CN113138234B - 一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒 - Google Patents

一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113138234B
CN113138234B CN202010052181.8A CN202010052181A CN113138234B CN 113138234 B CN113138234 B CN 113138234B CN 202010052181 A CN202010052181 A CN 202010052181A CN 113138234 B CN113138234 B CN 113138234B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mobile phase
carnitine
betaine
trimethylamine
mass
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010052181.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113138234A (zh
Inventor
詹红
铃木亨
霍志远
孔志霞
蔡洪玉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Maishi Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Maishi Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Maishi Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Maishi Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010052181.8A priority Critical patent/CN113138234B/zh
Publication of CN113138234A publication Critical patent/CN113138234A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113138234B publication Critical patent/CN113138234B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
    • G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
    • G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
    • G01N30/72—Mass spectrometers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/89—Inverse chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/045—Standards internal
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N30/06—Preparation
    • G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
    • G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
    • G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
    • G01N2030/8822—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials involving blood

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明首次提供一种一次性检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒，由对照品、质控品、同位素内标提取液、增强剂、提取溶剂、流动相添加剂A、流动相添加剂B、96孔反应板、96孔过滤板、说明书组成。本试剂盒可以同时检测乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ‑丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺，用时较短，提高了检测的效率。

Description

一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒
技术领域
本发明属于检测领域，具体涉及一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒。
背景技术
心血管疾病目前是中国城乡居民死亡原因的首位，高于肿瘤和其他疾病。最新发布的《中国心血管病报告2018》数据表明：中国心血管病患病率及死亡率仍处于持续上升阶段，推算全国有心血管病患者2.9亿，其中脑卒中1300万，冠心病1100万，肺心病500万，心力衰竭45万，风心病250万，高血压2.7亿。中国30％的人口存在≥3个心血管危险因素，即近4亿人口同时存在≥3个心血管危险因素。我国心血管病防治工作已取得初步成效但仍面临严峻挑战。总体上看，中国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段。心血管病死亡占城乡居民疾病死亡构成的40％以上，居首位，高于肿瘤及其他疾病。心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题，在政府发布的《中国慢性病防治工作规划》中就明确指出：慢病防治最关键的部分就在于提高疾病的风险预测，即做到早发现、早治疗。
氧化三甲胺(TMAO)是由肠道细菌消化红肉、鸡蛋、乳制品、咸水鱼后，再经过肝脏加工产生的一种极性小分子化合物。随着肠道菌群研究的深入，科学家们发现TMAO与心血管疾病、脑卒中、糖尿病、慢性肾病、癌症等多种疾病密切相关，因此TMAO越来越受到广泛关注。TMAO是一个新型的预测心脑血管及代谢疾病风险的生物标记物，能很好的独立预测心脑血管及代谢疾病的风险。近年来，科学家们陆续发现TMAO相关的最初代谢物和其他中间前体也显示是心脑血管及代谢疾病风险的标志。
然而，目前的检测方法虽然也用液质联用仪方法，但只能检测其中一个或少量几个指标，不能一次性联检全部指标。
因此，本领域迫切需要开放一种分析时间短、灵敏、准确且能够同时定量检测多种肠道微生物代谢物(例如例如乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺)的检测试剂盒及检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种分析时间短、灵敏、准确且能够同时定量检测多种肠道微生物代谢物(例如乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺)的检测试剂盒及检测方法。
