CN112689755A - 用于检测和定量微生物区系相关代谢物的质谱测定法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了通过质谱测定样品中一种或多种分析物的量的方法，所述分析物选自：N‑棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5‑氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N‑乙酰尸胺、尸胺、三甲胺‑N‑氧化物(TMAO)、γ‑氨基丁酸(GABA)、5‑羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(‑His‑Pro)、环(‑Pro‑Thr)、环(‑Gly‑His)、法莫替丁、甲酚、3‑硫酸吲哚酚、4‑羟基苯乙酸酯、2‑(4‑羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3‑苯基丙酸酯、4‑乙基苯酚、4‑羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N‑乙酰胞壁酸、N‑乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐、3‑吲哚乳酸及其组合。该方法包括在适合于从一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，将样品引入电离源；通过质谱测量来自一种或多种分析物的每一种的一种或多种离子的量；以及使用所测量的一种或多种离子的量来测定样品中一种或多种分析物中的每种分析物的量。本发明还公开了一种试剂盒，该试剂盒包含一种或多种同位素标记类似物，其作为一种或多种分析物中的每种分析物的内标。
Description
背景
提供以下描述本发明背景的信息以帮助理解本发明，并且这些信息不被认为构成或描述了本发明的现有技术。
微生物区系的改变(即体表或体内的生态失调(包括微生物组组成的改变)或微生物失衡)及其活性已经与许多慢性和退行性疾病相关联，并且现在被认为是其促成因素，所述疾病诸如过敏、关节炎、哮喘、自闭症、结肠癌、艰难梭菌(C.difficile)感染、糖尿病、IBS、肥胖等。
基于DNA的技术的最新进展已经使得能够探索人类微生物组的多样性和丰度。正在努力使用这些技术来表征永久存活于人体不同部位的所有微生物中存在的基因。这项工作旨在揭示细菌基因的功能及其在人类健康中的作用。
微生物群落依靠小分子在包括动物物种(宿主)在内的物种内部和之间进行通信。越来越多的证据表明，宿主与微生物之间的这些通信影响人类健康，并且健康影响可能是有益的或有害的。然而，这些作用背后的微生物与宿主的相互作用还没有得到很好地理解。测量微生物和与微生物相关的分析物水平变化的能力可以提供指示微生物区系诱发的宿主的变化及产生的健康作用的机制细节。另外，可以获得对微生物组本身的健康的了解。因此，一种检测和测量微生物及与微生物相关的分析物水平的方法可以提供对构成健康微生物组的内容的了解，并代表重大的未满足的医疗需求。
本文描述了用于检测和定量一种或多种、多个或一组分析物的方法，所述分析物可用于评估受试者中的微生物区系和宿主-微生物相互作用。这些方法的结果可以定量测量小体积样品中各种结构多样的微生物和微生物组相关分析物。可以使用质谱分析方法进行代谢物测定，每个测定或组仅需单次样品进样，并且无需衍生化。
概述
在本发明的第一方面，一种方法包括通过质谱检测和测定样品中由一种或多种分析物组成的一组分析物的量，所述分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯(3-(1H-咪唑-4-基)丙酸，脱氨基-组氨酸)、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuraminate)、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐、3-吲哚乳酸(吲哚乳酸酯)及其组合。在一个实施方案中，该方法包括在适合于从一种或多种分析物中的每一种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，使样品经受电离源。在另一个实施方案中，分析物在电离之前不被衍生化。本发明还提供了从样品中提取分析物并在通过质谱检测之前将分析物进行色谱分离的方法。
在本发明的第二方面，本发明描述了一种用于通过质谱测定样品中一种或多种分析物的量的方法。一种或多种分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯基丙酰甘氨酸、苯基乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐、3-吲哚乳酸及其组合。这些步骤包括在适于从一种或多种分析物中的每种分析物产生可通过质谱检测的一种或多种离子的条件下，将样品引入电离源，其中在电离之前不将分析物衍生化；通过质谱测量来自一种或多种分析物中的每种分析物的一种或多种离子的量；以及使用所测量的一种或多种离子的量来测定样品中一种或多种分析物中的每种分析物的量。在该方面的一个特征中，质谱是串联质谱。在该方面的另一个特征中，用于测定多种分析物中的每种分析物的量的一种或多种离子是选自表3、4和5中的离子中的一种或多种离子。在该方面的进一步的特征中，当所述一种或多种分析物之一包含N-棕榈酰丝氨醇，所述一种或多种离子包含一种或多种选自质荷比为330.3±0.5、312.1±0.5、239.1±0.5、149.1±0.5、139.1±0.5、92.1±0.5和74.1±0.5的离子。
在第一和第二方面的一个特征中，一种或多种分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)，并且在单次进样中测定一种或多种分析物的量。关于此特征，电离源以正电离模式操作。
在另一个特征中，一种或多种分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯基丙酰甘氨酸、苯基乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸和尿石素A，并且在单次进样中测定一种或多种分析物的量。关于此特征，电离源以负电离模式操作。
在另一个特征中，一种或多种分析物选自：木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)，并且在单次进样中测定一种或多种分析物的量。关于此特征，电离源以负电离模式操作。
在另一个特征中，一种或多种分析物选自：儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚，并且在单次进样中测定一种或多种分析物的量。关于此特征，电离源以负电离模式操作。
在另一个特征中，分析物是三甲胺-N-氧化物(TMAO)，并且在单次进样中测定分析物的量。关于此特征，电离源以正电离模式操作。
在另一个特征中，在将样品引入电离源之前，已经通过液相色谱法纯化样品。关于此特征，液相色谱法选自高效液相色谱法、超高效液相色谱法和湍流液相色谱法。再次关于此特征，在将样品引入电离源之前，通过高效液相色谱法或超高效液相色谱法纯化样品。
在进一步的特征中，测定所述多种分析物中2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种或7种或更多种的量。
在另一个特征中，测定N-棕榈酰丝氨醇和一种或多种选自下述的分析物的量：吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐和3-吲哚乳酸。
在又一个特征中，所述多种分析物中的第一一种或多种分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)，并且在单次进样中测定所述多种分析物中的所述第一一种或多种分析物；并且所述多种分析物中的第二一种或多种分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸和尿石素A，并且在单次进样中测定所述多种分析物中的所述第二一种或多种分析物。关于此特征，所述多种分析物中的第三一种或多种分析物选自木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，并且在单次进样中测定所述多种分析物中的所述第三一种或多种分析物。
在另一个特征中，一种或多种内标用于测定样品中一种或多种分析物中的每种分析物的量。关于此特征，一种或多种内标中的至少一种内标包括一种或多种待测分析物中至少一种分析物的同位素标记类似物。进一步考虑到此特征，所述一种或多种内标中的至少一种内标选自：N-棕榈酰丝氨醇-d3、三甲胺-N-氧化物-13C3、3-吲哚丙酸-d2、吲哚-d7、N-乙酰尸胺-d3、5-氨基戊酸-d4、尸胺-d4、法莫替丁-13C3、γ-氨基丁酸-d6、5-羟色胺-d4、哌啶酸-d9、咪唑丙酸-d3、咪唑乳酸-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、色氨酸-d5、对甲酚-d7、苯甲酸-d5、马尿酸盐-d5、4-羟基苯乙酸-d6、3-苯基乳酸-d5、(4-羟基苯基)-2-丙酸-d6、柚皮素-d3、(3-苯基丙酰基)甘氨酸-13C2,15N1、苯乙酰基甘氨酸-d5、对甲酚硫酸盐-d7、肠二醇-d6、肠内酯-d6、苯酚硫酸盐-d3、大豆素-d4、芹菜素-d5、对甲酚葡糖苷酸-d7、染料木素-d4、乙基苯硫酸盐-d4、雌马酚-d4、3-硫酸吲哚酚-13C6、苯乙酸-d7、脱氧胆酸-d4、石胆酸-d4、牛磺脱氧胆酸-d5、乳酸-d4、木糖-13C5、棉子糖-d9、水苏糖-d7、二氨基庚二酸-13C7,15N2、三甲胺-13C3、氢化肉桂-d5酸、4-乙基苯酚-2,3,5,6-d4,OD、4-羟基苯基乳酸酯-d2、肉桂-d5酸、肉桂酰甘氨酸-2,2-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、尿石素B-13C6、N-乙酰胞壁酸-d3、N-乙酰-D-神经氨酸-1,2,3-13C3、儿茶酚硫酸盐-13C6和吲哚乳酸酯-d5。
在本发明的第三方面，一种试剂盒包含一种或多种同位素标记类似物作为一种或多种选自下述的分析物中的每种分析物的内标：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐和3-吲哚乳酸及其组合，以及包装材料和使用该试剂盒的说明。关于此特征，所述内标包括一种或多种选自下述的内标：N-棕榈酰丝氨醇-d3、三甲胺-N-氧化物-13C3、3-吲哚丙酸-d2、吲哚-d7、N-乙酰尸胺-d3、5-氨基戊酸-d4、尸胺-d4、法莫替丁-13C3、γ-氨基丁酸-d6、5-羟色胺-d4、哌啶酸-d9、咪唑丙酸-d3、咪唑乳酸-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、色氨酸-d5、对甲酚-d7、苯甲酸-d5、马尿酸盐-d5、4-羟基苯乙酸-d6、3-苯基乳酸-d5、(4-羟基苯基)-2-丙酸-d6、柚皮素-d3、(3-苯基丙酰基)甘氨酸-13C2,15N1、苯乙酰基甘氨酸-d5、对甲酚硫酸盐-d7、肠二醇-d6、肠内酯-d6、苯酚硫酸盐-d3、大豆素-d4、芹菜素-d5、对甲酚葡糖苷酸-d7、染料木素-d4、乙基苯硫酸盐-d4、雌马酚-d4、3-硫酸吲哚酚-13C6、苯乙酸-d7、脱氧胆酸-d4、石胆酸-d4、牛磺脱氧胆酸-d5、乳酸-d4、木糖-13C5、棉子糖-d9、水苏糖-d7、二氨基庚二酸-13C7,15N2、三甲胺-13C3、氢化肉桂-d5酸、4-乙基苯酚-2,3,5,6-d4,OD、4-羟基苯基乳酸酯-d2、肉桂-d5酸、肉桂酰甘氨酸-2,2-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、尿石素B-13C6、N-乙酰胞壁酸-d3、N-乙酰-D-神经氨酸-1,2,3-13C3及其组合。
在第三方面的一个特征中，一种或多种分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)及其组合。关于此特征，所述内标包括一种或多种选自下述的内标：N-棕榈酰丝氨醇-d3、3-吲哚丙酸-d2、吲哚-d7,、色氨酸-d5、5-氨基戊酸-d4、哌啶酸-d9、N-乙酰尸胺-d3、尸胺-d4、三甲胺-N-氧化物-13C3、γ-氨基丁酸-d6、5-羟色胺-d4、咪唑丙酸-d3、咪唑乳酸-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、法莫替丁-13C3、二氨基庚二酸-13C7,15N2、三甲胺-13C3、儿茶酚硫酸盐-13C6、吲哚乳酸酯-d5及其组合。
