CN117393154B - 基于血清全通路氧化脂质组学筛选心力衰竭生物标志物的方法及应用 - Google Patents
基于血清全通路氧化脂质组学筛选心力衰竭生物标志物的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开基于血清全通路氧化脂质组学分析心力衰竭生物标志物的方法及应用。本发明将氧化脂质全通路方法应用于心力衰竭大鼠及患者临床血清样本的检测，通过与健康血清样本比较，在心力衰竭大鼠血清中共得到多个潜在生物标志物，进一步通过临床心力衰竭患者血清进行验证，得到共同的5种差异代谢物，在此基础上进行二元逻辑回归逐步分析和受试者工作特征曲线ROC分析，综合得到将3个差异代谢物联合诊断指标。通过验证组样本数据对该联合诊断模型进行验证，结果显示，该联合诊断指标区分心力衰竭疾病的能力较强，具有优异的临床诊断意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物样本中氧化脂质的分析领域，具体地涉及基于血清全通路氧化脂质组学分析心力衰竭生物标志物的方法及应用。
背景技术
心力衰竭是指由于心脏的收缩功能和/或舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心力衰竭是许多形式的晚期心血管疾病最后阶段的临床表现。随着人口老龄化的进程加剧，患病率逐年攀升，给公共卫生保健系统和个人家庭带来沉重负担。生物标志物在心力衰竭临床实践及患者管理的各个方面都发挥着至关重要的作用，生物标志物的应用提供了一种快速、客观、低成本的定量工具。
现有技术中公开了用于诊断心力衰竭的标志物。例如，中国专利申请CN104470942A公开了一种生物标志物，即饥饿素信号肽(GHRsp)片段，其可用于在患有不同障碍、疾病和病症，包括肺炎、心力衰竭、或肺炎并发心力衰竭或疑似肺炎、心力衰竭、或肺炎并发心力衰竭的对象中诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和治疗方案。然而，该标志物并不是心力衰竭的特异性标志物。
中国专利申请CN114994325A公开了一种急性心力衰竭诊断生物标志物及其治疗用途，所述生物标志物为人外周血CD170+中性粒细胞、CD170蛋白及CD170+中性粒细胞特异性代谢产物。该生物标志物可用于急性心力衰竭的早期诊断。通过生物标志物可以识别急性心力衰竭的高发人群，据此改变这类患者的生活方式，促进其以健康的方式生活。针对急性心力衰竭患者的代谢异常，给予相应的生物标志物及生物标志物组合的治疗，能够有针对性的治疗急性心力衰竭。然而，该方法是从代谢产物、细胞、蛋白、三个方面进行诊断，诊断方法复杂。
中国专利申请CN115792237A公开了一种早期预测心力衰竭的生物标志物，其在大鼠急性心肌梗死后心力衰竭的动物模型上构建从心肌梗死到心力衰竭动态演变蛋白质分子网络，利用回归分析筛选出Vcan和Col1a1为心力衰竭早期预警标志物。进一步细胞水平研究发现，使用血管紧张素II处理后，心肌细胞的Vcan及Col1a1的表达显著升高，而采用抑制剂分别干预Vcan与Col1a1后，能够减缓血管紧张素II对心肌细胞的损伤，表明Vcan与Col1a1与疾病的进程密切相关。然而，该专利申请并没在人体内对标志物的效果进行验证。
综上，目前仍然需要更简单、更具有实用性的心力衰竭诊断标志物。
背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明研究发现氧化脂质代谢在心力衰竭治疗和诊断中具有潜在价值，并经深入研究进一步发现特定的氧化脂质或其联合可以作为诊断指标，用于区分心力衰竭具有优异效果。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种基于血清全通路氧化脂质组学分析心力衰竭生物标志物的方法，其包括：
(a) 在动物模型中进行全通路血清氧化脂质靶向代谢组学分析，得到具有显著差异的氧化脂质代谢物作为第一潜在生物标志物；
(b) 在健康和心力衰竭受试者中进行全通路血清氧化脂质靶向代谢组学分析，得到具有显著差异的氧化脂质代谢物作为第二潜在生物标志物；
(c) 取第一潜在生物标志物和第二潜在生物标志物中共同的生物标志物作为自变量，以心力衰竭为作因变量，利用二元逻辑回归分析筛选得到候选生物标志物；和
(d) 验证候选生物标志物的准确性；
其中，所述全通路包括氧化脂质中从亚油酸(LA)经LOX到oxoODEs通路、从LA经CYP环氧合酶到EpOMEs通路、从二高-γ-亚麻酸(DGLA)经LOX到HETrE通路、从DGLA经COX到前列腺素类(Prostanoids)通路、从花生四烯酸(AA)经LOX到LTs&LXs通路、从AA经LOX到中链HETEs通路、从AA经非酶促反应到中链HETEs通路、从AA经非酶促反应到异前列腺素(Isoprostanes)通路、从AA经CYP环氧合酶到EETs通路、从AA经CYP ω-羟化酶到HETEs通路、从AA经COX到前列腺素类通路、从ɑ-亚麻酸(ALA)经LOX到HOTrEs通路、从二十碳五烯酸(EPA)经LOX到HEPEs通路、从EPA经CYP环氧合酶HEPEs、从EPA经CYP环氧合酶EpETEs、从EPA经非酶促反应到HEPEs、从EPA经COX到前列腺素类通路、从二十二碳六烯酸(DHA)经LOX到HDHAs通路和从DHA经CYP环氧合酶到EpDPA通路。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述动物模型选自大鼠、小鼠、猪、狗或猫。