在本发明的第一方面，提供了一种高效液相色谱质谱联用法检测试剂盒，包括：
(1)质控品，所述质控品含乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺；
(2)同位素内标提取液，所述同位素内标提取液含有乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10和氧化三甲胺-D9甲醇；
(3)增强剂，所述增强剂包括组分(a)溴乙酸叔丁酯和乙腈；和组分(b)碳酸钠；
(4)提取溶剂，所述提取溶剂包括组分(i)乙腈和组分(ii)乙酸；
(5)流动相添加剂A，所述流动相添加剂A包括甲酸；以及
(6)流动相添加剂B，所述流动相添加剂B包括氨水。
在另一优选例中，同位素内标提取液中，乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10和氧化三甲胺-D9甲醇的浓度相同。
在另一优选例中，在所述增强剂的所述组分(a)中，溴乙酸叔丁酯的浓度为25-45mmol/L。
在另一优选例中，在所述增强剂的所述组分(b)中，碳酸钠的浓度为0.1-0.5mol/L，较佳地，0.2-0.4mol/L。
在另一优选例中，所述提取溶剂中，所述组分(ii)的体积比(v/v)为1.0-3.0％，较佳地1.5-2.5％。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括选自下组的部件：
96孔反应板、说明书。
在另一优选例中，所述检测试剂盒还包括(7)对照品，所述对照品含乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐和三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
本发明第二方面提供了一种通过高效液相色谱质谱联用法测定所取的生物样品中一种或多种肠道微生物代谢物的量的方法，包括：
(i)通过电喷雾离子源(ESI)对所述一种或多种肠道微生物代谢物和内标进行电离，分别产生所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的至少一种前体离子；
(ii)分别产生所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的所述前体离子的一种或多种碎片离子；和
(iii)比较步骤(i)或(ii)或两者中产生的所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的一种或多种所述离子的量以确定所述生物样品中的所述一种或多种肠道微生物代谢物的量；
其中，色谱检测过程中的流动相中加入甲酸和氨水。
在另一优选例中，所述质谱为串联质谱。
在另一优选例中，所述一种或多种肠道微生物代谢物包括乙酰左旋肉碱，且其中所述乙酰左旋肉碱的所述母离子的质/荷比为204.00＞85.10；和/或
所述一种或多种肠道微生物代谢物包括甜菜碱醛，且其中所述甜菜碱醛的所述母离子的质/荷比为101.95＞58.10；和/或
所述一种或多种肠道微生物代谢物包括甜菜碱，且其中所述甜菜碱的所述母离子的质/荷比为118.10＞58.10；和/或
所述一种或多种肠道微生物代谢物包括氯化胆碱，且其中所述氯化胆碱的所述母离子的质/荷比为104.15＞58.10；和/或
所述一种或多种肠道微生物代谢物包括盐酸巴豆甜菜碱，且其中所述盐酸巴豆甜菜碱的所述母离子的质/荷比为144.00＞58.10；和/或
所述一种或多种肠道微生物代谢物包括γ-丁基甜菜碱，且其中所述γ-丁基甜菜碱的所述母离子的质/荷比为146.00＞87.05；和/或
所述一种或多种肠道微生物代谢物包括左旋肉碱，且其中所述左旋肉碱的所述母离子的质/荷比为162.10＞60.10；和/或
所述一种或多种肠道微生物代谢物包括三甲胺盐酸盐，且其中所述三甲胺盐酸盐的所述母离子的质/荷比为174.10＞59.10；和/或
所述一种或多种肠道微生物代谢物包括三甲基赖氨酸，且其中所述三甲基赖氨酸的所述母离子的质/荷比为189.20＞84.10；和/或
所述一种或多种肠道微生物代谢物包括氧化三甲胺，且其中所述氧化三甲胺的所述母离子的质/荷比为76.15＞58.15。
在另一优选例中，所述方法还包括：在通过电喷雾离子源(ESI)对所述一种或多种肠道微生物代谢物和内标进行电离前，用溴乙酸叔丁酯和碳酸钠对一种或多种肠道微生物代谢物和内标进行衍生处理。
在另一优选例中，色谱检测过程中，所述液相色谱具有下述一个或多色谱条件：
(i)流动相包括流动相A和流动相B；
其中，流动相A为含流动相添加剂A和流动相添加剂B的水；流动相B为含流动相添加剂A的乙腈；
(ii)色谱柱柱温为25-50℃，较佳地35-45℃；
(iii)进样室温度为2-20℃，较佳地5-15℃；
(iv)流速为0.1-1.5mL/min，较佳地0.2-1.0mL/min，更佳地0.3-0.8mL/min，最佳地0.4-0.6mL/min。
在另一优选例中，色谱检测过程中，梯度为：
0-1.5min：流动相B为80-99％，其余为流动相A；
1.5-2.5min：流动相B为35-90％，其余为流动相A；
2.5-3.5min：流动相B为35-99％，其余为流动相A；
3.5-5.0min：流动相B为92-99％，其余为流动相A。
在另一优选例中，所述流动相添加剂A为甲酸；所述流动相添加剂B为氨水。
在另一优选例中，流动相A中，流动相添加剂A的体积比(v/v)为0.05-0.4％，以流动相A的总体积计。
在另一优选例中，流动相A中，流动相添加剂B的体积比(v/v)为0.01-0.1％，以流动相A的总体积计。
在另一优选例中，所述的流动相B包括0.05-0.4％(v/v)的甲酸乙腈。
在另一优选例中，流动相A中，流动相添加剂A：流动相添加剂B：水的体积比为(0.05-0.2％)：(0.03-0.1％)：100％；较佳地，(0.08-0.12％)：(0.05-0.07％)：100％。
在另一优选例中，所述的反相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC。
在另一优选例中，所述的反相色谱柱的规格为(1.8-2.5)×(40-200)mm，1.5-2.3μM)。典型地，所述的反相色谱柱的规格为(2.1×100mm，1.7μM)。
代表性的，所述的反相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1×100mm，1.7μM)。保护预柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC VanGuard pre-column(1.7μM，2.1×5mm)。
在另一优选例中，所述的生物样品选自下组：血液、血清、血浆、或其组合，优选地，所述的生物样品为外周全血。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为实施例1得到的乙酰左旋肉碱标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:乙酰左旋肉碱，m/z:204.00>85.10，标准曲线公式:f(x)＝5.62294*x+0.0445346，相关系数(R)＝0.9976663，拟合度(R^2)＝0.9953381。