在另一个特征中，一种或多种分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸和尿石素A及其组合。关于此特征，所述内标包括一种或多种选自下述的内标：对甲酚-d7、3-硫酸吲哚酚-13C6、4-羟基苯基乳酸-d6、(4-羟基苯基)-2-丙酸-d6、苯甲酸-d5、苯乙酸-d7、3-苯基乳酸-d5、马尿酸盐-d5、乳酸-d4、(3-苯基丙酰基)甘氨酸-13C2,15N1、苯乙酰基甘氨酸-d5、乙基苯硫酸盐-d4、苯酚硫酸盐-d3、对甲酚硫酸盐-d7、对甲酚葡糖苷酸-d7、肠二醇-d6、肠内酯-d6、雌马酚-d4、大豆素-d4、芹菜素-d5、柚皮素-d3、染料木素-d4、脱氧胆酸-d4、石胆酸-d4、牛磺脱氧胆酸-d5、氢化肉桂-d5酸、4-乙基苯酚-2,3,5,6-d4,OD、4-羟基苯基乳酸酯-d2、肉桂-d5酸、肉桂酰甘氨酸-2,2-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、尿石素B-13C6及其组合。
在又一个特征中，一种或多种分析物选自：木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)及其组合。关于此特征，所述内标包括一种或多种选自下述的内标：木糖-13C5、棉子糖-d9、水苏糖-d7、N-乙酰胞壁酸-d3、N-乙酰-D-神经氨酸-1,2,3-13C3及其组合。
在又一个特征中，一种或多种分析物选自：儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯、硫酸吲哚酚及其组合。关于此特征，所述内标包括一种或多种选自下述的内标：儿茶酚硫酸盐-13C6、对甲酚硫酸盐-d7、乙基苯硫酸盐-d4、吲哚乳酸酯-d5、吲哚丙酸酯-d2和3-硫酸吲哚酚-13C6及其组合。
在又一个特征中，所述分析物是三甲胺-N-氧化物(TMAO)。关于此特征，所述内标包括三甲胺N-氧化物-13C3。
在第三方面的另一个特征中，一种或多种分析物选自：N-乙酰尸胺、5-氨基戊酸酯、咪唑丙酸酯、β-咪唑乳酸、N-棕榈酰丝氨醇、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、柚皮素、苯酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、棉子糖、水苏糖、4-羟基苯基乳酸酯、苯酚葡糖苷酸、N-乙酰胞壁酸、儿茶酚硫酸盐及其组合。关于此特征，所述一种或多种内标选自：N-乙酰尸胺-d3、5-氨基戊酸酯-d4、咪唑丙酸酯-d3、β-咪唑乳酸-d3、N-棕榈酰丝氨醇-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、2-(4-羟基苯基)丙酸酯-d6、柚皮素-d3钠盐、苯酚硫酸盐-d3、乙基苯硫酸盐-d4、棉子糖-d9、水苏糖-d7、4-羟基苯基乳酸酯-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、N-乙酰胞壁酸-d3、儿茶酚硫酸盐-13C6及其组合。
附图的简要说明
图1A-B显示了使用色谱方法1在单次进样中纯化和分离的下述的示例性色谱图：N-乙酰尸胺、咪唑丙酸酯、哌啶酸酯、吲哚、5-氨基戊酸酯、γ-氨基丁酸(GABA)、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、法莫替丁、N-棕榈酰丝氨醇、环(-His-Pro)、色氨酸、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、吲哚丙酸酯、5-羟色胺和咪唑乳酸酯。
图2A-C显示了使用色谱方法2在单次进样中纯化和分离的下述的示例性色谱图：苯酚硫酸盐、苯乳酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、4-羟基苯基乙酸酯、苯乙酸、苯甲酸酯、甲酚、乳酸酯、大豆素、雌马酚、3-硫酸吲哚酚、苯丙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯乙酰基甘氨酸、对甲酚硫酸盐、马尿酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、肠二醇、肠内酯、对甲酚葡糖苷酸、柚皮素、染料木素和芹菜素。
图3显示了使用色谱方法3在单次进样中纯化和分离的木糖、棉子糖和水苏糖的示例性色谱图。
图4显示了使用色谱方法4在单次进样中纯化和分离的儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚的示例性色谱图。
图5显示了使用色谱方法5纯化和分离的三甲胺-N-氧化物(TMAO)的示例性色谱图。
详述
本发明描述了用于测量样品中选自下述代谢物中的一种或多种分析物的量的方法：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐、3-吲哚乳酸及其组合。本发明描述了使用单次进样方法定量样品中单个和多个(多种)分析物的质谱方法。在定量多种分析物的实例中，分析物可以被称为“组”或“分析物组”。在一个实例中，该组可包括选自下述的多种分析物：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐、3-吲哚乳酸及其组合。在另一个实例中，该组可包括选自下述的多种分析物：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)及其组合。在又一个实例中，该组可包括选自下述的多种分析物：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A及其组合。在又一个实例中，该组可包括选自下述的多种分析物：木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰基神经氨酸(唾液酸)及其组合。在另一个实例中，该组可包括选自下述的多种分析物：儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚及其组合。所述方法可包括使用例如液相色谱法步骤如LC(液相色谱法)、UPLC(超高效液相色谱法)或HILIC(亲水相互作用色谱法)的纯化或富集步骤以进行分离(纯化、富集)所选的分析物(结合质谱方法)。本文所述的方法的优点是提供了一种高通量测定系统，该系统适于自动化定量样品中的多种分析物。
与当前测量这些分析物的方法相比，本文提出的方法提供了改进和优势。本发明提供了用于测量多个分析物组的方法。组中包括的分析物在结构上是多种多样的，并且方法通过在单次进样中一起测量分析物而无需衍生化，提供了技术的改进和优势。此外，在该方法中，分析物的稳定同位素标记类似物用于每种单独的分析物作为内标。与使用一种内标物定量几种(例如3种或更多种)分析物或使用结构相似的标记化合物(但不是类似物)进行定量的方法相比，对每种分析物使用标记类似物可实现更准确的定量。能够在单次进样中定量测量各种组合中的多种分析物的能力，减少了获得分析结果所需的时间，在实验室一次性用品(例如试管、移液器吸头、试剂)、实验室仪器和人力资源方面使用了更少的资源。这些改进可通过降低测定成本以及增加仪器和实验室进行样品分析的能力来节省成本。
在进一步详述本发明之前，定义以下术语。
定义：
术语“量”(“amount”)是指使用本文描述的方法测量的分析物的量。该量可以表示为浓度。例如，质量浓度、摩尔浓度、数浓度(number concentration)或体积浓度。如本文所用，量是指绝对量(absolute amount或absolute quantity)，而不是相对量(relativeamount或relative quantity)。
术语“固相萃取”是指一种样品制备过程，其中使用固体颗粒色谱填料(即固相或固定相)根据其物理和化学性质分离复杂混合物(即流动相)的组分。固体颗粒填料可以容纳在筒式装置(例如，柱)中。
术语“分离”是指将复杂混合物分离为其组分分子或代谢物的过程。常见的示例性实验室分离技术包括电泳和色谱法。
术语“色谱法”是指一种物理分离方法，其中待分离的组分(即化学成分)分配在两相之间，其中一相为固定的(固定相)，而另一相(流动相)沿确定的方向移动。流动相可以是气体(“气相色谱法”、“GC”)或液体(“液相色谱法”、“LC”)。色谱输出数据可用于本文所述方法的实施方案中。
术语“液相色谱法”或“LC”是指当流体均匀地移动通过细分的物质的柱或通过毛细管通道时，选择性抑制流体溶液的一种或多种组分的过程。抑制是由于当流动相相对于固定相移动时，混合物的组分在一个或多个固定相与流动相之间的分配而产生的。“液相色谱法”的实例包括“反相液相色谱法”或“RPLC”、“高效液相色谱法”或“HPLC”、“超高效液相色谱法”或“UPLC”或“UHPLC”或亲水相互作用色谱法或“HILIC”。
术语“保留时间”是指从将样品引入分离装置以来在色谱法过程中经过的时间。样品成分的保留时间是指在样品进样入分离装置中的时刻与样品成分从包含固定相的分离装置的部分洗脱(例如从其中出来)的时刻之间在色谱法过程中经过的时间。
样品成分的术语“保留指数”是指通过内插(interpolation)(通常是对数)获得的数字，该数字将样品组分的保留时间或保留因子与样品组分的峰之前和之后洗脱的标准的保留时间相关联，该机制利用已知标准的分离特征来消除系统误差。
术语“分离指数”是指与通过分离技术分离的化学成分相关的度量。对于色谱分离技术，分离指数可以是保留时间或保留指数。对于非色谱分离技术，分离指数可以是化学成分行进的物理距离。
如本文所用，术语“分离信息”和“分离数据”是指指示关于分离指数的化学成分的存在或不存在的数据。例如，分离数据可以指示具有特定质量的在特定时间洗脱的化学成分的存在。分离数据可以指示随时间化学成分洗脱的量上升、到峰值并且然后下降。在分离指数(例如时间)上绘制的化学成分的存在图可以显示图形峰。因此，在分离数据的上下文中，术语“峰信息”和“峰数据”与术语“分离信息”和“分离数据”同义。
术语“质谱”(MS)是指用于测量和分析分子的技术，该技术包括使靶分子电离或电离并碎片化，然后基于其质荷比分析离子以产生质谱，其作为“分子指纹”。测定物体的质荷比可以通过测定该物体吸收电磁能的波长来完成。有几种常用的方法来测定离子的质荷比，一些方法测量离子轨迹与电磁波的相互作用，另一些方法测量离子行进给定距离所花费的时间，或者两者结合。可以对照数据库搜索来自这些碎片质量测量的数据，以获得靶分子的标识。
术语“以负模式操作”或“以负多反应监测(MRM)模式操作”或“以负电离模式操作”是指其中产生和检测负离子的质谱方法。术语“以正模式操作”或“以正多反应监测(MRM)模式操作”或“以正电离模式操作”是指其中产生和检测正离子的质谱方法。
术语“质量分析器”是指质谱仪中的装置，其通过离子的质荷比(“m/z”)来分离离子的混合物。
术语“m/z”是指通过将离子的质量数除以其电荷数而形成的无量纲量。长期以来，它一直被称为“质荷比”。
如本文所用，术语“源”或“电离源”是指质谱仪中的装置，其使待分析的样品电离。电离源的示例包括电喷雾电离(ESI)、大气压化学电离(APCI)、加热电喷雾电离(HESI)、大气压光电离(APPI)、火焰电离检测器(FID)、基质辅助激光解吸附电离(MALDI)等。
如本文所用，术语“检测器”是指质谱仪中检测离子的装置。
术语“离子”是指包含电荷的任何物体，其可以例如通过向该物体添加电子或从该物体去除电子而形成。
术语“质谱”是指由质谱仪产生的数据图，通常在x轴上包含m/z值，在y轴上包含强度值。
术语“扫描”是指与特定的分离指数相关的质谱。例如，使用色谱分离技术的系统可生成多个扫描，每个扫描在不同的保留时间生成。
术语“运行时间”是指从样品进样到生成仪器数据的时间。
术语“串联MS”是指执行第一MS步骤(称为“一级MS”)，然后执行一个或多个后续MS步骤(通常称为“二级MS”)的操作。在一级MS中，在创建一级质谱期间检测并记录了代表一种(和可能多于一种)化学成分的离子。离子所代表的物质要经过二级MS，其中感兴趣的物质会发生碎片化，以使该物质分解为子成分，这些子成分将被检测并记录为二级质谱。在真正的串联MS中，一级MS中的感兴趣的离子与二级MS中产生的峰之间存在毫无疑义的关系。一级MS中的感兴趣的离子对应于“母”离子或前体离子，而二级MS中产生的离子则对应于母离子的子成分，在本文中称为“子”或“产物”离子。
