CN108344830A

CN108344830A - 用于诊断前列腺癌的尿样组合标志物及检测试剂盒和方法

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Publication number: CN108344830A
Application number: CN201710053132.4A
Authority: CN
Inventors: 许国旺; 邵亚平; 赵欣捷
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2017-01-22
Filing date: 2017-01-22
Publication date: 2018-07-31
Anticipated expiration: 2037-01-22
Also published as: CN108344830B

Abstract

本发明涉及尿样中小分子代谢物乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5‑羟基‑L‑色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸作为组合标志物在制备用于诊断受试者中的前列腺癌患者的试剂盒中的新应用。本发明还涉及检测受试者中的前列腺癌患者的试剂盒，通过检测来自男性受试者的尿样中上述组合标志物各自的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量以及确定的截点值，判断所述受试者是否是前列腺癌患者。上述几种小分子代谢物联合使用，可在辅助诊断前列腺癌特别是处于临床“诊断灰区”的前列腺癌中得到应用。

Description

用于诊断前列腺癌的尿样组合标志物及检测试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及一种新的小分子组合标志物在前列腺癌诊断中的应用。属于分析化学及临床医学及医学领域。

背景技术

前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是严重威胁男性健康的恶性肿瘤之一。前列腺癌多发于欧美发达国家，其发病率居男性恶性肿瘤的首位，死亡率居第二位，仅次于肺癌。2016年，美国预计前列腺癌新增病例数为180890例，死亡数为26120例。我国前列腺癌的发病率较欧美发达国家为低，但近年来也有逐渐上升的趋势，且发病年龄趋于年轻化。由于前列腺癌的病理发展过程千变万化，不同个体的差别很大，早期前列腺癌的症状极不典型，临床分期也比较复杂，因此，前列腺癌在诊断上遇到瓶颈，以至于确诊时已多属于晚期。目前，临床上主要采用血清中前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen，PSA)作为前列腺癌诊断的肿瘤标志物，但其特异性和灵敏度有限，当PSA浓度在4.0～10.0ng/mL即所谓“诊断灰区”时给前列腺癌与前列腺良性增生的鉴别诊断带来困难，增加了很多不必要的穿刺活检。因此开发新的灵敏度更高，特异性更强的生物标志物及其检测方法以用于临床十分迫切。

已有研究表明，前列腺癌的发生涉及多条代谢通路的改变，表现在尿样样本中氨基酸、有机酸、酰基肉碱、磷脂酰胆碱、核苷以及糖类等小分子代谢物的含量在前列腺癌患者与正常人和前列腺良性增生人群之间存在显著差异[参考文献1：Ana Rita Lima,Mariade Lourdes Bastos,Márcia Carvalho,and Paula Guedes de Pinho.Translationaloncology,2016；9(4):357-370]。通过采用色谱质谱联用技术检测体液中的小分子代谢物，在疾病诊断中已经显示出优势并有成功的应用案例。如采用液相色谱质谱联用技术检测尿样中肌氨酸的含量来判别前列腺癌的进展[参考文献2：Arun Sreekumar,LailaM.Poisson,Thekkelnaycke M.Rajendiran,Amjad P.Khan,Qi Cao,Jindan Yu,BharathiLaxman,Rohit Mehra,Robert J.Lonigro,Yong Li,Mukesh K.Nyati,Aarif Ahsan,Shanker Kalyana-Sundaram,Bo Han,Xuhong Cao,Jaeman Byun,Gilbert S.Omenn,Debashis Ghosh,Subramaniam Pennathur,Danny C.Alexander,Alvin Berger,JeffreyR.Shuster,John T.Wei,Sooryanarayana Varambally,Christopher Beecher&ArulM.Chinnaiyan.Nature,2009；457(7231):910-914],甘氨鹅脱氧胆酸用于肝癌的诊断和预后评价[参考文献3：Baohong Wang,Deying Chen,Yu Chen,Zhenhua Hu,Min Cao,QingXie,Yanfei Chen,Jiali Xu,Shusen Zheng,and Lanjuan Li.Journal of proteome,2012；11(2):1217-1227]，组合标志物脯氨酰基羟脯氨酸、L-同型半胱氨酸、2-辛烯酰基肉碱、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺用于肝郁脾虚综合征的诊断[参考文献4：Aihua Zhang,HuiSun,Ying Han,Ye Yuan,Ping Wang,Gaochen Song,Xiaoxia Yuan,Miao Zhang,Ning Xieand Xijun Wang.Analyst,2012；137:4200-4208]等。鉴于此，本发明采用色谱质谱联用技术分析检测尿样中的代谢物，并通过化学计量学分析筛选出组合标志物，有望为前列腺癌的临床诊断提供新的有效检测手段。