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述动物模型为心力衰竭动物模型。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，进一步包括从血液萃取得到氧化脂质的步骤，其包括利用固相萃取柱和萃取试剂进行萃取，其中，所述固相萃取柱为亲水亲脂性柱，所述萃取试剂包括醇、水以及含甲酸的醇，所述氧化脂质的获得包括用醇和水分别平衡所述亲水亲脂性柱，将血液上柱并用纯水洗涤，在惰性环境下干燥柱后，用含甲酸的醇洗脱，并收集所需组分干燥后作为质谱样本。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，利用质谱仪进行血清氧化脂质靶向代谢组学的分析，所述质谱仪包括色谱柱和质谱试剂，所述质谱试剂包括含乙腈和水的流动相A和含乙腈和异丙醇的流动相B。
在某些实施方案中，根据本发明所述的方法，其中，所述质谱仪的梯度洗脱条件为：0-12.0 min，0-60% B；12.0-14.0 min，60-100% B；14.0-14.1 min，100-0% B；14.1-16.0 min，0% B；流速：0.4mL/min，柱温：40℃，样本室温：4℃，进样量：5μL。
本发明的第二方面，提供试剂在制备用于诊断心力衰竭的装置中的用途，其中，所述试剂为能够检测根据第一方面所述方法得到的生物标志物的试剂。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述试剂包括萃取试剂和质谱试剂。
在某些实施方案中，根据本发明所述的用途，其中，所述生物标志物为12-HETE、20-HETE和4-HDHA三者的组合。
本发明将氧化脂质全通路方法成功应用于心力衰竭大鼠及患者临床血清样本的检测，并且通过与健康血清样本比较，在心力衰竭大鼠血清中共得到10个潜在生物标志物，并且通过临床心力衰竭患者血清进行验证，得到共同的5种差异代谢物，分别包括(12-，15-，20-)HETE、PGD2和4-HDHA，进一步进行二元逻辑回归逐步分析和受试者工作特征曲线ROC 分析，综合得到12-HETE、20-HETE、4-HDHA这3个差异代谢物联合诊断指标，通过验证组样本数据对该联合诊断模型进行验证，结果显示，该联合诊断指标区分心力衰竭疾病的能力较强，具有优异的临床诊断意义。
附图说明
图1 为造模28天后各组缺血性心力衰竭大鼠的心功能指标比较。(A)左心室射血分数(EF)，(B)左心室缩短分数(FS)，(各组n=8-13)。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
图2造模一个月各组缺血性心力衰竭大鼠的血流动力学指标。(A)左室舒张末压(LVEDP)，(B)左室收缩压(LVSP)，(C)±dp/dtmin，(D)±dp/dtmax。(各组n=8-13)，与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
图3造模一个月后缺血性心力衰竭大鼠的血清B型钠尿肽(BNP)和神经末端前体脑利钠肽(NT-proBNP)检测结果(各组n=8-13)。与模型组相比，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
图4通过UPLC-MS/MS测定的健康组、假手术组和心力衰竭组大鼠的血清氧化脂质水平。数据为平均值±SEM。使用t检验对结果进行比较。与心力衰竭组相比*p<0.05、**p<0.01、***p＜0.001。
图5基于心力衰竭患者和健康对照组之间在负离子模式下检测到的血清代谢谱生成偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型。
图6基于心力衰竭患者和健康对照组之间在负离子模式下检测到的血清代谢谱生成偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型的置换检验(n=200，两主成分)。
图7通过UPLC-MS/MS测量的心力衰竭组和健康组的血清氧化脂质浓度(n=30-36)。数据为平均值±SEM。使用t检验对结果进行比较。与HF组相比*p<0.05、**p<0.01、***p＜0.001。
图8 12-HETE、20-HETE和4-HDHA单独诊断心力衰竭疾病的受试者工作特征曲线(n=30-36)。
图9 12-HETE、20-HETE和4-HDHA联合诊断心力衰竭疾病的受试者工作特征曲线(n=30-36)。
图10 161例验证临床样本中12-HETE、20-HETE和4-HDHA单独及联合诊断的受试者工作特征曲线。
图11本申请氧化脂质全通路示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明的第一方面，提供一种基于血清全通路氧化脂质组学分析心力衰竭生物标志物的方法，其包括：
(a) 在动物模型中进行血清氧化脂质靶向代谢组学分析，得到具有显著差异的氧化脂质代谢物作为第一潜在生物标志物；
(b) 在健康和心力衰竭受试者中进行血清氧化脂质靶向代谢组学分析，得到具有显著差异的氧化脂质代谢物作为第二潜在生物标志物；
(c) 取第一潜在生物标志物和第二潜在生物标志物中共同的生物标志物作为自变量，以心力衰竭为作因变量，利用二元逻辑回归分析筛选得到候选生物标志物；和
(d) 验证候选生物标志物的准确性。