因此，串联MS允许创建代表复杂混合物中化学成分的母子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此之间的关系，其中子离子代表母离子的子成分。例如，可以对子离子重复进行串联MS，以确定“孙子”离子。因此，串联MS不限于两级碎片化，而是通常用于指代多级MS，也称为“MSn”。术语“MS/MS”是“MS2”的同义词。简便起见，下文中的术语“子离子”是指由二级或更高阶(即非一级)MS产生的任何离子。
“分析物”、“小分子”、“生化物质”(“biochemical”)或“代谢物”可以互换使用。如本文所用，分析物的实例包括N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。该术语不包括大分子，比如大蛋白(例如，分子量超过2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000的蛋白质)，大核酸(例如分子量超过2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000的核酸)或大多糖(例如分子量超过2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000的多糖)。
“样品”是指待通过所述方法分析的材料。样品可以是固体样品、液体样品或挥发性样品。样品可以指任何类型的样品，并且可包括非生物样品(非限制性实例包括：土壤样品、水样品、固体制剂(包括但不限于例如食品样品)、液体制剂(包括但不限于例如饮料样品)和生物样品。术语“生物样品”可以指从受试者中分离出的生物材料。生物样品可以包含任何适合检测所需分析物的生物材料，并且可包括来自受试者的细胞和/或非细胞材料。生物样品的非限制性实例包括：血液、血浆(blood plasma(plasma))、血清(blood serum(serum))、尿液、脑脊液(CSF)、粪便、组织、皮肤、盲肠内容物、母乳、唾液、植物样品、细胞或细胞培养物、细胞培养基和生物膜。
“受试者”是指任何动物，但优选是哺乳动物，例如人、猴、小鼠、狗、兔或大鼠。
I.样品制备和质量控制(QC)
通过从样品中可能存在的大分子(例如蛋白质、核酸、脂质)中分离样品中的分析物来制备含有分析物的样品提取物。术语“样品提取物”、“提取的样品”或“分析物提取物”在本文中也可以称为“分析样品”，并且这些术语可以互换使用。样品中的部分或全部分析物可与蛋白质结合。在MS分析之前，可以使用各种方法来破坏分析物与蛋白质之间的相互作用。例如，可以从样品中提取分析物以产生液体提取物，而可能存在的蛋白质则被沉淀并去除。可以使用例如乙酸乙酯或甲醇的溶液来沉淀蛋白质。为了使样品中的蛋白质沉淀，将乙酸乙酯或甲醇溶液添加到样品中，然后将混合物在离心机中离心，以从沉淀的蛋白质中分离出包含提取的分析物的液体上清液。
在其他实施方案中，分析物可以在不沉淀蛋白质的情况下而从蛋白质释放。例如，可以将甲酸溶液添加到样品中以破坏蛋白质和分析物之间的相互作用。或者，可以将硫酸铵、溶于乙醇的甲酸溶液或溶于甲醇的甲酸溶液添加到样品中，以破坏蛋白质和分析物之间的离子相互作用而不沉淀蛋白质。在一个实例中，乙腈、甲醇、水和甲酸的溶液可用于从样品中提取分析物。
在一些实施方案中，可以对提取物进行各种方法，包括如本文所述的液相色谱法、电泳、过滤、离心和亲和分离，以相对于样品中的一种或多种其他组分纯化或富集所选分析物的量。
为了评估例如检测和定量分析物的方法的精度、准确度、校准范围或分析灵敏度，可以使用质量控制(QC)样品。可以基于样品中检测到的给定分析物的定量下限(LLOQ)或定量上限(ULOQ)，确定要在QC样品中使用的给定分析物的浓度。在一个实例中，LLOQ可以由一个标准(例如，标准A)的浓度表示，而ULOQ可以由第二标准(例如，标准H)的浓度表示。低QC值可以设置为大约3X LLOQ的浓度，中QC值可以为高QC的约25-50％的浓度，而高QC值可以为ULOQ的约80％的浓度。可以基于分析测量范围(AMR)和在一组代表性样品中测得的样品结果的频率来选择QC靶浓度水平。
II.色谱法
在质谱分析之前，可以对分析物提取物进行一种或多种分离方法，例如电泳、过滤、离心、亲和分离或色谱法。在一个实施方案中，分离方法可包括液相色谱法(LC)，包括例如超高效LC(UHPLC)。
在一些实施方案中，可以使用反相柱色谱系统、亲水相互作用色谱法(HILIC)或混合相柱色谱系统进行UHPLC。
用于LC的柱加热器(或柱管理器)可以设置在约25℃到约80℃的温度下。例如，柱加热器可以设置为大约30℃、40℃、50℃、60℃、70℃等。
在一个实例中，可以使用HILIC系统进行UHPLC。在另一个实例中，可以使用反相柱色谱系统进行UHPLC。该系统可包括两个或更多个流动相。流动相可以被称为例如流动相A、流动相B、流动相A’和流动相B’。
在使用两个流动相A和B的示例性实施方案中，流动相A可包含全氟戊酸(PFPA)和水，而流动相B可包含PFPA和乙腈。PFPA的浓度可以从约0.01％至约0.500％。乙腈的浓度可在0％至100％的范围内。在一些实例中，流动相A中的全氟戊酸(PFPA)的浓度可以为0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％或0.3％。在其他实例中，流动相B中PFPA的浓度可以为0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％或0.3％，而乙腈的浓度可以为99.97％、99.96％、99.95％、99.94％、99.93％、99.92％、99.91％、99.9％、99.8％或99.7％。
在一个实例中，线性梯度洗脱可用于色谱法。线性梯度洗脱的起始条件可包括流动相的浓度(例如，流动相B)和/或流动相通过柱的流速(例如，流动相B)。起始条件可以针对一种或多种分析物的分离和/或保留进行优化。梯度条件也可以针对分析物的分离和/或保留进行优化，并且可以根据所选流速而变化。例如，初始条件可以是0.5％的流动相B和600μL/min的流速。流动相B可在约4分钟增加至5-10％，在约5.5-6.0分钟增加至约40-90％，并在约6.5分钟增加至约90-98％。流动相B可在6.7分钟恢复为0.5％，在此情况下，其可以维持平衡少于一分钟的时间，然后进行下一次进样。总运行时间可为7.0分钟或少于7.0分钟。
在另一个实例中，流动相A可以包含甲酸和水，而流动相B可以包含甲酸和乙腈。流动相A或流动相B中的甲酸浓度可在0.001％至5％的范围内。乙腈的浓度可在0％至100％的范围内。例如，流动相A可以包含溶于水中的0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％的甲酸，而流动相B可以包含溶于乙腈中的0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％的甲酸。线性梯度洗脱可用于色谱分析，并且可以以0％流动相B和600μL/min的流速的初始条件进行。然后可以将流动相B在3.5-4分钟增加至20-25％，在6.5-6.9分钟增加至25-30％，在6.9-8.0分钟增加至70-90％，在8-8.5分钟增加至90-95％。然后可以将流动相B维持在95％少于0.5分钟。在下一次进样之前，流动相B可恢复到0％平衡少于一分钟的时间，然后进行下一次进样。总运行时间可为9.0分钟或少于9.0分钟。
在又一个实例中，流动相A可包含三乙胺和水，而流动相B可包含三乙胺和乙腈。三乙胺的浓度可以在约0.01％至约0.500％的范围内，而乙腈的浓度可以在0％至100％的范围内。在一些实例中，流动相A或流动相B中三乙胺的浓度可以为0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％。线性梯度洗脱可用于色谱法。例如，初始条件可以是2％的流动相A和600μL/min的流速。流动相A可在1.5-2.0分钟增加至约10-20％，在约5分钟增加至25-30％，在约5分钟增加至40-50％，并维持少于0.5分钟。流动相A可在约5.5分钟恢复为2％，在此情况下，其可以维持平衡约0.5分钟的时间，然后进行下一次进样。总运行时间可为6.0分钟或少于6.0分钟。
在另一个实例中，流动相A可包含甲酸和水，而流动相B可包含甲酸和乙腈。流动相A或流动相B中的甲酸浓度可以在0.001％至5％的范围内。乙腈的浓度可在0％至100％的范围内。例如，流动相A可以包含溶于水中的0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％的甲酸，而流动相B可以包含溶于乙腈中的0.005％、0.01％、0.05％、0.1％或0.5％的甲酸。线性梯度洗脱可用于色谱分析，可在0-15％流动相B和550μL/min的流速的初始条件下进行。然后可以将流动相B在约3分钟增加至15-30％，在4.0-4.3分钟增加至30-45％，并且在4.3-5.0分钟增加至70-99％。流动相B可恢复到10％平衡少于一分钟的时间，然后进行下一次进样。总运行时间可为5.50分钟或少于5.50分钟。
在又一个实例中，流动相A可包含甲酸铵和水，而流动相B可包含甲酸铵，乙腈和水。流动相A中的甲酸铵浓度可以在0.1mM至100mM的范围内，而乙腈浓度可在0％至100％的范围内。在一些实例中，流动相A中的甲酸铵的浓度可以为1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或50mM，而乙腈的浓度可以为60％、70％、80％或90％。线性梯度洗脱可用于色谱分析，并且可以以0-15％流动相A和550μL/min的流速下的初始条件进行。然后可以在约2.5分钟将流动相A增加至15-35％，并在2.6-3.5分钟增加至30-60％。然后，流动相A可恢复到5％平衡少于一分钟的时间，然后进行下一次进样。总运行时间可为4.30分钟或少于4.30分钟。
来自色谱柱的洗脱液可以直接和自动引入质谱仪的电喷雾源中。
III.质谱和定量
可以通过例如质谱将一种或多种分析物电离。使用质谱仪进行质谱，质谱仪包括电离源，所述电离源用于电离分级分离后的样品并产生带电分子以进行进一步分析。样品的电离可以通过例如电喷雾电离(ESI)来进行。其他电离源可包括例如大气压化学电离(APCI)、加热电喷雾电离(HESI)、大气压光电离(APPI)、火焰电离检测器(FID)或基质辅助激光解吸附电离(MALDI)。可以基于多种考虑来确定电离方法的选择。示例性考虑因素包括待测量的分析物、样品类型、检测器类型以及正或负模式的选择。在一些实例中，质谱方法可以分为两个或更多个时间段以增加灵敏度。
可以以正或负模式将一种或多种分析物电离以产生一种或多种离子。例如，分析物N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)可以以正模式电离。在又一个实例中，分析物甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐和3-吲哚乳酸可以以负模式电离。在一些实例中，分析物可以在单次进样中以正模式和负模式电离。
在一个实例中，分析物N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)可以以正模式电离，并且可以在单次进样中测量。在另一个实例中，分析物甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸和尿石素A可以以负模式电离，并且可以在单次进样中测量。在又一个实例中，分析物木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)可以以负模式电离，并且可以在单次进样中测量。在又一个实例中，分析物儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚可以以负模式电离，并且可以在单次进样中测量。
可以针对给定的分析方法和/或所使用的特定质谱仪优化质谱仪的仪器设置。仪器可以使用各种气体，例如氮气、氦气、氩气或零空气(zero air)。在一个实施方案中，可以使用AB Sciex QTrap 6500质谱仪进行质谱。在一个实例中，可以以正多反应监测(MRM)模式操作质谱仪。离子喷雾电压的设置可以在约0.5kV至约6.0kV的范围内；在一个实施方案中，电压可以设置为5.5kV。源温度可以在约350℃至约600℃的范围内；在一个实施方案中，源温度可以设置为500℃。气帘气(curtain gas)可以在约10至约55psi的范围内；在一个实施方案中，气帘气设定为35psi。雾化器和去溶剂化气的流速可以在约0至约90psi的范围内。在一个实施方案中，流速可以设置为70。CAD气设置可以从高到低的范围；在一个实施方案中，将碰撞活化解离(CAD)气设定为中等。去簇电压可以在约20V至约190V的范围内。碰撞能量(CE)可以在约10V至约70V的范围。入口电压(EP)可以在约10V。碰撞室出口电压(CXP)设置可以在约2V至约30V的范围。
