CN102533968A - 诊断高胆红素血症的SNP、生物标志物及单倍型区块tagSNPs集合 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物技术领域内的诊断高胆红素血症的SNP、生物标志物及单倍型区块tagSNPs集合；所述SNP位点为表中所示的15个SNP位点中的一种；所述生物标志物为1A4 intron SNP c.867+101G＞T；利用本发明提供的SNP、生物标志物及单倍型区块tagSNPs集合，可以检测出个体是否有患病的风险，并且可根据具体标志物SNP位点的不同，诊断出个体的患高胆红素血症的具体类型，达到早预测、早诊断、早干预、早治疗的目的；本发明提供生物标志物还能用于诊断试剂盒的开发，并可应用于临床研究、分析及诊断用途。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术领域内的SNP、生物标志物及单倍型区块tagSNPs集合，具体涉及一种诊断高胆红素血症的SNP、生物标志物及单倍型区块tagSNPs集合。
背景技术
高胆红素血症是指胆红素在生理代谢过程中出现的代谢速率缓慢或代谢障碍而导致在体内累积的疾病，在临床上主要表现为黄疸症状。高胆红素血症主要包括三种：Crigler-Najjar I(CN I)，Crigler-Najjar II(CN II)和Gilbert综合症(GS)。CN I和CNII，是发生于新生儿和婴幼儿的遗传性高胆红素血症，前者由于多伴有胆红素脑病，胆红素的神经毒性作用引起脑组织的病理性损害，如不及早防治可致后遗症或死亡，并且临床药物治疗无效，I型病人预后不良，大多数在出生后18个月内死于胆红素脑病或后遗症；II型患者病情较I型相对较轻，无神经系统症状，智力发育亦正常，黄疸程度稍低，药物苯巴比妥可辅助治疗，II型预后比I型好，轻型患者或可存活至成年。Gilbert综合症，病人主要为青少年，男性多见，临床表现特点为长期间歇性轻度黄疸，多无明显症状，发病率大约为5％左右。
传统的临床诊断方法是测定患者的总胆红素水平及间接胆红素水平，但由于受个体差异，民族、地区、性别、喂养方式等多种因素的影响，黄疸胆红素浓度诊断标准常常不适用，例如早产儿，低出生体重儿等，经常由于不能早发现早干预而导致新生儿致残与死亡。正是由于传统的高胆红素血症的诊断方法具有不稳定性及不确定性，因此，寻找并制定一个持之有效的新标准来实现胆红素代谢疾病的诊断与预测预防非常重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种诊断高胆红素血症的SNP、生物标志物及单倍型区块tagSNPs集合。本发明避开患者胆红素浓度生理指标的波动性和个体差异性，从遗传因素出发，基于疾病关联性分析以及胆红素代谢酶编码基因内单核苷酸多态性(SNP)的连锁分析，筛选出具有生物学意义的代表性生物标志物，这些生物标志物的存在状态决定了个体患病的风险。通过鉴定个体基因组内特定生物标志物的遗传状态，来评估患胆红素代谢疾病的风险性，从而达到早预测、早诊断、早干预、早治疗的目的。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种用于诊断高胆红素血症的SNP位点，所述SNP位点为表中所示的15种SNP位点中的一种：
。
优选地，所述高胆红素血症为三类先天性非溶血性黄疸，具体为CN I、CN II和Gilbert综合症。
第二方面，本发明还涉及一种用于诊断高胆红素血症的生物标志物，所述生物标志物为1A4 intron SNP c.867+101G＞T。
进一步地，本发明还提供了一种用于诊断高胆红素血症的单倍型区块tagSNPs集合，所述单倍型区块tagSNPs集合为：
Block 9单倍型tagSNP集c.-688A＞C，c.-118_-117insT；
Block 9/7/6单倍型tagSNP集c.855+152G＞A，c.855+399G＞A，c.855+485G＞A，c.855+642G＞A，p.K131Q，p.R208W，c.756G＞A，c.351A＞G，p.T181A；
Block 5单倍型tagSNP集p.L248I，c.792T＞C；
Block 4/3单倍型tagSNP集c.804G＞A，c.-66T＞C，p.R45W，p.V47A，c.477A＞G；
Block3’UTR单倍型tagSNP集c.1602+211T＞C，c.1602+339G＞C。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：本发明提供了能够诊断高胆红素血症的SNP、生物标志物及单倍型区块tagSNPs集合；通过对本发明提供的与致病SNP位点连锁的标志物SNP进行基因分型(genotyping)，即可从检测出个体是否有患病的风险，并且可根据具体标志物SNP位点的不同，诊断出个体的患高胆红素血症的具体类型，达到早预测、早诊断、早干预、早治疗的目的；同时，本发明提供生物标志物还可用于诊断试剂盒的开发，并能够应用于临床研究、分析及诊断等诸多用途。