图2为实施例1得到的甜菜碱醛标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:甜菜碱醛，m/z:101.95>58.10，标准曲线公式:f(x)＝0.376097*x-0.298077，相关系数(R)＝0.9996012，拟合度(R^2)＝0.9992025。
图3为实施例1得到的甜菜碱标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:甜菜碱，m/z:118.10>85.10，标准曲线公式:f(x)＝1.05870*x+0.509209，相关系数(R)＝0.9989848，拟合度(R^2)＝0.9979705。
图4为实施例1得到的氯化胆碱标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:氯化胆碱，m/z:104.15>85.10，标准曲线公式:f(x)＝0.242195*x+0.0812191，相关系数(R)＝0.9980620，拟合度(R^2)＝0.9961277。
图5为实施例1得到的巴豆甜菜碱标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:巴豆甜菜碱，m/z:144.00>85.10，标准曲线公式:f(x)＝1.67834*x+0.0610866，相关系数(R)＝0.9990792，拟合度(R^2)＝0.9981593。
图6为实施例1得到的γ-丁基甜菜碱标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:γ-丁基甜菜碱，m/z:146.00>87.05，标准曲线公式:f(x)＝1.33656*x+0.0880738，相关系数(R)＝0.9993898，拟合度(R^2)＝0.9987800。
图7为实施例1得到的左旋肉碱标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:左旋肉碱，m/z:162.10>60.10，标准曲线公式:f(x)＝0.660252*x+0.764883，相关系数(R)＝0.9978426，拟合度(R^2)＝0.9956899。
图8为实施例1得到的三甲胺标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:三甲胺，m/z:174.10>59.10，标准曲线公式:f(x)＝0.750847*x+0.106649，相关系数(R)＝0.9959083，拟合度(R^2)＝0.9918333。
图9为实施例1得到的三甲基赖氨酸标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:三甲基赖氨酸，m/z:189.20>84.10，标准曲线公式:f(x)＝0.267728*x+0.0146602，相关系数(R)＝0.9968940，拟合度(R^2)＝0.9937977。
图10为实施例1得到的氧化三甲胺标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:氧化三甲胺，m/z:76.15>58.15，标准曲线公式:f(x)＝0.423274*x+0.703103，相关系数(R)＝0.9991637，拟合度(R^2)＝0.9983280。
图11为实施例1中待测血浆样本的以上肠道菌群代谢物的液质色谱图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究。通过大量筛选，例如对于增强剂、提取溶剂等的筛选，首次开发了一种能够在一次检测中同时对乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺这多种肠道菌群代谢物进行定量检测的高效液相色谱质谱联用检测方法。该方法首次一次性可检测多种肠道菌群代谢物指标，分析时间短、检测结果灵敏度高、准确，且结果重现率高。此外，本发明还能够快速和准确测定分析血浆中以上心血管风险标记物的含量，从而为心脑血管及代谢疾病的预测提供支持。在此基础上，本发明人完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“液-质联用”为高效液相-质谱联用的简称，即“液-质联用”与“高效液相-质谱联用”可互换使用。
如本文所用，术语“氧化三甲胺”简称TMAO，即“氧化三甲胺”与“TMAO”可互换使用。
如本文所用，术语“乙酰左旋肉碱”简称ALC，即“乙酰左旋肉碱”与“ALC”可互换使用。
如本文所用，术语“超高效液相色谱”简称UPLC，即“超高效液相色谱”与“UPLC”可互换使用。
在本发明中，应当理解的是，所述的流动相流速为流动相A和流动相B的流速之和。
如本文所用，术语“乙酰左旋肉碱-D3”和与“ALC-D3”可互换使用，是指乙酰左旋肉碱中H被同位素氘所取代后形成的氘代物，在本发明中，它可被用作乙酰左旋肉碱质谱检测的内标。
如本文所用，术语“三甲胺-D10”与“TMA-D10”可互换使用，在本发明中，它被用作三甲胺质谱检测的内标。
如本文所用，术语“氧化三甲胺-D9甲醇”与“TMAO-D9”可互换使用，在本发明中，它被用作氧化三甲胺和三甲基赖氨酸质谱检测的内标。
如本文所用，术语“甜菜碱-D11”是甜菜碱、甜菜碱醛、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱的内标。
如本文所用，术语“氯化胆碱-D9”是氯化胆碱的内标。
如本文所用，术语“左旋肉碱-D9”是左旋肉碱的内标。如本文所用，术语“前体离子”和“母离子”可以互换使用，是指可进一步发生分解反应产生碎片离子的离子。
如本文所用，术语“碎片离子”和“子离子”可以互换使用，是指由分子离子或较大碎片离子的单分子裂解反应产生的。
如本文所用，术语“流动相A”、“A相”或“水流动相”可以互换使用是指液相条件中按0.05-0.4％(v/v)甲酸和0.01-0.1％(v/v)氨水的比例分别将流动相添加剂A、流动相添加剂B加入到超纯水后得到的流动相A。
如本文所用，术语“流动相B”、“B相”或“有机流动相”可以互换使用是指液相条件中，所述的流动相B包括0.05-0.4％(v/v)的甲酸乙腈。
如本文所用，“液相层析”(LC)是指当流体均一地通过细微分开的物质的柱或者通过毛细管道过滤时流体溶液的一种或多种组分选择性延迟的方法延迟是由于当该流体相对于固定相(或多个)移动时混合物的组分在一个或多个固定相和本体流体(bulk fluid)(即流动相)之间的分布“液相层析”包括反相液相层析(RPLC)、高效液相层析(HPLC)和高湍流液相层析(HTLC)。
如本文所用，术语“HPLC”或“高效液相层析”是指这样的液相层析，其中分离程度是通过使流动相在压力下穿过固定相通常为紧密填充柱而增加的。
如本文所用，“质谱法”(MS)是指通过它们的质量鉴定化合物的分析技术MS技术一般包括(1)使化合物电离以形成带电化合物；和(2)检测带电化合物的分子量并计算质荷比(m/z)化合物可通过任何合适的方式电离并检测“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。