在另一个实例中，可以以负MRM模式操作MS仪器。离子喷雾电压设置可在-0.5kV至-5.5kV的范围；在一个实施方案中，电压可以设置为-4.5kV。在另一个实施方案中，电压可以设置为-3.5kV。源温度范围可以在约350℃到600℃的范围；在一个实施方案中，源温度可以设置在500℃。气帘气可在10至40的范围内；在一个实施方案中，气帘气可以被设置为35。在另一实施方案中，气帘气可以被设置为20。雾化器和去溶剂气的流速可以在40至90的范围内。在一个实施分方案中，流速可以被设置为70。在另一个实施方案中，流速可以设置为60。CAD气可以从低到高的范围。在一个实例中，CAD可以被设置为例如中等。去簇电压的范围可以在约-10V到约-290V的范围。碰撞能量(CE)可以在约-10V至约-130V的范围内。进入电压(EP)可以在约-10V。碰撞室出口电压(CXP)设置的范围可在约-5V至约-35V的范围。
电离之后，可以分析带电离子以测定质荷比。用于测定质荷比的示例性合适的分析仪包括四极杆分析仪、离子阱分析仪和飞行时间分析仪。可以使用例如选择模式或扫描模式来检测离子。示例性扫描模式包括MRM和选择反应监测(SRM)。
分析结果可包括由串联MS产生的数据。在示例性实施方案中，串联MS可以是准确质量串联MS。例如，准确质量串联质谱可以使用四极杆飞行时间(Q-TOF)分析仪。串联MS允许创建代表复杂混合物中化学成分的母子关系的数据结构。该关系可以由树状结构表示，该树状结构示出了母离子和子离子彼此之间的关系，其中子离子代表母离子的子成分。
例如，一级质谱可以包含五种不同的离子，其可以表示为五个图形峰。一级质谱中的每种离子可以是母离子。每种母离子都可以经过二级MS，该二级MS会产生质谱图，该质谱图显示该特定母离子的子离子。
可以扩展母子关系以描述分离的组分(例如，从色谱状态洗脱的组分)与在一级MS中检测到的离子之间的关系，以及待分析的样品与分离的组分之间的关系。
质谱仪通常向用户提供离子扫描(即，具有在给定范围内特定质量/电荷的每种离子的相对丰度)。可以通过多种方法将质谱数据与原始样品中分析物的量相关联。在一个实例中，使用校准标准来生成标准曲线(校准曲线)，以便可以将给定离子的相对丰度转换为原始分析物的绝对量。在另一实例中，校准标准可以是外标，并且可以基于从用以计算一个或多个分析物的量的标准产生的离子来生成标准曲线。在进一步的实例中，外标可以是未标记的分析物。
可以将内标添加到校准标准和/或测试样品中。内标可用于解释样品处理过程中分析物的损失，以获得样品中测得的分析物的更准确值。分析物峰面积与校准标准水平的内标峰面积之比可用于生成校准曲线并定量样品。一种或多种同位素标记的分析物类似物可用作内标。在一些实施方案中，用作内标的分析物类似物可以用氘、碳13(13C)、氧17(17O)、氧18(18O)、硫33(33S)、硫34(34S)、氚(3H)、碳14(14C)或其组合标记。可用作内标的标记类似物的非限制性实例包括三甲胺-N-氧化物-13C3、3-吲哚丙酸-d2、吲哚-d7、N-乙酰尸胺-d3、5-氨基戊酸-d4、尸胺-d4、法莫替丁-13C3、γ-氨基丁酸-d6、5-羟色胺-d4、哌啶酸-d9、咪唑丙酸-d3、咪唑乳酸-d3、N-棕榈酰丝氨醇-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、色氨酸-d5、对甲酚-d7、苯甲酸-d5、马尿酸盐-d5、4-羟基苯乙酸-d6、3-苯基乳酸-d5、(4-羟基苯基)-2-丙酸-d6、柚皮素-d3、(3-苯基丙酰基)甘氨酸-13C2,15N1、苯乙酰基甘氨酸-d5、对甲酚硫酸盐-d7、肠二醇-d6、肠内酯-d6、苯酚硫酸盐-d3、大豆素-d4、芹菜素-d5、对甲酚葡糖苷酸-d7、染料木素-d4、乙基苯硫酸盐-d4、雌马酚-d4、3-硫酸吲哚酚-13C6、苯乙酸-d7、脱氧胆酸-d4、石胆酸-d4、牛磺脱氧胆酸-d5、乳酸-d4、木糖-13C5、棉子糖-d9、水苏糖-d7、二氨基庚二酸-13C7,15N2、三甲胺-13C3、氢化肉桂-d5酸、4-乙基苯酚-2,3,5,6-d4,OD、4-羟基苯基乳酸-d2、肉桂-d5酸、肉桂酰甘氨酸-2,2-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、尿石素B-13C6、N-乙酰胞壁酸-d3、N-乙酰-D-神经氨酸-1,2,3-13C3、儿茶酚硫酸盐-13C6或吲哚乳酸酯-d5。可以将一种或多种同位素标记添加到用作内标的分析物类似物中。在一些实施方案中，可以将2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个同位素标记添加到类似物中。在一些实施方案中，例如当标记的分析物类似物不可商购或无法合成时，可以使用结构相似的标记化合物进行定量。例如，内标N-乙酰-D-神经氨酸-1,2,3-13C3可用于分析物N-乙酰胞壁酸的定量。
可以将来自MS仪器的分析数据发送到计算机并且使用计算机软件进行处理。在一个实例中，使用统计回归方法进行定量，将分析物与内标的峰面积比与校准标准的浓度进行拟合。在另一个实例中，统计回归是加权线性最小二乘回归。使用校准曲线计算出的斜率和截距可用于计算实验样品中分析物的未知浓度。
IV.试剂盒
本文描述了一种试剂盒，其用于测定一种或多种微生物组分析物或多种分析物，所述分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐、3-吲哚乳酸及其组合。例如，试剂盒可包括包装材料和足以用于测量一个或多个测定的量的一种或多种校准标准、分析物标准、内标或质量控制样品。在示例性实施方案中，内标可以被标记(例如同位素标记或放射性标记)，试剂盒可包括预制的校准标准溶液、内标溶液、流动相溶液、质量控制样品、质量控制样品重构溶液，和/或试剂盒可包含校准标准试剂、内标试剂、流动相试剂和制备流动相溶液的说明。试剂盒还可包含以有形形式记录的说明(例如，在纸上，例如说明书或电子介质)，以用于使用试剂测量一种或多种分析物。
在示例性实施方案中，与试剂盒一起使用的一种或多种内标可包括选自下述的一种或多种内标：N-棕榈酰丝氨醇-d3、三甲胺-N-氧化物-13C3、3-吲哚丙酸-d2、吲哚-d7、N-乙酰尸胺-d3、5-氨基戊酸-d4、尸胺-d4、法莫替丁-13C3、γ-氨基丁酸-d6、5-羟色胺-d4、哌啶酸-d9、咪唑丙酸-d3、咪唑乳酸-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、色氨酸-d5、对甲酚-d7、苯甲酸-d5、马尿酸盐-d5、4-羟基苯乙酸-d6、3-苯基乳酸-d5、(4-羟基苯基)-2-丙酸-d6、柚皮素-d3、(3-苯基丙酰基)甘氨酸-13C2,15N1、苯乙酰基甘氨酸-d5、对甲酚硫酸盐-d7、肠二醇-d6、肠内酯-d6、苯酚硫酸盐-d3、大豆素-d4、芹菜素-d5、对甲酚葡糖苷酸-d7、染料木素-d4、乙基苯硫酸盐-d4、雌马酚-d4、3-硫酸吲哚酚-13C6、苯乙酸-d7、脱氧胆酸-d4、石胆酸-d4、牛磺脱氧胆酸-d5、乳酸-d4、木糖-13C5、棉子糖-d9、水苏糖-d7、二氨基庚二酸-13C7,15N2、三甲胺-13C3、氢化肉桂-d5酸、4-乙基苯酚-2,3,5,6-d4,OD、4-羟基苯基乳酸酯-d2、肉桂-d5酸、肉桂酰甘氨酸-2,2-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、尿石素B-13C6、N-乙酰胞壁酸-d3、N-乙酰-D-神经氨酸-1,2,3-13C3、儿茶酚硫酸盐-13C6和吲哚乳酸酯-d5及其组合。
在其他示例性实施方案中，与试剂盒一起使用的一种或多种内标可包括选自下述的一种或多种内标：N-乙酰尸胺-d3、5-氨基戊酸酯-d4、咪唑丙酸酯-d3、β-咪唑乳酸-d3、N-棕榈酰丝氨醇-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、2-(4-羟基苯基)丙酸酯-d6、柚皮素-d3钠盐、苯酚硫酸盐-d3、乙基苯硫酸盐-d4、棉子糖-d9、水苏糖-d7、4-羟基苯基乳酸酯-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、N-乙酰胞壁酸-d3,儿茶酚硫酸盐-13C6及其组合。
在一个实施方案中，本文描述了一种用于分析一个或多个或多种分析物的试剂盒，所述分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)及其组合。与试剂盒一起使用的内标可以选自：N-棕榈酰丝氨醇-d3、3-吲哚丙酸-d2、吲哚-d7、色氨酸-d5、5-氨基戊酸-d4、哌啶酸-d9、N-乙酰尸胺-d3、尸胺-d4、三甲胺-N-氧化物-13C3、γ-氨基丁酸-d6、5-羟色胺-d4、咪唑丙酸-d3、咪唑乳酸-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、法莫替丁-13C3、二氨基庚二酸-13C7,15N2和三甲胺-13C3。
在另一个实施方案中，本文描述了一种用于分析一个或多个或多种分析物的试剂盒，所述分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A及其组合。与试剂盒一起使用的内标可以选自：对甲酚-d7、3-硫酸吲哚酚-13C6、4-羟基苯基乳酸-d6、(4-羟基苯基)-2-丙酸-d6、苯甲酸-d5、苯乙酸-d7、3-苯基乳酸-d5、马尿酸盐-d5、乳酸-d4、(3-苯基丙酰基)甘氨酸-13C2,15N1、苯乙酰基甘氨酸-d5、乙基苯硫酸盐-d4、苯酚硫酸盐-d3、对甲酚硫酸盐-d7、对甲酚葡糖苷酸-d7、肠二醇-d6、肠内酯-d6、雌马酚-d4、大豆素-d4、芹菜素-d5、柚皮素-d3、染料木素-d4、脱氧胆酸-d4、石胆酸-d4、牛磺脱氧胆酸-d5、氢化肉桂-d5酸、4-乙基苯酚-2,3,5,6-d4,OD、4-羟基苯基乳酸酯-d2、肉桂-d5酸、肉桂酰甘氨酸-2,2-d2、苯酚葡糖苷酸-d5和尿石素B-13C6。
在另一个实施方案中，本文描述了一种用于分析一个或多个或多种分析物的试剂盒，所述分析物选自：木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)及其组合。与试剂盒一起使用的内标可以选自：木糖-13C5、棉子糖-d9、水苏糖-d7、N-乙酰胞壁酸-d3和N-乙酰-D-神经氨酸-1,2,3-13C3。
在进一步的实施方案中，本文描述了一种用于分析一个或多个或多种分析物的试剂盒，所述分析物选自下述:儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯、硫酸吲哚酚及其组合。与试剂盒一起使用的内标可以选自：儿茶酚硫酸盐-13C6、对甲酚硫酸盐-d7、乙基苯硫酸盐-d4、吲哚乳酸酯-d5、吲哚丙酸酯-d2和3-硫酸吲哚酚-13C6。
实施例
I.试剂与仪器
HPLC级甲醇、乙醇、水和乙腈获自Fisher Scientific。使用来自VWR Scientific的Multi-Tube Vortexer进行混合。板的离心在来自Thermo Scientific的Sorvall ST 40R离心机中用3617桶式转子进行。从商业来源获得试剂。内标是从商业来源获得的或内部合成的。
II.内标合成
在本文描述的方法中使用的以下内标不能从商业来源获得并且是内部合成的：N-乙酰尸胺-d3、5-氨基戊酸酯-d4、咪唑丙酸酯-d3、β-咪唑乳酸-d3、N-棕榈酰丝氨醇-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、2-(4-羟基苯基)丙酸酯-d6、柚皮素-d3钠盐、苯酚硫酸盐-d3、乙基苯硫酸盐-d4、棉子糖-d9、水苏糖-d7、4-羟基苯基乳酸酯-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、N-乙酰胞壁酸-d3和儿茶酚硫酸盐-13C6。