本发明涉及的组合标志物乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸参与人体多种病理生理过程。有研究发现乙酰亮氨酸等乙酰化的氨基酸在枫糖尿症患者尿样中累积，体内氨基酸代谢的异常导致某一种或几种氨基酸水平升高，从而部分氨基酸转变为相应乙酰化的衍生物。酰基肉碱是由肉碱发生酶催化酯化反应的产物，对于脂肪酸从胞浆转移到线粒体发生β-氧化起重要作用，因而酰基肉碱通常与能量代谢相关联。研究表明，丙酰基肉碱可以通过提供丙酰基辅酶A回补三羧酸循环的中间代谢物[参考文献5：Malaguarnera,Mariano.Current Opinion inGastroenterology,2012；28(2):166-176]。丁酰基肉碱的变化有可能与酰基辅酶A脱氢酶异常表达相关。黄嘌呤核苷参与嘌呤代谢通路，前列腺癌的发生通常伴随嘌呤代谢的改变。硫酸对甲酚是一种微生物代谢物，可以通过对苯酚的二级代谢产生。已经发现进展型多发性硬化的患者尿样中的硫酸对甲酚异常增高，尿中硫酸对甲酚含量过高时，通常被认为具有尿毒性。犬尿酸、5-羟基-L-色氨酸和色氨酸参与色氨酸代谢通路。色氨酸是一种必需氨基酸，主要参与两种代谢途径：5-羟色胺途径和犬尿素途径。色氨酸是合成5-羟基-L-色氨酸的前体物质，5-羟基-L-色氨酸可以在芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC1)的作用下直接生成5-羟色胺，而5-羟色胺是一种要要的神经递质。犬尿酸也是色氨酸的代谢物之一，是已知的少数几个内源性的兴奋性氨基酸受体阻滞剂之一，当其浓度超出生理水平正常范围时，具有广谱的阻滞剂作用[参考文献6：Ying-Yong Zhao a,Jing Liu b,Xian-Long Cheng b,XuBai c,Rui-Chao Lin.Clinica Chimica Acta,2012；413:642-649]。目前为止，尚无研究将乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸作为组合标志物应用于前列腺癌的临床诊断。

发明内容

本发明的目的是针对前列腺癌早期诊断的特异性不强、容易出现过度诊断的临床问题，提供一种新的组合小分子代谢物应用于前列腺癌早期诊断，并提供了可用于检测上述组合标志物的方法。方法如下：

采用超高效液相色谱质谱联用的代谢组学分析技术，对前列腺良性增生和前列腺癌患者的尿样进行代谢组学指纹分析。分离系统为Waters ACQUITY UPLC系统，色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,Waters)柱，柱温控制在40摄氏度，进样室温度为4摄氏度，流动相流速为0.35mL/min，进样量为5μL。洗脱液为A相0.1％(v/v)甲酸的水溶液、B相为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液。洗脱梯度如下：0-1分钟，保持B为5％；1-18分钟，B从5％线性升到50％；在0.5分钟内B线性升到80％并保持4分钟；然后在0.5分钟内B回到初始5％，并保持3分钟平衡。正负离子模式下均采用相同的液相条件。检测器采用的质谱为Q ExactiveHF组合型四极杆Orbitrap质谱仪。

尿样预处理方法：

从-80摄氏度冰箱取出尿样并在冰浴条件下解冻，涡旋使其充分混匀，定量取60μL于1.5mL离心管。冰浴条件下定量加入240μL含有多个同位素内标的甲醇提取剂，涡旋2分钟混匀。在13000g，4℃条件下离心10分钟后，定量取上清液于1.5mL离心管，并在真空条件下冷冻干燥。干燥后的粉末用180μL 95％水(含5％甲醇)的复溶试剂复溶，涡旋混匀，在13000g，4℃条件下离心10分钟后，取上清液进样分析。通过总离子流图以及峰提取和峰匹配软件得到内标峰、肌酐峰和组合标志物中的八种代谢物乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸的峰面积，以确定这八种代谢物的相对肌酐浓度。提取剂中内标及其浓度见附表1。