术语“电子电离”如本文所用是指这样的方法，其中气态或蒸汽相中的感兴趣分析物与电子流相互作用电子与分析物的相互作用产生分析物离子，其然后可用于质谱法技术。
术语“化学电离”如本文所用是指这样的方法，其中试剂气体(例如氨)用于电子碰撞，并且分析物离子通过试剂气体离子与分析物分子相互作用而形成。
术语“电离”如本文所用是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程负离子是具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而正离子是具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。
术语“大约”如本文所用在提及定量测量时是指所示值加上或减去10％。
试剂盒
本发明提供了一种乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺多种肠道菌群代谢物液相色谱质谱联用法(即液质联用法)检测试剂盒，该检测试剂盒包括质控品、同位素内标提取液、增强剂、提取溶剂、流动相添加剂A、流动相添加剂B。优选地，所述检测试剂盒还包括对照品、96孔反应板、96孔过滤板、说明书等。本发明的试剂盒可用于检测乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺这多种肠道菌群代谢物，具体地，可用于检测同时检测乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺多种肠道菌群代谢物的含量。
具体地，在本发明的试剂盒中，对照品和/或质控品含有乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺，同位素内标提取液中含有乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10和氧化三甲胺-D9甲醇，增强剂包括组分(a)溴乙酸叔丁酯和乙腈和组分(b)碳酸钠，提取溶剂包括组分(i)乙腈和组分(ii)乙酸，流动相添加剂A为甲酸，流动相添加剂B为氨水。本试剂盒保存于2～8℃。
在一优选实施方式中，本发明的试剂盒包括本发明所述的用于通过液质联用首次检测血样中乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺的增强剂，包括(i)组分A，所述的组分A为溴乙酸叔丁酯的乙腈溶液，溴乙酸叔丁酯的浓度为25mmol/L～45mmol/L；溴乙酸叔丁酯(ii)组分B，所述的组分B为碳酸钠水溶液；浓度比例为0.1mol/L～0.5mol/L。此外，该检测方法和试剂盒中的提取溶剂包括：(i)组分A，所述的组分A为乙腈；(ii)组分B，所述的组分B为乙酸；所述的组分B体积比(v/v)为1.0-3.0％。在一个优选例中，所述的检测试剂盒还包括乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺标准品和/或内标品。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒包括：
(1)混合标准品溶液，所述的乙酰左旋肉碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、三甲胺盐酸盐和三甲基赖氨酸这五种物质标准曲线的浓度为0.2、1、4、10、20、40、100μmol/L；所述的氧化三甲胺、甜菜碱、氯化胆碱、左旋肉碱这四种物质标准曲线的浓度为0.1、0.5、2、5、10、20、50μmol/L；所述的甜菜碱醛标准曲线的浓度为0.2、1.0、4、10、20、40、100μmol/L；以上混标溶液的配制基质为50％甲醇水溶液；
(2)内标溶液，所述的内标溶液为5-15μM(优选为10μM)的乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10、氧化三甲胺-D9甲醇混合溶液；
(3)增强剂；
(4)提取溶剂；
(5)质控品I和质控品II，所述的质控品I和质控品II通过以下方法制备：
取适量Seralab碳吸附空白人血浆，加入少量混合标准品的浓度最高点溶液，分别配制质控I和质控II；
(6)流动相A；
(7)流动相B；
检测方法
本发明还提供了一种检测方法，用于检测以乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺为代表的多种肠道微生物代谢物。
通常，本发明方法包括步骤：
(i)通过电喷雾离子源(ESI)对所述一种或多种肠道微生物代谢物和内标进行电离，分别产生所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的至少一种前体离子；
(ii)分别产生所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的所述前体离子的一种或多种碎片离子；和
(iii)比较步骤(i)或(ii)或两者中产生的所述一种或多种肠道微生物代谢物和所述内标的一种或多种所述离子的量以确定所述生物样品中的所述一种或多种肠道微生物代谢物的量；
其中，色谱检测过程中的流动相中甲酸和氨水。
本发明方法特别适合检测乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
在一优选实施方式中，本发明的检测方法包括如下步骤：
(1)将本发明所述的标准品、内标品、增强剂和提取溶剂加入到质控品和待测血样中，经充分反应后，取上清液，通过高效液相-质谱联用测定分析待测血样中以上肠道菌群代谢物的含量。
在一个优选例中，所述的高效液相的色谱条件为：
色谱柱：反相色谱柱；和
流动相：流动相A和流动相B，所述的流动相A包括0.05-0.4％(v/v)甲酸和0.01-0.1％(v/v)氨水的水溶液，以流动相A的总体积计算；所述的流动相B包括0.05-0.4％(v/v)的甲酸乙腈，以流动相B的总体积计算；
流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为
在另一优选例中，另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：
在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：
在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：
在另一优选例中，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：
色谱柱温度：25-50℃，较佳地35-45℃；
进样室温度：2-20℃，较佳地5-15℃；
流动相(流动相A+流动相B)流速：0.1-1.5mL/min，较佳地0.2-1.0mL/min，更佳地0.3-0.8mL/min，最佳地0.4-0.6mL/min；
在另一优选例中，所述的反相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC。
在另一优选例中，所述的反相色谱柱的规格为(1.8-2.5)×(40-200)mm，1.5-2.3μM)。典型地，所述的反相色谱柱的规格为(2.1×100mm，1.7μM)。