本发明中，动物模型为构建得到的心力衰竭动物模型。其中，作为模型的动物包括但不限于大鼠、小鼠、猪、狗、猫等。心力衰竭动物模型的确认或鉴定包括但不限于心功能检测、血流动力学检测以及生化指标检测。其中，心功能检测包括左心室射血分数(EF)和左心室缩短分数(FS)检测。血流动力学检测包括左心室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP)、±dp/dtmin和±dp/dtmax等。生化指标检测包括但不限于B型钠尿肽(BNP)和神经末端前体脑利钠肽(NT-proBNP)检测。
本发明中，血清氧化脂质靶向代谢组学分析进一步包括从血清萃取得到氧化脂质的步骤。优选地，通过固相萃取来得到氧化脂质。固相萃取包括利用固相萃取柱和萃取试剂进行萃取。其中，固相萃取柱一般为亲水亲脂性柱，即HLB柱。萃取试剂包括醇、水和含甲酸的醇，如含甲酸的甲醇，三者一般以单独的形式存在。醇或含甲酸的醇的实例包括甲醇、乙醇等小分子醇，优选为甲醇。含甲酸的醇中甲酸的量基于体积一般为0.005-0.1%，例如0.01-0.08%，如0.02%、0.04%、0.06%、0.08%。如果甲酸的用量过低，则氧化脂质的提取倾向于过低，甚至达不到所需的量。另一方面，如果用量过高，则杂质倾向于升高。
在某些实施方案中，本发明的萃取步骤包括：用甲醇和水分别依次平衡固相萃取柱。上样后，用纯水洗涤固相萃取柱，在N2下干燥柱。接下来，用含有0.02%甲酸的甲醇洗脱小柱，将收集的样本在氮气下干燥后，用甲醇重新溶解，以用于进行UPLC-MS/MS分析。
本发明中，血清氧化脂质靶向代谢组学分析进一步包括利用质谱仪检测氧化脂质组成的步骤。质谱仪包括色谱柱和质谱试剂。其中，质谱仪和色谱柱不限定。质谱试剂包括流动相，其包括流动相A和流动相B，其中流动相A为乙腈水混合溶剂，其中乙腈与水的体积比为40-50:60-50。优选地，流动相A含有0.005-0.1%，例如0.01-0.08%，如0.02%、0.04%、0.06%、0.08%的甲酸，从而优化色谱峰形，提高分离度及灵敏度。流动相B为乙腈异丙醇溶剂，其中乙腈与异丙醇的体积比为45-55:55-45。
在某些实施方案中，本发明的色谱条件还包括控制流速为0.1-1mL/min，如0.2-0.8mL/min，还包括控制柱温为30-50℃，如35℃、40℃、45℃等。
本发明中，全通路包括氧化脂质中从LA经LOX到oxoODEs通路、从LA经CYP环氧合酶到EpOMEs通路、从DGLA经LOX到HETrE通路、从DGLA经COX到前列腺素类通路、从AA经LOX到LTs&LXs通路、从AA经LOX到中链HETEs通路、从AA经非酶促反应到中链HETEs通路、从AA经非酶促反应到异前列腺素通路、从AA经CYP环氧合酶到EETs通路、从AA经CYPω-羟化酶到HETEs通路、从AA经COX到前列腺素类通路、从ALA经LOX到HOTrEs通路、从EPA经LOX到HEPEs通路、从EPA经CYP环氧合酶HEPEs、从EPA经CYP环氧合酶EpETEs、从EPA经非酶促反应到HEPEs、从EPA经COX到前列腺素类通路、从DHA经LOX到HDHAs通路和从DHA经CYP环氧合酶到EpDPA通路。本发明的分析优选包括上述通路中的全部。本发明中，血清全通路氧化脂质靶向代谢组学分析至少包括分析OxoODE、13-OxoODE、9(10)-EpOME、12(13)-EpOME、9(10)-DiHOME、5(S)-HETrE、PGD1、PGE1、PGK1、PGF1α、11-deoxy-PGE1、PGD2、PGJ2、PGE2、PGF2α、6-keto-PGF1a、5-iPF2a-VI、TXB2、8,9-EET、5(6)-EET、11(12)-EET、14(15-EET、5,6-DIHETrE、5-HETE、9-HETE、11(S)-HETE、12-HETE、15-HETE、16-HETE、17-HETE、18-HETE、19(S)-HETE、20-HETE、5-OxoETE、15-OxoETE、LTB4、LTD4、LTE4、LXA4、LXB4、9(S)-HOTrE、13(S)-HOTrE、TXB3、PGF3α、5-HEPE、12-HEPE、15-HEPE、18-HEPE、LXA5、17(18)EpETE、5(S)(15(S)-DiHETE、5(6)-DiHETE、1-Mar、4-HDHA、7-HDHA、14(S)-HDHA、17-HDHA、RvE1、RvD1、RVD3、RvD2、RVD5、16(17)-EpDPA、TXB2-D4、PGF2a-D4、RvD2-D5、LXA4-D5、LTE4-D5、15-HEPE-D5、17-HDHA-D5和9-OxoODE-D3。优选地，至少分析9(S)-HOTrE、13(S)-HOTrE、13-OxoODE、9-OxoODE、12(13)-EpOME、9(10)-EpOME、9(10)-DiHOME、9-HETE、11(S)-HETE、12-HETE、16-HETE、18-HETE、15-HETE、5-HETE、5(6)-EET、20-HETE、7-HDHA、14(S)-HDHA、4-HDHA、PGD2、RvD2、5-HEPE、5-iPF2a-VI和5-OxoETE。
在某些实施方案中，本发明质谱仪的梯度洗脱条件包括0-12 min，0-60% B；12.0-14.0 min，60-100% B；14.0-14.1 min，100-0% B；14.1-16.0 min，0% B。即在0-12min内流动相由100%流动相A逐渐变为40%流动相A+60%流动相B；然后，在第12.0-14.0 min时间段内使使流动相进一步逐渐变为100%流动相B，在第14.0-14.1 min极短时间内，使流动相快速变为100%流动相A，并在第14.1-16.0 min时间段内保持100%流动相A洗脱。本发明的第二方面，提供试剂在制备用于分析心力衰竭的装置中的用途，其特征在于，所述试剂包括萃取试剂和质谱试剂。此类试剂通常以单独存在的形式提供。