使用数据处理软件SPSS对所获得的数据进行二元逻辑回归分析，所建模型的回归方程如下：

X＝87062.786*A+51190.039*B-23205.79*C+32807.545*D+56562.519*E-32166.936*F+16.661*G-2764.838*H+37.996

Pi(前列腺癌)＝1/(1+e^-x)

其中，A、B、C、D、E、F、G、H为乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸的相对肌酐浓度，Pi(前列腺癌)为前列腺癌的概率，截点值为0.824，即当Pi(前列腺癌)值大于0.824时，诊断为前列腺癌。

所建立的组合标志物模型对于区分PSA浓度在4.0～10.0ng/mL即所谓“诊断灰区”的前列腺癌与前列腺良性增生的患者具有很好的判别能力。组合标志物的曲线下面积(AUC)为0.993，高于临床诊断指标血清PSA(AUC＝0.478)(见图1)。组合标志物的灵敏度为93.5％、特异性为100％，均优于临床诊断指标血清PSA(见表2)。以上结果表明，本发明建立的组合标志物模型具有区分前列腺癌“诊断灰区”中前列腺癌与前列腺良性增生疾病的潜力。

本发明具有的效果是：尿样样品中小分子代谢物乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸可以联合用于前列腺癌的诊断。通过本发明涉及的组合标志物，对“诊断灰区”的前列腺癌与前列腺良性增生的区分具有高灵敏度、高特异性的优点，该组合标志物有望用于前列腺癌的辅助诊断。

附图说明

1.图1为组合标志物及PSA在判别处于“诊断灰区”的前列腺癌与前列腺良性增生组的ROC曲线图；

2.图2为组合标志物及PSA在判别处于“诊断灰区”的前列腺癌与前列腺良性增生组的诊断结果图。

具体实施方式

实施例1

1.尿样样本收集

尿样样品收集采集前，纳入研究的所有志愿者签署知情同意书。

包括46例前列腺癌患者和20例前列腺良性增生患者，所有前列腺癌患者都经过临床组织病理学确认患癌，所有前列腺良性增生患者都经过临床组织病理学确认为非癌。所有人的血清PSA浓度在4.0～10.0ng/mL范围之内。所有人均是在禁食8小时以上，次日早晨采集尿样，采集的尿样置于-80摄氏度冰箱保存，备用。

2.分析方法

2.1尿样样本预处理

从-80℃冰箱取出尿样并在冰浴条件下解冻，涡旋使其充分混匀，定量取60μL于1.5mL离心管。冰浴条件下定量加入240μL含有多个同位素内标的甲醇提取剂(内标的浓度见表1)，涡旋2分钟使其充分混匀。13000g，4℃条件下离心10分钟，定量取上清液于1.5mL离心管，并在真空条件下冷冻干燥，保存在-80℃冰箱中备用。进样分析前，样品用180μL 95％水(含5％甲醇)的复溶试剂复溶，涡旋2分钟混匀，在13000g，4℃条件下离心10分钟，取上清液5μL用于进样分析。

表1.提取液中的内标浓度

2.2超高效液相色谱质谱分析

(1)液相条件：色谱仪为Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱(Waters,Ireland)；色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,Waters)柱(Waters,Ireland)；洗脱液为A相0.1％(v/v)甲酸的水溶液、B相为0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液。洗脱梯度如下：0-1分钟，保持B为5％；1-18分钟，B从5％线性升到50％；在0.5分钟内B线性升到80％并保持4分钟；然后在0.5分钟内B回到初始5％，并保持3分钟平衡时间。色谱柱温度为40摄氏度，进样室温度为4摄氏度，流动相流速为0.35mL/min，进样量为5μL。正负离子模式下均采用相同的液相条件。

(2)质谱条件：Q Exactive HF组合型四极杆Orbitrap质谱仪(Thermo,USA)。正离子模式下的喷雾电压为3.5kV，负离子下的喷雾电压为3.0kV；毛细管温度为300℃，鞘流气流速为45arbitrary units，辅助气流速为10arbitrary units，辅助气体加热器温度为分辨率为350℃；S-lens rf水平为50.0。在全扫描模式下，分辨率设为120000，自动增益控制(AGC)以及最大离子注入时间(IT)分别设为1×10⁶和100ms。正负离子模式下的离子扫描范围为：70～1000。

