CN102458481A

CN102458481A - 用于诊断和预测疾病的含三甲胺的化合物

Info

Publication number: CN102458481A
Application number: CN201080034456XA
Authority: CN
Inventors: S·L·黑曾; 王则能; B·L·莱维森
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Current assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 2009-05-28
Filing date: 2010-05-28
Publication date: 2012-05-16
Also published as: CA2790371A1; WO2010138899A3; NZ597273A; EP2435097A2; CA2790371C; EP2435097B1; EP2435097A4; JP5746154B2; AU2010253965A1; WO2010138899A2; JP2012528340A; AU2010253965B2

Abstract

本发明提供了用于确定受试者(特别是人类受试者)患有疾病诸如心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD(非酒精性脂肪肝病)或NASH(非酒精性脂肪肝炎)或具有(在例如接下来的1年、2年和或/3年内)患上此类疾病风险的标记物及方法。本申请还涉及该标记物的用途，及用于监测上述疾病在受试者中的状态、或者治疗剂对患有这种疾病的受试者的效果的方法。

Description

用于诊断和预测疾病的含三甲胺的化合物

本申请要求2009年5月28日递交的序列号为61/181,858的美国临时申请的优先权，该申请通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及用于确定受试者(尤其是人类受试者)是否患有疾病或病症诸如心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH等或具有(在例如接下来的1年、2年和或/3年内)患上此类疾病或病症风险的标记物及方法。本申请还涉及该标记物的用途，及用于监测上述疾病和病症在受试者中的状态、或者治疗剂对患有这种疾病和病症的受试者的效果的方法。

背景

在美国，每两例死亡中就有一例是心血管病(CVD)；而且它是美国和大多数欧洲国家的头号致命疾病。因此，预防心血管病是公共健康中一个非常重要的领域。低脂饮食和运动被推荐用来预防CVD。此外，医务人员也会向那些已知具有患有CVD风险的个体开多种治疗剂的处方。对那些具有患有CVD高风险的个体可以采用更具冲击性的治疗，如施用复方药物(multiple medications)或进行手术干预(surgical intervention)。鉴于CVD疗法可能产生有害的副作用，期望能找到用于鉴定那些具有在短期内发生不良心血管事件的风险的个体(尤其是那些具有在短期内发生不良心血管事件的高风险的个体)的方法。

目前，医务人员使用多个风险因子来评估个体患上或患有CVD的风险，以及对高危个体进行鉴定。主要的心血管病风险因子包括年龄、高血压、早熟性心血管病家族史、吸烟、高总胆固醇、高LDL胆固醇、低HDL胆固醇、肥胖和糖尿病。CVD的主要风险因子是可叠加的，医师经常在风险预测算法中结合使用这些风险因子来寻找那些最可能从CVD治疗中获益的个体。在预测10年内发生CVD风险时，这些算法具有高灵敏性和特异性。但目前的算法预测患上CVD的更高概率的能力却是有限的。在不具有上述风险因子的外表健康的成年人中，10年患上CVD的风险仍然很大——根据年龄的不同约为2％甚至更高。此外，具有很低至中等风险特性(采用目前公知的风险因子测定)的个体会产生许多CVD并发症。因此，需要扩展目前的心血管风险算法，以对更广泛的具有患有CVD风险或已感染CVD的个体进行鉴定。

动脉粥样硬化是心血管病发展过程中的一个重要因素。但人们还没完全理解动脉粥样硬化的机制。在过去的十年中，有大量的临床学、病理学、生物化学和遗传学上的数据支持这样的观点：动脉粥样硬化是一种慢性的炎症性病症。急性期反应物(如：C-反应蛋白、补体蛋白)是具有灵敏性却无特异性的炎症标记物，它们在脂纹中和动脉粥样硬化病变后期发生富集。在近期的前瞻性临床试验中，C-反应蛋白的基线血浆水平能独立地预测外表健康的个体发生初次心肌梗死和中风的风险。美国专利NO.6,040,147记述的方法使用C-反应蛋白、细胞因子和细胞粘附分子来表征个体患上心血管病症的风险。虽然该方法有效，但在由于CVD之外引起炎症的个体的血液中也能发现这些标记物，故这些标记物可能不具有充分的特异性。此外，还未证实通过调节它们的水平能多次用于预测CVD发病率或死亡率的降低。因此，目前需要一种新的标记物来对受试者的CVD风险进行评估。

发明概要

本发明提供了用于确定受试者(特别是人类受试者)患有疾病或病症诸如心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD(非酒精性脂肪肝病)或NASH(非酒精性脂肪肝炎)或具有(在例如接下来的1年、2年和或/3年内)患上此类疾病或病症的风险的标记物及方法。本申请还涉及这种标记物的使用方法，及监测上述疾病在受试者中的状态、或者治疗剂或介入治疗对患有该疾病的受试者的效果的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了鉴定具有遭受动脉粥样硬化心血管病并发症的风险的受试者的方法，该方法包括：a)确定在来自受试者的生物学样品中的含三甲胺(TMA)化合物的水平(例如，使用分析设备)，其中，与胆碱有关的含TMA化合物选自胆碱、巴豆甜菜碱(包括顺式和反式异构体)、γ-丁基甜菜碱(gamma-butyrobetaine)、肉碱、4-三甲基铵丁醛(4-Trimethylammonium butyraldehyde)、脱氢肉碱(dehydrocamitine)、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基铵丙酮(trimethylammoniumacetone)、脱羧肉碱(decarboxycarnitine)、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱和磷脂酰胆碱；和b)将生物学样品中与胆碱有关的含TMA化合物的水平与对照值相比；其中，生物学样品中与胆碱有关的含TMA化合物的水平相比于对照值得以提高的受试者具有遭受动脉粥样硬化心血管病并发症的风险。

在某些实施方案中，该方法还包括当含TMA化合物的水平高于对照值时，将受试者遭受动脉粥样硬化心血管病并发症的风险表征为较高；当含TMA化合物的水平低于对照值时，将受试者遭受动脉粥样硬化心血管病并发症的风险表征为较低的步骤。在其它实施方案中，所述并发症为下列中的一种或多种：非致命性心肌梗死、中风、短暂性脑缺血发作、心绞痛、短暂性缺血发作、外周动脉疾病、充血性心力衰竭、心肌病(包括缺血性与非缺血性)、主动脉瘤、主动脉夹层、血管再生需要(冠状动脉旁路移植术、冠状动脉血管成形术、冠状动脉支架术)和死亡。在其它实施方案中，所述风险是经过长时间例如在接下来的3年或更长的时间点(如4年、5年、6年、7年或更长)后遭受动脉粥样硬化心血管病并发症的风险。

在一些实施方案中，本发明提供了表征受试者患有或患上心血管病风险的方法，该方法包括：a)用分析设备确定在来自受试者的生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺(TMA)化合物的水平，其中，所述与胆碱有关的含TMA的化合物选自胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱和磷脂酰胆碱；和b)将生物学样品中与胆碱有关的含TMA化合物的水平与对照值相比；其中，生物学样品中与胆碱有关的含TMA化合物的水平相比于对照值得以提高的受试者具有患有或患上心血管病的风险。

在某些实施方案中，这些方法还包括当含TMA化合物的水平高于对照值时，将受试者患有或患上心血管病的风险表征为较高；当含TMA化合物的水平低于对照值时，将受试者患有或患上心血管病的风险表征为较低的步骤。在其它实施方案中，所述风险是经过长时间例如在接下来的3年或更长的时间点(如4年、5年、6年、7年或更长)患有或患上心血管病的风险。

在另外的实施方案中，本发明提供了评估心血管病治疗剂或介入治疗(如使用装置、或者膳食处方，或锻炼计划)对患有心血管病的受试者的效力的方法，该方法包括：a)在施用治疗剂时或之后，用分析设备确定在来自受试者的生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺(TMA)化合物的水平，其中，所述与胆碱有关的含TMA的化合物选自胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱和磷脂酰胆碱中；和b)将生物学样品中与胆碱有关的含TMA化合物的水平与预定值相比；c)如果与胆碱有关的含TMA化合物的水平低于预定值，则确定该治疗剂或介入治疗是有效的。

在一些实施方案中，本发明提供了鉴定受试者是否患有糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH或具有患上糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH风险的方法，该方法包括：a)用分析设备确定在来自受试者的生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺(TMA)化合物的水平；和b)将生物学样品中与胆碱有关的含TMA化合物的水平与对照值相比；其中，生物学样品中与胆碱有关的含TMA化合物的水平相比于对照值得以提高的受试者具有患上糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH或具有患有糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险。

在另外的实施方案中，该方法还包括当含TMA化合物的水平高于对照值时，将受试者患有或患上糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险表征为较高；当含TMA化合物的水平低于对照值时，将受试者患有或患上糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险表征为较低的步骤。在其它实施方案中，所述与胆碱有关的含TMA的化合物选自：胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱和磷脂酰胆碱。在其它实施方案中，所述与胆碱有关的含TMA化合物选自由三甲胺-N-氧化物、胆碱或甜菜碱所组成的组。在其它实施方案中，所述风险是在接下来的3年内患上糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险。

在一些实施方案中，本发明提供了评估治疗剂或介入治疗对患有选自糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的疾病的受试者的效力的方法，该方法包括：a)在施用治疗剂时或之后，用分析设备确定在获自受试者的生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺(TMA)化合物的水平；b)将生物学样品中与胆碱有关的含TMA化合物的水平与预定值相比；和c)如果与胆碱有关的含TMA化合物的水平低于预定值，则确定该治疗剂在治疗糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH方面是有效的。

在某些实施方案中，本发明提供了治疗病况、或预防患上病况的方法，该方法包括：向受试者施用益生菌(probiotics)、益生元(prebiotics)和抗生素以使肉碱在受试者中形成的三甲胺、TMANO、巴豆甜菜碱和/或γ-丁基甜菜碱(gamma-butyrotetaine)减少，从而至少能部分地治疗选自由心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH所组成的组中的病况或预防患上此类病况。在具体的实施方案中，短疗程内向受试者施用所述抗生素：例如7天或更少(如7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天)。在某些实施方案中，所述抗生素为选自由灭滴灵(metronidazole)、环丙沙星、新霉素、阿莫西林、阿莫西林(amoxicilling)/克拉维酸(clavulinic acid)、氯霉素、或者头孢菌素类抗生素、大环内酯类抗生素、β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环类抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素或砜类抗生素所组成的组中的一种抗生素或抗生素的组合。

在具体的实施方案中，本发明提供了治疗病况、或预防患上病况的方法，该方法包括：向受试者施用抗生素以使肉碱在受试者中形成的三甲胺、TMANO、巴豆甜菜碱和/或γ-丁基甜菜碱(或其它与胆碱有关的含TMA化合物)减少，从而至少能部分地治疗选自由心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH所组成的组中的病况或预防患上此类病况。

在一些实施方案中，本发明提供了筛选候选抑制剂的方法，该方法包括：a)将i)与胆碱有关的含三甲胺(TMA)化合物，ii)能够使裂解与胆碱有关的含TMA化合物从而形成三甲胺的肠内菌群，和iii)候选抑制剂进行组合；和b)通过检测形成的三甲胺、或形成的下游代谢产物三甲胺氧化物、形成的巴豆甜菜碱、或形成的γ-丁基甜菜碱的水平来确定所述候选抑制剂在抑制三甲胺形成方面的能力。

在一些实施方案中，所述与胆碱有关的含TMA化合物选自由胆碱、肉碱、甜菜碱、磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、甘油磷酸胆碱、巴豆甜菜碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和γ-丁基甜菜碱所组成的组。在其它实施方案中，从肠道灌洗材料、特定的肠道切片、盲肠匀浆(cecumhomogenate)、盲肠洗涤废水或粪便中获得所述肠内菌群。在其它实施方案中，通过质谱或HPLC(高效液相色谱)来测定形成的三甲胺的水平。在另外的实施方案中，以可被检测到的方式对与胆碱有关的含TMA化合物进行标记(例如，用生色团或荧光部分)。在一些实施方案中，候选抑制剂包括抗生素。

在一些实施方案中，本发明提供了治疗病况、或预防患上病况的方法，该方法包括：向受试者施用抑制剂以使肉碱在受试者中形成的三甲胺、TMANO、巴豆甜菜碱和/或γ-丁基甜菜碱减少，从而至少能部分地治疗选自由心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH所组成的组中的病况或预防患上此类病况。在一些实施方案中，TMA形成抑制剂选自由新霉素、阿莫西林、灭滴灵、活性炭、或叶绿酸铜、阿莫西林/克拉维酸、氯霉素、或者头孢菌素类抗生素、大环内酯类抗生素、β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环类抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素或砜类抗生素所组成的组。

在一些实施方案中，本文描述的是用于鉴定受试者患有或可能患上心力衰竭、心肌病(缺血性或非缺血性)、心室收缩功能不全、舒张功能不全、主动脉夹层或主动脉瘤的方法。该方法涉及对来自受试者的测试样品中的与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平进行测量。

本发明的一个方面提供了鉴定受试者具有在接下来的3年内遭受心力衰竭、心肌病(缺血性或非缺血性)、心室收缩功能不全、舒张功能不全、主动脉夹层或主动脉瘤的风险的方法，该方法包括用分析设备确定在获自受试者的生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平；将生物学样品中与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平与对照值相比；和当与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平高于对照值时，将受试者在接下来的3年中遭受心力衰竭、主动脉夹层或主动脉瘤的风险表征为较高；当与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平低于对照值时，将受试者在接下来的3年中遭受心力衰竭、主动脉夹层或主动脉瘤的风险表征为较低。