本发明中，作为标志物优选地包括选自OxoODE、13-OxoODE、9(10)-EpOME、12(13)-EpOME、9(10)-DiHOME、5(S)-HETrE、PGD1、PGE1、PGK1、PGF1α、11-deoxy-PGE1、PGD2、PGJ2、PGE2、PGF2α、6-keto-PGF1a、5-iPF2a-VI、TXB2、8,9-EET、5(6)-EET、11(12)-EET、14(15-EET、5,6-DIHETrE、5-HETE、9-HETE、11(S)-HETE、12-HETE、15-HETE、16-HETE、17-HETE、18-HETE、19(S)-HETE、20-HETE、5-OxoETE、15-OxoETE、LTB4、LTD4、LTE4、LXA4、LXB4、9(S)-HOTrE、13(S)-HOTrE、TXB3、PGF3α、5-HEPE、12-HEPE、15-HEPE、18-HEPE、LXA5、17(18)EpETE、5(S)(15(S)-DiHETE、5(6)-DiHETE、1-Mar、4-HDHA、7-HDHA、14(S)-HDHA、17-HDHA、RvE1、RvD1、RVD3、RvD2、RVD5、16(17)-EpDPA、TXB2-D4、PGF2a-D4、RvD2-D5、LXA4-D5、LTE4-D5、15-HEPE-D5、17-HDHA-D5和9-OxoODE-D3。优选地，至少分析9(S)-HOTrE、13(S)-HOTrE、13-OxoODE、9-OxoODE、12(13)-EpOME、9(10)-EpOME、9(10)-DiHOME、9-HETE、11(S)-HETE、12-HETE、16-HETE、18-HETE、15-HETE、5-HETE、5(6)-EET、20-HETE、7-HDHA、14(S)-HDHA、4-HDHA、PGD2、RvD2、5-HEPE、5-iPF2a-VI和5-OxoETE中的至少一种。优选地，作为标志物的氧化脂质包括HETE、PGD2和4-HDHA中的一种或多种的组合。
在某些实施方案中，本发明将12-HETE、20-HETE和4-HDHA单独分别作为诊断标志物，其阈值分别为1541.177±10、626.394±10和652.420±10，优选地，分别为1541.177±5、626.394±5和652.420±5，进一步优选，分别为1541.177±2、626.394±2和652.420±2。
在某些实施方案中，本发明将12-HETE、20-HETE和4-HDHA三者联合作为诊断标志物，其阈值一般为0.226±0.1，优选0.226±0.05，还优选0.226±0.01，进一步优选0.226±0.005。
本发明中，用于分析心力衰竭的装置可以是任何形式，例如以试剂盒形式提供。可选地，试剂盒包括容器，其中预存所需的溶剂或试剂。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂或试剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。
在某些实施方案中，本发明的试剂盒中某些或某一组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，组成的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。
本发明中，作为试剂盒还可包括以政府机构规定的形式与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒或其部分结构还可任选地设置在适合的优选用于质谱操作的装置中。
在某些实施方案中，本发明的装置为系统，其包括试剂盒、质谱检测系统或其部分、固相萃取系统或其部分中的至少一种。其中，质谱检测系统包括色谱柱、检测器。固相萃取系统包括固相萃取柱。此处所述的系统还任选地进一步包括软件。
实施例
一、构建心力衰竭大鼠模型
1.1 大鼠左冠状动脉前降支结扎(LAD)模型制备
35只SPF级雄性SD大鼠(购于北京华阜康生物科技股份有限公司)，体重240±10g，大鼠适应环境3天后，于造模前12h禁食。随机分为空白组、假手术组和模型组。模型组使用无菌生理盐水配置3%戊巴比妥钠溶液，按0.2mL/100g的剂量进行腹腔麻醉。大鼠胸部去毛备皮，消毒，在无菌条件下沿左胸骨左缘1cm出纵行切开皮肤约2cm，在第四或第五助骨间钝性分离肌肉组织，打开胸腔并剪开心包膜，用钝性拉钩勾出心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间穿线，结扎左冠状动脉前降支，然后迅速将心脏放回胸腔，缝合胸腔及皮肤。左冠状动脉前降支行结扎术后观察每只大鼠的心电图，保留 ST 段弓背抬高≥0.1mV，即有心肌缺血症状的大鼠。假手术组除不结扎冠状动脉外，其余操作与造模动物相同。
造模后半个月及1个月时的血液样本，血清冰浴静置30min，4℃、3000rpm条件下离心10min，上清液分装后冻存于-80℃冰箱备用。采用腹部按摩法采集大鼠新鲜粪便，用于肠道菌群分析，在-80℃超低温冰箱中保存备用。
1.2 大鼠心力衰竭模型确认
在造模28天后进行心功能检测、血流动力学检测以及生化指标检测。应用小动物超声系统进行测定，心功能检测结果如图1所示，与假手术组和空白组相比，冠状动脉结扎诱导急性心肌梗死后第28天，大鼠左心室射血分数(EF)和左心室缩短分数(FS)显著降低，表明大鼠可能发生心力衰竭(见图1)。