2.3尿样测试结果及辅助诊断方法

通过对前列腺癌和前列腺良性增生患者尿样的指纹图谱分析，计算得到组合标志物乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸的相对浓度，同时，将各标志物的相对浓度值带入回归方程式中，计算出概率Pi，截点值为0.824，即组合标志物的概率大于0.824则认为是前列腺癌(图2)。同时对组合标志物的效果进行评价，发现组合标志物的AUC＝0.993，并且具有较高的灵敏度和特异性，分别为93.5％和100％(见表2)。而使用临床常用的指标血清PSA时，AUC＝0.478，灵敏度和特异性相比组合标志物来说也比较低。这说明对于PSA浓度在4.0～10.0ng/mL即所谓“诊断灰区”的前列腺癌与前列腺良性增生的诊断中，组合标志物具有很好的临床应用前景，有望解决处于“诊断灰区”的前列腺癌的临床判别难题。

表2.PSA和组合标志物在前列腺癌和前列腺良性增生诊断中的灵敏度和特异性

本发明检测受试者中的前列腺癌患者的试剂盒，通过检测来自男性受试者的尿样中上述组合标志物各自的相对浓度，基于二元逻辑回归方程计算所述组合标志物变量以及确定的截点值，判断所述受试者是否是前列腺癌患者。上述几种小分子代谢物联合使用，可在辅助诊断前列腺癌特别是处于临床“诊断灰区”的前列腺癌中得到应用。

Claims

1.用于诊断前列腺癌的尿样组合标志物，包括乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸。

2.一种权利要求1所述组合标志物在制备用于诊断受试者中的前列腺癌患者的试剂盒中的应用，所述组合标志物包括乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸。

3.一种检测受试者中的前列腺癌的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：

(1)标准化学品：乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸，所述标准品分别用于对应的尿样中小分子代谢物乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸的定性；

(2)含稳定同位素内标的提取液：所述提取液用于预处理来自受试者的尿样样品，为包含下述多种稳定同位素内标化合物的甲醇溶液，即含内标化合物D3-乙酰基肉碱、D3-己酰基肉碱、D3-癸酰基肉碱、D3-亮氨酸、D5-丙苯氨酸、D5-色氨酸、D4-胆酸、D4-去氧鹅胆酸和亮氨酸脑啡肽的甲醇溶液；

(3)用于洗脱色谱柱的洗脱溶液。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其中所述用于洗脱色谱柱的洗脱溶液是用于洗脱ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,Waters)色谱柱的洗脱液。

5.根据权利要求3或4所述的检测试剂盒，其中所述洗脱液是：0.1％(v/v)甲酸的水溶液和0.1％(v/v)甲酸的乙腈溶液。

6.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其中受试者为男性受试者，包括前列腺癌患者和/或对照组的前列腺良性增生患者。

7.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其中所述稳定同位素内标化合物于甲醇溶液中的浓度见表1。

8.一种非诊断目的的计算受试者的尿样中组合标志物变量的方法，所述组合标志物包括乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸，所述方法包括以下步骤：

(1)使用含稳定同位素内标的提取液预处理来自受试者的尿样，沉淀尿样中的蛋白并稀释其中代谢物，将上清液冷冻干燥后，用甲醇：水＝5：95v/v复溶，取上清，采用质谱分别在正离子模式和/或负离子模式下检测；

(2)基于液相色谱-质谱分析获得的总离子流图，采用峰提取和峰匹配软件SIEVE获得包含所述组合标志物乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸以及内标化合物D3-乙酰基肉碱、D3-己酰基肉碱、D3-癸酰基肉碱、D3-亮氨酸、D5-丙苯氨酸、D5-色氨酸、D4-胆酸、D4-去氧鹅胆酸和亮氨酸脑啡肽和肌酐的峰面积；

(3)对每一受试者尿样样本中所述组合标志物中的八种物质以及肌酐的峰面积分别与提取液中的内标物比较，获得乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸的相对浓度；随后再计算每一受试者样本中所述组合标志物中的八种物质与肌酐的比值，得到组合标志物中乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸相对肌酐的浓度值；

(4)以上述组合标志物乙酰亮氨酸、丙酰基肉碱、丁酰基肉碱、犬尿酸、黄嘌呤核苷、5-羟基-L-色氨酸、硫酸对甲酚和色氨酸的相对肌酐浓度值，基于二元逻辑回归方程计算组合标志物变量。

9.根据权利要求8所述方法，其中受试者为男性受试者，包括前列腺癌患者和/或对照组的前列腺良性增生患者。