本发明的另一方面提供了对患有心力衰竭、心肌病(缺血性或非缺血性)、心室收缩功能不全、舒张功能不全的受试者进行诊断的方法，该方法包括用分析设备确定在来自受试者的生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平；将生物学样品中与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平与对照值相比；和当与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平高于对照值时，将受试者诊断为很有可能患有心力衰竭。

本发明的另一方面提供了对患有主动脉病症的患者进行诊断的方法，该方法包括用分析设备确定在来自受试者的生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平；将生物学样品中与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平与对照值相比；和当与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平高于对照值时，将受试者诊断为有可能患有主动脉病症。在一些本发明的实施方案中，所述主动脉病症为主动脉夹层，而在其它实施方案中，所述主动脉病症指的是主动脉瘤。

在一些本发明的实施方案中，所述与胆碱有关的含三甲胺化合物为三甲胺N-氧化物、胆碱、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱或肉碱。在一个实施方案中，所述与胆碱有关的含三甲胺化合物为三甲胺N-氧化物。在另一个实施方案中，所述与胆碱有关的含三甲胺化合物为胆碱或甜菜碱。在本发明方法的另外的实施方案中，对生物学样品中的多个与胆碱有关的含三甲胺化合物进行测定。

在本发明的其它实施方案中，所述生物学样品为全血、血清、血浆、尿液、脑脊液(cerebrospinal fluid)或支气管肺泡灌洗液，而在另外的实施方案中，所述生物学样品为血液、血清或血浆。在另外的实施方案中，所述分析设备为质谱仪。在本发明方法的一些实施方案中，所述受试者不具有心血管病的任何迹象或症状。

附图简述

图1(a-c)为反映了质荷比(m/z)为50-100的正离子MS1模式下提取离子色谱的峰面积的图。用与质谱仪相连的反相高效液相色谱(HPLC)碱鉴定m/z＝76时的组分为TMANO(三甲胺N-氧化物)。

图2(a-c)为反映了m/z＝76时的正离子MS1模式下提取离子色谱的结果的图。用与质谱仪相连的反相HPLC对m/z＝76时的组分进行鉴定。

图3(图a)反映了对应于正态MS1模式下的提取离子色谱中m/z＝76时的峰的碰撞(能量为21eV)诱导的解离(CID)质谱。图(b)反映了从76→58发生母-子离子跃迁(parent-to-daughter transition)时，正离子多反应监测(MRM)模式下的提取离子色谱。图c反映了从76→58发生母-子离子跃迁(不包括甘氨酸从76→59)时，正态MRM模式下的提取离子色谱。

图4的图a-c反映了探讨TMANO的血浆浓度与动脉粥样硬化CVD流行程度之间关系的案例/对照研究的结果。依次从接受诊断性心导管检查术的患有CVD的受试者(n＝632)和对照受试者(n＝361)体内分离出血浆。图(a)显示了患有(n＝632)和未患有(n＝361)动脉粥样硬化CVD的受试者中的血浆TMANO。图(b)显示了按TMANO四分位数表示的动脉粥样硬化CVD、冠心病(CAD)和外周动脉疾病(PAD)的发生率。P值表示在四分位数上的趋势。图(c)反映了按照多因素回归，TMANO水平作为CVD、CAD、PAD和CAD+PAD风险的预测因子的奇数比和95％置信区间。该模型包括弗莱明罕姆风险评分(Framingham risk score)、通过MDRD公式测定的估算肾小球滤过率、C-反应蛋白(CRP)和TMANO水平。

图5(a-c)反映了探讨TMANO血浆丰度与主要不良心脏事件(major adverse cardiac event，MACE；包括以下病况中的一种或多种：非致命性MI、中风、血管再生需要(血管再生)或死亡)预期风险之间的关系的案例/对照研究的结果。图(a)表示经历了(n＝374)和未经历(n＝619)随后的临床事件的受试者的TMANO。图(b)为根据TMANO丰度四分位数表示的临床事件(血管再生、MI或中风、死亡和它们的组合、MACE)的发生率。P值表示在四分位数上的趋势。图(c)显示了按照多因素回归，表示临床事件(血管再生需要、非致命性MI或中风、死亡或它们的组合、MACE)事故风险的奇数比和95％置信区间对TMANO四分位数的图。该模型包括弗莱明罕姆风险评分(Framingham risk score)、通过MDRD公式测定的估算肾小球滤过率、C-反应蛋白(CRP)和TMANO。

图6显示了对实施例7所描述的队列进行心力衰竭预测时，血浆中TMANO的预后值。

图7显示了实施例8中描述的巴豆甜菜碱(7a)、γ-丁基甜菜碱(7B)和肉碱(7C)三分位数的卡普兰·梅尔(Kaplan Meier)绘图。

图8显示了D3-肉碱(图8A所示)经依赖肠内菌群的途径进行新陈代谢后成为促致动脉粥样化的三甲胺(TMA)(图8B所示)和三甲胺N-氧化物(TMANO)(图8C所示)。

图9显示了肉碱通过依赖肠内菌群的途径进行新陈代谢后成为巴豆甜菜碱(图9A所示)和γ-丁基甜菜碱(图9B所示)。

图10显示了在能用于本发明的与某些胆碱有关的含三甲胺化合物的化学式。

发明详述

本发明提供了用于确定受试者(特别是人类受试者)是否患有疾病诸如心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD(非酒精性脂肪肝病)或NASH(非酒精性脂肪肝炎)等或具有(在例如接下来的1年、2年和或/3年，或更长的时间内)患上此类疾病风险的标记物及方法。本申请还涉及该标记物的用途，及用于监测上述疾病或病症在受试者中的状态、或者治疗剂或介入治疗对患有这种疾病的受试者的效果。

在一个实施方案中，本发明提供了用于表征受试者(特别是人类受试者)患有心血管病(尤其是动脉粥样硬化心血管病)的风险的方法和标记物。所述心血管病的实例包括心力衰竭、主动脉夹层和主动脉瘤。在另一个实施方案中，本发明提供了用于表征受试者患上心血管病风险的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了用于表征受试者在接下来的1年、2年或3年内遭受心血管(CVD)事件风险的方法。本发明的方法能有效地对那些需要进行高度冲击CVD疗法或介入治疗的受试者和不需要进行以抑制或防止CVD或CVD并发症为目的的治疗或介入治疗的受试者进行鉴定。

本文使用的术语“心血管病”(CVD)或“心血管病症”是用于划分侵袭心脏、心脏瓣膜和体内血管(如静脉和动脉)，包括但不限于以下疾病和病况：动脉硬化、动脉粥样硬化、心肌梗死、急性冠状动脉综合症(acute coronary syndrome)、心绞痛、充血性心力衰竭、主动脉瘤、主动脉夹层、髂动脉瘤或股动脉瘤、肺栓塞、原发性高血压、心房颤动、中风、短暂性脑缺血发作、收缩功能不全、舒张功能不全、心肌炎、房性心动过速、心室颤动、心内膜炎、动脉病、血管炎、动脉粥样硬化斑块、易损斑块、急性冠状动脉综合症、急性脑缺血发作、心脏性猝死、外周血管疾病、冠心病(CAD)、外周动脉疾病(PAD)和脑血管疾病。

本文使用的术语“动脉粥样硬化心血管病”或“病症”指的是这样一类心血管病子集：它们以动脉粥样硬化作为特定类型心血管病的组成或前体，并且包括且不限于CAD、PAD、脑血管疾病。动脉粥样硬化是一种在动脉血管壁处发生的慢性的炎症性应答。它包括粥样斑块的形成，这会导致动脉变窄(“狭窄症”)并最终引起动脉开口的局部或完全闭合和/或斑块破裂。因此，动脉粥样硬化疾病或病症包括粥样斑块形成和破裂的结果，该结果包括但不限于动脉狭窄症或变窄、心力衰竭、包括主动脉瘤的动脉瘤形成、主动脉夹层和缺血性事件例如心肌梗死和中风。

本文使用的心血管事件指的是心血管病给受试者造成不良病况的表现形式，例如心脏性猝死或急性冠状动脉综合症，包括但不限于心肌梗死、稳定心绞痛、动脉瘤或中风。本文中的术语“心血管事件”可以与术语心血管并发症互换使用。而心血管事件可以是急性病况，还可以表示先前检测的病况恶化至呈现出严重威胁受试者健康的点，例如早前发现的动脉瘤扩大或高血压升高至威胁生命的水平。

本文使用的术语“诊断”可以包括确定疾病在受试者中的类型，以及确定对疾病的严重性和可能结果，或者确定疾病的发作和/或恢复前景(预后)。“诊断”还能包括在合理疗法背景下的诊断，其中，所述诊断能指导治疗(包括治疗的起始选择、治疗的更改(如剂量和/或施用方案或生活方式改正建议方面的调整))等的进行。

术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文能互换使用，它们通常指代哺乳动物，包括但不限于灵长类(包括猿猴和人类)、马科动物(包括马)、犬科动物(如狗)、猫科动物、家养牲畜(如有蹄动物，像猪类(swine)、小猪(pig)、山羊、绵羊等)，以及家养宠物和动物园饲养的动物。在一些实施方案中，该受试者特别指人类受试者。

在进一步描述本发明前，应该理解本发明不限于所描述的具体实施方案，而应当可以有所不同。还应该理解的是，本文使用术语的目的仅为对具体实施方案进行描述，而不是进行限制，因此本发明的范围仅由随附权利要求书确定。

当列举出数值范围时，应该理解在该范围上限和下限之间的每个中间数值(除非上下文另外明确说明，精确到下限单位的十分之一)和在该所述范围内的任何其它所述数值或中间数值都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在所述较小范围内，并且也包含在本发明内，这取决于所述范围内被明确排除的限制。当所述范围包括一个或两个限值时，排除了那些所包括的限值中的一个或两个之外的范围也包含在本发明中。

除非另有定义，否则本文使用的所有技术性和科学性术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的意义。虽然所有与本文所描述相似或相等的方法和材料都可以用于实践或测试本发明，但现在仅对优选的方法和材料进行描述。通过引用将本文提到的所有出版物并入本文，从而对与所引用出版物中有关的方法和/或材料进行披露和描述。

必须指出的是，除非上下文明确另有说明，否则本文和随附权利要求书中使用的单数形式的“一个(a)”、“和”、以及“该(the)”包括复数形式的指代物。故举例来说，提到“一个样品”时包括多个这种样品，但提到特定酶(如精氨酸酶)时包括提到一种或多种精氨酸酶多肽及本领域技术人员已知的等价物，等等。

除非另有说明，否则应当将在说明书和权利要求书中使用的表示成分数量、特性(如分子量)、反应条件等的所有数字被理解成在所有情况下都由术语“约”修饰。因此，除非另有说明，否则在下文说明书和权利要求书中提到的数字特征是约数，并且随着本发明实施方案中寻求的期望特性而有不同。尽管限定了本发明较宽范围的数值范围和参数是约数，但对具体实施例中列举的数值则报道得尽可能的精确。但是，任何数值不可避免地因其各自度量存在中的误差而具有一定误差。

在一个实施方案中，本发明的方法包括确定生物学样品(例如，来自受试者的体液)中的与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平。与胆碱有关的含三甲胺化合物包括甜菜碱、三甲胺N-氧化物(TMANO)、胆碱、乙酰胆碱、卡巴胆碱乙酰肉碱(carbachol acetylcarnitine)、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱和磷脂酰胆碱。在另外的实施方案中，本发明的方法包括确定TMANO、胆碱和甜菜碱这三种化合物中的一种或多种的水平。在另外的实施方案中，本发明的方法包括确定生物学样品中的TMANO水平。在另外的实施方案中，本发明的方法包括确定来自受试者的生物学样品中的胆碱、甜菜碱或上述二者的水平。

在一些实施方案中，将来自受试者的生物学样品中的三甲胺N-氧化物(TMANO)、胆碱、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱或它们的任意组合的水平与相应的对照值相比，或者将其与对获自参考队列的可比生物学样品中的TMANO、胆碱、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱或它们的任意组合进行测量而得到的数值相比。本文使用的相应数值指的是使用给定化合物的适当对照，例如确定TMANO的参考人群水平用作对照值来比较从受试者中测得的TMANO水平。可选择地，可以将从来自受试者的生物学样品中获得的TMANO、胆碱、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱(也被称为卵磷脂)或它们的任意组合的水平与来自受试者生物学样品的内标水平相比。如本领域技术人员公知的是，内标可以是与目标分析物相似的多种化合物，例如由重同位素标记的标准。内标是这样的化合物：能将已知量的内标加入样品中，进而协助确定分析物在样品中的量。例如，能用于确定胆碱的量的内标包括重同位素标记的胆碱，或结构上相关的化合物，例如乙酰基-β-甲基胆碱和丁酰胆碱。在一些实施方案中，所述生物学样品为尿液或血液，或源自血液的液体，例如血清或血浆。

在一个实施方案中，通过利用诊断CVD的标准方案进行测定的比较结果表征了受试者患有CVD的风险。实施了进一步的实施方案来表征目前患有动脉粥样硬化CVD的风险。此外，受试者的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱(顺式和反式)、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平与对照值之间的差别程度也能有效地对风险程度进行表征，从而确定哪些受试者能从特定的治疗或介入治疗中最大地获益。更具体来说，在差别和风险程度之间存在有正相关由此较大的水平差对应着较大的风险。