本领域普通技术人员将理解，用于氘代化合物的命名法通常反映出具有最高掺入氘代的异构体。但是，在氢-氘(H-D)交换化学中，氘的掺入通常不完全，并且导致异构体的混合物。记录了每种合成化合物的异构体分布。以下化合物名称中指示的氘化水平反映了用作本文所述方法的内标的异构体。该异构体并不总是反映出混合物中掺入最高氘代的异构体。
N-乙酰尸胺-d3
向搅拌的溶于D2O中(0.50mL)的N-乙酰尸胺(27mg，0.187mmol，1.0eq)的悬浮液中添加溶于D2O中的NaOD(40wt％，0.100mL)。该混合物在45℃搅拌过夜，但显示不完全的H-D交换。加入另外的溶于D2O中的NaOD等分试样(约0.100mL)，并继续搅拌过夜。当通过HRMS判断HD交换已完全时(d0＝<0.5％)，将反应混合物用HCl中和至pH＝7，并冻干以提供25mg(93％，粗品)N-乙酰尸胺-d3，将其使用而无需进一步纯化。对于C7H13D3N2O+H]+，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为146.1378。所观察到的合成的N-乙酰尸胺-d3的m/z为146.1385。通过HRMS(ESI)分析的同位素分布为d0＝0％，d1＝1％，d2＝11％，d3＝71％，d4＝6％，d5＝0％。
5-氨基戊酸酯-d4
向搅拌的溶于ACN(0.200mL)的溴戊酸-d4(75.0mg，0.405mmol，1.0eq)的悬浮液中添加二苄胺(75.0，0.380mmol，0.94eq)。将反应混合物在40℃下搅拌数小时，并除去溶剂。将残余物溶于1.5mL EtOH中，并在H2气氛下与10％Pd/C(20.0mg)一起搅拌过夜。过滤后，除去溶剂，并将残余物溶于水中并冻干，以提供38mg(78％，粗品)5-氨基戊酸酯-d4，将其使用而无需进一步纯化。对于C5H7D4NO2-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为120.0968。所观察到的合成的5-氨基戊酸酯-d4的m/z为120.0973。
咪唑丙酸酯-d3
向搅拌的溶于D2O(1.0mL)中的4-咪唑丙烯酸(20.0mg)的悬浮液中加入10％Pd/C(2.5mg)和10％Pt/C(2.5mg)。将反应混合物在H2气氛下在60℃下搅拌过夜。当通过HRMS判断为H-D交换完成时(d0＝＜0.5％)，将反应混合物过滤并浓缩以提供5mg(25％，粗品)的咪唑丙酸酯-d3，将其使用而无需进一步纯化。对于C6H4D4N2O2-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为146.0764。所观察到的合成的咪唑丙酸-d3的m/z为143.0773。通过HRMS(ESI)分析的同位素分布为d0＝0％，d1＝1％，d2＝12％，d3＝26％，d4＝45％，d5＝17％。
β-咪唑乳酸-d3
向搅拌的溶于D2O(2.5mL)中的组氨酸一盐酸盐一水合物(75.0mg，0.358mmol)的悬浮液中添加10％Pd/C(2.5mg)和5％Pt/C(2.5mg)。将反应混合物在H2气氛下在60℃下搅拌过夜。当通过HRMS判断为H-D交换完成时(d0＝＜0.5％)，将反应混合物过滤并浓缩为油，其用于下一步骤而无需进一步纯化。将该残余物溶解在8:2水/HOAc(1mL)中，并用2M NaNO2(49.0mg(2.0eq)溶于0.35mL水中)处理。搅拌过夜后，蒸发溶剂，并将残余物用MeOH研磨。过滤上清液并干燥，以提供45.0mg(60％，粗品)β-咪唑乳酸-d3，将其使用而无需进一步纯化。对于C6H5D3N2O3-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为158.0650。所观察到的合成的β-咪唑乳酸-d3的m/z为158.0648。通过HRMS(ESI)分析的同位素分布为d0＝0％，d1＝5％，d2＝51％，d3＝36％，d4＝8％，d5＝1％。
N-棕榈酰丝氨醇-d3
向搅拌的溶于DMF(1.0mL)中的十六烷酸-3(25.0mg，0.0966mmol，1.0eq)、丝氨醇(8.80mg，0.966mmol，1.0eq)和HBTU(31.0mg，0.116mmol，1.2eq)的悬浮液中加入DIPEA(67.0μL，0.386mmol，1.2eq)。沉淀立即形成。在室温搅拌过夜后，将反应混合物用水稀释，并通过抽滤收集固体，以提供17.9mg的N-棕榈酰基丝氨醇-d3(56％)，将其使用而无需进一步纯化。对于C19H36D3NO3-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为331.3045。所观察到的合成的N-棕榈酰丝氨醇-d3的m/z为331.3045。
环(-His-Pro)-d3
向搅拌的溶于D2O(1.0mL)中的环(-His-Pro)(25.0mg)的悬浮液中添加10％Pd/C(4.0mg)和5％Pt/C(4.0mg)。将反应混合物在H2气氛下于100℃搅拌48h。当通过HRMS判断HD交换完成时(d0＝＜0.5％)，将反应混合物过滤并冻干，以提供19.0mg(76％，粗品)环(-His-Pro)-d3，将其使用而无需进一步纯化。对于C11H11D3N4O2-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为236.1232。所观察到的合成的环(-His-Pro)-d3的m/z为236.1237。通过HRMS(ESI)分析的同位素分布为d0＝0％，d1＝3％，d2＝23％，d3＝47％，d4＝24％，d5＝3％。
环(-Pro-Thr)-d3
向搅拌的溶于D2O(1.0mL)中的环(-Pro-Thr)(25.0mg)的悬浮液中添加10％Pd/C(4.0mg)和5％Pt/C(4.0mg)。将反应混合物在H2气氛下于100℃搅拌48h。当通过HRMS判断HD交换完成时(d0＝＜0.5％)，将反应混合物过滤并冻干，以提供19.0mg(76％，粗品)环(-Pro-Thr)-d3，其现以非对映异构体混合物存在。使用该化合物而无需进一步纯化。对于C9H11D3N2O3-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为202.1265。所观察到的合成的环(-Pro-Thr)-d3的m/z为202.1260。通过HRMS(ESI)分析的同位素分布为d0＝0％，d1＝1％，d2＝24％，d3＝39％，d4＝17％，d5＝10％，d6＝5％，d7＝3％。
环(-Gly-His)-d4
向搅拌的溶于D2O(1.0mL)中的环(-Gly-His)(25.0mg)的悬浮液中添加10％Pd/C(4.0mg)和5％Pt/C(4.0mg)。将反应混合物在H2气氛下于100℃搅拌48h。当通过HRMS判断HD交换完成时(d0＝＜0.5％)，将反应混合物过滤并冻干，以提供18.0mg(72％，粗品)环(-Gly-His)-d4，将其使用而无需进一步纯化。对于C8H6D4N4O2+H]+，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为199.1128。所观察到的合成的环(-Gly-His)-d4的m/z为199.1117。通过HRMS(ESI)分析的同位素分布为d0＝0％，d1＝1％，d2＝9％，d3＝34％，d4＝40％，d5＝14％，d6＝1％。
2-(4-羟基苯基)丙酸酯-d6
向搅拌的溶于D2O(2.0mL)中的(4-羟基苯基)-2-丙酸的悬浮液中添加10％Pd/C(2.0mg)和5％Pt/C(2.0mg)。将反应混合物在H2气氛下在密封管中于180℃搅拌过夜。当通过HRMS判断HD交换完成时(d0＝＜0.5％)，将反应混合物过滤并冻干，以提供23mg(77％，粗品)2-(4-羟基苯基)丙酸酯-d6，将其使用而无需进一步纯化。对于C9H4D6O3-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为171.0934。所观察到的合成的2-(4-羟基苯基)丙酸酯-d6的m/z为171.0939。通过HRMS(ESI)分析的同位素分布为d0＝0％，d1＝0％，d2＝10％，d3＝24％，d4＝13％，d5＝12％，d6＝32％，d7＝8％。
柚皮素-d3钠盐
向搅拌的溶于D2O(2.0mL)中的柚皮素(30.0mg)的悬浮液中添加10％Pd/C(3.5mg)。将反应混合物在H2气氛下在密封管中于160℃搅拌过夜。当通过HRMS判断HD交换完成时(d0＝＜0.5％)，将反应混合物冷却并将产物沉淀。用一滴6M NaOH将产物转化为可溶性Na+盐，并将混合物过滤并冻干以提供36.0mg(113％，粗品)柚皮素-d3钠盐，将其使用而无需进一步纯化。对于C15H9D3O5-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为274.0800。所观察到的合成的柚皮素-d3钠盐的m/z为274.0783。通过HRMS(ESI)分析的同位素分布为d0＝0％，d1＝2％，d2＝16％，d3＝67％，d4＝15％。
苯酚硫酸盐-d3
向搅拌的溶于吡啶(1.0mL)中的苯-2,4,6-d3-醇(20.0mg，0.208mmol，1.0eq)的悬浮液中加入SO3-Pyr(38.0mg，0.239mmol，1.15eq)。将反应混合物在60℃搅拌过夜，冷却，并在氮气流下除去溶剂，以提供41.0mg(111％，粗品)苯酚硫酸盐-d3，将其使用而无需进一步纯化。对于C6H3D3O4S-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为176.0102。所观察到的合成的苯酚硫酸盐-d3的m/z为176.0106。
乙基苯硫酸盐-d4
向搅拌的溶于吡啶(1.0mL)中的4-乙基苯酚-2,3,5,6-d4(50.0mg，0.394mmol，1.0eq)的悬浮液中加入SO3-Pyr(93.0mg，0.591mmol，1.5eq)。将反应混合物在60℃搅拌过夜，然后在室温下搅拌一周。在氮气流下除去溶剂。将该固体用EtOAc研磨，过滤，并除去溶剂，以提供109mg(134％，粗品)乙基苯硫酸盐-d4，将其使用而无需进一步纯化。对于C8H6D4O4S-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为205.0478。所观察到的合成的乙基苯硫酸盐-d4的m/z为205.0479。
棉子糖-d9
向搅拌的溶于D2O(1.0mL)中的棉子糖(20.0mg)的悬浮液中添加5％Ru/C(3.0mg)。将反应混合物在H2气氛下在80℃下搅拌过夜。当通过HRMS判断HD交换完成时(d0＝＜0.5％)，将反应混合物过滤并冻干，以提供12.0mg(80％，粗品)棉子糖-d9，将其使用而无需进一步纯化。对于C18H23D9O16-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为513.2182。所观察到的合成的棉子糖-d9的m/z为513.2258。通过HRMS(ESI)分析的同位素分布为d0＝0％，d1＝0％，d2＝0％，d3＝0％，d4＝0％，d5＝0％，d6＝1％，d7＝5％，d8＝12％，d9＝21％，d10＝24％，d11＝19％，d12＝10％，d13＝4％，d14＝4％，d15＝1％。
水苏糖-d7
向搅拌的溶于D2O(1.0mL)中的水苏糖(15.0mg)的悬浮液中添加5％Ru/C(3.0mg)。将反应混合物在H2气氛下在80℃下搅拌过夜。当通过HRMS判断HD交换完成时(d0＝＜0.5％)，将反应混合物过滤并冻干，以提供12mg(80％，粗品)水苏糖-d7，将其使用而无需进一步纯化。对于C18H23D9O16-H]-，高分辨率电喷雾电离质谱HRMS(ESI)质荷比(m/z)计算为672.2585。所观察到的合成的水苏糖-d7的m/z为672.2600。通过HRMS(ESI)分析的同位素分布为d0＝0％，d1＝0％，d2＝0％，d3＝1％，d4＝4％，d5＝11％，d6＝17％，d7＝21％，d8＝18％，d9＝13％，d10＝7％，d11＝4％，d12＝2％。
儿茶酚硫酸盐-13C6
向搅拌的溶于吡啶(50uL)中的13C6标记的儿茶酚(2.5mg，0.02154mmol，1.0eq)的溶液中加入SO3-Pyr(3.8mg，0.02369mmol，1.1eq)。将反应混合物在40℃搅拌数小时，但起始材料未完全消耗。加入另外的等分试样的SO3-Pyr(2.0mg)和另外的吡啶(约200uL)，并将混合物搅拌过夜。尽管保留了一些起始材料，但将反应混合物用1M KOH(150uL)淬灭。将该溶液逐滴加入到2-丙醇(2mL)中，将混合物离心，倒出上清液。重复该过程两次，并将所得残余物在真空下干燥，以提供儿茶酚硫酸盐-13C6(约10mg)，将其使用而无需进一步纯化。13C6H6O2S-H]-的HRMS(ESI)m/z计算为195.0064。所观察到的合成的儿茶酚硫酸盐-13C6的m/z为195.0080。
