本发明，术语“冠心病”，也称为“冠状心脏疾病(CHD)”、“冠状动脉疾病(CAD)”，是指包括稳定型心绞痛，不稳定型心绞痛，心肌梗塞和冠心病猝死等症状的一组疾病。在本发明中，CHD患者通过冠状动脉造影技术诊断。

根据本发明，术语“生物标志物集合”是指一种生物标志物、或两种及两种以上生物标志物的组合。

根据本发明，质谱(MS)可以分为离子阱质谱、四极杆质谱、轨道阱质谱和飞行时间质谱，偏差分别为0.2amu、0.4amu、3ppm和5ppm。在本发明中，利用轨道阱质谱获得MS数据。

根据本发明，生物标志物质的水平通过MS峰强度指示。

根据本发明，由现有技术已知，质荷比(m/z)和保留时间(RT)具有相同的含义。在本发明中，m/z单位为amu，这是指原子质量单位，也命名为道尔顿。道尔顿表示物质在原子或分子级(原子质量)的标准单位。一个统一的原子质量单位相当于1克/摩尔。它的定义为：碳-12原子质量的十二分之一。本发明对代谢物鉴定时的允许质量分辨率(误差)为10ppm，ppm即百万分之一。例如，某代谢物A同位素准确质量＝118Da，仪器测量的质量＝118.001Da；偏差＝0.001 amu；误差[偏差/准确质量×106]＝8.47ppm。

本领域的技术人员应当清楚：m/z和保留时间的值在使用不同的检测方法或 LC-MS仪器时会有一定范围的波动。例如，m/z可以在±3.00，或±2.00，或±1.00 的范围内波动；保留时间可以在±60秒，或±45秒，或±30秒，或±15秒的范围内波动。

根据本发明，参考集指训练集。

根据本发明，由现有技术可知，训练集和验证集具有相同的含义。在本发明的一个实施方式中，训练集指CHD患者和健康对照生物样品中的生物标志物水平的集。在本发明的一个实施方式中，验证集是指用于测试训练集性能的数据集。在本发明的一个实施方式中，生物标志物的水平可以根据测定的方法代表为绝对值或相对值。例如，当用质谱来测定生物标记物的水平时，峰的强度可以代表生物标记物水平，这是一个相对值的水平；当用PCR来测定生物标志物的水平时，基因的拷贝数或基因片段的拷贝数可以代表的生物标志物的水平。

在本发明的一个实施方式中，参照值是指健康对照的参考值或正常值。本领域的技术人员清楚，在样品数量足够多情况下，每个每个生物标记的正常值 (绝对值)的范围可以通过检验和计算方法得到。因此，当利用除质谱以外的其他方法来检测生物标志物的水平时，这些生物标记物水平的绝对值，可以直接与正常值比较，从而评价患有CHD的风险，以及诊断或早期诊断CHD。任选地，还可以使用统计方法。

根据本发明，术语“生物标志物”，也称为“生物学标志物”，是指个体的生物状态的可测量指标。这样的生物标记物可以是在个体中的任何物质，只要它们与被检个体的特定生物状态(例如，疾病)有关系，例如，核酸标志物(例如DNA)，蛋白质标志物，细胞因子标记物，趋化因子标记物，碳水化合物标志物，抗原标志物，抗体标志物，物种标志物(种/属的标记)和功能标志物(KO/OG 标记)等。生物标记物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程，致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。

根据本发明，术语“个体”指动物，特别是哺乳动物，如灵长类动物，最好是人。

根据本发明，术语“血浆”指的是全血的液体成分。根据所使用的分离方法，血浆可能完全不含细胞成分，也可能含有不同量的血小板和/或少量其它细胞成分。

根据本发明，术语如“一”、“一个”和“这”不仅指单数的个体，而是包括可以用来说明特定实施方式的通常的一类。

需要说明的是，在此提供术语的解释仅为了使本领域技术人员更好地理解本发明，并非对本发明限制。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明以血浆代谢物作为生物标志物用于CHD的早期筛查、预判、防治，具有高灵敏性、高特异性的优点，具有重要的应用价值。