在另一个实施方案中，比较结果表征受试者将来患上CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险。如本文实施例2中阐述的，与胆碱有关的含三甲胺化合物具有鉴定受试者将患上CVD可能性的预后作用。不受理论限制的情况下，在胆碱新陈代谢、参与胆碱新陈代谢的肠内菌群和患上CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH、和/或遭受重大心血管事件、和/或遭受心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的重大并发症之间存在联系。糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症的重大并发症包括动脉粥样硬化性心脏病、微血管病变、视网膜病、肾病、神经病变和血脂异常。NAFLD和/或NASH的重大并发症包括肝癌、肝硬化、肝功能衰竭、肝性脑病。

举例来说，受试者内的与胆碱有关的含三甲胺化合物的量与对照值的比较结果可以用于表征受试者在接下来的3年内遭受心血管事件的风险，或者在一些实施方案中为2年，或在一些实施方案中为1年(或者它们的任意期间内)。还可以用本发明的方法来确定出现胸痛症状的受试者是否在近期内有遭受心血管事件(如心肌梗死、再梗死、血管再生需要和/或死亡)的风险。本文中的术语“近期”表示的是当受试者出现胸痛症状之后的1天、三个月、6个月或1年的时间内。

本文还提供了对受试者中的CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH随时间的状态进行监测的方法。实施了进一步的实施方案来对动脉粥样硬化CVD随时间的状态进行检测。在一个实施方案中，该方法包括确定在起始时间得自受试者的生物学样品和随后时间内获自受试者的相应的生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的水平。与起始时间的相比，在随后时间内获得的生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平升高就意味着受试者患有CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险增加。受试者中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的水平降低就意味着受试者患有CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险减小。对于那些已经遭受过心血管事件(如心肌梗死或缺血性中风)的受试者，该方法有效地评估该受试者遭受随后的心血管事件的风险。这些受试者中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、和/或甜菜碱水平的升高意味着该受试者遭受随后不良心血管事件的风险增加。受试者中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的水平降低就表示该受试者遭受随后不良心血管事件的风险减小。

本发明的方法还可涉及对受试者有关心血管病或心血管事件方面进行检查、监测或诊断。例如，本发明的方法可涉及鉴定具有患上心力衰竭或主动脉病症(如主动脉瘤或主动脉夹层)风险的患者。

心力衰竭是心血管病的一种类型，它是这样的一种病况：其中由于心脏结构或功能上存在问题而损害了心脏供应足够血流以满足身体需要的能力，以受损的心室收缩或舒张功能或二者兼有为特征。心力衰竭表现的症状可能仅为单独较差的组织灌流(如疲劳、运动耐量差和/或混乱)，或者同时表现出较差的组织灌流和血管床阻断(如呼吸困难、肾功能下降、心肾综合症、胸腔积液、肺水肿、颈静脉扩张、肝脏充血和/或外周性水肿)的症状。充血性心力衰竭代表了心力衰竭的一种类型，与高输出心力衰竭相比，其心输出量较低，身体对氧气和营养物的需求增加，且这一需求超出了心脏供给能力。

心力衰竭可能是一种或多种诱因造成的。主要诱因为动脉粥样硬化继发病，其中一种或多种缺血性事件(如心脏病发作)导致心脏发生缺血性损伤和功能降低。由于造成心功能不全的原因继发于缺血性损伤，因此这一类型的心力衰竭指的是缺血性心力衰竭。缺血性心力衰竭(有时被称为缺血性心脏病)也能因会造成缺血性损伤的其它心血管病况(例如限制了血流的动脉粥样硬化)引起。

心力衰竭还可以由缺血之外的诱因引发，故将这种类型的心力衰竭称为非缺血性心力衰竭。非缺血性心力衰竭的实例包括因病毒感染引起的心肌炎、心肌组织淀粉样变、心律不齐、遗传缺陷外显、因酗酒、滥用药物或酗烟造成的损伤、其它对心肌组织造成损伤的原因，如细菌或寄生虫感染或缺乏维生素。

主动脉夹层是在主动脉壁上发生的撕裂，它使得血液在主动脉壁层之间流动并迫使层发生分离。在主动脉夹层中，血液穿透内膜(主动脉血管最里面的层)进入了中膜。高压力将血管中层组织从层平面上剥离出来，并造成血管中层内部的2/3和外部1/3发生分离。该现象能在主动脉长度方向上前后延伸较长距离。将延伸朝髂分支(顺着血流)发生的夹层称为顺行性夹层(anterograde dissection)，并将那些延伸朝主动脉根部(逆着血流)发生的夹层称为逆行性夹层(retrogradedissection)。通常在主动脉瓣上发生100mm内的起始撕裂，故逆行性夹层能轻易地对心包膜造成损害，从而导致半心畸形(hemocardium)。主动脉夹层是即使在采用最佳治疗方案后依然可以快速导致死亡的医疗紧急事故。

主动脉夹层的症状是本领域技术人员公知的，包括突然发作的重度疼痛，感觉像从内部发生撕裂，或具有如刀割般或尖锐刺痛感觉。某些个体描述疼痛随着该夹层沿主动脉向下延伸而迁移。虽然这种疼痛可能与心肌梗死的疼痛发生混淆，但主动脉夹层通常不会伴随有其它心肌梗死的症状，包括心力衰竭、和ECG(脑皮层电图)改变。遭受主动脉夹层的个体通常不会出现发汗症状(大汗)。患有慢性夹层的个体可能不会出现疼痛症状。通常会发现主动脉瓣关闭不全的现象。能主动脉夹层中观察到的其它不太常见的症状包括充血性心力衰竭(7％)、昏厥(9％)、脑血管意外(3-6％)、缺血性外周神经病变、截瘫、心脏停搏和猝死。优选地，在诊断显像测试中对内膜瓣进行可视化诊断，例如用碘造影物质对胸腔进行的CT扫描和经食管超声心动图。

另一方面，主动脉瘤是一种以主动脉发生肿胀为特征的心血管病症，它通常因局部主动脉壁内潜藏的薄弱问题而导致。通过主动脉瘤在主动脉上发生的位置对其进行分类。腹部主动脉瘤(下文称为AAA)是最常见的主动脉瘤类型，一般在发生破裂前无临床症状。虽然其它因素也影响了AAA的形成，但它主要是由于动脉粥样硬化引起的。AAA可以无限期地保持无临床症状。因此，尽管一些AAA在破裂前的直径可以肿胀到15cm以上，但当尺寸达到5cm时就有非常大的发生破裂的风险。因为术前术后死亡率较高，仅有10-25％的患者在破裂后存活。

主动脉瘤的症状可以包括：焦虑或压力感、恶心和呕吐、皮肤湿冷；快速心室率。但完整的主动脉瘤却不会产生症状。随着肿瘤的长大，可能产生例如腹痛和背痛的症状。对神经根部的压缩可能导致腿部的疼痛或麻木。未经治疗的动脉瘤会变得越来越大，而对特定个体的扩张率是不可预测的。在一些情况下，排列在大部分主动脉瘤上的血块可能破裂并导致栓塞。优选使用医学成像法来确诊主动脉瘤。

本发明还提供了表征受试者对旨在稳定或削弱CVD(如动脉粥样硬化CVD)、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的治疗进行应答的方法。该方法包括确定在治疗前得自受试者的生物学样品中与胆碱有关的含三甲胺化合物(如TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱)的水平，和确定在治疗时或治疗后得自受试者的对应的生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的水平。在治疗时或治疗后从样品中获得的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平比在治疗前从样品中获得的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平低时，指示对接受治疗的受试者进行的针对心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的治疗具有积极效果。

在另一个实施方案中，本发明涉及含有用于对获自测试受试者的生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、和/或甜菜碱的水平进行评估的试剂的试剂盒。在某些实施方案，所述试剂盒还包括印刷好的材料，例如操作本发明方法的说明，或能有效地用于评估测试受试者的CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH风险的信息。上述信息的实例包括但不限于临界值、在具体临界值下的灵敏性，以及其它关于在分析结果基础上对风险进行表征的印刷好的材料。在一些实施方案中，所述试剂盒可以包括对照剂，例如已知量的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱。

在一些实施方案中，将测试受试者的生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺的化合物(如TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、和/或甜菜碱)的水平与对照值相比，所述对照值来源于对照受试者的可比生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、和/或甜菜碱水平。在替代实施方案中，然后可以将测试受试者的生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、和/或甜菜碱的水平与基于该受试者的生物学样品中的其它生物分子水平的内标相比。TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、和/或甜菜碱水平高于对照值或在对照值的较高范围内的测试受试者比那些TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、和/或甜菜碱水平处于对照值内或低于对照值或者在对照值较低范围内的测试受试者具有更高的风险患有或患上心血管病(如充血性心力衰竭、主动脉瘤等)、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH。此外，受试者的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、和/或甜菜碱水平与对照值之间的差别程度也能有效地表征风险程度，从而确定哪些受试者能从特定的治疗中最大地获益。

在某些实施方案中，通过结合第一风险值与一个或多个附加风险值(additional risk value)得到最终风险值而测定出受试者的CVD、糖尿病、糖尿病前期、糖耐量降低、空腹糖调解受损、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH风险特征，所述第一风险值是通过比较受试者生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺化合物(如TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、和/或甜菜碱)水平与对照人群的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平而得到的。得到附加风险值的步骤包括但不限于：确定受试者的血压、评估受试者对压力测试的应答、确定受试者个体样品中的髓过氧化物酶、高瓜氨酸、硝基酪氨酸、C-反应蛋白、纤维蛋白原和PAI-1、高半胱氨酸、非对称性二甲基精氨酸、脑钠肽、低密度脂蛋白或胆固醇水平，或者对受试者的动脉粥样硬化斑块负荷进行评估。

在一个实施方案中，使用本发明的方法来评估受试者患有心血管病，特别是动脉粥样硬化心血管病的风险。冠心病是心血管病的一种类型。确定人类受试者是否患有冠心病或具有遭受冠心病并发症的医疗过程包括但不限于：冠状动脉血管造影术、冠状血管内超声(IVUS)、压力测试(成像或不成像)、颈动脉内膜中层增厚的评估、进行或不进行虚拟组织学技术的颈动脉超声研究、冠状动脉电子束计算机断层扫描(EBTC)、心脏计算机断层扫描(CT)、CT血管造影法、心脏核磁共振成像(MRI)和磁共振血流成像(MRA)。因为心血管病通常不局限在受试者脉管系统的一个区域内，所以被诊断成患有冠心病或具有患上冠心病风险的受试者还被认为具有患上或患有其它类型的CVD，例如脑血管疾病、主动脉-髂动脉疾病和外周动脉疾病。具有患心血管病风险的受试者可能会发生异常压力测试或异常心导管检查术的风险。具有患CVD风险的受试者还具有展现出增加的颈动脉内膜中层厚度增加以及冠状动脉钙化的风险，可以通过非侵入式成像技术对这些特征进行评估。具有患CVD风险的受试者可能发生动脉粥样硬化(atheroscleorotic)斑块负荷升高，可以通过血管内超声检查到该特征。

在另一个实施方案中，本发明的方法用于评估受试者将来患上心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险。在一个实施方案中，受试者为外表健康的个体。在另一个实施方案中，受试者患有心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险在增加。

还可以将本发明方法的实施方案用于评估测试受试者在接下来的3年、2年或1年内遭受心血管事件的风险。在另一个实施方案中，用本发明的方法来确定出现胸痛症状的受试者是否具有遭受心脏病发作或其它心血管事件(如近期内的心肌梗死、再梗死、血管再生需要或死亡)的风险。上文中使用的术语“近期”指的是1年之内。因此，具有近期风险的受试者可能具有在出现胸痛症状后的接下来的1天、3个月或6年内遭受心血管事件的风险。

本发明还提供了用于监测已被诊断为患有CVD的受试者中CVD随时间的状态的方法。在上下文中，该方法还能有效地监测动脉粥样硬化在患CVD受试者中的进化或退化风险。在一个实施方案中，该方法包括确定在起始时间得自受试者的生物学样品和在随后时间得自受试者的相应的生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平。与起始时间的相比，在随后时间获得的生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺的化合物(如TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱)水平升高就意味着受试者的CVD已进化或者退化。TMANO、胆碱.巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、和/或甜菜碱水平下降则说明CVD得到了改善或发生了退化。对那些已经遭受心血管事件(如心肌梗死或缺血性中风)的受试者来说，该方法还能用于评估受试者发生随后的心血管事件的风险。受试者中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平随着时间发生增加就说明该受试者遭受随后的不良心血管事件的风险升高。受试者内的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱发生降低就说明该受试者遭受随后的不良心血管事件的风险减小。

在另一个实施方案中，本发明提供了在对疑似患有或被诊断出患有心血管病的受试者中评价治疗的方法。该方法包括：确定在治疗前来自受试者的生物样品中一种或多种与胆碱有关的含三甲胺化合物(如TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、和/或甜菜碱)的水平，和确定在治疗中或治疗后来自受试者的对应的生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的水平。在治疗时或治疗后获得样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平比治疗前获得的样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平低时，指示对接受治疗的受试者进行的针对心血管病的治疗具有积极效果。

生物学样品

生物学样品包括但不必须限于诸如与血液有关的样品的体液(如全血、血清、血浆和其它血源性样品)、尿液、脑脊髓液(cerebral spinalfluid)、支气管肺泡灌洗液等。其它生物学样品的实例为组织样品。可以对TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平进行定量或定性评估，通常进行定量评估。可以在活体内或者在活体外对与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平进行测定。