采用颈动脉心室内插管法评估各组大鼠心脏血流动力学指标。血流动力学检测结果如图2所示，血流动力学评估表明，模型组的左心室舒张末压(LVEDP)高于假手术组和空白组；相反，与假手术组和空白组相比，接受冠状动脉结扎的大鼠的左心室收缩压(LVSP)、±dp/dtmin和±dp/dtmax显著降低。
取大鼠造模一个月后血清进行大鼠B型钠尿肽(BNP)和神经末端前体脑利钠肽(NT-proBNP)检测(采用THERMO全自动酶标仪MK3按照ELISA试剂盒进行)。生化指标检测显示模型大鼠的BNP和NT-proBNP浓度明显高于空白组和假手术大鼠(如图3所示)。
上述结果提示大鼠心力衰竭模型制作成功。
二、血清氧化脂质靶向代谢组学分析
2.1 样本前处理
采用由Trilution LH软件(RayKol Group Corp.，Ltd.)控制的Fotector Plus自动固相萃取(RayKol Group Corp.，Ltd.)。使用Oasis HLB(亲水亲脂性平衡)柱(1cc，30mg)萃取50 μl大鼠血清中的氧化脂质。用2mL甲醇和2mL水平衡固相萃取小柱。上样后，用2 mL纯水洗涤固相萃取小柱，在N2下干燥10分钟。用1.5 mL 含有0.02%甲酸的甲醇洗脱小柱，将收集的样本在氮气下干燥后，用50 μl 甲醇重新溶解，涡旋2分钟，并在4℃和12000 rpm下离心5分钟以进行UPLC-MS/MS分析。
2.2 色谱条件
Waters ACQUITY UPLC系统，色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱(2.1x100,1.7um)，流动相：A：乙腈：水=45:55(含0.02%甲酸)；B：乙腈：异丙醇=50:50，梯度洗脱：0-12min, 0-60% B; 12.0-14.0 min, 60-100% B; 14.0-14.1 min, 0% B; 14.1-16.0 min,0% B。流速：0.4mL/min，柱温：40℃，样本室温：4℃，进样量：5μL。
2.3 质谱条件
XEVO TQS检测器，离子源：ESI离子源。模式：负离子模式，毛细管电压：2KV，锥孔电压：40V，离子源温度：150℃，去溶剂温度：400℃；锥孔气流速：150L/Hr，去溶剂气流速：800L/Hr。MRM多反应监测模式下进行，采用Masslynx软件中的IntelliStart进行母子离子对、锥孔电压和碰撞能量的优化，结果见表1。
表1氧化脂质类化合物的质谱条件
| 编号 | 化合物 | 分子量 | 母离子(m/z) | 子离子(m/z) | 锥孔电压(V) | 碰撞能量(V) | 通路 | PUFAs |
| 1 | 9-OxoODE | 294.50 | 293.28 | 185.08 | 4 | 20 | LOX | LA |
| 2 | 13-OxoODE | 294.50 | 293.28 | 113.10 | 2 | 22 | LOX | LA |
| 3 | 9(10)-EpOME | 296.50 | 295.28 | 277.21 | 8 | 14 | CYP | LA |
| 4 | 12(13)-EpOME | 296.50 | 295.21 | 195.15 | 2 | 16 | CYP | LA |
| 5 | 9(10)-DiHOME | 314.50 | 313.28 | 201.06 | 12 | 20 | CYP | LA |
| 6 | 5(S)-HETrE | 322.50 | 321.28 | 303.29 | 2 | 10 | LOX | DGLA |
| 7 | PGD1 | 354.50 | 353.28 | 235.15 | 8 | 16 | COX | DGLA |
| 8 | PGE1 | 354.50 | 353.28 | 335.23 | 2 | 8 | COX | DGLA |
| 9 | PGK1 | 352.50 | 351.30 | 251.15 | 4 | 18 | COX | DGLA |
| 10 | PGF1α | 356.50 | 355.28 | 311.22 | 2 | 22 | COX | DGLA |
| 11 | 11-deoxy-PGE1 | 338.50 | 337.28 | 319.29 | 4 | 24 | COX | DGLA |
| 12 | PGD2 | 352.50 | 351.28 | 315.21 | 2 | 12 | COX | AA |
| 13 | PGJ2 | 334.50 | 333.28 | 189.12 | 4 | 16 | COX | AA |
| 14 | PGE2 | 352.50 | 351.21 | 315.21 | 18 | 10 | COX | AA |
| 15 | PGF2α | 354.50 | 353.28 | 193.10 | 4 | 24 | COX | AA |
| 16 | 6-keto-PGF1a | 370.50 | 369.28 | 245.23 | 2 | 28 | COX | AA |
| 17 | 5-iPF2a-VI | 354.50 | 353.28 | 115.05 | 2 | 22 | 自发氧化 | AA |
| 18 | TXB2 | 370.50 | 369.53 | 169.08 | 48 | 14 | COX | AA |
| 19 | 8,9-EET | 320.50 | 319.28 | 155.20 | 2 | 12 | CYP | AA |