(b)血浆作为生物标志物检测样本具有取材方便、操作步骤简单和可连续体外检测等优点。

(c)本发明的生物标志物用于CHD的早期筛查、预判、防治具有重复性好的特点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

本专利申请中的生物标志物b5对应于PCT专利申请(申请号PCT/CN2015/087664)的生物标志物18。

实施例1

1.材料与方法

1.1样品收集

从广东省人民医院招募83位志愿者。其中，40位为经血管造影确诊为CHD 患者，其他43位为健康对照。利用通过Vacuette EDTA血液收集管收集志愿者血液样品，并于以4℃下，14000g离心10分钟，得到血浆样品，保存于-80℃备用。 (志愿者的临床信息列于表1中)，本实验得到了深圳华大基因研究院伦理审查委员会批准。并且样品收集前，得到了所有志愿者的书面同意。

1.2材料与试剂

HPLC级甲酸购自赛默飞世尔科技公司(英国拉夫伯勒)，实验所用纯水用 Milli-Q超纯水系统(密里博公司，美国麻萨诸塞州比尔里卡)制备。所用分分析柱为安捷伦ZORBAXODS C18色谱柱(安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉)(150mm×2.1mm，3.5μm)。

1.3样品制备

为了提取血浆样品中低分子量(＜1500道尔顿)的代谢物，用类似先前报道的方法(Luan H，Meng N，Liu P，Fu J，Chen X，Rao W，Jiang H，Xu X，Cai Z，Wang J. Non-targeted metabolomics and lipidomics LC-MS data from maternal plasma of 180healthy pregnant women.Gigascience[Internet].2015；4：16-19.，通过引用并入本文)制备样品。实验前，所有的血浆样品于冰上解冻。从每个血浆样品中，各取10μL进行混合，从而得到“质量控制”(QC)样品。对于血浆样品，取100μL样品与200μL甲醇混合以沉淀蛋白质。然后将混合物在4℃下以14000g离心10分钟。上清液转移到1.5mL聚丙烯管中，用以下面的代谢谱分析实验。

1.4 HPLC-MS实验

为了进行HPLC-MS实验，将分辨率为30000的LTQ Orbitrap Velos仪器(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州)与Shimadzu Prominence HPLC系统(岛津科学仪器，日本京都)连接。所有样品在正离子模式下进行分析。设置锥孔电压为 4.5KV、毛细管温度为350℃。质量扫描范围为50-1500m/z。氮气鞘气速度为 30L/min，辅气为10L/min。该HPLC-MS系统在双梯度模式下运行。溶剂A为 0.1％(v/v)甲酸/水，溶剂B为0.1％(v/v)甲酸/甲醇。流动相梯度如下：0分钟，5％B； 5min，5％B；8min，100％B；9min，100％B；18min，5％B；20min，5％B。流速为0.2mL/min。为了保证系统的平衡，在实验开始时注射5份QC样品；同时，为检测系统在整个实验期间的稳定性，每5个试验样品之间注入1个QC样品。

1.5数据处理与统计分析

HPLC-MS数据的预处理包括以下程序：峰选择，峰分组，保留时间校正，第二峰值分组，以及同位素和加合物注释(Lu K，Knutson CG，Wishnok JS，Fox JG，TannenbaumSR.Serum metabolomics in a Helicobacter hepaticus mouse model of inflammatorybowel disease reveal important changes in the microbiome， serum peptides，andintermediary metabolism.J Proteome Res.ACS Publications； 2012；11：4916-4926.，通过引用并入本文)。将LC-MS得到的原始数据文件转换成mzXML格式，然后用R软件(V3.1.1)中的XCMS(Smith CA，Want EJ，O′Maille G，Abagyan R，Siuzdak G.XCMS：processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinearpeak alignment，matching，and identification. Anal Chem.ACS Publications；2006；78：779-787.，通过引用并入本文)和 CAMERA(Kuhl C，Tautenhahn R，