生物学样品可以是新鲜的或储存的(如，储存在血库中的血液或血液级分)。生物学样品可以是为了进行本发明的分析而特意收集的体液，或者是因其它目的而获取的体液，它可以作为本发明分析的子样品。

在一个实施方案中，生物学样品为全血。可以采用标准临床操作从受试者中获得全血。在另一个实施方案中，生物学样品为血浆。可以通过对抗凝血进行离心分离来从全血样品中获得血浆。该操作能产生由白细胞组分组成的血沉棕黄层和血浆上清液。在另一个实施方案中，生物学样品为血清。可以通过对不含有抗凝血剂的收集在试管中的全血样品进行离心分离来获得血清。允许在进行离心分离前使血液结块。离心分离后得到的黄红色流体就是血清。在另一个实施方案中，样品为尿液。

必要时，可以对所述样品进行预处理：通过在合适的缓冲溶液中进行稀释、肝素化、浓缩(如有必要)或以多种方法进行分级，包括但不限于超速离心、用快速液相色谱(FPLC)进行分级、或用含蛋白的载脂蛋白B与硫酸葡聚糖进行沉淀，或其它的方法。可以使用任意数量的具有生理pH的标准缓冲水溶液，如磷酸盐、Tris(三羟甲基氨基甲烷)等。

受试者

受试者是待测以对其CVD(如充血性心力衰竭、主动脉瘤或主动脉夹层)、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH风险进行表征的任何人类或其它动物。在某些实施方案中，所述受试者发生不良心血管事件的风险没有升高。遭受心血管事件的风险升高的受试者包括那些具有心血管病家族病史、血脂升高、吸烟者、早期急性心血管事件等群体(参见例如Harrison’s Principles of ExperimentalMedicine，第15版，McGraw-Hill有限公司，纽约——下文以“Harrison’s”表示)。

在某些实施方案中，受试者外表上看起来是健康的。本文使用的“外表健康”表示这样的受试者：他们没有任何CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的迹象或症状，事先也未被诊断出具有表示存在动脉粥样硬化的迹象或症状，例如心绞痛、心血管事件史，如心肌梗死或中风、或通过诊断成像法获得动脉粥样硬化的证据，包括但不限于冠状动脉血管造影术。外表健康的受试者也不具有任何患上心力衰竭或主动脉病症的迹象或症状。

在其它实施方案中，受试者已经表现出心血管病的症状。例如，该受试者可以表现出心力衰竭或主动脉病症的症状，例如主动脉夹层或主动脉瘤。对于已经遭受心血管病的受试者来说，可以使用与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平来预测发生更多的心血管事件的可能性或者所患心血管病的结果。

在某些实施方案中，受试者为不吸烟的人。“不吸烟的人”指的是这样的个体：他们在评估过程中不是吸烟者。这包括从未吸烟的个体和吸烟但在过去一年内未抽吸过烟草产品的个体。在一些实施方案中，受试者为吸烟者。

在某些实施方案中，受试者为非高血脂性受试者。“非高血脂性”指的是这样的受试者：其是非高胆固醇血症(nonhypercholesterolemic)和/或非高甘油三酯血症(nonhypertriglyceridemic)受试者。“非高胆固醇血症”受试者是不符合目前针对高胆固醇血症受试者所建立的标准的群体。“非高甘油三酯血症”受试者是指不符合目前针对高甘油三酯血症受试者所建立的标准的群体(参见例如Harrison’s Principles ofExperimental Medicine，第15版，McGraw-Hill有限公司，纽约——下文以“Harrison’s”表示)。高胆固醇血症受试者和高甘油三酯血症受试者都与早发冠心病的发病率的提高有关。高胆固醇血症受试者的LDL水平为＞160mg/dL的，或者LDL水平为＞130mg/dL且具有至少两个选自由男性、早发冠心病家族病史、吸烟(每天超过10支)、高血压、低HDL(＜35mg/dL)、糖尿病、高胰岛素血症、腹部肥胖、高脂蛋白(a)，以及脑血管疾病或闭合性外周血管疾病的个人病史所组成的组中的风险因子。非高甘油三酯血症受试者的甘油三酯(TG)水平为＞250mg/dL。因此，将非高血脂性受试者定义为胆固醇和甘油三酯水平都低于上述高胆固醇血症和高甘油三酸酯血症受试者的下限。

用于测量与胆碱有关的含三甲胺化合物水平的方法

可以使用各种合适的分析方法(包括本领域公知的方法)来对与胆碱有关的含三甲胺化合的水平进行测量。例如，可以用分析设备对受试者中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱(反式和顺式)、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和甜菜碱的水平进行测量，所述分析设备是这样一种仪器：它具有能够鉴定小有机分子的检测器，例如与胆碱有关的含三甲胺化合物。所述分析设备可以是光谱设备，例如质谱仪、紫外线光谱仪或核磁共振波谱仪。光谱仪是利用光谱技术来对介质例如生物学样品(如体液)中的给定品种的浓度或数量进行评估的设备。用于测量与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平的分析设备可以是便携式装置或固定式装置。在用于检测与胆碱有关的含三甲胺化合物的装置之外，所述分析设备还可以包括附加装置，从而能在进行分析前对分析物进行物理分离。例如，如果所述分析物检测器为质谱仪，则该分析设备还可以包括高效液相色谱(HPLC)或气谱，从而能在用质谱监测与胆碱有关的含三甲胺化合物之间对其进行提纯。

如本文中所指出的，可以使用建立在质谱基础上的方法来评估生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的水平。质谱仪包括电离源(如电喷雾)，和根据其质荷比(m/z)用于分离在电离源处形成的离子的分析仪，和用于带电离子的检测器。在串联式质谱中包括了两个或更多个分析仪。该方法是本领域中的标准方法，并且包括与例如电喷雾电离(ESI)和串联式质谱联机的HPLC。

也可以用其他的光谱分析法来检测与胆碱有关的含三甲胺化合物。例如，可以使用多种检测器通过HPLC来测量与胆碱有关的含三甲胺化合物，包括但不限于UV或Vis(衍生形式)、质谱或GC/MS。可以用于鉴定与胆碱有关的含三甲胺化合物的方法为核磁共振法(NMR)。NMR的实例包括质子NMR和C-13NMR。

测出与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平之后，可以将其以多种方式展现出来。例如，与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平可以在显示器上以数值或比例条(如条状图)通过图表表现，或者通过本领域技术人员知道的其他任何显示方法表现。图示法能直观地表示所评价的生物学样品中的与胆碱有关的含三甲胺化合物(如TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱或甜菜碱)的量。此外，在一些实施方案中，还可以将分析设备构造成能显示受试者体液中的TMANO水平与来自参照队列的可比体液中的TMANO水平的基础上的对照值的比较结果。

对照值

在一些实施方案中，可以将来自测试受试者的生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平与对照值相比。对照值是分析物的浓度，它反映了分析物的已知量或代表量。例如，可以在获得自参照队列的可比样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱水平的基础上获得对照值。在某些实施方案中，参照队列是一般性群体。在某些实施方案中，参照队列为从人类受试者中挑选出来的群体。在某些实施方案中，参照队列包括这样的个体：他们事先没有任何能证实存在动脉粥样硬化的迹象或症状，例如心绞痛、心血管事件(如心肌梗死或中风)病史、通过诊断成像法(包括但不限于冠状动脉血管造影术)发现的动脉粥样硬化的证据。在某些实施方案中，参照群组包括这样的个体：他们在医务人员的检查中表现出无疾病(如心血管病)症状。在另一个实施方案中，参照队列可以是这样的个体：他们是不吸烟的人(即，不抽吸纸烟或类似物品(例如雪茄)的个体)。不吸烟队列的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的正常范围可以与吸烟群体和一般群体具有的正常范围不同。因此，选择对照值时需要考虑测试受试者所述的类型。本领域技术人员可以根据常规实验来选择合适的类型。

优选藉由用于表征获自测试受试者的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的水平的相同单位来测量对照值。因此，如果TMANO水平是绝对值时(例如，每毫升血液中的TMANO、胆碱和/或甜菜碱的量)，对照值也是建立在一般群体或选定群体的人类受试者的个体的每毫升血液中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的单位的基础上。

对照值可以具有多种形式。该对照值可以是单个临界值，如中位数(median)或平均值(mean)。可以基于对比组来确立对照值，例如在一个确定组内的风险是另一个确定组的风险的两倍。可以平均(或不平均地)将对照值进行分组，例如低风险组、中等风险组和高风险组，或将对照值分成四等份，最低的四分位数是风险最低的个体，而最高的四分位数为风险最高的个体，因此，测试受试者患CVD的风险可以建立在他或她的测试值落入的组的基础上。通过测定一般群体或选定群体的个体大样品进，并利用统计模型，如用于选择阳性标准的预测值方法，或者接受者操作特征曲线来确立所获得的生物学样品中的TMANO对照值，例如平均水平、中位数水平或“临界”水平，所述接受者操作特征曲线定义了最佳特异性(最高的真阴性率)和灵敏性(最高的真阳性率)，参见Knapp，R.G.和Miller，M.C.(1992).ClinicalEpidemiology and Biostatistics.William和Wilkins，Harual出版公司，Malvern，Pa.，该文献通过引用明确并入本文。可以确定每一个被分析的风险预测因子的“临界”值。

从受试者获得的与胆碱有关的含三甲胺化合物与对照值的比较

可以将受试者的生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的水平与单个对照值或对照值范围进行比较。如果受试者的生物学样品中的现有风险预测因子水平高于对照值或超过对照值的较高范围或在对照值的较高范围内，该测试受试者比水平等于或低于对照值或者在对照值较低范围内的个体具有更大的患上或患有CVD(或糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH)或者在接下来的1年、2年和/或3年内遭受心血管事件的风险。相反，如果测试受试者的生物学样品中的现有风险预测因子的水平低于对照值或在对照值的较低范围内，该测试受试者比水平等于或高于对照值或者超过对照值的较高范围或者在对照值的较高范围内的个体具有更小的患上或患有CVD(或糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH)或者在接下来的1年、2年和/或3年内遭受心血管事件的风险。测试受试者的风险预测因子水平与对照值之间的差别程度也能有效地表征风险程度，从而确定哪些个体能够从特定的冲击性治疗中最大地获益。在对照值范围被分成多组的情况下(例如针对高危个体、平均风险个体和低危个体的对照值范围)，这种比较包括确定测试受试者的相关风险预测因子水平属于哪一组。

另一类型的对照值是样品中的内标。内标是已知量的另一种化合物，可以将该化合物提供在能与分析物一起进行测量的样品中，从而起到参照的作用。还可以通过确定受试者生物学样品中的TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的水平，并将它们与内标的量进行比较来进行本文所述的诊断方法。

对治疗剂的评估

还提供了用于评价CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH治疗剂对那些被诊断为患有CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH或具有患上CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH风险的个体的效果的方法。所述治疗剂包括但不限于抗生素、消炎剂、胰岛素增敏剂(insulinsensitizing agent)、抗高血压剂、抗血栓形成剂、抗血小板剂、纤维蛋白溶解剂、降脂剂、直接凝血酶抑制剂、ACAT抑制剂、CDTP抑制剂曲格列酮(thioglytizone)、糖蛋白IIb/IIIa受体抑制剂、旨在提高或改变HDL新陈代谢的试剂，例如载脂蛋白A-I米兰突变体(apoA-Imilano)或CETP抑制剂(如托彻普(torcetrapib))、或设计为起到人造HDL作用的试剂。因此，本文所用的CVD治疗剂指的是更宽范围内能治疗一系列与心血管有关的病况的试剂，而且还包括比传统定义的心血管试剂种类更多的化合物。

对CVD、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH治疗剂的效力的评价可以包括，获得与胆碱有关的含三甲胺化合物或生物学样品中化合物的预定值，以及确定在施用所述治疗剂后得自受试者的相应的生物学流体中的一种或多种与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平。在施用治疗剂后获得的样品中的一种或多种与胆碱有关的含三甲胺化合物的水平比在施用治疗剂之前获得的样品中的所选风险标记物的水平低时，指示对接受治疗的受试者进行的针对心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的治疗具有积极效果。

预定值可以是建立在施用治疗剂之前得自受试者的生物学样品中的一种或多种与胆碱有关的含三甲胺化合物水平的基础上的。在另一个实施方案中，所述预定值是建立在来自被本文定义为外表健康的对照受试者的可比生物学样品中的一种或多种与胆碱有关的含三甲胺化合物水平的基础上的。

本文所描述的方法的实施方案还能有效地用于确定是否或者何时应当或不应当向个体开具目的在于预防CVD(或糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH)或用于减缓CVD进程的治疗剂。例如，可以将TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱的值高于特定临界值的个体，或上述值处于“正常范围”中较高值的三分位数或四分位数的个体鉴定为需要通过降脂剂、胰岛素、改变生活方式等进行更具冲击性介入治疗的个体。