代表性的，所述的反相色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1×100mm，1.7μM)。保护预柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC VanGuard pre-column(1.7μM，2.1×5mm)。
在另一优选例中，所述的流动相A包括0.05-0.2％(v/v)甲酸和0.03-0.1％(v/v)氨水的水溶液，以流动相A的总体积计算。
在另一优选例中，所述的流动相A包括0.08-0.12％(v/v)甲酸和0.05-0.7％(v/v)氨水的水溶液，以流动相A的总体积计算。
在另一优选例中，所述的流动相B包括0.05-0.4％(v/v)的甲酸乙腈，以流动相B的总体积计算。
在另一优选例中，所述的流动相B包括0.07-0.25％(v/v)的甲酸乙腈，以流动相B的总体积计算。
在另一优选例中，所述的流动相B包括0.09-0.15％(v/v)的甲酸乙腈，以流动相B的总体积计算。
在本发明所述的体外非治疗性和非诊断性检测血样中多种肠道微生物代谢物的分析方法及试剂盒的方法中，所述的血样(包括但不限于)：血液、血清、血浆，或其组合。
优选地，所述的血液为外周全血。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明首次提供一种用于液相色谱串联质谱法一次性检测血样中乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺的多种肠道菌群代谢物检测方法和试剂盒。此外，使用该检测方法和试剂盒包括的增强剂和提取溶剂对血浆进行前处理，既能很好提高三甲胺的检测灵敏度，又能获得很好的联检效果。
(b)本发明所述增强剂和提取溶剂对待测血样中进行处理后，上清液可直接进样于液质联用仪，操作简单，适于大规模推广应用。
(c)经过大量筛选，例如对于增强剂、提取溶剂等的筛选，首次开发了一种能够在一次检测中同时对乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺多种肠道菌群代谢物进行定量检测的高效液相色谱质谱联用检测方法。且该检测方法分析时间短、检测结果灵敏度高、准确，且结果重现率高。此外本发明还能够快速和准确测定分析血浆中以上心血管风险标记物的含量，从而为心脑血管及代谢疾病的预测提供支持。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1
1、主要仪器与设备：
岛津LC-MS 8050；LabSolutions Insight软件。
2、试剂与材料：
乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺标准品、乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10、氧化三甲胺-D9内标品、甲醇、乙腈、乙醇、甲酸、氨水、碳酸钠、碳吸附人血浆皆为市售试剂。
3、液相色谱和质谱分析条件：
色谱条件：
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC(1.7μM，2.1×100mm)；
保护预柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC VanGuard pre-column(1.7μM，2.1×5mm)；
流动相A：0.1％(v/v)甲酸(A)+0.025％(v/v)氨水(B)的水溶液；流动相B：0.1％(v/v)甲酸(A)的乙腈溶液；以流动相B的总体积计；流速0.6mL/min：柱温45℃：进样室温度：8℃；进样量1μL；洗针液：50％甲醇水。
流动相梯度方法：
质谱条件：
采用电喷雾离子源(ESI)，正离子MRM模式检测；
化合物 监测离子 Q1 Pre偏差 碰撞能 Q3 Pre偏差
乙酰左旋肉碱 204.00＞85.10 -14V -22.0eV -22V
甜菜碱醛 101.95＞58.10 -20V -23.0eV -21V
甜菜碱 118.10＞58.10 -12V -25.0eV -21V
氯化胆碱 104.15＞58.10 -11V -31.0eV -10V
巴豆甜菜碱 144.00＞58.10 -10V -25.0eV -10V
γ-丁基甜菜碱 146.00＞87.05 -10V -17.0eV -16V
左旋肉碱 162.10＞60.10 -11V -17.0eV -10V
三甲胺 174.10＞59.10 -11V -28.0eV -10V
三甲基赖氨酸 189.20＞84.10 -13V -22.0eV -15V
氧化三甲胺 76.15＞58.15 -12V -22.0eV -10V
乙酰左旋肉碱-D3 207.15＞85.05 -10V -22.0eV -14V
甜菜碱-D11 129.10＞66.15 -14V -30.0eV -11V
氯化胆碱-D9 113.05＞66.30 -22V -32.0eV -25V
左旋肉碱-D9 171.20＞69.20 -12V -19.0eV -12V
TMAO-D9 85.15＞66.20 -10V -24.0eV -12V
三甲胺-D10 183.15＞66.15 -12V -41.0eV -12V
雾化气流量3L/min，加热气流量10L/min；干燥气流量10L/min；接口温度：300℃；DL温度：300℃；加热块温度：400℃；
4、实验过程：
4-1溶液配制
4-1-1混合标准曲线溶液配制：
精密称取乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺标准品适量，用50％甲醇水溶液溶解后分别配制成浓度为5mmol/L的标准品储备液。再用50％甲醇水溶液将浓度为5mmol/L的标准品储备液依次稀释为以下标准曲线工作溶液。
混合标准品溶液，所述的乙酰左旋肉碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、三甲胺盐酸盐和三甲基赖氨酸这五种物质标准曲线的浓度为0.2、1、4、10、20、40、100μmol/L；所述的氧化三甲胺、甜菜碱、氯化胆碱、左旋肉碱这四种物质标准曲线的浓度为0.1、0.5、2、5、10、20、50μmol/L；所述的甜菜碱醛标准曲线的浓度为0.2、1.0、4、10、20、40、100μmol/L；以上混标溶液的配制基质为50％甲醇水溶液；
4-1-2混合内标溶液配制：
精密称取乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10、氧化三甲胺-D9适量，用甲醇溶解得到1mmol/L混合内标储存溶液，再用甲醇稀释到10μmol/L的混合内标工作溶液。
4-1-3提取溶剂
所述的提取溶剂的成分为乙腈和乙酸，且乙酸的体积比为2.0％。
4-2质控品I和质控品II的配制：
取适量Seralab碳吸附空白人血浆，加入少量混合标准品的浓度最高点溶液，分别配制质控I和质控II。
4-3血浆样本的前处理及进样分析：
分别将混合标准品工作液、质控品I、质控品II和待测血浆样本各25μL加入到96孔板的不同孔中，然后向每个孔中依次加入20μL的混合内标、50μL溴乙酸叔丁酯(35mM)和25uL的碳酸钠溶液(0.3M)，在常温下孵育振荡20min，再加入400μL乙酸乙腈溶液(乙酸浓度为2％)，涡旋1min，4000rpm离心5min，取上清液120μL，分别进样1μL到液质联用仪，测定分析待测血浆样本中肠道菌群代谢物各代谢物的含量(单位为μM)。其中，以上化合物的标准回归曲线如图1-图10所示，待测血浆样本的以上10种代谢物的液质色谱图为图11所示。