| 20 | 5(6)-EET | 320.50 | 319.28 | 191.13 | 10 | 10 | CYP | AA |
| 21 | 11(12)-EET | 320.50 | 319.28 | 167.07 | 4 | 16 | CYP | AA |
| 22 | 14(15-EET | 320.50 | 319.34 | 219.16 | 22 | 4 | CYP | AA |
| 23 | 5,6-DIHETrE | 338.50 | 337.34 | 145.08 | 2 | 18 | CYP | AA |
| 24 | 5-HETE | 338.50 | 337.34 | 145.08 | 2 | 18 | LOX | AA |
| 25 | 9-HETE | 320.50 | 319.28 | 123.20 | 20 | 14 | 自发氧化 | AA |
| 26 | 11(S)-HETE | 320.50 | 319.28 | 167.07 | 4 | 16 | LOX | AA |
| 27 | 12-HETE | 320.50 | 319.28 | 179.10 | 2 | 12 | LOX | AA |
| 28 | 15-HETE | 320.50 | 319.28 | 219.15 | 4 | 12 | LOX | AA |
| 29 | 16-HETE | 320.50 | 319.28 | 233.10 | 4 | 12 | CYP | AA |
| 30 | 17-HETE | 320.50 | 319.28 | 247.24 | 16 | 12 | CYP | AA |
| 31 | 18-HETE | 320.50 | 319.28 | 261.23 | 2 | 16 | CYP | AA |
| 32 | 19(S)-HETE | 320.50 | 319.28 | 231.10 | 14 | 16 | CYP | AA |
| 33 | 20-HETE | 320.50 | 319.28 | 289.25 | 2 | 16 | CYP | AA |
| 34 | 5-OxoETE | 318.50 | 317.28 | 203.17 | 2 | 20 | LOX | AA |
| 35 | 15-OxoETE | 318.50 | 317.21 | 113.10 | 12 | 16 | LOX | AA |
| 36 | LTB4 | 336.50 | 335.02 | 195.10 | 44 | 14 | LOX | AA |
| 37 | LTD4 | 496.70 | 495.35 | 177.00 | 60 | 20 | LOX | AA |
| 38 | LTE4 | 439.60 | 438.25 | 333.27 | 2 | 18 | LOX | AA |
| 39 | LXA4 | 352.50 | 351.21 | 114.99 | 2 | 16 | LOX | AA |
| 40 | LXB4 | 352.50 | 351.28 | 221.11 | 6 | 16 | LOX | AA |
| 41 | 9(S)-HOTrE | 294.50 | 293.21 | 171.10 | 4 | 14 | LOX | ALA |
| 42 | 13(S)-HOTrE | 294.50 | 293.28 | 195.22 | 28 | 16 | LOX | ALA |
| 43 | TXB3 | 368.50 | 367.21 | 169.06 | 2 | 14 | COX | EPA |
| 44 | PGF3α | 352.50 | 351.28 | 193.27 | 2 | 24 | COX | EPA |
| 45 | 5-HEPE | 318.50 | 317.28 | 115.01 | 22 | 20 | LOX | EPA |
| 46 | 12-HEPE | 318.50 | 317.28 | 179.10 | 10 | 14 | LOX | EPA |
| 47 | 15-HEPE | 318.50 | 317.28 | 219.16 | 2 | 12 | LOX | EPA |
| 48 | 18-HEPE | 318.50 | 317.21 | 215.20 | 4 | 16 | CYP/自发氧化 | EPA |
| 49 | LXA5 | 350.50 | 349.21 | 115.04 | 4 | 16 | LOX | EPA |
| 50 | 17(18)EpETE | 318.50 | 317.28 | 215.19 | 6 | 14 | CYP | EPA |
| 51 | 5(S)(15(S)-DiHETE | 336.50 | 335.28 | 145.09 | 2 | 18 | CYP | EPA |
| 52 | 5(6)-DiHETE | 336.50 | 335.28 | 145.09 | 2 | 18 | CYP | EPA |
| 53 | 1-Mar | 360.50 | 359.28 | 177.13 | 2 | 16 | LOX | EPA |
| 54 | 4-HDHA | 344.50 | 343.28 | 101.00 | 4 | 14 | LOX | DHA |
| 55 | 7-HDHA | 344.50 | 343.28 | 281.26 | 4 | 12 | LOX | DHA |
| 56 | 14(S)-HDHA | 344.50 | 343.28 | 205.10 | 4 | 12 | LOX | DHA |
| 57 | 17-HDHA | 344.50 | 343.28 | 245.10 | 2 | 12 | LOX | DHA |