药物筛选和疗法

在一些实施方案中，本发明提供了药物筛选分析(例如，筛选用于TMA形成抑制剂的药物)。本发明的筛选方法将含三甲胺的前体(如TMANO、胆碱、巴豆甜菜碱(顺式和反式)、γ-丁基甜菜碱、肉碱、4-三甲基丁醛铵、脱氢肉碱、3-羟基-N6-三甲基-赖氨酸、N6-三甲基-赖氨酸、三甲基丙酮铵、脱羧肉碱、磷酸胆碱、甜菜醛、甘油磷酸胆碱、磷脂酰胆碱和/或甜菜碱)用于与能够裂解与胆碱有关的含TMA化合物从而形成三甲胺的肠内菌群进行孵育。例如，在一些实施方案中，本发明提供了筛选这样化合物的方法，该化合物抑制了菌群裂解含TMA前体形成TMA的能力。在一些实施方案中，候选化合物为抗生素化合物。在其他实施方案中，候选化合物是小分子(例如，来自小分子文库)。

在一种筛选方法中，通过使候选化合物与含所述菌群和含TMA前体的样品进行接触，然后分析候选化合物对TMA形成产生的影响来评价候选化合物抑制菌群形成TMA的能力。在一些实施方案中，通过检测形成的TMA水平来分析候选化合物对TMA形成所造成的影响。

具体来说，本发明提供了用于鉴定调节剂，即能防止肠内菌群将含前体TMA的分子转化为TMA的候选化合物或测试化合物或试剂(如蛋白质、肽、类肽、类胨、小分子、抗生素或其他药物)的筛选方法。能抑制肠内菌群形成TMA的化合物能有效地用于对心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的治疗中。

可以利用本领域公知的组合库(combinatorial library)方法中任意数量的途径来获得本发明的测试化合物，包括生物学库、类胨库(具有肽官能团但具有新的非肽骨架的分子的库，它们对酶促降解有耐受性却仍能保持生物活性，参见Zuckennann等人，J.Med.Chem.37：2678-85(1994))；空间可寻址平行(spatially addressable parallel)固相或液相库；需要重叠合法(deconvolution)的合成库方法；“一珠一化合物”库方法；和采用亲和色谱选择法的合成库方法。优选与肽库一起使用生物库和类胨库途径，而其他四种途径也适用于肽、非肽低聚物或化合物的小分子库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。

在一些实施方案中，测试化合物为抗生素。可以对任何类型的抗生素进行筛选。该抗生素的实例包括但不限于氨苄西林(Ampicillin)；巴卡西林(Bacampicillin)；茚满基羧苄西林(Carbenicillin Indanyl)；美洛西林(Mezlocillin)；哌拉西林(Piperacillin)；替卡西林(Ticarcillin)；阿莫西林-克拉维酸；氨苄西林-舒巴坦(Ampicillin-Sulbactam)；苄青霉素(Benzylpenicillin)；氯唑西林(Cloxacillin)；双氯西林(Dicloxacillin)；甲氧西林(Methicillin)；苯唑西林(Oxacillin)；青霉素G(Penicillin G)；青霉素V(Penicillin V)；哌拉西林他唑巴坦(PiperacillinTazobactam)；替卡西林克拉维酸(Ticarcillin Clavulanic Acid)；乙氧萘青霉素(Nafcillin)；头孢菌素I代(Cephalosporin I Generation)；头孢羟氨苄(Cefadroxil)；头孢唑啉(Cefazolin)；头孢氨苄(Cephalexin)；头孢噻吩(Cephalothin)；头孢匹林(Cephapirin)；头孢拉定(Cephradine)；头孢克洛(Cefaclor)；头孢孟多(Cefamandol)；头孢尼西(Cefonicid)；头孢替坦(Cefotetan)；头孢西丁(Cefoxitin)；头孢丙烯(Cefprozil)；头孢美唑(Ceftmetazole)；头孢呋辛(Cefuroxime)；氯碳头孢(Loracarbef)；头孢地尼(Cefdinir)；头孢布烯(Ceftibuten)；头孢哌酮(Cefoperazone)；头孢克肟(Cefixime)；头孢噻肟(Cefotaxime)；头孢泊肟酯(Cefpodoximeproxetil)；头孢他啶(Ceftazidime)；头孢唑肟(Ceftizoxime)；头孢曲松(Ceftriaxone)；头孢吡肟(Cefepime)；阿奇霉素(Azithromycin)；克拉霉素(Clarithromycin)；克林霉素(Clindamycin)；地红霉素(Dirithromycin)；红霉素(Erythromycin)；林可霉素(Lincomycin)；醋竹桃霉素(Troleandomycin)；西诺沙星(Cinoxacin)；环丙沙星；依诺沙星(Enoxacin)；加替沙星(Gatifloxacin)；格帕沙星(Grepafloxacin)；左氟沙星(Levofloxacin)；洛美沙星(Lomefloxacin)；莫西沙星(Moxifloxacin)；萘啶酸(Nalidixic acid)；诺氟沙星(Norfloxacin)；氧氟沙星；司帕沙星(Sparfloxacin)；曲伐沙星(Trovafloxacin)；奥索利酸(Oxolinic acid)；吉米沙星(Gemifloxacin)；甲氟哌酸(Perfloxacin)；亚胺培南-西司他丁美罗培南(Imipenem-Cilastatin Meropenem)；氨曲南(Aztreonam)；阿米卡星(Amikacin)；庆大霉素(Gentamicin)；卡那霉素(Kanamycin)；新霉素；奈替米星(Netilmicin)；链霉素(Streptomycin)；妥布霉素(Tobramycin)；巴龙霉素(Paromomycin)；替考拉宁(Teicoplanin)；万古霉素(Vancomycin)；去甲金霉素(Demeclocycline)；强力霉素(Doxycycline)；甲烯土霉素(Methacycline)；米诺环素(Minocycline)；土霉素(Oxytetracycline)；四环素(Tetracycline)；金霉素(Chlortetracycline)；磺胺米隆(Mafenide)；磺胺嘧啶银(SilverSulfadiazine)；磺胺醋酰(Sulfacetamide)；磺胺嘧啶(Sulfadiazine)；磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole)；柳氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)；：磺胺异噁唑(Sulfisoxazole)；甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(Trimethoprim-Sulfamethoxazole)；磺胺甲噻二唑(Sulfamethizole)；利福布汀(Rifabutin)；利福平(Rifampin)；利福喷丁(Rifapentine)；利奈唑胺(Linezolid)；链阳性菌素(Streptogramin)；奎奴普丁达福普汀(Quinopristin Dalfopristin)；杆菌肽(Bacitracin)；氯霉素；磷霉素(Fosfomycin)；异烟肼(Isoniazid)；乌洛托品(Methenamine)；甲硝唑(Metronidazol)；莫匹罗星(Mupirocin)；呋喃妥因(Nitrofurantoin)；呋喃西林(Nitrofurazone)；新生霉素(Novobiocin)；多粘菌素(Polymyxin)；大观霉素(Spectinomycin)；甲氧苄啶(Trimethoprim)；粘菌素(Colistin)；环丝氨酸(Cycloserine)；卷曲霉素(Capreomycin)；乙硫异烟胺(Ethionamide)；吡嗪酰胺(Pyrazinamide)；对氨基水杨酸(Para-aminosalicyclic acid)；和琥乙红霉素(Erythromycinethylsuccinate)。

可以在本领域中找到关于合成分子库的方法的实例，例如在：DeWitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6909(1993)；Erb等人，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 91：11422(1994)；Zuckermann等人，J.Med.Chem.37：2678(1994)；Cho等人，Science 261：1303(1993)；Carrell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33.2059(1994)；Carell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061(1994)；和Gallop等人，J.Med.Chem.37：1233(1994)。

化合物库可以存在于溶液中(如Houghten，Biotechniques 13：412-421(1992))、或在珠上(Lam，Nature 354：82-84(1991))、芯片上(Fodor，Nature 364：555-556(1993))、细菌或孢子上(美国专利No.5,223,409，通过引用并入本文)、质粒(Cull等人，Proc.Nad.Acad.Sci.USA 89：18651869(1992))或在噬菌体上(Scott和Smith，Science 249：386-390(1990)；Devlin Science 249：404-406(1990)；Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382(1990)；Felici，J.MoI.Biol.222：301(1991))。

可以通过对含TMA的前体化合物中TMA部分进行可被检测到的标记，来监测测试化合物抑制肠道菌群形成TMA的能力。这种可检测标记包括，例如放射性同位素、生色团、荧光团或酶标。例如，可以用含TMA的前体可以直接或间接地用¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³H进行标记，通过辐射发射(radioemmission)直接计数或闪烁计数来检测放射性同位素。可选择地，可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶对含TMA的前体进行酶标记，通过确定合适的底物到产物的转化率来对酶标进行检测。

在一个实施方案中，将含TMA的前体或测试物质锚固在固相上。可以在反应结束时检测锚固在固相上的含TMA的前体。

在一些实施方案中，可以在液相中进行无细胞分析。在该分析中，用任意数量的标准技术将反应产物与未反应组分分离，所述标准技术包括但不限于：差速离心(参见例如Rivas和Minton，Trends BiochemSci 18：284-7(1993))；色谱法(凝胶过滤色谱法、离子交换色谱法)；电泳(参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in MolecularBiology 1999，J.Wiley：纽约)；和免疫沉淀法(参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology 1999，J.Wiley：纽约)。上述树脂和色谱技术是本领域技术人员公知的(参见例如Heegaard J.MoI.Recognit 1 1：141-8(1998)；Hageand Tweed J.Chromatogr.Biomed.Sci.Appl 699：499-525(1997))。

本发明还涉及通过上述筛选分析对试剂进行鉴定。因此，将使用根据本文所述方法进行鉴定的试剂进一步用于合适的动物模型中以确定用该试剂进行治疗的效力、毒性、副作用或反应机理也属于本发明的范围。此外，可以在本文描述的治疗中使用通过上述筛选分析鉴定的新试剂。

实施例

以下实施例仅用于阐述目的而不旨在限制权利要求书的范围。

实施例1

根据以下研究，确定生物学样品(如血浆、血清、全血或尿液)中的被称为TMANO(三甲胺N-氧化物)的化合物可以起到心血管病风险预测因子的作用，该心血管病风险预测因子能同时针对短期不良结果，例如对出现胸痛症状患者的评估、针对近期评估和针对风险较低群体的长期结果，例如在以社区为基础筛选出来的受试者，或经历了选择性诊断心血管过程，例如血管造影法、心脏CT、压力测试或心肌灌注研究的受试者。

TMANO水平预示着患有CVD例如冠心病(CAD)和/或外周动脉疾病(PAD)的风险，以及发生CVD不良事件(包括非致命性心肌梗死(MI)、中风、血管再生需要或死亡)的风险。

TMANO水平还能用于监测CVD疗法，并对消炎介入治疗和其他降低心血管风险介入治疗的应答进行监测。

通过一系列的代谢组学研究发现了TMANO。已经尝试对血浆、血清、血液或尿液中的可能预示心血管病(CVD)的低分子量分析物进行鉴定。采用50％病例对50％对照的“学习模式(learning set)”，其中的病例由在接下来3年内会遭受心血管事件的受试者定义，例如遭受非致命性MI、中风、血管再生事件(CABG、血管成形术、支架术)或死亡，以及由不会发生上述事件的个体的对照组成。所研究的初始受试者来自大型医疗室，后来的经历了选择性诊断性心导管检查术受试者也来自于此，而且他们的结果数据是可获得的。

一开始，将蛋白质从血浆中除去，并通过液相色谱-质谱(LC/MS)分析对小分子量组分(＜1000)进行分析。记录每种分子量洗脱低于1000的分析物的保留时间和m/z，以及电离信号。将病例组获得的结果与对照组获得的结果进行比较。

图1所示为仅对m/z为50-100之间的分析物进行监测的绘图。上图(a)反映了信号的级数。需要对血浆内的分析物进行鉴定，该分析物能区分病况组和对照组此时能观察到大的信号。中图(b)显示了在该m/z范围内的各个分析物在第四四分位数对第一四分位数水平上的-logP值。对它们进行评价来鉴定预示CVD风险的分析物，从而得到显著性P值(即，-logP＞1.3，对应的P＜0.05)。下图(c)显示了在该m/z范围内的分析物针对每个分析物在第四四分位数对第一四分位数水平上的奇数比(95％置信区间)。提供了较大奇数比(OR)和置信区间(CI)的分析物是显著性的。图1示出了多个可能适用于选择病例和对照的分析物。对分析物进行鉴定表明选出的m/z为76，这是因为它表现出高信号、能显著区分病例和对照，和用于预测心血管事件的大奇数比。

图1中的数据是反相HPLC通过Ionics EP 10+升级(Concord)在阳性ESI-MS离子模式下连接到API 365三联四级质谱仪(AppliedBiosystems，Foster，CA)上而得到的。将血浆上清液(20μl)用80％的甲醇进行沉淀后，以0.8ml/分钟的流速注入苯基柱(4.6×250mm，5pm的Rexchrom Phenyl)(Regis)内。通过以下梯度进行分离：开始用10mM甲酸铵进行0.5分钟，然后用5mM甲酸铵、25％甲醇和0.1％甲酸进行3分钟，静置8分钟，然后用100％甲醇和水各进行每次3分钟的洗涤。断开起始4分钟内从HPLC柱的洗出液，仅将从第4-11分钟的洗出液用于质谱仪的数据收集。图(b)是有关经过诊断性心导管检查术并在本研究开始后的3年内没有遭受主要不良心血管事件的50个对照和在本研究开始后的3年内经历了主要不良心血管事件(MACE，包括非致命性MI、中风、血管再生需要或死亡)的50个病例之间提取的各离子水平差别显著。图(c)是关于根据提取的离子峰面积的对于MACE、血管再生(Revasc)、非致命性MI或中风、死亡的前景风险奇数比。用逻辑回归模型通过将最高四分位数的风险与最低四分位数的风险相比，计算出奇数比(OR)和置信区间。