实施例2
实施例2通过选用增强剂组分B中碳酸钠溶液的不同浓度，再次验证由溴乙酸叔丁酯和碳酸钠溶液组成的增强剂对质控I、质控II及样本进行前处理的影响。表1、表2、表3结果表明，增强剂中碳酸钠溶液不同浓度对质控I、质控II及样本中乙酰左旋肉碱、氧化三甲胺、三甲胺的检测结果有影响，对甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲基赖氨酸这7个指标没有影响。
表1实施例2中的碳酸钠水溶液的不同浓度对质控I的检测影响(单位：uM)
表2实施例2中的碳酸钠水溶液的不同浓度对质控II的检测影响(单位：uM)
表3实施例2中的碳酸钠水溶液的不同浓度对样本的检测影响(单位：uM)
在通过液质联用测定血浆样品肠道微生物代谢物的含量中，实施例2中采用不同浓度的碳酸钠水溶液对质控I、质控II及血浆样本进行前处理。从表1中可见，当碳酸钠水溶液的浓度为0.1M-0.5M时，乙酰左旋肉碱、氧化三甲胺和三甲胺的含量没有失控，在正常范围内；当碳酸钠水溶液的浓度小于0.1M或者大于0.5M时，乙酰左旋肉碱、氧化三甲胺和三甲胺的含量失控；当碳酸钠水溶液的浓度为0.2M-0.4M时，乙酰左旋肉碱、氧化三甲胺和三甲胺的含量更接近于靶值，效果更优。以上说明，增强剂组分B的碳酸钠水溶液浓度范围对乙酰左旋肉碱、氧化三甲胺和三甲胺的检测结果影响很大。碳酸钠水溶液浓度的合理范围为0.1M-0.5M，较佳地0.2M-0.4M。
实施例3
实施例3通过选用提取溶剂乙腈乙酸中乙酸的不同浓度，再次验证由乙腈和乙酸组成的提取溶剂对质控I、质控II及血浆样本前处理的影响。如下表4、表5、表6所示，提取溶剂中乙酸的不同浓度对质控I、质控II及血浆样本中巴豆甜菜碱、氧化三甲胺、三甲胺的检测结果有影响，对甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲基赖氨酸这些指标没有影响。
表4实施例3中乙腈乙酸中乙酸的不同浓度对质控I的检测影响(单位：uM)
表5实施例3中乙腈乙酸中乙酸的不同浓度对质控II的检测影响(单位：uM)
表6实施例3中乙腈乙酸中乙酸的不同浓度对样本的检测影响(单位：uM)
实施例3中采用提取溶剂乙腈乙酸中乙酸的不同浓度对质控I、质控II及血浆样本进行前处理。从表4、表5、表6中可见，当乙酸的浓度为1.0％-3.0％时，巴豆甜菜碱、氧化三甲胺和三甲胺的含量没有失控，在正常范围内；当乙酸的浓度小于1.0％或者大于3.0％时，巴豆甜菜碱、氧化三甲胺和三甲胺的含量失控；当乙酸的浓度为1.5％-2.5％时，巴豆甜菜碱、氧化三甲胺和三甲胺的含量更接近于靶值，效果更优。以上说明，提取溶剂乙腈乙酸中乙酸的不同浓度对巴豆甜菜碱、氧化三甲胺和三甲胺的检测结果影响很大。提取溶剂乙腈乙酸中乙酸的合理浓度为1.0％-3.0％，较佳地1.5％-2.5％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种通过高效液相色谱质谱联用法同时定量检测生物样品中10种肠道微生物代谢物的方法，所述肠道微生物代谢物包括乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺，其特征在于，包括：
(i)通过电喷雾离子源(ESI)对所述肠道微生物代谢物和内标进行电离，分别产生所述肠道微生物代谢物和所述内标的前体离子；
(ii)分别产生所述肠道微生物代谢物和所述内标的所述前体离子的碎片离子；和
(iii)比较步骤(i)或(ii)或两者中产生的所述肠道微生物代谢物和所述内标的所述离子的量以确定所述生物样品中的所述肠道微生物代谢物的量；
并且所述方法还包括：在通过电喷雾离子源(ESI)对所述肠道微生物代谢物和内标进行电离前，用溴乙酸叔丁酯和碳酸钠对肠道微生物代谢物和内标进行衍生处理，并用提取溶剂处理；所述碳酸钠的浓度为0.1-0.5mol/L，所述提取溶剂包括组分(i) 乙腈和组分(ii) 乙酸，所述组分(ii)的体积比（v/v）为1.0-3.0％；
并且，色谱检测过程中，所述液相色谱具有以下色谱条件：
(i)流动相包括流动相A和流动相B；
其中，流动相A为含流动相添加剂A和流动相添加剂B的水；流动相B为含流动相添加剂A的乙腈，流动相添加剂A为甲酸；所述流动相添加剂B为氨水；
(ii)色谱柱柱温为25-50℃，所述的色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC；
(iii) 进样室温度为2-20℃；
(iv)流速为0.1-1.5mL/min；
并且色谱检测过程中，梯度为：
0-1.5 min：流动相B为80-99%，其余为流动相A；
1.5-2.5min：流动相B为35-90%，其余为流动相A；
2.5-3.5min：流动相B为35-99%，其余为流动相A；
3.5-5.0min：流动相B为92-99%，其余为流动相A。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱为串联质谱。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙酰左旋肉碱的母离子的质/荷比为204.00＞85.10；和/或
所述甜菜碱醛的母离子的质/荷比为101.95＞58.10；和/或
所述甜菜碱的母离子的质/荷比为118.10＞58.10；和/或
所述氯化胆碱的母离子的质/荷比为104.15＞58.10；和/或
所述盐酸巴豆甜菜碱的母离子的质/荷比为144.00＞58.10；和/或
所述γ-丁基甜菜碱的母离子的质/荷比为146.00＞87.05；和/或
所述左旋肉碱的母离子的质/荷比为162.10＞60.10；和/或
所述三甲胺盐酸盐的母离子的质/荷比为174.10＞59.10；和/或
所述三甲基赖氨酸的母离子的质/荷比为189.20＞84.10；和/或
所述氧化三甲胺的母离子的质/荷比为76.15＞58.15。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相A中，流动相添加剂A的体积比(v/v)为0.05-0.4%，以流动相A的总体积计。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相A中，流动相添加剂B的体积比(v/v)为0.01-0.1%，以流动相A的总体积计。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的流动相B包括0.05-0.4%(v/v)的甲酸乙腈。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相A中，流动相添加剂A：流动相添加剂B：水的体积比为(0.05-0.2%)：(0.03-0.1%)：100%。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生物样品选自下组：血液、血清、血浆、或其组合。
9.一种基于权利要求1所述的方法制备的检测试剂盒，其特征在于，包括：
(1)质控品，所述质控品含乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺；