| 58 | RvE1 | 350.50 | 349.21 | 195.07 | 2 | 16 | LOX | DHA |
| 59 | RvD1 | 376.50 | 375.21 | 141.00 | 2 | 14 | LOX | DHA |
| 60 | RVD3 | 376.50 | 375.21 | 147.09 | 2 | 22 | LOX | DHA |
| 61 | RvD2 | 376.50 | 375.20 | 141.00 | 6 | 20 | LOX | DHA |
| 62 | RVD5 | 360.50 | 359.20 | 341.30 | 2 | 10 | LOX | DHA |
| 63 | 16(17)-EpDPA | 344.50 | 343.21 | 233.21 | 30 | 12 | CYP | DHA |
| 64 | TXB2-D4 | 373.00 | 173.00 | 1.04 | 25 | 14 | ||
| 65 | PGF2a-D4 | 357.00 | 197.00 | 1.19 | 40 | 24 | ||
| 66 | RvD2-D5 | 380.00 | 175.00 | 1.41 | 25 | 20 | ||
| 67 | LXA4-D5 | 356.00 | 115.00 | 1.74 | 25 | 16 | ||
| 68 | LTE4-D5 | 443.00 | 338.00 | 2.28 | 25 | 16 | ||
| 69 | 15-HEPE-D5 | 322.00 | 219.00 | 5.45 | 2 | 12 | ||
| 70 | 17-HDHA-D5 | 348.00 | 286.30 | 6.64 | 2 | 12 | ||
| 71 | 9-OxoODE-D3 | 296.00 | 185.08 | 6.88 | 4 | 20 |
2.4 结果
基于UPLC-MS/MS的空白组、假手术组和模型组样本中血清代谢物的评估，对靶向氧化脂质进行了T检验。其中，在假手术组和模型组共9个氧化脂质差异代谢物具有显著性变化，如图4所示。结果显示，相对于空白组和假手术组，造模一个月后的大鼠血清中11-，12-，18-，15-，17-，20-HETE，PGE2, PGD2和PGF2ɑ氧化脂质水平显著升高，4-HDHA显著降低，是心力衰竭疾病的潜在生物标志物。
三、靶向定量分析心力衰竭患者血清中氧化脂质差异代谢物
3.1 临床患者的纳入和排出
聊城市人民医院伦理委员会批准了这项研究(2019-0894)，该研究是根据1975年赫尔辛基宣言的宗旨进行的。所有参与者均提供了书面知情同意书以参加本研究。心力衰竭患者的纳入标准：
(1)患者符合2022年AHA/ACC/HFSA心力衰竭管理指南的诊断标准：美国心脏病学会/美国心脏协会临床实践联合委员会指南的报告，
(2)NYHA的心功能分类为Ⅱ-Ⅳ级，
(3)完整的临床数据。
排除标准：
急性和慢性感染，
(2) 近6个月有急性心肌梗死史；
(3) 伴有内分泌或免疫系统疾病，
(4) 精神疾病，
(5) 存在肺心病和限制性心肌病，
(6) 恶性肿瘤和脑，肝，肾功能障碍。
如上所述，在所有参与者中测量血清氧化脂质水平。
3.2 样本采集
本项研究招募了聊城市人民医院的30名35-90岁的心力衰竭患者，以及没有冠状动脉疾病或心房颤动的对照参与者。心力衰竭患者通过临床表现诊断，左心室射血分数(LVEF)低于50%，NT-proBNP水平显着高于正常参考范围。所有血清样品均在室温下直立凝结30-60分钟，然后在4°C下以3000g离心10分钟。离心后，每个血清样品(50μL)的等分试样用于氧化脂质检测。在分析之前，将所有等分试样立即储存在80℃。所有参与者的基线特征总结表2所示。
表2. 研究参与者的基线特征
3.3色谱条件
同2.2 色谱条件
3.4质谱条件
同2.3 质谱条件
3.5质量控制样本，内标溶液及工作曲线的配置。
通过混合TXB2-D4、PGF2a-D4、RvD2-D5、LXA4-D5、LTE4-D5、15-HEPE-D5、17-HDHA-D5、9-OxoODE-D3、12-HETE-D8(4ng/mL)制备内标溶液。通过混合心力衰竭患者血清样本和健康对照组血清样本的等分试样，制备合并质控(QC)样品。包括IS混合物在内的所有提取溶剂在4℃在提取脂质之前用冰箱冷藏。所有提取均在1.5mL Eppendorf管中进行。表3中列举了主要氧化脂质的工作曲线。
表3. 用于24种主要氧化脂质浓度绝对定量的标准曲线
仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障。CV值即变异系数(Coefficient of Variation)，是原始数据标准差与原始数据平均数的比，可反映数据离散程度。 同时监测检测过程中9种内标CV值变化情况，内标CV值的变化小于20%，表明检测过程中仪器稳定，如表4所示。
表4 九种氧化脂质内标在样本及QC样本中的变异系数
3.6 数据处理分析及标志物的筛选
将峰面积积分数据导入SIMCA软件进行多元统计分析。通过偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型，寻找心力衰竭患者中较大的代谢物(VIP>1.0)。然后通过T-test检验，设置p<0.05为差异显著性标准。最终筛选出VIP>1.0 且 p<0.05的差异代谢物，可能是潜在的诊断心力衰竭疾病的生物标志物。上述分析筛选的潜在心力衰竭生物标志物，利用元逻辑回归逐步法筛选差异代谢物能够诊断心力衰竭疾病。