图2显示的是血浆中m/z为76的追踪心脏病风险的分析物的色谱图，它在3个分离柱/流动相组合中的色谱特征与TMANO类似，根据单峰的证据可以看出分析物是单一品种。

图2中的数据是反相HPLC通过Ionics EP 10+升级(Concord)在阳性ESI-MS离子模式下连接到API 365三联四级质谱仪(AppliedBiosystems，Foster，CA)上而得到的。将血浆上清液(20μl)用80％的甲醇或20μl的三甲胺N-氧化物(TMANO)进行沉淀后，以0.8ml/分钟(图a-b)的流速注入苯基柱(4.6×250mm，5pm的RexchromPhenyl)(Regis)内，或以0.2ml/分钟(图c)的流速注入Prodigy 5u ODS(2)柱(150×2.00mm，5微米)内。图a中的分离是通过下列梯度进行的：开始用10mM甲酸铵进行0.5分钟，接着用5mM甲酸铵、25％甲醇和0.1％甲酸进行3分钟，静置8分钟，然后用100％甲醇和水各进行每次3分钟的洗涤。图b中的分离是通过下列梯度进行的：开始用0.1％甲酸进行2分钟，接着具有0.1％甲酸的18％乙腈中进行18分钟，然后用100％乙腈和水进行每次3分钟的洗涤，开始用0.1％甲酸进行2分钟，接着通过0.1％甲酸移至18％乙腈中进行2分钟，然后用100％乙腈和水各进行每次6分钟的洗涤。图c中的分离是通过下列梯度进行的：开始通过0.1％甲酸移至具有0.1％甲酸的50％乙腈中进行18分钟，然后用100％乙腈和水各进行每次3分钟的洗涤，开始用0.1％甲酸进行2分钟，接着用具有0.1％甲酸的18％乙腈进行18分钟，然后用100％的乙腈和水各进行每次3分钟的洗涤。

表1a证实了从血浆中分离出的追踪CVD发病风险的组分是TMANO，而不是具有相同分子量和元素组成的其他异构体。发现仅TMANO在3个不同的溶剂系统的保留时间内显示出与从血浆中分离出的预示CVD风险的分析物相同的母-子离子。

表1a.m/z＝76时，正质子化母离子的LC-MS特性。

系统1：Regis RexChrom Phenyl HPLC柱(25cm×4.6mm，5微米，100A)。用以下梯度进行分离：0-0.5分钟，10mM甲酸铵；0.5-3.5分钟，线性变为具有5mM甲酸铵和0.1％甲酸的25％甲醇，并静置8分钟；11.5-14分钟，线性变为具有10mM甲酸铵的100％甲醇，并静置3分钟；17-20分钟，用10mM的甲酸铵水溶液。流速为0.8ml/分钟。

系统2：Regis RexChrom Phenyl HPLC柱(25cm×4.6mm，5微米，100A)。用以下梯度进行分离：开始用0.1％甲酸进行2分钟，接着用具有0.1％甲酸的18％乙腈进行18分钟，然后用100％乙腈和水各进行每次3分钟的洗涤，开始用0.1％甲酸进行2分钟，接着用0.1％甲酸的18％乙腈进行2分钟，然后用100％乙腈和水各进行每次6分钟的洗涤。流速为0.8ml/分钟。

系统3：Prodigy 5u ODS(2)柱(150×2.00mm，5微米)。开始用0.1％甲酸至具有0.1％甲酸的50％乙腈进行18分钟，然后用100％乙腈和水各进行每次3分钟的洗涤，开始用0.1％甲酸进行2分钟，接着用具有0.1％甲酸的18％乙腈进行18分钟，然后用100％乙腈和水各进行每次3分钟的洗涤。流速为0.2ml/分钟。

表1b进一步独立证实了从血浆中分离出的追踪CVD发病风险的组分是TMANO，而不是具有相同分子量和元素组成的其他异构体。发现仅TMANO在保留时间内显示出与从血浆中分离出的预示CVD风险的分析物相同的母-子离子。通过GC MS按照两个独立的区分策略对分离出的血浆组分和具有相同分子量和元素组成的异构体结构进行分析。表1a和表1b的结果清楚地对分离出的血浆组分进行了鉴定——为预示CVD发病风险的TMANO。

表1b.对血浆中预示CVD发病风险的峰值和分子量同样为75(M+＝76)的化合物进行的GC-MS分析。用三甲基氯硅烷(TMCS，系统1)或氯甲酸三氯乙烷(TCECF，系统2)对所有的化合物进行衍生化。

系统1，使组分与含HMDS、TMCS、吡啶的Sylon HTP试剂盒(Supelco，LB44596)在90℃下反应9小时。在连接至Hewlett Packard6890的气相色谱仪的Hewlett Packard(Palo Alto，CA)5973质谱仪上使用甲烷作为试剂气体并采用阳离子化学电离模式，进行对TMS衍生物的GC-MS分析。将源温设定为250℃。在J&W Scientific(Folsom，CA)DB-1柱(20.0m，内径为0.18mm，膜厚度为0.18-pm)上将TMS衍生物分离。将注射器和传输线温度保持为320℃。将GC炉在60℃下保持2分钟，然后以20℃/分钟的速度升温至300℃。

系统2，将组分与氯化钛(III)反应后，再与氯甲酸三氯乙烷(TCECF)反应。将产物溶解在甲苯中。在连接至Hewlett Packard 6890的气相色谱仪的Hewlett Packard(Palo Alto，CA)5973质谱仪上使用甲烷作为试剂气体并采用阳离子化学电离模式，进行对TMS衍生物的GC-MS分析。将源温设定为250℃。在Agilent HP-1甲基硅氧烷柱(12.0m，内径为0.20mm，膜厚度为0.33-mm)上将TMS衍生物分离。将注射器和传输线温度保持为250℃。将GC炉在70℃下保持2分钟，然后以25℃/分钟的速度升温至170℃。

图3提供的示例性数据确认了TMANO与预示着CVD发病风险的m/z为76的血浆组分相同。图a显示血浆组分与TMANO的CID谱相同。图b和图c显示血浆组分中特征母-子离子跃迁保留时间与两个独立的HPLC色谱系统中的TMANO相同，从而可以将血浆中具有相同分子量的其它品种可区别于TMANO并且不共享所分离出血浆组分的所有特性。

图3(a)中提供的数据获得自在血浆上清液和TMANO标准中，对应于正态MS1模式下提取离子色谱的m/z＝76时的峰值的碰撞(能量为21eV)诱导的解离(CID)质谱。图3(b)中提供的数据获得自从76→58发生母-子离子跃迁(parent-to-daughter transition)时，正离子多反应监测(MRM)模式下的提取离子色谱。将样品(20μl)以0.8ml/分钟的流速注入苯基柱(4.6×250mm，5pm的Rexchrom Phenyl)(Regis)内。通过以下梯度进行分离：开始用10mM甲酸铵进行0.5分钟，然后用5mM甲酸铵、25％甲醇和0.1％甲酸进行3分钟，静置8分钟，然后用100％甲醇和水进行各每次3分钟的洗涤。图3(c)中提供的数据获得自从76→58发生母-子离子跃迁(不包括甘氨酸从76→59)时，正态MRM模式下的提取离子色谱。将样品(20pl)以0.8ml/分钟的流速注入苯基柱(4.6×250mm，5pm的Rexchrom Phenyl)(Regis)内。通过以下梯度进行分离：开始用0.1％甲酸进行2分钟，接着通过具有0.1％甲酸的18％乙腈进行2分钟，然后用100％乙腈和水各进行每次6分钟的洗涤。

图4和表2a及表2b显示的是第一独立临床验证研究的结果，它显示了TMANO预示着进行诊断性心导管检查术治疗的约500位男性和500女性中患有CVD、CAD、PAD或CAD与PAD的组合风险。表2a显示了患有CVD的受试者对那些未具有心血管病的临床或血管造影术证据的受试者的患者特征以及人口统计。图4a是研究队列中患有CVD对未患CVD群体中TMANO水平的盒须图。图4b显示了按照全部群体的四分位数进行分类的TMANO水平对人群中患有CVD、CAD、PAD或CAD+PAD可能性的频率图。注意到随着TMANO水平的升高与患CVD、CAD、PAD或CAD+PAD几率增加之间有极强联系。图4c和表2b显示了TMANO水平对用传统心脏风险因子进行调整后的患CVD、CAD、PAD或CAD+PAD的奇数比和95％置信区间。这些结果显示了针对在大量临床研究中鉴定出具有患CVD、CAD、PAD或CAD+PAD风险的个体的TMANO水平的测量结果。

表2a：CVD流行性的人口统计学

表2b：对应于TMANO四分位数的心血管疾病(CVD)风险的奇数比(95％CI)

图5和表3a及表3b显示的是第二临床验证研究的结果，它显示了TMANO水平预示着进行诊断性心导管检查术治疗的约500位男性和500女性中遭受非致命性MI或中风、血管再生事件、死亡或它们的组合(MACE，主要不良心血管事件)的3年发病风险。表3a显示了根据本研究开始后3年内经历MACE对那些未发生MACE进行分类的受试者的患者特征以及人口统计。图5a是研究队列中还会经历MACE对不再经历MACE的人群的TMANO水平的盒须图。图5b显示了按照全部群体的四分位数进行分类的TMANO水平对全部群体中经历非致命性MI或中风、血管再生事件(CABG、血管成形术或支架术)、死亡或它们的组合(MACE)发病可能性的频率图。注意到TMANO水平的升高明显预示着非致命性MI或中风、血管再生事件(CABG、血管成形术或支架术)、死亡或它们的组合(MACE)的3年发病风险。图5c和表3b显示了TMANO水平对用传统心脏风险因子进行调整后的非致命性MI或中风、血管再生事件(CABG、血管成形术或支架术)、死亡或它们的组合(MACE)的3年发病风险的奇数比和95％置信区间。这些结果显示能将TMANO水平的测量结果作为针对非致命性MI或中风、血管再生事件(CABG、血管成形术或支架术)、死亡或它们的组合(MACE)的3年发病风险的有力且独立的预测因子。

表3a：具有MACE(血管再生、MI、中风、或死亡)未来风险的受试者的人口统计

表3b：根据TMANO四分位数的MACE(血管再生(Revasc)、非致命性MI、中风或死亡)发病风险的奇数比(95％CI)

ζ模型包括Framingham风险评分、MDRD、CRP和TMANO。

为了获得图5所示的数据，对来自病例组的受试者(n＝374)血浆中TMANO含量进行分析，该受试者经过了诊断性心导管检查术并在本研究开始后的3年内发生了MACE。同时对来自对照受试者(n＝619)的血浆进行平行分析，该受试者经过了诊断性心导管检查术，并在本研究开始后的3年内未发生MACE。

实施例2

采用序贯病例：对照设计，通过LC/MS进行代谢组学分析(即，对特定细胞过程留下的独特化学指纹进行系统研究)来鉴定血浆中能对具有在接下来的3年内患有MACE风险的受试者进行鉴定的小分子。仅有13种分析物满足区分研究队列和验证队列的风险的允收标准。在这些代谢物中，通过回归分析显示有3种分析物(质荷比(m/z)为76、104和118)是强烈相关的(P＜0.0001)，这说明它们通过共同路径而产生联系。通过LC/MS/MS、化学衍化、GC/MS并用各种胆碱同位素喂食小鼠，明确地证实m/z为76、104和118的品种分别是三甲胺N-氧化物(TMANO)、胆碱和甜菜碱。已经在1020位序贯批准的经历诊断性左心导管检查术的受试者中证实了血浆TMANO、胆碱和甜菜碱水平在预示3年MACE风险的预后应用。与最低的四分位数相比，不考虑Framingham风险因子和CRP情况下，TMANO、胆碱或甜菜碱之一的水平最高(第四四分位数)的受试者具有3倍以上的患CAD风险、5倍以上的患PAD风险和2倍以上的在接下来的3年内经历MACE的风险。

实施例3

可以将被诊断为患有慢性充血性心力衰竭的患者中的三甲胺N-氧化物水平(TMANO)的血浆水平显示为较高。从确诊为心力衰竭(HF)和稳定病况的患者，和没有心力衰竭或心功能不全(非HF)迹象或症状记载的对照患者中获得血样。对照患者可以包括其他的病况，例如糖尿病、高血压和慢性阻碍性肺病。按照Simpson’s规则用经胸壁超声心动图测定左心室射血分数。

用乙二胺四乙酸-血浆采血管(Becton Dickinson and Company，Franklin Lakes，New Jersey)来收集样品，对样品进行处理，并在进行分析前将其冷冻在-80℃下。按照实施例1描述的方法测定血浆TMANO水平。还可以通过实验室分析法测定血浆中B型脑钠肽(BNP)水平(AxSYM BNP，Abbott Diagnostics有限公司，Abbott Park，Illinois)。使用Kruskal-Waliis试验(秩和试验)来比较根据HF队列进行分组(并在纽约心脏协会(NYHA)分级范围内)的TMANO和BNP之间的差。对方差检验的分析评价了在TMANO四分位数范围内的连续连续临床变量的差别，而Cochran-Armitage测试则检测在TMANO四分位数范围内患者患有HF、缺血性诱因或是男性时的趋势比例。将自然对数转换用于确定Spearman’s相关系数。由多元逻辑回归分析法参考第一四分位数(奇数比为1.0)对第二、第三和第四四分位数内的TMANO的分析计算出患HF的奇数比。可以根据年龄和BNP水平而作出调整。接受者操作特征分析计算了用于预示HF的最佳TMANO临界值。将p值＜0.05视为具有统计学上的显著性。用JMP5.1(SAS Institute有限公司，Cary，North Carolina)来进行统计分析。

期望通过结果来显示TMANO水平四分位数的提高意味着HF具有更高的流行性。

预计HF队列中的TMANO水平的平均值比对照患者的要高得多。另外，预期血浆TMANO水平的平均值也是按照NYHA分级而升高的。

本研究能证明血浆TMANO水平在患HF的患者中升高了，伴随着与NYHA分级恶化程度有关的水平也提高了。

实施例4

可以将TMANO的血浆水平表示为对患有慢性心力衰竭的患者进行评价的预后值。本研究的首要目的是测定血浆TMANO水平与心脏结构、心脏收缩和心脏舒张性能之间的关系，以及对患有慢性心脏收缩HF的患者的整体预后。

已经对ADEPT(对多普勒超声心电图在预后和治疗中的评估)研究中的神经激素亚研究进行了描述。见Troughton等人，J.Am.Coll.Cardiol.43，416-22(2004)。患有稳定的慢性心脏收缩心力衰竭(HF)(左心室射血分数[LVEF]＜35％，纽约心脏协会的功能鉴定为II至IV)的患者进行超声心动图对心脏收缩和心脏舒张性能进行评价，并收集其血浆样品。根据计划的电话回访来追踪临床事件(全死因死亡率、心脏移植或HF住院治疗)并按照Troughton等人(Am.J.Cardiol 96，257-62(2005))的描述用回顾表的方式进行验证。可以使用Crockcroft-Gault方程式，在肌酸酐、年龄和体重的基础上计算出肌酸酐清除率。可以通过Christchurch BNP分析法来对血浆中B型脑钠肽(BNP)水平进行分析。

用乙二胺四乙酸管收集样品，对其进行处理并在进行分析前将其冷冻在-80℃下。按照实施例1描述的方法测定血浆TMANO水平。应当在调查者不知道临床结果的情况下进行实验室分析。

使用可商购得到的HDI 5000(Phillips Medical Systems，Bothell，华盛顿)和Acuson Sequoia(Siemens Medical Solutions USA有限公司，Malvern，Pennsylvania)机器来进行综合性经胸壁超声心动图。以标准胸骨切面和尖端切面上进行二维彩色多普勒成像。在连续10次心跳过程中，使用已描述的技术以50cm/秒和100cm/秒的扫描速率获得心脏舒张指数(包括频谱多普勒、彩色M-型多普勒成像和组织多普勒成像)。按照下文对心脏舒张压阶段进行划分：阶段I(松弛功能受损)包括二尖瓣E/A＜1，减速时间＞220毫秒，肺静脉S/D＞1，心房返流(AR)＜35cm/秒；阶段II(假性正常)显示二尖瓣E/A＝1-2，肺静脉S/D＜1，减速时间＜220毫秒，AR？35cm/秒；阶段III(受限制)给出了二尖瓣的E/Vp比值。用Simpson双平面法测量LVEF和心脏容积。重复3次取测量结果的平均值(对心房颤动重复5次)，且由两位经验丰富的个体(不知道神经激素数据)进行所有的测量。

血浆TMANO水平可以是非正态分布的，并将其作为非参数变量进行处理(表示为中位数和四分位数间距[IQR])。根据是否为正态分布使用方差分析或Kruskal-Wallis测试来评估在TMANO三分位数上的连续临床变量的差别，通过列联表分析来评估在TMANO三分位数上的临床比例的差别。Shapiro-Wilk W测试来对正常台进行评估。将Spearman秩相关法作为血浆TMANO水平和所有临床变量之间相关联系的非参数度量。在TMANO的第一三分位数、第二三分位数和第三三分位数上，用多元逻辑回归分析法参考第一三分位数(奇数比＝1.0)计算出患有不同的心脏收缩或心脏舒张特性的奇数比。可以根据年龄和BNP水平而作出调整。可以从基线到全死因死亡率、心脏移植或HF住院治疗的时间超过33个月的平均回访数后的时间来绘制出卡普兰.梅尔存活图。还可以计算全部单变量和多变量科克斯比例危险分析(Cox proportionality hazard analyses)，以全死因死亡率、心脏移植或HF住院治疗作为结果，并将血浆TMANO水平看作相对于最低血浆TMANO的最高2个三分位数内的患者的结果间差异进行建模的分类变量。可以进行受试者特征曲线分析来通过BNP测定TMANO预后值的增量。将p值＜0.05视为具有统计学上的显著性。用9.1版SAS和5.1版JMP(SAS Institute有限公司，Cary，NorthCarolina)进行统计分析。

预计血浆TMANO水平的升高将关联到更高比例的右心室收缩功能不全。在多变量逐步逻辑回归分析中使用的变量表现出与经对数转换的血浆TMANO水平具有统计学上的显著相关性，仅组织多普勒成像衍生的间隔Aa波独立地与TMANO水平产生关联。

预计一种或多种与胆碱有关的含三甲胺化合物水平升高的患者将经历心血管事件、死亡或心脏移植。

实施例5

健康的老年受试者中的TMANO水平可以用于预示发生心力衰竭的风险。本研究的目的是评估HF发病风险，由此排除了在进行初次拜访前就患有流行性HF、流行性心肌梗死(MI)、流行性中风或死亡的患者。将持续对事件的回访。在首次检查中可以对以下的因子进行评估年龄、种族、性别、糖尿病、高血压、吸烟、亚临床血管疾病、酒精使用、现用药、身高、体重、血压和实验室测量(TMANO和脂类)，并且这些因子可以作为多因素分析中的共变量。为了对流行性心力衰竭进行诊断，通过物理测试的组分来对自我报告进行证实，或者在必要时通过认证协议来进行，该认证协议包括治疗医师进行检查和回顾病例。为了对发作的心力衰竭进行诊断，医师将根据参与者的用药记录回顾作出对心力衰竭进行诊断。然后由委员会基于医师的诊断，并考虑了心力衰竭的症状、迹象、胸X光结果和对心力衰竭(利尿剂和洋地黄或血管舒张药的现有处方)的治疗来确定心力衰竭的发病率。在坐下位置时的连续两次读数计算出收缩压和舒张压。将吸烟分为目前吸烟对目前不吸烟。可以用Friedewald式来计算低密度脂蛋白(LDL)胆固醇。有记载的亚临床心血管病(CVD)可以包括通过超声监测到的颈动脉内膜中层厚度异常、踝-臂指数异常、通过心电学检测到的升高的左心室质量和主要心电图异常。可以每6个月对事件(包括MI和中风)进行回访，且每年对本人进行。

对首次检查时收集的冰冻样品中的三甲胺N-氧化物(TMANO)进行测量。用实施例1中描述的方法对血浆TMANO水平进行测定。

进行预先指定的统计学分析计划，包括基于四分位数的分析和由人口统计特征分布和在四分位数组上的传统心血管风险因子得到的比较结果。用针对连续变量的Cochrane-Armitage趋势测验和针对分类变量的Chi Square测试来对基线特征的差别进行比较。用多变量科克斯比例危险回归模型来测定TMANO和HF之间的关联。为了计算TMANO四分位数作为风险标记物的分布，在未经调整的阶段下建模；然后对人口统计和心血管风险因子进行调整。用与时间有关的变量来进行分析，从而将MI发病率加入到模型中以计算在删改基线特征的关系上，针对具有MI发病率的参与者对这一中间事件的控制的效果。

越高水平的TMANO将与更高的HF发病率相关联。

本发明的发明人开发了两种多变量模型，它们能用于探究TMANO在血液中的水平与传统心脏风险因子和心肌梗死之间的相互关系。模型1中，发明人将MI视为与时间有关的变量。将年龄、性别、收缩压(SBP)、吸烟、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、糖尿病、任何亚临床心血管病和MI调整为与时间有关的变量后，期望升高的TMANO水平将预示着受试者患上HF的风险增加。

实施例6

患者中的TMANO水平还能用于预示患上主动脉病症的风险，例如主动脉夹层或主动脉瘤。如果患者事先表现出了主动脉病症，例如主动脉夹层或主动脉瘤，则将其排除。可以在首次检查中进行评估的其他因子包括年龄、种族、性别、糖尿病、高血压、吸烟、亚临床血管疾病、酒精使用、现用药、身高、体重、血压和实验室测量(TMANO和脂类)，并且这些因子可以作为多因素分析中的共变量。为了对诸如主动脉夹层或主动脉瘤的主动脉病症进行诊断，通过物理测试或回顾病例对报告进行证实。优选使用诊断成像技术来证实主动脉病症。可以每3个月、每6个月、每年或按照其他的日程安排来对主动脉病症(包括主动脉夹层和/或主动脉瘤)进行回访或检查。

为了使三甲胺N-氧化物(TMANO)水平与主动脉病症的发展相关联，先对首次检查时收集的冰冻样品中的三甲胺N-氧化物(TMANO)进行测量。用实施例1中描述的方法对血浆TMANO水平进行测定。然后在第3个月、第6个月、1年或其它间隔如2年或3年时对患者进行检查，以鉴定已经经历或正在经历主动脉病症的患者的数量。可以将主动脉夹层和主动脉瘤的数量分别制表。

进行预先指定的统计学分析计划，包括基于四分位数的分析和由人口统计特征分布和在四分位数组上的传统心血管风险因子得到的比较结果。用针对连续变量的Cochrane-Armitage趋势测验和针对分类变量的Chi Square测试来对基线特征的差别进行比较。用多变量科克斯比例危险回归模型来测定TMANO和主动脉病症之间的关联。为了计算TMANO四分位数作为风险标记物的分布，在未经调整的阶段下建模；然后对人口统计和心血管风险因子进行调整。

期望越高水平的TMANO能与更高的主动脉病症发病率相关联，例如主动脉夹层和主动脉瘤。除此之外，多变量模型能用于探究TMANO在血液中的水平与传统心脏风险因子之间的相互关系。在多变量模型中，将年龄、性别、收缩压(SBP)、吸烟、低密度脂蛋白(LDL)胆固醇、糖尿病、任何亚临床心血管病和MI调整为与时间有关的变量后，期望升高的TMANO水平将预示着受试者患上主动脉病症(例如主动脉夹层和/或主动脉瘤)的风险增加。

实施例7

本实施例描述了三甲胺品种TMANO、胆碱和甜菜碱的预后值。使分析中的受试者参与ADEPT试验，该试验对患有收缩性或舒张性心力衰竭的受试者的长期结果进行测量。结果(列于下表4)显示TMANO、胆碱和甜菜碱与死亡以及心脏移植后的死亡的风险有关，并且对胆碱和甜菜碱而言是因心力衰竭而发生的非预定性住院治疗的风险。由于本实施例中样品数量不足，会发现TMANO具有相同的走势，但无法达到连续变量的显著程度。看到TMANO第四四分位数和第一四分位数的水平，发现也存在高TMANO水平与非与定性住院治疗之间的显著联系(p＜0.05)。

表4

^*每1SD增量下的HR(1SD TMANO＝20.7μM；1SD胆碱＝4.9μM；1SD甜采碱＝11.9μM；1SD Ln TMANO＝0.99μM；1SD Ln胆碱＝0.38μM；1SD Ln甜菜碱＝0.27μM).

对经历了心脏评定(n＝2983)的序贯受试者(GeneBank队列)的血浆TMANO水平进行测量。总体上看，患有左心室收缩功能不全(LVSD)的患者具有较高水平的TMANO(p＜0.001)，这与将TMANO水平作为HF(心力衰竭)和LVSD的标记物时相吻合。图6关注的是TMAMO在预示队列中发生心力衰竭的预后值。在接受监测的队列中，约18％具有充血性心力衰竭病史(CHF，n＝537)而大多数没有CHF病史(n＝2446)。CHF中的TMANO水平较高(P＜0.001)。在患有CHF的人群中，在那些患上非致命性MI、中风或死亡的风险升高的人群中观察到TMANO的水平也升高了(中间值5.21对3.54，HR 1.22、1.09-1.35，p＝0.001)。发现其他三甲胺品种也出现了类似的结果。例如，胆碱升高就与CHF受试者中发生非致命性MI、中风或死亡有显著关联(11.8对10，HR 1.18、1.06-1.3，p＝0.004)。下面示出了仅针对CHF受试者血浆TMANO的中位数至上线和下限关系的卡普兰·梅尔(KM)存活图(在组内以中位数5.21为界)。通过血浆BNP的监测，在随后的分析也表明，血浆TMANO(r＝0.24，p＜0.001)和胆碱(r＝0.23，p＜0.001)与心肌拉伸与功能不全亚临床的亚临床指数具有最合适的关联性。

实施例8

本实施例提供的结果能证明预后和巴豆甜菜碱(包括顺式和反式异构体)、γ-丁基甜菜碱和肉碱在心血管病、中风、血管再生需要、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性代谢综合症(NASH)的诊断值。

让经历了心脏评定的受试者进行抽血，将血浆分离出来，并在进行分析前将其冷冻在-80℃下。在接下来的4年中对受试者中主要不良心血管事件的发展进行监测，包括心肌梗死(MI)、中风、血光再生需要或死亡。通过稳定同位素稀释法LC/MS/MS对血浆中指定的含三甲胺品种进行分析。图7所示为用于指示含三甲胺的分析物对死亡、非致命性MI或中风、或血管再生需要的复合风险的卡普兰·梅尔存活曲线(分为三分位数)。具体来说，图7A显示了巴豆甜菜碱的数据，图7B显示了γ-丁基甜菜碱的数据，图7C显示了肉碱的数据。

在另外的工作中，用D3-肉碱对小鼠进行灌胃，并且对随着时间在血浆中出现的D3-TMA和TMANO进行定量分析。如图8所示地，用广谱抗生素混合物对小鼠进行3周的预处理以抑制肠内菌群。发现TMA和TMANO都作为摄入的肉碱代谢物而产生，并且对肠内菌群的抑制能极大地降低它们的产率。通过稳定同位素稀释法LC/MS/MS对D3-肉碱、D3-TMA和D3-TMA的氘(D3)标记代谢物的血浆水平进行定量分析。通过管饲法给t＝0的小鼠喂食D3-肉碱。结果示于图8中，其中TMA的产率示于图8B中，TMANO的产率示于图8C中。

在进一步的工作中，用D3-肉碱对小鼠进行灌胃，并且对随着时间在血浆中出现的D3-巴豆甜菜碱和γ-丁基甜菜碱进行定量分析。如图9所示地，用广谱抗生素混合物对小鼠进行3周的预处理以抑制肠内菌群。发现这两种化合物都作为摄入的肉碱代谢物而产生，并且对肠内菌群的抑制能极大地降低它们的产率。对用D3-肉碱进行灌胃喂食后的指定时间时分离的血浆中的D3-巴豆甜菜碱和D3-γ-丁基甜菜碱用LC/MS/MS分析法进行定量分析。结果示于图9中，其中巴豆甜菜碱的产率示于图9A中，γ-丁基甜菜碱的产率示于图9B中。

在进一步的研究中，让经历了心脏评定的受试者进行抽血，将血浆分离出来，并在进行分析前将其冷冻在-80℃下。在接下来的4年中对受试者中主要不良心血管事件的发展进行监测，包括心肌梗死MI、中风、血光再生需要或死亡。通过稳定同位素稀释法LC/MS/MS对血浆中指定的含三甲胺品种进行分析。指定三甲胺品种的血浆水平与经历的复合终点为死亡、非致命性MI或中风或血管再生需要的相对风险和95％置信区间之间的关系列于表5中。还示出了各个分析物在多因素回归模型中的调整后的相对风险(95％置信区间)，其中已经对指定的传统心脏风险因子进行了调整。

表5：患者在4年期间经历的复合事件：死亡、MI、中风或血管再生的相对风险

在同一群组内，对用于预示患糖尿病的巴豆甜菜碱的预后值进行测定。具有较高(最高三分位数)的巴豆甜菜碱血浆水平的个体患有2型糖尿病的风险大大超过了具有最低三分位数血浆水平的受试者。即使在对多个风险因子，包括年龄、性别、总胆固醇、高血压、高血脂、冠心病、吸烟史和BMI(体质指数)进行调整后，该关联性仍然存在。这些结果列于表6中。

表6：最高三分位数对最低三分位数甜菜碱中糖尿病的疾病普及率的几率

在同一临床群组中，对空腹胰岛素和葡萄糖的血浆水平进行测量，并在葡萄糖/胰岛素比值的监测下测量巴豆甜菜碱血浆水平预示抗胰岛素性的能力。即使对多个风险因子进行多因素回归分析后，巴豆甜菜碱仍起到抗胰岛素性的有力且独立的预测因子。这些结果在表7中示出。

表7

巴豆甜菜碱预测抗胰岛素性的风险(葡萄糖/胰岛素比值)

在同一临床队列中，对空腹胰岛素和完全代谢小组(completemetabolic panel)进行测定，并在HOMA式的监测下测量巴豆甜菜碱血浆水平预示抗胰岛素性的能力。即使对多个风险因子进行多因素回归分析后，巴豆甜菜碱仍起到抗胰岛素性的有力且独立的预测因子。这些结果在表8中示出。

表8

巴豆甜菜碱预测抗胰岛素性的风险(HOMA)

在同一临床群组中，对空腹胰岛素和完全代谢小组(completemetabolic panel)进行测定，并在HOMA式的监测下测量巴豆甜菜碱血浆水平预示抗胰岛素性的能力。即使对多个风险因子进行多因素回归分析后，巴豆甜菜碱仍起到代谢综合症的有力且独立的预测因子。

在同一临床群组中，检查了巴豆甜菜碱的血浆水平预示受试者具有代谢综合征的可能性的能力。即使对多个风险因子进行多因素回归分析后，巴豆甜菜碱仍起到代谢综合症的有力且独立的预测因子。这些结果在表9中示出。

表9

巴豆甜菜碱预测抗胰岛素性的风险

对GeneBank队列(包括经历了选择性诊断性心导管检查术的序贯受试者)中的基于病例而被诊断为NAFLD或NASH的受试者(n＝50)进行鉴定，并将与他们的年龄和性别匹配但未有NAFLD或NASH病史的受试者作为对照组(n＝50)。通过稳定同位素稀释法LC/MS/MS分析来测定巴豆甜菜碱的空腹血浆水平。检查了巴豆甜菜碱空腹血浆水平预示受试者患有NAFLD或NASH的可能性的能力。即使对多个风险因子进行多因素回归分析后，巴豆甜菜碱仍起到NAFLD或NASH的有力且独立的预测因子。这些结果在表10中示出。

表10：巴豆甜菜碱预示非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和非酒精性脂肪肝炎(NASH)的风险

虽然仅对少数示例性实施方案进行了详细描述，但是本领域技术人员很容易理解：在不显著背离本公开的新教导和优势下，可对这些示例性实施方案作出多种更改。因此，这种更改和替换也包括在随附权利要求书所限定的本发明的范围内。本领域技术人员还应理解的是，这种更改和等价替换的构造或方法没有背离本公开的实质和范围，而且能在不背离本公开的实质和范围前提下对其作出各种改变、取代或替换。

Claims

1.一种鉴定受试者具有遭受动脉粥样硬化心血管病并发症风险的方法，该方法包括：

a)确定在获自受试者的生物学样品中的含三甲胺(TMA)化合物的水平，其中，所述含TMA化合物选自巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱或肉碱；和

b)将所述生物学样品中的所述含TMA化合物的水平与对照值相比；

其中，所述生物学样品中的所述含TMA化合物的水平相比于所述对照值得以提高的受试者具有遭受动脉粥样硬化心血管病并发症的风险。

2.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括当所述含TMA化合物的水平高于所述对照值时，将所述受试者遭受动脉粥样硬化心血管病并发症的风险表征为较高；当所述含TMA化合物的水平低于所述对照值时，将所述受试者遭受动脉粥样硬化心血管病并发症的风险表征为较低的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物学样品包括全血、血清、血浆、尿液、脑脊液或支气管肺泡灌洗液。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述并发症为以下中的一种或多种：非致命性心肌梗死、中风、心绞痛、短暂性脑缺血发作、充血性心力衰竭、主动脉瘤、主动脉夹层、和死亡。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述风险为在接下来的3年内遭受动脉粥样硬化心血管病并发症的风险。

6.一种表征受试者患有或患上心血管病风险的方法，该方法包括：

a)确定在来自受试者的生物学样品中的含三甲胺(TMA)化合物的水平，其中，所述含TMA化合物选自巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱或肉碱；和

其中，所述生物学样品中的所述含TMA化合物的水平相比于所述对照值得以提高的受试者具有患有或患上心血管病的风险。

7.根据权利要求6所述的方法，该方法还包括当所述含TMA化合物的水平高于所述对照值时，将所述受试者患有或患上心血管病的风险表征为较高；当所述含TMA化合物的水平低于所述对照值时，将所述受试者患有或患上心血管病的风险表征为较低的步骤。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述生物学样品包括全血、血清、血浆、尿液、脑脊液或支气管肺泡灌洗液。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述风险为在接下来的3年内患有或患上心血管病的风险。

10.一种评估心血管治疗剂对患有心血管病的受试者的效力的方法，该方法包括：

a)在施用所述治疗剂时或之后，确定在来自受试者的生物学样品中的含三甲胺(TMA)化合物的水平，其中，所述含TMA化合物选自巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱或肉碱；和

b)将所述生物学样品中的所述含TMA化合物的水平与预定值相比；

c)如果所述含TMA化合物的水平低于所述预定值，则确定所述治疗剂是有效的。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述生物学样品包括全血、血清、血浆、尿液、脑脊液或支气管肺泡灌洗液。

12.一种鉴定受试者是否患有或具有患上糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH风险的方法，该方法包括：

a)确定在来自受试者的生物学样品中的含三甲胺(TMA)化合物的水平；和

其中，所述生物学样品中的所述含TMA化合物的水平相比于所述对照值得以提高的受试者具有患有或患上糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险。

13.根据权利要求12所述的方法，该方法还包括当所述含TMA化合物的水平高于所述对照值时，将所述受试者患有或患上糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险表征为较高；当所述含TMA化合物的水平低于所述对照值时，将所述受试者患有或患上糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险表征为较低的步骤。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述含TMA化合物选自由巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱或肉碱所组成的组。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述生物学样品包括全血、血清、血浆、尿液、脑脊液或支气管肺泡灌洗液。

16.根据权利要求12所述的方法，其中，所述含TMA化合物选自由三甲胺N-氧化物、胆碱或甜菜碱所组成的组。

17.根据权利要求12所述的方法，其中，所述风险为在接下来的3年内患上糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的风险。

18.一种评估治疗剂对患有糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH的受试者的效力的方法，该方法包括：

a)在施用所述治疗剂时或之后，确定在来自受试者的生物学样品中的含三甲胺(TMA)化合物的水平；

b)比较所述生物学样品中的所述含TMA化合物的水平；

c)如果所述含TMA化合物的水平低于所述预定值，则确定所述治疗剂在治疗糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH方面是有效的。

19.一种治疗病况、或预防患上病况的方法，该方法包括：向受试者施用益生菌和抗生素以使肉碱在所述受试者中形成的三甲胺、TMANO、巴豆甜菜碱和/或γ-丁基甜菜碱减少，从而至少能部分地治疗选自由心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH所组成的组中的病况或预防患上此类病况。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，在7天或更少的短疗程内向受试者施用所述抗生素。

21.根据权利要求19所述的方法，其中，所述抗生素为选自由灭滴灵、环丙沙星和新霉素、阿莫西林所组成的组中的一种抗生素或抗生素的组合。

22.根据权利要求19所述的方法，其中，所述受试者未患有臭鱼症。

23.一种治疗病况、或预防患上病况的方法，该方法包括：向受试者施用抗生素以使肉碱在所述受试者中形成的三甲胺、TMANO、巴豆甜菜碱和/或γ-丁基甜菜碱减少，从而至少能部分地治疗选自由心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH所组成的组中的病况或预防患上此类病况。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述在7天或更少的短疗程内向受试者施用所述抗生素。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述抗生素为选自由灭滴灵、环丙沙星和新霉素、阿莫西林所组成的组中的一种抗生素或抗生素的组合。

26.根据权利要求23所述的方法，其中，所述受试者未患有臭鱼症。

27.一种筛选候选抑制剂的方法，该方法包括：

a)将i)含三甲胺(TMA)化合物，ii)能够裂解所述含TMA化合物从而形成三甲胺的肠内菌群，和iii)候选抑制剂进行组合；和

b)通过检测形成的所述三甲胺水平来确定所述候选抑制剂在抑制所述三甲胺形成方面的能力。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述含TMA化合物选自由胆碱、肉碱、甜菜碱、磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、甘油磷酸胆碱、巴豆甜菜碱和γ-丁基甜菜碱所组成的组。

29.根据权利要求27所述的方法，其中，从盲肠匀浆、盲肠洗涤废水或粪便中获得所述肠内菌群。

30.根据权利要求27所述的方法，其中，通过质谱法或HPLC对形成的所述三甲胺的水平进行所述检测。

31.根据权利要求27所述的方法，其中，以能被检测到的方式对所述含TMA化合物进行标记。

32.根据权利要求27所述的方法，其中，所述候选抑制剂包括抗生素。

33.一种治疗病况、或预防患上病况的方法，该方法包括：向受试者施用抑制剂以使肉碱在受试者中形成的三甲胺、TMANO、巴豆甜菜碱和/或γ-丁基甜菜碱减少，从而至少能部分地治疗选自由心血管病、糖尿病、抗胰岛素性、代谢综合症、NAFLD或NASH所组成的组中的病况或预防患上此类病况。

34.根据权利要求34所述的方法，其中，所述TMA形成抑制剂选自由新霉素、阿莫西林、灭滴灵、活性炭或叶绿酸铜所组成的组。

35.一种鉴定受试者具有遭受主动脉夹层风险的方法，该方法包括：用分析设备确定在获自受试者的生物学样品中的含三甲胺化合物的水平；将生物学样品中的含三甲胺化合物的水平与对照值相比；和当含三甲胺化合物的水平高于对照值时，将受试者遭受主动脉夹层的风险表征为较高；当所述含三甲胺化合物的水平低于对照值时，将所述受试者遭受主动脉夹层的风险表征为较低。

36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述含三甲胺化合物为三甲胺N-氧化物、胆碱、甜菜碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱或肉碱。