附图说明
图1为UGT1基因簇结构图；
图2为中国人群UGT1基因簇SNP连锁图谱；
图3为UGT1基因簇内各单倍型区块内的单倍型类型及频率示意图；
图4为本发明检测方法示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
人类中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)是代谢内源性化合物胆红素的唯一葡萄糖醛酸化酶类，关联性分析研究表明，UGT1A1基因的SNP位点，包括UGT1A1启动子的c.-54_-53insTA，基因编码区的p.P34Q、p.H39D、p.W40R、p.G71R、p.F83L、p.C156R、p.P229Q等位点能够导致CN I，CN II和GS疾病的发生。
本实施例通过大片段(跨17.7kb)重测序的方法，在随机选择的273个中国人组成的大样本中，寻找并获得UGT1基因簇(UGT1基因簇结构图如图1所示；其中，每个外显子下方的灰色方块表示重测序区域，此图为按比例绘制，其中箭头左边的1指示UGT1基因簇内的重测序区域(总跨度约17.7kb))内的共101个SNP位点，其中包括15个未曾报道过的新位点(新发现的15个SNP位点及频率如表1所示，参考序列为GenBank序列AF297093.1。cDNA位置计算方法是以mRNA参考序列中翻译起始密码子ATG的A为+1。对于3’UTR区的SNP而言，外显子5a终止密码子后的第一个核苷酸记为+1)，计算其群体频率后进行SNP遗传连锁分析及单倍型分析，找出其中与这些致病SNP位点连锁的标志物SNP，这些标志物在统计学上及生物学意义上(R2≥0.8)能够完全代表致病SNPs，通过对这些标志物进行基因分型(genotyping)，即可从检测出个体是否有患病的风险，并且可根据具体标志物SNP位点及存在状态的不同，诊断出个体的患高胆红素血症的具体类型。
表1
。
前述15个SNP位点，其中有6个导致氨基酸改变(非同义)，4个无氨基酸改变，2个位于启动子区域，3个位于内含子区，并且一新SNP位点1A9 c.*-2188T＞C与UGT1内的1A9c.855+143C＞T和1A7 c.627G＞T位点出现强连锁，在统计学及生物学意义上(R2≥0.8)，c.*-2188T＞C能够完全代表c.855+143C＞T与c.627G＞T所含的全部生物信息。
在本实施例中，计算其群体频率后进行SNP遗传连锁分析及单倍型分析，找出其中与这些致病SNP位点连锁的标志物SNP具体为：通过对273例正常中国人群基因组中UGT1基因簇内12个DNA片段的进行重测序，获得了101个SNPs及其群体频率，通过计算两两SNP位点之间的连锁不平衡(LD)水平获得整个UGT1基因簇的连锁情况，并进一步通过单倍型分析获得各单倍型区块内的单倍型类型，这些单倍型类型会对应于不同的药物代谢速率，最后找出单倍型的生物标志物，即tagSNPs。
如图2所示，其中A为UGT1基因簇两两连锁不平衡(LD)分析及单倍型区块重构分析示意图，图中SNP排列顺序与人2号染色体上的实际顺序一致，每个小方块的黑色深浅代表了两两SNP位点间的连锁强弱，黑色粗线条表示重构的单倍型区块边界，黑色倒三角形表示每个单倍型区块的tagSNPs；TagSNPs由GEVALT 2.0软件包中的STAMPA程序筛选获得；B为UGT1基因簇内五个单倍型区块间的多位点连锁分析示意图，方块上的数字(％)是指任意两区块间的D’值，由软件Haploview 4.1生成，D’值越大连锁越紧密，每个小方块的黑色深浅代表了两两区块间的连锁强弱。
图2中，2为UGT1A9启动子区新SNP位点c.*-2188T＞C与已知SNP 1A9 c.855+143C＞T完全连锁(D’＝1，R2＝1)；3为UGT1A9启动子区新SNP位点c.*-2188T＞C与已知SNP 1A7c.627G＞T强连锁(D’＝1，R2＝0.921)；4为已知致病位点1A1 p.P229Q与1A3 intron SNPc.867+101G＞T完全连锁(D’＝1，R2＝1)；在统计学及生物学意义上(R2≥0.8)，c.*-2188T＞C能够完全代表c.855+143C＞T与c.627G＞T所含的全部生物信息；c.867+101G＞T能够完全代表p.P229Q所含的全部生物信息，可参见表2。
由图2可知：UGT1基因簇内的九个基因间有着不同程度地相互连锁，连锁紧密的基因SNP位点被划为一个Block(区块)，UGT1基因簇分为五个区块，分别为Block 9，Block9/7/6，Block 5，Block 4/3，Block 3’UTR，区块间亦有不同程度的连锁(如B所示)，可参见表2：
Block 9单倍型tagSNP集c.-688A＞C，c.-118_-117insT；