III.内标制备
以表1中指示的浓度溶于水:乙腈(1:1)中制备工作内标(WIS)溶液。在一些实例中，对于不同的样品类型可能需要不同的WIS浓度。本领域技术人员将理解如何确定给定样本类型的WIS。
表1.工作内标(WIS)溶液
IV.校准标准的合成
在本文描述的方法中使用的儿茶酚硫酸盐的校准标准不能从商业来源获得而是在内部合成的。
儿茶酚硫酸盐二钾盐
向搅拌的溶于吡啶(1.75mL)中的儿茶酚(424mg，3.85mmol，1.0eq)的溶液中加入SO3-Pyr(665mg，4.20mmol，1.1eq)。将反应混合物在40℃搅拌数小时，并用1M KOH(17.5mL)淬灭。将该溶液的约一半逐滴加入到2-丙醇中。最初，产物沉淀为固体，但最终被油析出(oiled out)。将混合物离心并倒出上清液。将该研磨过程重复两次，并将所得残余物在真空下干燥，以提供固体形式的儿茶酚硫酸盐二钾盐(约200mg)，将其使用而无需进一步纯化。定量NMR分析表明该物质的纯度为约36％，可能是与硫酸钾混合的二钾盐。C6H6O2 S-H]-的HRMS(ESI)m/z计算为188.9863。所观察到的儿茶酚硫酸盐二钾盐的m/z为188.9860。1HNMR谱(500MHz；D2O)；δ(以ppm计)7.34-7.28(dd，1H)；7.05-7.01(dt，1H)；6.76-6.74(dd，1H)，6.56-6.53(dt，1H)。
V.校准范围的确定
使用掺有已知浓度的校准标准的溶液确定每种分析物的校准范围。对于每种分析物，LLOQ代表校准范围的下限，而校准范围的上限则由ULOQ代表。
在一个实例中，为了覆盖粪便样品中的校准范围，使用了8种校准标准(表2中的标准A-H)。
表2.分析物的校准范围
在另一个实例中，为了覆盖血清样品的校准范围，使用了以下校准范围：4-乙基苯硫酸盐为1.00-400ng/mL，对甲酚硫酸盐为5.00-2000ng/mL，3-硫酸吲哚酚为10.0-4000ng/mL，儿茶酚硫酸盐为10.0-4000ng/mL，吲哚乳酸酯为10.0-4000ng/mL，吲哚丙酸酯为5.00-2000ng/mL，并且三甲胺氧化物(TMAO)为7.50-3000ng/mL。
本领域普通技术人员将理解如何在不进行过度实验的情况下确定其他分析物和/或样品类型的校准范围。可以以相应校准浓度的100倍或250倍制备校准加标溶液。加标溶液用于生产用于分析运行的组合校准标准。
VI.样品制备
固体样品
将约20mg的实验样品材料(人粪便材料)称重放入1.5mL管中，并记录确切重量。一些固体样品(例如粪便样品)在称重之前可能需要冻干以干燥样品。
通过合并粪便样品并用分析物进行强化或用PBS或水稀释(根据需要)来制备粪便的QC样品，以获得所需的分析物水平。使用前，所有QC样品均储存在-80℃下。
对于校准标准、空白和空白-IS样品，将20.0μL的水加入到1.5mL管中。对于QC样品，将约20.0mg的与实验样品类型相对应的QC样品材料添加到1.5mL管中，并记录准确的重量。对于组合校准标准，将80.0μL体积的校准溶液(对应于要测量的每种分析物所确定的校准范围)添加到相应的组合校准标准管(例如A-H)中，并将80.0μL体积的乙醇/乙腈/水(2:1:1)添加到标准、空白-IS、QC和实验样品中。将20.0μL的WIS溶液添加到组合校准标准、空白-IS、QC和实验样品中，并将20.0μL的乙腈/水(1:1)添加到空白样品中。
液体样品
将50.0μl实验样品(猫血清)加入微量滴定板的孔中。通过合并12个血清批次并取合并样品的等分试样来制备血清的QC样品；分析物为内源水平。所有的QC样品均存储在-80℃直至用于分析。
对于空白和空白-IS样品，将50.0μL的水加入微量滴定板的孔中。对于校准标准，将50.0μL相应的校准溶液添加到微量滴定板的孔中。对于QC样品，将50.0μL相应样品类型的QC样品材料添加到微量滴定板的孔中。将20.0μL体积的WIS溶液添加到校准标准、空白-IS、QC样品和实验样品中，并将20.0μL的水添加到空白样品中。
VII.提取
对于色谱方法1-3，通过向所有样品中加入200μL溶于70％甲醇中的1％的甲酸来沉淀蛋白质并提取分析物，然后将样品摇晃或涡旋5分钟，然后以4000rpm离心5分钟。将150μL的澄清上清液转移至新鲜的96孔板中。将板盖上盖子并进行LC-MS/MS分析。
对于色谱方法4和5，将40μL ACN/水添加至空白样品，并将20μL ACN/水添加至空白-IS、QC和实验样品。通过向所有样品中加入200μL甲醇沉淀蛋白质并提取分析物，然后将样品摇晃或涡旋，然后离心。将100μL的澄清上清液转移至新鲜的96孔板中。将板盖上盖子并进行LC-MS/MS分析。
实施例1：色谱纯化和分离来自样品的分析物
使用UHPLC开发了分析多达58种分析物的色谱方法。将分析物分成组，每个组具有单独的色谱方法。
对于每种色谱方法，对于所分析的每个样品，将1.0μL最终提取溶液的单个固定等分试样进样到UPLC柱上。配有二元溶剂泵单元、冷藏自动进样器(设置为4℃)和柱加热器(色谱方法1-3设置为60℃，而色谱方法4和5设置为50℃)的Agilent 1290Infinity UHPLC系统用于液相色谱法，伴随用于色谱方法1、2和4的反相柱(Waters ACQUITY BEH C18，1.7μm，2.1×100mm)、用于色谱方法3的HILIC柱(XBridge BEH Amide，2.5μm，2.1×100mm)以及用于色谱方法5的Waters Acquity BEH酰胺(1.7μm，2.1×150mm)柱。下面进一步举例说明每种色谱方法。
A.色谱方法1
在一个实例中，开发了一种用于在同一进样中纯化和分离一组多达19种分析物的液相色谱方法，所述分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)。可以使用该方法来测量一种或多种分析物(例如，2种或更多种、3种或更多种和多达19种分析物及选自所述组的组合)的量。
流动相A是溶于水中的PFPA，而流动相B是溶于乙腈中的PFPA。进行线性梯度洗脱，其初始条件是0.5％的流动相B(99.5％的流动相A)和600μL/min的流速。包括色谱和质谱在内的总运行时间为7.00分钟。
在色谱方法1的一个实例中，如上所述制备了粪便样品。对于所分析的每个样品，将1.0μL的最终分析样品的单个固定等分试样注入色谱柱。在此实例中，色谱方法1分离了具有良好峰形的多达17种分析物。对于粪便样品，所得的分离出的分析物N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)和法莫替丁的示例性色谱图显示在图1(A-B)中。表3中显示了大致的保留时间(以分钟计)。
B.色谱方法2
在另一个实例中，开发了一种用于在同一进样中纯化和分离一组多达32种分析物的液相色谱方法，所述分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸和尿石素A。可以使用该方法来测量一种或多种分析物(例如，2种或更多种、3种或更多种和多达32种分析物及选自所述组的组合)的量。
流动相A是溶于水中的甲酸，而流动相B是溶于乙腈中的甲酸。进行线性梯度洗脱，其初始条件是0％的流动相B(100％的流动相A)和600μL/min的流速。包括色谱和质谱在内的总运行时间为9.00分钟。
在色谱方法2的一个实例中，如上所述制备了粪便样品。对于所分析的每个样品，将1.0μL的最终分析样品的单个固定等分试样注入色谱柱。在此实例中，色谱方法2分离了具有良好峰形的多达25种分析物。对于粪便样品，所得的分离出的分析物甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐和牛磺脱氧胆酸盐的示例性色谱图显示在图2(A-C)中。表4中显示了大致的保留时间(以分钟计)。
C.色谱方法3
另一个实例中，开发了一种用于在同一进样中纯化和分离一组多达5种分析物的液相色谱方法，所述分析物选自：木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。可以使用该方法来测量一种或多种分析物(例如，2种或更多种、3种或更多种和多达5种分析物及选自所述组的组合)的量。
流动相A是溶于水中的三乙胺，而流动相B是溶于乙腈中的三乙胺。进行线性梯度洗脱，其初始条件是2％的流动相A(98％的流动相B)和600μL/min的流速。包括色谱和质谱在内的总运行时间为6.00分钟。
在色谱方法3的一个实例中，如上所述制备粪便样品。对于所分析的每个样品，将1.0μL的最终分析样品的单个固定等分试样注入色谱柱。在此实例中，色谱方法3分离了具有良好峰形的多达3种分析物。对于粪便样品，所得的分离出的分析物木糖、棉子糖和水苏糖的示例性色谱图显示在图3中。表5中显示了大致的保留时间(以分钟计)。
D.色谱方法4
在另一个实例中，开发了一种用于在同一进样中纯化和分离一组多达6种分析物的液相色谱方法，所述分析物选自：儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚。可以使用该方法来测量一种或多种分析物(例如，2种或更多种、3种或更多种和多达6种分析物及选自所述组的组合)的量。
流动相A是溶于水中的甲酸，而流动相B是溶于乙腈中的甲酸。进行线性梯度洗脱，其初始条件是10％的流动相B(90％的流动相A)和550μL/min的流速。包括色谱和质谱在内的总运行时间为5.50分钟。
在色谱方法4的一个实例中，如上所述制备血清样品。对于所分析的每个样品，将1.0μL的最终分析样品的单个固定等分试样注入色谱柱。在此实例中，色谱方法4分离了具有良好峰形的多达6种分析物。所得的分离出的分析物儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚的示例性色谱图显示在图4中。表6中显示了大致的保留时间(以分钟计)。
E.色谱方法5
在另一个实例中，开发了一种用于纯化和分离三甲胺-N-氧化物(TMAO)的液相色谱方法。可以使用该方法测量三甲胺-N-氧化物(TMAO)的量。
流动相A是溶于水中的甲酸铵，而流动相B是在乙腈/水中的甲酸铵。进行线性梯度洗脱，其初始条件是5％的流动相A(95％的流动相B)和550μL/min的流速。包括色谱和质谱在内的总运行时间为4.30分钟。
在色谱方法5的一个实例中，如上所述制备血清样品。对于所分析的每个样品，将1.0μL的最终分析样品的单个固定等分试样注入色谱柱。色谱方法5分离了具有良好峰形的三甲胺-N-氧化物(TMAO)。三甲胺-N-氧化物(TMAO)的示例性色谱图显示在图5中，表4中显示了大致的保留时间(以分钟计)。
实施例2：质谱测量分析物
使用具有Turbo V源(ESI)的AB Sciex QTrap 6500质谱仪，按照以下方法所述对样品提取物进行质谱。从仪器获取原始数据，并使用Analyst 1.6.2软件(AB Sciex)处理。为了定量，通过加权(1/x)线性或二次回归将分析物与内标的峰面积比与校准标准的浓度进行拟合。所得的校正曲线的斜率和截距用于计算实验样品中的未知浓度。
A.MS方法1
开发了MS方法以检测和测定分析物的量。在该方法(MS方法1)中，仪器以正多反应监测(MRM)模式运行。离子喷雾电压设置为5.5kV，源温度为500℃，气帘气(例如氮气)为35psi，雾化器和去溶剂化气(例如氮气)的流速为70psi，碰撞激活解离(CAD)气(例如氮气)为中等。甲醇用于针洗。
MS方法1可以用于在单次进样中检测和测定一组分析物的量，所述分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)。可以使用该方法来测量一种或多种分析物(例如，2种或更多种、3种或更多种和多达19种分析物及选自所述组的组合)的量。
在一个实例中，将MS方法1与色谱方法1一起使用以测定一组分析物的量。在该实例中，将来自实施例1、色谱方法1中所述的色谱柱的洗脱液直接和自动引入质谱仪的电喷雾源中。
在表3中列出了使用色谱方法1/MS方法1产生的用于下述的定量的示例性离子：吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、N-棕榈酰丝氨醇、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)和法莫替丁。母离子列在名为“母离子(m/z)”的列下，而子离子列在标为“子离子(m/z)”的列下。本实例中用于定量的子离子的选择针对分析测量范围内的灵敏度进行了优化；但是，在实例中，可以选择其他子离子来替换或增加用于定量的子离子。
表3.来自色谱方法1和MS方法1的分析物的母离子和子离子的质荷比(m/z)
在另一个实例中，将MS方法1与色谱方法5结合使用以检测和测定三甲胺-N-氧化物(TMAO)的量。在该实例中，将来自实施例1、色谱方法5中所述的色谱柱的洗脱液直接和自动引入质谱仪的电喷雾源中。
表4中列出了使用色谱方法5/MS方法1产生的用于定量三甲胺-N-氧化物(TMAO)的示例性离子。
表4.来自色谱方法5和MS方法1的分析物的母离子和子离子的质荷比(m/z)
B.MS方法2
开发了MS方法(MS方法2)以检测和测定分析物的量。对于此方法，MS仪器在负MRM模式下运行。离子喷雾电压设置为-4.5kV，源温度为500℃，气帘气(例如氮气)为35psi，雾化器和去溶剂气(例如氮气)的流速为70psi，碰撞激活解离(CAD)气(例如氮气)为中等。甲醇用于针洗。
在一个实例中，将MS方法2与色谱方法2一起使用，以在单次进样中检测和测定一组分析物的量，所述分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸和尿石素A。
在该实例中，将来自实施例1、色谱方法2中所述的色谱柱的洗脱液直接和自动引入质谱仪的电喷雾源中。
在表5中列出了使用色谱方法2/MS方法2产生的用于下述的定量的示例性离子：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐和牛磺脱氧胆酸盐。
表5.来自色谱方法2和MS方法2的分析物的母离子和子离子的质荷比(m/z)
在另一个实例中，将MS方法2与色谱方法4一起使用，以检测和测定一组分析物的量，该组分析物选自：儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚。
将来自实施例1、色谱方法4中所述的色谱柱的洗脱液直接和自动引入质谱仪的电喷雾源中。
表6中列出了使用色谱方法4/MS方法2产生的用于定量儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚的示例性离子。
表6.来自色谱方法4和MS方法2的分析物的母离子和子离子的质荷比(m/z)
| 分析物 | 母离子(m/z,±0.5) | 子离子(m/z,±0.5) | 大致的保留时间(分钟) |
| 3-硫酸吲哚酚 | 212 | 80.95 | 1.4 |
| 3-硫酸吲哚酚-<sup>13</sup>C<sub>6</sub> | 218.1 | 138.2 | 1.4 |
| 儿茶酚硫酸盐 | 188.95 | 108.0 | 1.1 |
| 儿茶酚硫酸盐-<sup>13</sup>C<sub>6</sub> | 195 | 114.0 | 1.1 |
| 对甲酚硫酸盐 | 187 | 107.05 | 2.1 |
| 对甲酚硫酸盐-d<sub>7</sub> | 194 | 114.05 | 2.1 |
| 吲哚乳酸酯 | 204.05 | 128.0 | 2.4 |
| 吲哚乳酸酯-d<sub>5</sub> | 209.1 | 132.0 | 2.4 |
| 乙基苯硫酸盐 | 201 | 121.05 | 3.3 |
| 乙基苯硫酸盐-d<sub>4</sub> | 205 | 125.05 | 3.3 |
| 吲哚丙酸酯 | 188.05 | 59 | 3.9 |
| 吲哚丙酸酯-d<sub>2</sub> | 190 | 61 | 3.9 |
C.MS方法3
开发了另一种MS方法(MS方法3)，以在单次进样中检测和测定一组分析物的量，该组分析物选自：木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)。可以使用该方法来测量一种或多种分析物(例如，2种或更多种、3种或更多种和多达5种分析物及选自所述组的组合)的量。
仪器在负MRM模式下运行。离子喷雾电压设置为-3.5kV，源温度为500℃，气帘气(例如氮气)为20psi，雾化器和去溶剂气(例如氮气)的流速为60psi，碰撞激活解离(CAD)气(例如氮气)为中等。
在一个实例中，将来自实施例1、色谱方法3中所述的色谱柱的洗脱液直接和自动引入质谱仪的电喷雾源中。表7中列出了为定量木糖、棉子糖和水苏糖而产生的示例性离子。
表7.来自色谱方法3和MS方法3的分析物的母离子和子离子的质荷比(m/z)
实施例3：定量测量固体实验样品中的分析物。
将粪便样品冻干过夜直至干燥。将干燥后的样品匀浆，并将约20mg样品称重放入1.5mL管中；记录确切重量。除实验性粪便样品外，还为每次分析运行准备了组合校准标准、空白、空白-IS和QC样品。对于校准标准、空白和空白-IS样品，将20.0μL的水添加到1.5mL管中。对于QC样品，将约20.0mg冻干QC样品添加到1.5mL管中，并记录准确的重量。对于组合校准标准，将80.0μL体积的校准溶液(与实施例V.校准范围的确定中确定的每种分析物的校准范围水平相对应)添加到相应的管中，并将80.0μL体积的乙醇/乙腈/水(2:1:1)添加到装有标准、空白-IS、QC和实验样品的管中。将20.0μL体积的WIS溶液添加到含有校准标准、空白-IS、QC和实验样品的管中，并将20.0μL的乙腈/水(1:1)添加到用于空白样品的管中。
为了沉淀蛋白质和提取分析物，向样品中加入200μL的在70％甲醇中的1％甲酸，并将样品摇晃或涡旋5分钟，并以4000rpm离心5分钟。为了进行样品分析，将150.0μL体积的澄清上清液转移到新鲜的96孔板的适当孔中。将板盖上盖子并进行LC-MS/MS分析。
使用实施例1和2中所述的LC和MS方法在实验样品中测量分析物。这些方法用于测定粪便样品中下述分析物的绝对量：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖和水苏糖。
使用色谱方法1和MS方法1在单次进样中测量了下述分析物：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)和法莫替丁，运行时间为7.0分钟。
使用色谱方法2和MS方法2在单次进样中测量了下述分析物：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐和牛磺脱氧胆酸盐，运行时间为9.0分钟。
使用色谱方法3和MS方法3在单次进样中测量了下述分析物：木糖、棉子糖和水苏糖，运行时间为6.0分钟。
使用所述方法确定所测量的样品中分析物的量示于表8中。
表8.来自代表性的粪便样本的结果
实施例4：定量测量液体实验样品中的分析物。
合并来自多个供体的血清样品，并将50.0μl的合并样品的等分试样添加至微量滴定板的孔中。对于空白和空白-IS样品，将50.0μL PBS加入微量滴定板的孔中。对于组合校准标准样品，将50.0μL校准溶液(对应于每种待测分析物的确定的校准范围)添加到微量滴定板的孔中。对于QC样品，将50.0μL相应样品类型的QC样品添加到微量滴定板的孔中。将20.0μL体积的WIS溶液添加到含有校准标准、空白-IS、QC和实验样品的孔中，并将20.0μL的水添加到含有空白样品的孔中。将40μL ACN/水添加到具有空白样品的孔中，将20μL ACN/水添加到含有空白-IS、QC和实验样品的孔中。
为了沉淀蛋白质和提取分析物，向所有样品中加入200μL甲醇，并将样品摇晃或涡旋，然后离心。将100μL的澄清上清液转移至新鲜的96孔板中。将板盖上盖子并进行LC-MS/MS分析。
使用实施例1和2中所述的LC和MS方法在实验样品中测量分析物。这些方法用于测定血清样品中下述分析物的绝对量：儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯、硫酸吲哚酚和三甲胺-N-氧化物(TMAO)。
使用色谱方法4和MS方法2在单次进样中测量下述分析物：儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚，运行时间为5.50分钟。
使用色谱方法5和MS方法1在单次进样中测量分析物三甲胺-N-氧化物(TMAO)，运行时间为4.30分钟。
使用所述方法确定所测量的代表性合并血清样品中的分析物的量示于表9中。
表9.来自代表性的血清样本的结果
| 分析物 | 浓度(ng/mL) |
| 3-硫酸吲哚酚 | 152 |
| 儿茶酚硫酸盐 | 171 |
| 对甲酚硫酸盐 | 72.8 |
| 吲哚乳酸酯 | 197 |
| 乙基苯硫酸盐 | 17.2 |
| 3-吲哚丙酸 | 101 |
| 三甲胺-N-氧化物 | 135 |
Claims (38)
1.通过质谱测定样品中一种或多种分析物的量的方法，其中所述一种或多种分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐、3-吲哚乳酸及其组合，所述方法包括：
a)在适于从所述一种或多种分析物中的每种分析物产生可通过质谱检测到的一种或多种离子的条件下，将样品引入电离源，其中在电离之前分析物不被衍生化；
b)通过质谱测量来自所述一种或多种分析物中的每种分析物的一种或多种离子的量；和
c)使用所测量一种或多种离子的量来测定样品中所述一种或多种分析物中的每种分析物的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)，并且其中在单次进样中测定所述一种或多种分析物的量。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸和尿石素A，并且其中在单次进样中测定所述一种或多种分析物的量。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种分析物选自：木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，并且其中在单次进样中测定所述一种或多种分析物的量。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种分析物选自：儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚，并且其中在单次进样中测定所述一种或多种分析物的量。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在将所述样品引入所述电离源之前，已经通过液相色谱法对其进行了纯化。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述液相色谱法选自高效液相色谱法、超高效液相色谱法和湍流液相色谱法。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在将所述样品引入所述电离源之前，已经通过高效液相色谱法或超高效液相色谱法对其进行了纯化。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多种分析物包括两种或更多种分析物。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多种分析物包括三种或更多种分析物。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多种分析物包括四种或更多种分析物。
12.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多种分析物包括五种或更多种分析物。
13.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多种分析物包括六种或更多种分析物。
14.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述多种分析物包括七种或更多种分析物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述多种分析物包括N-棕榈酰丝氨醇和一种或多种选自下述的分析物：吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐和3-吲哚乳酸。
16.根据权利要求2所述的方法，其中所述电离源以正电离模式操作。
17.根据权利要求3-5中任一项所述的方法，其中所述电离源以负电离模式操作。
18.根据权利要求1所述的方法，其中
所述多种分析物中的第一一种或多种分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)，并且其中在单次进样中测定所述多种分析物中的第一一种或多种分析物；和
所述多种分析物中的第二一种或多种分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸和尿石素A，并且其中在单次进样中测定所述多种分析物中的第二一种或多种分析物。
19.根据权利要求1所述的方法，其中
所述多种分析物中的第一一种或多种分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)，并且其中在单次进样中测定所述多种分析物中的第一一种或多种分析物；和
所述多种分析物中的第二一种或多种分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸和尿石素A，并且其中在单次进样中测定所述多种分析物中的第二一种或多种分析物；和
所述多种分析物中的第三一种或多种分析物选自：木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，并且其中在单次进样中测定所述多种分析物中的第三一种或多种分析物。
20.根据权利要求1所述的方法，其中用于测定所述多种分析物中的每种分析物的量的所述一种或多种离子是选自表3、4、5、6和7中的离子中的一种或多种离子。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种分析物之一包括N-棕榈酰基丝氨醇，并且所述一种或多种离子包括选自下述的一种或多种离子：质荷比为330.3±0.5、312.1±0.5、239.1±0.5、149.1±0.5、139.1±0.5、92.1±0.5和74.1±0.5的离子。
22.根据权利要求1所述的方法，其中使用内标来测定所述样品中的所述一种或多种分析物中的每种分析物的量。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述内标包括一种或多种待测分析物中至少一种分析物的同位素标记类似物。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述内标选自：N-棕榈酰丝氨醇-d3、三甲胺-N-氧化物-13C3、3-吲哚丙酸-d2、吲哚-d7、N-乙酰尸胺-d3、5-氨基戊酸-d4、尸胺-d4、法莫替丁-13C3、γ-氨基丁酸-d6、5-羟色胺-d4、哌啶酸-d9、咪唑丙酸-d3、咪唑乳酸-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、色氨酸-d5、对甲酚-d7、苯甲酸-d5、马尿酸盐-d5、4-羟基苯乙酸-d6、3-苯基乳酸-d5、(4-羟基苯基)-2-丙酸-d6、柚皮素-d3、(3-苯基丙酰基)甘氨酸-13C2,15N1、苯乙酰基甘氨酸-d5、对甲酚硫酸盐-d7、肠二醇-d6、肠内酯-d6、苯酚硫酸盐-d3、大豆素-d4、芹菜素-d5、对甲酚葡糖苷酸-d7、染料木素-d4、乙基苯硫酸盐-d4、雌马酚-d4、3-硫酸吲哚酚-13C6、苯乙酸-d7、脱氧胆酸-d4、石胆酸-d4、牛磺脱氧胆酸-d5、乳酸-d4、木糖-13C5、棉子糖-d9、水苏糖-d7、二氨基庚二酸-13C7,15N2、三甲胺-13C3、氢化肉桂-d5酸、4-乙基苯酚-2,3,5,6-d4,OD、4-羟基苯基乳酸-d2、肉桂-d5酸、肉桂酰甘氨酸-2,2-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、尿石素B-13C6、N-乙酰胞壁酸-d3、N-乙酰-D-神经氨酸-1,2,3-13C3、儿茶酚硫酸盐-13C6和吲哚乳酸酯-d5及其组合。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述质谱是串联质谱。
26.一种试剂盒，其包含一种或多种同位素标记类似物，所述类似物作为一种或多种选自下述的分析物中的每一种分析物的内标：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、木糖、棉子糖、水苏糖、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、儿茶酚硫酸盐、3-吲哚乳酸及其组合，以及包装材料和使用该试剂盒的说明。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述一种或多种分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯、三甲胺(TMA)及其组合。
28.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述一种或多种分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸、尿石素A及其组合。
29.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述一种或多种分析物选自：木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)及其组合。
30.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述一种或多种分析物选自：N-乙酰尸胺、5-氨基戊酸酯、咪唑丙酸酯、β-咪唑乳酸酯、N-棕榈酰丝氨醇、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、柚皮素、苯酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、棉子糖、水苏糖、4-羟基苯基乳酸酯、苯酚葡糖苷酸、N-乙酰胞壁酸、儿茶酚硫酸盐及其组合。
31.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述内标包含一个或多个选自下述的内标：N-棕榈酰丝氨醇-d3、三甲胺-N-氧化物-13C3、3-吲哚丙酸-d2、吲哚-d7、N-乙酰尸胺-d3、5-氨基戊酸-d4、尸胺-d4、法莫替丁-13C3、γ-氨基丁酸-d6、5-羟色胺-d4、哌啶酸-d9、咪唑丙酸-d3、咪唑乳酸-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、色氨酸-d5、对甲酚-d7、苯甲酸-d5、马尿酸盐-d5、4-羟基苯乙酸-d6、3-苯基乳酸-d5、(4-羟基苯基)-2-丙酸-d6、柚皮素-d3、(3-苯基丙酰基)甘氨酸-13C2,15N1、苯乙酰基甘氨酸-d5、对甲酚硫酸盐-d7、肠二醇-d6、肠内酯-d6、苯酚硫酸盐-d3、大豆素-d4、芹菜素-d5、对甲酚葡糖苷酸-d7、染料木素-d4、乙基苯硫酸盐-d4、雌马酚-d4、3-硫酸吲哚酚-13C6、苯乙酸-d7、脱氧胆酸-d4、石胆酸-d4、牛磺脱氧胆酸-d5、乳酸-d4、木糖-13C5、棉子糖-d9、水苏糖-d7、二氨基庚二酸-13C7,15N2、三甲胺-13C3、氢化肉桂-d5酸、4-乙基苯酚-2,3,5,6-d4,OD、4-羟基苯基乳酸-d2、肉桂-d5酸、肉桂酰甘氨酸-2,2-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、尿石素B-13C6、N-乙酰胞壁酸-d3、N-乙酰-D-神经氨酸-1,2,3-13C3、儿茶酚硫酸盐-13C6和吲哚乳酸酯-d5及其组合。
32.根据权利要求27所述的试剂盒，其中所述内标包含一个或多个选自下述的内标：N-棕榈酰丝氨醇-d3、3-吲哚丙酸-d2、吲哚-d7,、色氨酸-d5、5-氨基戊酸-d4、哌啶酸-d9、N-乙酰尸胺-d3、尸胺-d4、三甲胺-N-氧化物-13C3、γ-氨基丁酸-d6、5-羟色胺-d4、咪唑丙酸-d3、咪唑乳酸-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、法莫替丁-13C3、二氨基庚二酸-13C7,15N2、三甲胺-13C3及其组合。
33.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述内标包含一个或多个选自下述的内标：对甲酚-d7、3-硫酸吲哚酚-13C6、4-羟基苯基乳酸-d6、(4-羟基苯基)-2-丙酸-d6、苯甲酸-d5、苯乙酸-d7、3-苯基乳酸-d5、马尿酸盐-d5、乳酸-d4、(3-苯基丙酰基)甘氨酸-13C2,15N1、苯乙酰基甘氨酸-d5、乙基苯硫酸盐-d4、苯酚硫酸盐-d3、对甲酚硫酸盐-d7、对甲酚葡糖苷酸-d7、肠二醇-d6、肠内酯-d6、雌马酚-d4、大豆素-d4、芹菜素-d5、柚皮素-d3、染料木素-d4、脱氧胆酸-d4、石胆酸-d4、牛磺脱氧胆酸-d5、氢化肉桂-d5酸、4-乙基苯酚-2,3,5,6-d4,OD、4-羟基苯基乳酸-d2、肉桂-d5酸、肉桂酰甘氨酸-2,2-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、尿石素B-13C6及其组合。
34.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述内标包含一个或多个选自下述的内标：木糖-13C5、棉子糖-d9、水苏糖-d7、N-乙酰胞壁酸-d3、N-乙酰-D-神经氨酸-1,2,3-13C3及其组合。
35.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述一种或多种内标选自：N-乙酰尸胺-d3、5-氨基戊酸酯-d4、咪唑丙酸酯-d3、β-咪唑乳酸-d3、N-棕榈酰丝氨醇-d3、环(-His-Pro)-d3、环(-Pro-Thr)-d3、环(-Gly-His)-d4、2-(4-羟基苯基)丙酸酯-d6、柚皮素-d3钠盐、苯酚硫酸盐-d3、乙基苯硫酸盐-d4、棉子糖-d9、水苏糖-d7、4-羟基苯基乳酸酯-d2、苯酚葡糖苷酸-d5、N-乙酰胞壁酸-d3、儿茶酚硫酸盐-13C6及其组合。
36.根据权利要求1所述的方法，其中
所述多种分析物中的第一一种或多种分析物选自：N-棕榈酰丝氨醇、吲哚丙酸酯、吲哚、色氨酸、5-氨基戊酸酯、哌啶酸酯、N-乙酰尸胺、尸胺、三甲胺-N-氧化物(TMAO)、γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺、咪唑丙酸酯、咪唑乳酸酯、环(-His-Pro)、环(-Pro-Thr)、环(-Gly-His)、法莫替丁、二氨基庚二酸酯和三甲胺(TMA)，并且其中在单次进样中测定所述多种分析物中的第一一种或多种分析物；和
所述多种分析物中的第二一种或多种分析物选自：甲酚、3-硫酸吲哚酚、4-羟基苯乙酸酯、2-(4-羟基苯基)丙酸酯、苯甲酸酯、苯乙酸、苯乳酸酯、马尿酸盐、乳酸酯、苯丙酰基甘氨酸、苯乙酰基甘氨酸、乙基苯硫酸盐、苯酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、对甲酚葡糖苷酸、肠二醇、肠内酯、雌马酚、大豆素、芹菜素、柚皮素、染料木素、脱氧胆酸盐、石胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、3-苯基丙酸酯、4-乙基苯酚、4-羟基苯基乳酸酯、肉桂酸酯、肉桂酰甘氨酸、苯酚葡糖苷酸和尿石素A，并且其中在单次进样中测定所述多种分析物中的第二一种或多种分析物；和
所述多种分析物中的第三一种或多种分析物选自：木糖、棉子糖、水苏糖、N-乙酰胞壁酸和N-乙酰神经氨酸(唾液酸)，并且其中在单次进样中测定所述多种分析物中的第三一种或多种分析物；和
所述多种分析物中的第四一种或多种分析物选自：儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯和硫酸吲哚酚，并且其中在单次进样中测定所述多种分析物中的第四一种或多种分析物。
37.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述一种或多种分析物选自：儿茶酚硫酸盐、对甲酚硫酸盐、乙基苯硫酸盐、吲哚乳酸酯、吲哚丙酸酯、硫酸吲哚酚及其组合。
38.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述内标包括选自下述的一种或多种内标：儿茶酚硫酸盐-13C6、对甲酚硫酸盐-d7、乙基苯硫酸盐-d4、吲哚乳酸酯-d5、吲哚丙酸-d2、3-硫酸吲哚酚-13C6及其组合。
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