C，LarsonTR，Neumann S.CAMERA： an integrated strategy for compound spectra extractionand annotation of liquid chromatography/mass spectrometry data sets.AnalChem.ACS Publications； 2011；84：283-289.，通过引用并入本文)工具包进行处理。另外，还记录每个峰的强度，并生成一个包括任意离子峰指数(保留时间和m/z对)、样品名称(观测值) 和离子强度信息(变量)的三维矩阵。

为了获得一致的结果，对所获得的矩阵，进一步去除缺失值超过80％(离子强度＝0)的峰以及在CHD和健康对照组中都存在的同位素离子。基于标准生物质量控制样品(QC样品)与真实血浆样品的定量分析，使用Robust Loess信号校正 (R-LSC)法将所有实验样品的离子峰强度根据QC样品峰强度标准化(Dunn WB， Broadhurst D，Begley P，Zelena E，Francis-McIntyre S，Anderson N，Brown M， Knowles JD，Halsall A，HaseldenJN.Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma usinggas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.NatProtoc.Nature Publishing Group；2011；6：1060-1083.，通过引用并入本文)，从而保证代谢谱的质量。QC样品中代谢物的相对标准偏差 (RSD)的阈值设定30％，该值被作为评估代谢组数据集重复性的标准(Dunn WB， Wilson ID，Nicholls AW，Broadhurst D.Theimportance of experimental design and QC samples in large-scale and MS-drivenuntargeted metabolomic studies of humans.Bioanalysis.Future Science；2012；4：2249-2264.，通过引用并入本文)。

使用非参数单因素法(Mann-Whitney-Wilcoxon检验)来寻找CHD患者中相对健康对照显著改变的代谢物。用错误发现率(FDR)对得到的结果进行校正，从而确保代谢物的峰被重复地检测到(Ling XB，Cohen H，Jin J，Lau I，Schilling J. FDR made easy indifferential feature discovery and correlation analyses.Bioinformatics.Oxford Univ Press；2009；25：1461-1462.，通过引用并入本文)。用多元分析(PCA，PLS-DA)方法来辨别CHD患者样品和对照个体样品。基于10折交叉验证PLS-DA模型，变量预测重要性(VIP)的阈值设置为1，可以获得大量的造成CHD患者和对照个体代谢谱差异的代谢物。利用R软件统计工具包中的 FDR检验对PLS-DA模型在单因素水平进行验证(p＜0.05)。三维PLS-DA也用来展示CHD患者样品和对照个体样品的的差异(Triba MN，Moyec L Le，Amathieu R， Goossens C，Bouchemal N，Nahon P，Rutledge DN，SavarinP.PLS/OPLS models in metabolomics：the impact of permutation of dataset rowson the K-fold cross-validation quality parameters.Mol Biosyst.Royal Societyof Chemistry； 2015；11：13-19.，通过引用并入本文)。利用Spearman相关分析方法来分析CHD 患者和对照个体显著改变的血浆代谢物与临床表型数据的相关性。此外，利用接收器操作特征(ROC)分析评估鉴定出的潜在生物标志物的诊断能力(Ndrepepa G，Braun S，Kastrati A，

A.Area under ROC curve，sensitivity，specificity of N-terminal probrain natriuretic peptide in predicting mortality in varioussubsets of patients with ischemic heart disease.Clin Res Cardiol.Springer；2007；96：763-765.，通过引用并入本文)。

1.6代谢物鉴定与验证

将样品代谢物精确分子质量数据(m/z)与在线HMDB数据库(http：//www.hmdb.ca)(Wishart DS，Tzur D，Knox C，Eisner R，Guo AC，Young N， Cheng D，Jewell K，Arndt D，Sawhney S.HMDB：the human metabolome database. Nucleic Acids Res.Oxford UnivPress；2007；35：D521-D526.；Wishart DS，Knox C， Guo AC，Eisner R，Young N，Gautam B，Hau DD，Psychogios N，Dong E，Bouatra S.HMDB：a knowledgebase for the humanmetabolome.Nucleic Acids Res.Oxford Univ Press；2009；37：D603-D610.；Wishart DS，Jewison T，Guo AC，Wilson M， Knox C，Liu Y，Djoumbou Y，Mandal R，Aziat F，DongE.HMDB 3.0-the human metabolome database in 2013.Nucleic Acids Res.OxfordUniv Press； 2012；gks 1065.，通过引用并入本文)和KEGG数据库 (www.genome.jp/kegg/)(Kanehisa M，Goto S.KEGG：kyoto encyclopedia of genes and genomes.NucleicAcids Res.Oxford Univ Press；2000；28：27-30.；Kanehisa M， Goto S，Sato Y，Kawashima M，Furumichi M，Tanabe M.Data，information， knowledge and principle：back to metabolism in KEGG.Nucleic Acids Res.Oxford Univ Press；2014；42：D199-D205.，通过引用并入本文)进行比对，从而对代谢物进行鉴定。如果观测值和数据库值之间的质量差异小于10ppm，代谢物将被鉴定。代谢物的分子式将进一步由同位素分布测量来验证。通过比较与购买的参考标准品的MS/MS谱和保留时间，来验证和确认那些显著变化的代谢物(Chen J， Zhao X，Fritsche J，Yin P，Schmitt-Kopplin P，Wang W，Lu X，

HU，Schleicher ED，Lehmann R.Practical approach for the identification and isomerelucidation of biomarkers detected in a metabonomic study for the discoveryof individuals at risk for diabetes by integrating the chromatographic andmass spectrometric information.Anal Chem.ACS Publications；2008；80：1280-1289.，通过引用并入本文)。

2.实验结果

2.1志愿者临床信息

本发明利用非靶标代谢组学方法分析40位CHD患者和43位健康对照个体的血浆样品(训练集)。所有志愿者的临床信息列于表1中。包括共13种生化指标，分别为：年龄(AGE)、甘油三酯(TRIG)、脂蛋白(LPA)、BMI、丙氨酸转氨酶(ALT)、低密度脂蛋白(LDLC)、胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDLC)、天冬氨酸转氨酶(AST)、载脂蛋白B(APOB)、载脂蛋白A(APOA)、白蛋白(ALB)和总蛋白(TP)。

表1志愿者临床生化指标信息

^#由于并不是所有志愿者都搜集到了所有的生化指标，列出了每个指标的CHD患者和健康对照的志愿者人数。

2.2 QC样品分析

利用基于非靶标HPLC-MS代谢组技术，从血浆样品中获得2588种代谢物 (m/z，质荷比)。为了评估数据集的稳定性和再现性，在整个实验期间测定了QC 样品。对QC样品和测试样品进行主成分分析(PCA)，从而得到一个二维PCA得分图，示于图1。结果表明，QC样品形成的簇与测试样品形成的簇没有明显的分散，由此证实，我们目前的代谢组数据具有良好的稳定性和再现性。

2.3血浆代谢组数据分析

为了说明整个代谢组数据谱，发明人示出了所有2588种代谢物的云状图(图 2)。结果表明，与健康对照组进行比较，其中31.22％(808)的代谢物在CHD患者的血浆样品中显著增加(改变倍数＞1.2)，而其中30.64％(793)的代谢物在CHD患者的血浆样品中显著下降(改变倍数＜0.8)。

为了评价所得到的2588代谢物的鉴别能力，发明人对40位CHD患者和43名健康对照个体的血浆样品进行主成分分析(PCA)，得到的样本的二维PCA得分图 (如图3)，结果表示，主成分PC1和PC2分别为11.09％和6.61％，CHD患者组和对照组中形成两个独立的集群。此外，对CHD患者组和健康对照组进行三维偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，结果如图4所示，主成分PC1，PC2和PC3分别为 42.86％，10.72％和7.68％，表明两组代谢谱具有显著的差异。该PLS-DA模型是利用10折交叉验证构建出来的，并经证实利用3个组分是一个良好的模型，具有良好预测能力(累计R2(X)＝61.26％，累计Q2(X)＝48.32)。为了避免模型的过拟合，发明人进一步利用置换多元变量分析(PERMANOVA)对其进行验证。血浆样品PLS-DA模型置换检验的R2分布图示于图5。置换模型使用了三个潜在的因素，这种模型随机发生的概率小于0.001。上述这些结果证实，CHD患者和对照组的代谢谱是显著不同的。

2.4代谢物生物标志物鉴定

为了鉴定CHD患者中显著改变的代谢物以及CHD的潜在生物标志物，发明人进行了两种类型的分析。首先，从PLS-DA模型中获得所有2588种代谢物的 VIP得分，推测的生物标志物用S图示出(图6)。PLS-DA模型的协方差(x轴)和相关性(y轴)一起示于散点图中。将CHD患者中的每一个代谢物的错误发现率 (q-value)、改变倍数(FC)和平均强度用健康对照的相同代谢物的平均值进行标准化，然后利用双侧Wilcoxon秩和检验进行检验。将改变大小与统计检验结果一起绘制成火山图(图7)，这使得可以对改变倍数较大的代谢物进行快速直观地识别。为了整合S图和火山图的结果，发明人绘制了维恩图(图8)。最终，重叠区域下的83种代谢物符合以下标准(q值＜0.05，FC＞1.2或FC＜0.8，VIP＞1)。

为了鉴定潜在生物标志物，将83种显著改变的代谢物比对到KEGG和 HMDB数据库(＜10ppm)。一共鉴定出37种潜在的代谢物，它们的详细信息在表2 中列出。在这37种代谢物中，有7个，即2，3-二甲基马来酸盐 (2，3-Dimethylmaleate)、2-萘酚(2-Naphthol)、甲基衣康酸盐(Methylitaconate)、 N-乙酰基-D-葡糖胺-6-磷酸盐(N-Acetyl-D-glucosamine6-phosphate)、1-萘酚 (1-Naphthol)、左旋肉碱(L-Carnitine)和苯丙酮酸盐(Phenylpyruvate)用购买的参照标准品得到了验证，可以认为是CHD诊断的候选潜在生物标志物。这7种代谢物的详细信息列于表3中。这7种潜在生物标志物中，2，3-二甲基马来酸盐、2- 萘酚、甲基衣康酸盐和N-乙酰基-D-葡糖胺-6-磷酸盐在CHD患者中显著增加(富集方向)，改变倍数分别为4.24，17.61，1.40和16.58，q值分别为3.88×10^-9，0.014， 3.14×10^-11和2.85×10^-10。其他三个代谢物(1-萘酚、左旋肉碱、和苯丙酮酸盐)在 CHD患者中明显降低(富集方向)，改变倍数分别为0.27，0.06和0.06倍；q值分别为0.0035，0.0079和0.0198。用在线工具MetaboAnalyst 3.0分析相关代谢通路，共鉴定了以下5个通路(表4)：烟酸盐和烟酰胺的代谢通路，细胞色素P450异源物质代谢通路，苯丙氨酸通路，酪氨酸和色氨酸生物合成通路，苯丙氨酸代谢通路，氨基糖和核苷酸糖代谢通路。

表4与7种显著改变的代谢物相关的通路

1).通路中代谢物的总数目；

2).上传的代谢物数据中与通路中代谢物匹配的个数；

3).在通路中富集的代谢物的显著性(Fisher精确检验)；

4).上传的代谢物在通路中的影响值。影响值是指代谢物在该代谢通路网络图中，所在位置重要性(根据网络图的节点的中介中心性衡量)。

2.5潜在代谢物生物标志物与临床生化指标的关联分析

为了评估13种生化指标在CHD和对照组之间的差别，发明人进行t检验，结果列于表1中。结果表明，相对于对照组，CHD患者组中LPA显著地增加，而 TRIG，LDLC，CHOL，HDL，APOB，ALB和TP显著减少。另一方面，AST， ALT和APOA的水平在CHD患者组和对照组之间没有差异。

为了评CHD患者的协变量(年龄，BMI指数等临床生化因素)对代谢谱的影响，发明人对7种潜在生物标志物和13种临床生化指标之间的关联性进行 PERMANOVA分析。最具潜力的生物标志物的强度与ALB，TP，HDLC，CHOL， LDLC，TRIG，LPA的水平具有强相关性，而与BMI，ALT，AGE，APOA，LDLC， AST无相关性。有趣的是，有3种代谢物(2，3-二甲基马来酸盐、甲基衣康酸盐和 N-乙酰基-D-葡糖胺-6-磷酸盐)在CHD患者中显著升高，但却与ALB和TP水平呈负相关，而与TRIG和LPA水平呈正相关。相反地，在CHD患者中下降的3种代谢物(1-萘酚、左旋肉碱和苯丙酮酸盐)，与ALB和TP水平呈正相关，而与TRIG， LPA的水平呈负相关。例如，N-乙酰基-D-葡糖胺-6-磷酸盐的水平在CHD患者中增加，它与TP和ALB呈显著负相关(TP：p＝5.62E-05，ρ＝-0.442；ALB：p＝ 6.15E-06，ρ＝-0.490)。再如，左旋肉碱的水平在CHD患者明显减少，它与TP 和ALB呈显著的正相关(TP：P＝0.014，ρ＝0.278；ALB：P＝0.005，ρ＝0.315)。 PERMANOVA分析结果表明，这些临床指标与CHD患者的血浆代谢谱相关。

另外，为了评价7种潜在生物标志物的相关性，发明人进行了Spearman相关分析，结果示于图9中，3种生物标记物(甲基衣康酸盐、N-乙酰基-D-葡糖胺-6-磷酸盐和2，3-二甲基马来酸盐)的水平在CHD患者中增加，它们彼此之间也呈显著正相关。另一方面，左旋肉碱和苯丙酮酸盐水平在CHD患者中降低也彼此呈正相关，但它们与其他5种生物标志物没有相关性。

2.6潜在生物标志物的接收者操作特征(ROC)分析

为了评估7种潜在生物标志物的诊断能力，发明人利用接收者操作特征(ROC)分析方法对另外102个血浆样品(验证集，59例CHD患者和43名健康对照) 进行分析。在验证集中，发明人构建了随机森林分类器，发现7种潜在生物标志物中的5种(甲基衣康酸盐、N-乙酰基-D-葡糖胺-6-磷酸盐、左旋肉碱、1-萘酚和2-萘酚)结合具有较好的辨别能力，其曲线下面积(AUC)达到89.95％，95％置信区间(CI)为：83.29％-96.61％(图10，表6)。表5示出了这5种代谢物在验证集的 CHD患者组和对照组中的丰度情况。对于训练集，这5种潜在生物标志物随机森林分类器的AUC为97.44，95％置信区间(CI)为94.69％-100％(图11，表8)。在训练集中，对这5种代谢物分别进行ROC分析，结果如图12所示，其AUC分别为90.99％(甲基衣康酸盐)，89.3％(N-乙酰基-D-葡糖胺-6-磷酸盐)，66.63％(左旋肉碱)，68.6％(1-萘酚)，65.17％(2-萘酚)。图13示出了这5种代谢物在训练集的 CHD患者组和对照组中的丰度情况(表7)。以上结果表明，5种代谢物结合作为分类器的辨别能力对于训练集也是非常好的。