Block 9/7/6单倍型tagSNP集c.855+152G＞A，c.855+399G＞A，c.855+485G＞A，c.855+642G＞A，p.K131Q，p.R208W，c.756G＞A，c.351A＞G，p.T181A；
Block 5单倍型tagSNP集p.L248I，c.792T＞C；
Block 4/3单倍型tagSNP集c.804G＞A，c.-66T＞C，p.R45W，p.V47A，c.477A＞G；
Block3’UTR单倍型tagSNP集c.1602+211T＞C，c.1602+339G＞C。
通过对各单倍型区块的tagSNPs进行基因分型，即可知道每个中国个体对应的UGT1单倍型是否为患病或高风险单倍型，通过单倍型类型的判断可直接对该个体的患病风险、用药有效性以及药物毒性进行评估。
图3为UGT1基因簇内各单倍型区块内的单倍型类型及频率示意图。其中，每个单倍型中淡灰色方块表示与参考序列(AF297093.1)一致的核苷酸，深灰色方块表示与参考序列该位点不一致的核苷酸；两个区块单倍型之间的粗线条表示两者在同一条染色体上的概率大于10％的事件；仅群体频率大于或等于1％的单倍型被列出，所有单倍型是由Phase 2.1.1程序生成。
进一步，本实施例同时提供了一种生物标志物，即1A4 intron SNP c.867+101G＞T。此SNP能够完全代表患病SNP p.P229Q(D’＝1，R2＝1)的生物信息。通过基因分型技术检测1A4 c.867+101G＞T的存在状态(如图4所示)，当为GG时，表明个体正常；当为GT时，表明个体为致病SNP携带者，建议对其后代进行此分子检测；当为TT时，表明个体患有Gilbert综合症，建议对患者根据具体病情辅助以苯巴比妥等诱导性药物治疗，并建议对其后代进行此分子检测。
本实施例中，高胆红素血症特指的是三类先天性非溶血性黄疸：CN I，CN II和Gilbert综合症三种，此三类疾病是由UGT1A1基因缺陷导致的UGT1A1酶活性降低所致。
表2
综上所述，本发明在第一方面提供了15个SNP位点，其中有6个导致氨基酸改变(非同义)，4个无氨基酸改变，2个位于启动子区域，3个位于内含子区，并且一些新位点与UGT1内的其他基因SNP位点出现强连锁；第二方面，由于UGT1基因簇包括9个功能基因，编码的酶类负责35％的II相药物代谢反应，其中包括大多数药物(如依立替康，氟尿嘧啶，甲酰四氢叶酸)、致癌物、毒物等，最终达到代谢、解毒、排泄功能。因此，UGT1酶活性的强弱，在很大程度上决定着临床上多种药物治疗的有效性以及药物毒副作用大小。本发明呈现出了中国人整个UGT1基因簇连锁图谱，通过对各单倍型区块特定的tagSNPs进行基因分型，即可知道每个中国个体的UGT1单倍型，通过单倍型类型可进一步做出患者个体化用药研究、分析及诊断。第三方面，本发明提供了能代表致病性SNP位点p.P229Q的生物标志物，可用于高胆红素血症风险评估及诊断。
综上所述，本发明提供了能够诊断高胆红素血症的SNP、生物标志物及单倍型区块tagSNPs集合；通过对本发明提供的与致病SNP位点连锁的标志物SNP进行基因分型(genotyping)，即可从检测出个体是否有患病的风险，并且可根据具体标志物SNP位点的不同，诊断出个体的患高胆红素血症的具体类型，达到早预测、早诊断、早干预、早治疗的目的；同时，本发明提供生物标志物还可用于诊断试剂盒的开发，并能够应用于临床研究、分析及诊断等诸多用途。
Claims (4)
1.一种用于诊断高胆红素血症的SNP位点，其特征在于，所述SNP位点为表中所示的15种SNP位点中的一种：
。
2.如权利要求1所述的用于诊断高胆红素血症的SNP位点，其特征是，所述高胆红素血症为三类先天性非溶血性黄疸，具体为CN I、CN II和Gilbert综合症。
3.一种用于诊断高胆红素血症的生物标志物，其特征在于，所述生物标志物为1A4intron SNP c.867+101G＞T。
4.一种用于诊断高胆红素血症的单倍型区块tagSNPs集合，其特征在于，所述单倍型区块tagSNPs集合为：
Block 9单倍型tagSNP集c.-688A＞C，c.～18_-117insT；
Block 9/7/6单倍型tagSNP集c.855+152G＞A，c.855+399G＞A，c.855+485G＞A，c.855+642G＞A，p.K131Q，p.R208W，c.756G＞A，c.351A＞G，p.T181A；
Block 5单倍型tagSNP集p.L248I，c.792T＞C；
Block 4/3单倍型tagSNP集c.804G＞A，c.-66T＞C，p.R45W，p.V47A，c.477A＞G；
Block3’UTR单倍型tagSNP集c.1602+211T＞C，c.1602+339G＞C。
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