3.7结果
3.7.1差异代谢物分析
在健康和心力衰竭患者中进行血清氧化脂质靶向代谢组学分析。在来PLS-DA评分散点图中观察到，心力衰竭疾病发生后氧化脂质的代谢改变(图5)。PLS-DA模型的所有R2Y和Q2值均大于0.5。截距R2和Q2的低值表明这些模型没有过度拟合(图6)。
与健康组相比，心力衰竭组中6种氧合脂质代谢物的水平显著升高，包括(9-，12-，15-，20-)HETE，PGD2，5-iPFɑ-VI，两种氧化脂质代谢物RvD2和4-HDHA的水平显着降低(图7)。其中(12-，15-，20-)HETE、PGD2和4-HDHA与心力衰竭大鼠中检测到的差异代谢物相同。
3.7.2 生物标志物分析及性能预测
研究利用二元逻辑逐步分析筛选出3种差异代谢物可用于诊断，并通过采用受试者工作特征曲线 ROC 分析代谢物对心力衰竭疾病的诊断性能。
如表5分析结果显示，将12-HETE、15-HETE、20-HETE、4-HDHA、PGD2作为自变量，而将心力衰竭疾病作为因变量，利用二元逻辑回归逐步法筛选到3种差异代谢物能够诊断区心力衰竭疾病，分别为12-HETE、20-HETE、4-HDHA，其中12-HETE、20-HETE会对心力衰竭疾病的产生显著的正向影响关系，4-HDHA会对心力衰竭疾病的产生显著的负向影响关系。
接下来，采用受试者工作特征曲线 ROC 分析氧化脂质对心力衰竭疾病的诊断性能。将12-HETE、20-HETE、4-HDHA这3个差异代谢物分别和联合诊断区分心力衰竭疾病(表5-6，图8-9)。
结果显示，联合诊断心力衰竭疾病的能力较强，ROC曲线下面积 AUC值达到0.998，具有优秀的临床诊断意义。
表5 三标志物单独诊断受试者工作特征曲线分析结果(n=30-36)
表6. 三标志物联合诊断受试者工作特征曲线分析结果(n=30-36)
四、联合诊断心力衰竭疾病指标的应用
为了进一步验证12-HETE、20-HETE和4-HDHA是否可以准确有效预测心力衰竭疾病，对包含来自于2个独立医学中心的共161例临床样本进行筛查，我们进行了靶向代谢组学的分析并且考察该诊断指标的有效性。所有血清样本离心后置于-80℃冰箱内保存，研究时取出血清样本解冻后进行后续分析。检测条件和数据分析方法与上述2.2-2.3相同。结果显示，单个差异代谢物单个用于诊断区分心力衰竭患者能力较强，ROC曲线下面积(AUC)均大于0.6，具有临床诊断意义。这3个差异代谢物联合用于诊断时，AUC进一步提高，3个联合起来诊断心力衰竭疾病的AUC值达到0.983，在最佳cut-off值下，敏感度和特异度分别为94.7%和92.9%。单个及联合诊断的AUC见表7。
表7 临床样本中标志物单独及联合诊断受试者工作特征曲线分析结果
综上，本发明成功建立了一种基于LC-MS/MS利用全自动固相萃取检测血清中全通路不饱和脂肪酸检测方法，并且为心力衰竭疾病提供了一组氧化脂质标志物组合，具备临床使用推广价值。
尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。
Claims (1)
1.一种基于血清全通路氧化脂质组学筛选心力衰竭生物标志物的方法，其特征在于，包括：
(a) 在大鼠心力衰竭模型中进行血清全通路氧化脂质靶向代谢组学分析，得到具有显著差异的氧化脂质代谢物作为第一潜在生物标志物；
(b) 在健康和心力衰竭受试者中进行血清全通路氧化脂质靶向代谢组学分析，得到具有显著差异的氧化脂质代谢物作为第二潜在生物标志物，包括从血液萃取得到氧化脂质的步骤，其包括利用固相萃取柱和萃取试剂进行萃取，其中，所述固相萃取柱为亲水亲脂性柱，所述萃取试剂包括醇、水以及含甲酸的醇，所述氧化脂质的获得包括用醇和水分别平衡所述亲水亲脂性柱，将血液上柱并用纯水洗涤，在惰性环境下干燥柱后，用含甲酸的醇洗脱，并收集所需组分干燥后作为质谱样本，利用质谱仪进行血清全通路氧化脂质靶向代谢组学的分析，所述质谱仪包括色谱柱和质谱试剂，所述质谱试剂包括含乙腈和水的流动相A和含乙腈和异丙醇的流动相B，质谱仪的梯度洗脱条件为：0-12.0 min，0-60% B；12.0-14.0min，60-100% B；14.0-14.1 min，100-0% B；14.1-16.0 min，0% B；流速：0.4 mL/min，柱温：40°C，样本室温：4°C，进样量：5 μL；
(c) 取第一潜在生物标志物和第二潜在生物标志物中共同的生物标志物作为自变量，以心力衰竭作为因变量，利用二元逻辑回归分析筛选得到候选生物标志物；和
(d) 验证候选生物标志物的准确性，其中所述生物标志物为12-HETE、20-HETE和4-HDHA的组合；
其中，所述全通路包括氧化脂质中从LA经LOX到oxoODEs通路、从LA经CYP环氧合酶到EpOMEs通路、从DGLA经LOX到HETrE通路、从DGLA经COX到前列腺素类通路、从AA经LOX到LTs&LXs通路、从AA经LOX到中链HETEs通路、从AA经非酶促反应到中链HETEs通路、从AA经非酶促反应到异前列腺素通路、从AA经CYP环氧合酶到EETs通路、从AA经CYPω-羟化酶到HETEs通路、从AA经COX到前列腺素类通路、从ALA经LOX到HOTrEs通路、从EPA经LOX到HEPEs通路、从EPA经CYP环氧合酶HEPEs、从EPA经CYP环氧合酶EpETEs、从EPA经非酶促反应到HEPEs、从EPA经COX到前列腺素类通路、从DHA经LOX到HDHAs通路、从DHA经CYP环氧合酶到EpDPA通路。
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