(2)同位素内标提取液，所述同位素内标提取液含有乙酰左旋肉碱-D3、甜菜碱-D11、氯化胆碱-D9、左旋肉碱-D9、三甲胺-D10和氧化三甲胺-D9甲醇；
(3)增强剂，所述增强剂包括组分(a) 溴乙酸叔丁酯和乙腈；和组分(b) 碳酸钠；
(4)提取溶剂，所述提取溶剂包括组分(i) 乙腈和组分(ii) 乙酸；
(5)流动相添加剂A，所述流动相添加剂A包括甲酸；以及
(6)流动相添加剂B，所述流动相添加剂B包括氨水；
在所述增强剂的所述组分(b)中，碳酸钠的浓度为0.1-0.5mol/L；所述提取溶剂中，所述组分(ii)的体积比（v/v）为1.0-3.0％；
并且所述检测试剂盒同时检测乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐、三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
10.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，在所述增强剂的所述组分(a)中，溴乙酸叔丁酯的浓度为25-45mmol/L。
11.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，在所述增强剂的所述组分(b)中，碳酸钠的浓度为0.2-0.4mol/L。
12.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述提取溶剂中，所述组分(ii)的体积比（v/v）为1.5-2.5％。
13.如权利要求9所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括(7)对照品，所述对照品含乙酰左旋肉碱、甜菜碱醛、甜菜碱、氯化胆碱、盐酸巴豆甜菜碱、γ-丁基甜菜碱、左旋肉碱、三甲胺盐酸盐和三甲基赖氨酸和氧化三甲胺。
CN202010052181.8A 2020-01-17 2020-01-17 一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒 Active CN113138234B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010052181.8A CN113138234B (zh) 2020-01-17 2020-01-17 一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010052181.8A CN113138234B (zh) 2020-01-17 2020-01-17 一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113138234A CN113138234A (zh) 2021-07-20
CN113138234B true CN113138234B (zh) 2024-05-24

Family

ID=76808275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010052181.8A Active CN113138234B (zh) 2020-01-17 2020-01-17 一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113138234B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114487229A (zh) * 2022-02-09 2022-05-13 杭州佰辰医疗器械有限公司 一种血浆和血清内源性小分子化合物质控品配制方法
CN115144517B (zh) * 2022-05-31 2023-07-21 北京豪思生物科技股份有限公司 一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的方法及其试剂盒和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102458481A (zh) * 2009-05-28 2012-05-16 克里夫兰诊所基金会 用于诊断和预测疾病的含三甲胺的化合物
WO2018150077A1 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 Afekta Technologies Oy Betaine biomarkers for nutritional status, nutritional regimen, endogenous metabolism, or risk of cardiovascular or metabolic diseases
CN109239212A (zh) * 2018-09-13 2019-01-18 苏州帕诺米克生物医药科技有限公司 一种测定小分子生物标志物的方法
CN110687227A (zh) * 2019-10-25 2020-01-14 上海阿趣生物科技有限公司 一种tmao及其相关代谢产物的检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102458481A (zh) * 2009-05-28 2012-05-16 克里夫兰诊所基金会 用于诊断和预测疾病的含三甲胺的化合物
WO2018150077A1 (en) * 2017-02-16 2018-08-23 Afekta Technologies Oy Betaine biomarkers for nutritional status, nutritional regimen, endogenous metabolism, or risk of cardiovascular or metabolic diseases
CN109239212A (zh) * 2018-09-13 2019-01-18 苏州帕诺米克生物医药科技有限公司 一种测定小分子生物标志物的方法
CN110687227A (zh) * 2019-10-25 2020-01-14 上海阿趣生物科技有限公司 一种tmao及其相关代谢产物的检测方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Elevation of Trimethylamine-N-Oxide in Chronic Kidney Disease: Contribution of Decreased Glomerular Filtration Rate;Caroline C. Pelletier et al.;Toxins;文章第11页 *
Rapid L C-MRM-MS assay for simultaneous quantification of choline, betaine, trimethy lamine, trimethylamine N- ox i d e , and c reatinine in human plasma and urine;Xueqing Zhao et al.;Electrophoresis;摘要，第2208-2210页 *