此外，发明人发现N-乙酰基-D-葡糖胺-6-磷酸盐和1-萘酚两种代谢物作为 CHD诊断标志物具有更大的潜力。由此，发明人在验证集中对两种代谢物结合诊断CHD进行了ROC分析，结果显示(图14)，其AUC达到91.01％，95％置信区间(CI)为84.69％-97.33％，证实了N-乙酰基-D-葡糖胺-6-磷酸盐和1-萘酚结合具有较高的诊断CHD的能力。

表5 5种代谢物在验证集样品中的离子强度

表6 5种代谢物结合预测验证集的患病概率(患病概率≥0.5确认个体具有患CHD的风险或者患有CHD)

表7 5种代谢物在训练集样品中的离子强度

表8 5种代谢物结合预测训练集的患病概率(患病概率≥0.5确认个体具有患CHD的风险或者患有CHD)

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种试剂组合，其特征在于，所述试剂组合用于评估待测对象的CHD患病风险或待测对象CHD诊断，并且所述的试剂组合中包括用于检测一生物标志物集合中各个生物标志物的试剂；

其中，所述的集合包括多种选自下表的生物标志物：

2.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述的集合包括生物标志物bm、和一个或多个选自子集X的生物标志物，其中子集X由生物标志物b1～b(m-1)和生物标志物b(m+1)～b37构成，m为整数且1≤m≤37；

其中，b3、b13和b20生物标志物为以下生物标志物：

3.如权利要求2所述的试剂组合，其特征在于，1≤m≤7。

4.如权利要求2所述的试剂组合，其特征在于，1≤m≤5。

5.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述的集合包括选自下组的生物标志物：

生物标志物b1、生物标志物b2、生物标志物b4、生物标志物b5、生物标志物b6、生物标志物b7、或其组合。

6.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述的集合包括选自下组的生物标志物：

生物标志物b1、生物标志物b2、生物标志物b4、生物标志物b5、或其组合。

7.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，与一参考值进行比较，一个或多个选自子集H的生物标志物增加，表明待测对象具有CHD患病风险或患有CHD，

其中子集H包括生物标志物b2、b4、b5、b6、b8、b10、b15、b16、b17、b18、b21、b22、b23、b24、b26、b27、b31、b32、b33、b34、和b35。

8.如权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，与一参考值进行比较，一个或多个选自子集K的生物标志物减少，表明待测对象具有CHD患病风险或患有CHD，

其中子集K包括生物标志物b1、b7、b9、b11、b12、b14、b19、b25、b28、b29、b30、b36、和b37。

9.如权利要求1或2所述的试剂组合，其特征在于，所述的集合用于评估待测对象的CHD患病风险或待测对象CHD诊断。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1或2所述的试剂组合。

11.一种生物标志物集合在制备一试剂盒中的用途，其特征在于，所述的试剂盒用于评估待测对象的CHD患病风险或待测对象CHD诊断，所述试剂盒中包括用于检测所述生物标志物集合中各个生物标志物的试剂；

其中，所述的集合包括一种或多种选自下表的生物标志物：

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的集合包括生物标志物bm、和一个或多个选自子集X的生物标志物，其中子集X由生物标志物b1～b(m-1)和生物标志物b(m+1)～b37构成，m为整数且1≤m≤37；

其中，b3、b13和b20生物标志物为以下生物标志物：

13.如权利要求11或12所述的用途，其特征在于，所述的评估或诊断包括步骤：

(1)提供一来源于待测对象的样品，对样品中所述集合中各个生物标记物的水平进行检测；

(2)将步骤(1)测得的水平与一参考数据集或一参考值进行比较。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的参考数据集包括来源于CHD患者和健康对照者的所述集合中各个生物标记物的水平。

15.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的样品选自下组：血液、血浆、和血清。

16.一种筛选治疗CHD的候选化合物的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样品中权利要求11或12所述的用途中的所述集合中各个生物标记物的水平V1；在对照组中，向待测对象施用空白对照，检测对照组中来源于所述对象的样品中所述集合中各个生物标记物的水平V2；

(2)比较上一步骤检测得到的水平V1和水平V2，从而确定所述测试化合物是否是治疗CHD的候选化合物。

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