Simultaneous determination of trimethylamine and trimethylamine N-oxide in mouse plasma samples by hydrophilic interaction liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry;Si Mi et al.;Journal of Separation Science;文章第11页 *
Xueqing Zhao et al..Rapid L C-MRM-MS assay for simultaneous quantification of choline, betaine, trimethy lamine, trimethylamine N- ox i d e , and c reatinine in human plasma and urine.Electrophoresis.2015,摘要，第2208-2210页. *
测定血清游离胆碱、甜菜碱、三甲胺和胺 氧化三甲 UPLC-MS/MS;陈偲等;中国公共卫生;第35卷(第9期);第1271-1274页 *
测定血清游离胆碱、甜菜碱、三甲胺和胺氧化三甲UPLC-MS/MS;陈偲等;中国公共卫生;第35卷(第9期);第1272页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113138234A (zh) 2021-07-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gika et al. Current practice of liquid chromatography–mass spectrometry in metabolomics and metabonomics
CN112689755A (zh) 用于检测和定量微生物区系相关代谢物的质谱测定法
Liu et al. Determination of polyamines in human urine by precolumn derivatization with benzoyl chloride and high-performance liquid chromatography coupled with Q-time-of-flight mass spectrometry
US9146219B2 (en) Sensitive method for measuring cis-diol containing compounds in plasma using 2D-LC-MS/MS
US8614418B2 (en) Methods for detecting catecholamines by mass spectrometry
French Advances in clinical mass spectrometry
CN113138234B (zh) 一种检测多种肠道微生物代谢物的定量分析方法及试剂盒
van der Hooft et al. Enhanced acylcarnitine annotation in high-resolution mass spectrometry data: fragmentation analysis for the classification and annotation of acylcarnitines
CN111398480A (zh) 同时检测三唑类抗真菌药物和糖肽类抗生素的试剂盒及其检测方法
CN112611827B (zh) 测3种雌激素的化学衍生-超高效液相色谱-串联质谱法
CN109613144A (zh) 一种儿茶酚胺类激素的检测方法
EP2850430B1 (en) Analysis of a panel of cerebrotendinous xanthomatosis biomarkers using site specific derivation and lc/ms/ms workflow
CN112180013B (zh) 用于心肌梗死诊断的肠道微生物代谢标志物组合物及其检测方法和应用
CN115078554A (zh) 一种同时检测多种鞘磷脂代谢物的方法
Furlani et al. Liquid chromatography-mass spectrometry for clinical metabolomics: an overview
Zhang et al. Validation and quantification of genomic 5-carboxylcytosine (5caC) in mouse brain tissue by liquid chromatography-tandem mass spectrometry
CN111983112A (zh) 血清中tmao及其相关代谢物的检测方法
Lin et al. Sensitive quantification of short-chain fatty acids combined with global metabolomics in microbiome cultures
CN116818957B (zh) 一种生猪样品中五氯酚酸钠及其代谢物含量的检测方法
CN114487185B (zh) 一种胆固醇通路的分离鉴定方法
CN113341023B (zh) 一种基于液质联用的血清二氨基庚二酸的检测试剂盒及检测方法与应用
Wachełko et al. New approach for barbiturates, phenytoin, methyprylon and glutethimide determination and fragmentation (UHPLC-MS/MS)
CN115144517B (zh) 一种检测样本中肌氨酸及其代谢物的方法及其试剂盒和应用
CN117554550B (zh) 血浆中儿茶酚胺代谢物的液相色谱串联质谱检测方法和组合稳定剂
DeFelice From discovery to the clinic: Improving the information content of targeted and untargeted metabolomic data

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20220805

Address after: 201201 floor 2, building 3, No. 412, Huiqing Road, Pudong New Area, Shanghai

Applicant after: Shanghai Maishi Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 201203 Pudong New Area, Shanghai, China (Shanghai) free trade pilot area 1, 115 Lane 572, Po Po Road.

Applicant before: SHANGHAI TELLGEN LIFE SCIENCE CO.,LTD.

Applicant before: SHANGHAI TELLGEN DIAGNOSIS TECHNOLOGY CO.,LTD.

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant