CN104470942A - 生物标志物 - Google Patents

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Abstract

可用于在患有不同障碍、疾病和病症，包括肺炎、心力衰竭、或肺炎并发心力衰竭或疑似肺炎、心力衰竭、或肺炎并发心力衰竭的对象中诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和治疗方案的饥饿素信号肽片段测定和试剂盒，以及用于监测治疗的方法。

Description

生物标志物
领域
本发明涉及饥饿素(ghrelin)信号肽片段生物标志物。其还涉及饥饿素信号肽片段生物标志物方法和试剂盒及它们的用途，例如在肺炎感染、心力衰竭、或肺炎并发心力衰竭、以及导致肽片段释放到循环中的相关生物学事件或状态的预后、诊断和监测中的用途。
背景
下文包括可用于理解本发明的信息。而并非承认本文具体或隐含引用的任何信息、出版物或文件是现有技术，或对于正在描述或要求保护的发明是必不可少的。本文提到的所有出版物和专利以其整体并入本文作为参考。
送至医院急诊科以呼吸急促(breathlessness)(呼吸困难(dyspnea))为主要疾病的患者对于他们的病症可能有多种原因。呼吸困难可以由心脏障碍、肺脏障碍(lung disorder)、肺障碍(pulmonary disorder)、非心肺障碍或传染性障碍(单独或组合)引起，并且做出及时准确的诊断很重要。解决此点的鉴别诊断策略集中于临床检查、病历和侵入式/非侵入式测试结果。
对于传染性疾病，肺炎在快速诊断和患者数量的方面而言是重大挑战，并且存在有限的临床医生可用的生物标志物选择。
肺炎是一种急性呼吸道感染形式，由数种细菌、病毒和真菌病原体引起，所述病原体包括肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、呼吸道合胞体病毒(RespiratorySyncytial Virus)和患有HIV的患者、耶氏肺孢子虫(Pneumocystisjiroveci)。引起的感染以肺泡炎症和肺脏中积液为特征。肺炎的症状包括呼吸困难、呼吸率提高、咳嗽、发热、寒战和胸痛。
肺炎具有高发病率和死亡率。Sharma S等人，Radiological imaging inpneumonia:recent innovations.Current Opinion in Pulmonary Medicine.2007；13(3):159-169。其被公认为全球发病率和死亡率的重要成因，超过了HIV、疟疾和麻疹的总数(UNICEF/WHO,Geneva,Switzerland)。每年，肺炎致死据估计180万五岁以下的儿童，占该年龄组中所有死亡的20％，并且导致每分钟四例儿科死亡(WHO Fact Sheet No.331,October 2011)。已发现肺炎发生率与健康差异紧密关联，在南亚和撒哈拉以南非洲地区最为流行。
在美国，每年高于三百万的人群发展成肺炎。在这之中近20％需要住院治疗，平均停留长度为5.2天且平均住院率为1.17次/患者。肺炎在所有住院患者死亡中占3.4％，等同于每100,000人口16.5人的死亡率(Centresfor Disease Control and Prevention,Pneumonia FastStats Sheet,January2012)。除了肺炎在住院患者环境下所施加的负担外，社区获得性肺炎每年引起高于1000万次对初级护理医师的拜访，和6400万天受限的活动(Mandell L.A.Epidemiology and etiology of community-acquiredPneumonia,Infect Dis Clin North Am.2004；18(4):761-76)。
肺炎的临床诊断因症状没有可靠的预测性这一事实而复杂化。在送至急诊科的308例患者的研究中，咳嗽是肺炎患者中最常见的症状(86％)，但等同地常见于其它呼吸系统疾病的患者。在31％的肺炎患者中没有发热，在低于50％的肺炎患者中见到肺部检查的异常发现，而异常生命体征(温度高于37.8摄氏度(100华氏度)、脉搏大于100/min或呼吸大于20/min)是最佳的预测指标，报告于97％的肺炎患者中。Gennis P.,等人,Clinical criteria for the detection of Pneumonia in adults:guidelines forordering chest roentgenograms in the emergency department.J Emrg Med,1989；7(3):263-8。
基于现行的美国胸科协会和美国传染病协会指导方针，在送至急诊科的患者中从急性支气管炎区分肺炎的金标准是由胸部射线照相指示的肺部浸润的存在。然而，由于解释中的可变性，胸部X线结果是不统一的预测指标，并且不能确立其成因的病原体。此外，门诊患者环境中呈现社区获得性肺炎的患者可能因为有限的资源和成本而不能进行胸部X线。Evertsen J.,等人,Diagnosis and management of Pneumonia and bronchitisin outpatient primary care practices,Primary Care Resp J,2010；19(3):237:241。
由于准确临床诊断中的困难，内科医生经常利用实验诊断学帮助从急性呼吸道感染(ARTI)中区分肺炎，并鉴定成因性的病原体以确定最合适的治疗。实验诊断学包括显微镜检查、和下呼吸道标本、血液标本的培养、尿液中抗原的检测和血清学。Bartlett,J.G.,Decline in microbial studiesfor patients with pulmonary infections,Clin.Infect.Dis.2004；39；170-172。最近几年，在抗原和核酸检测领域已出现了新的诊断学，并且商业抗原检测测定法现在可用于数种肺炎病原体，特别是肺炎链球菌、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)和一些呼吸道病毒。检测C-多糖细胞壁抗原的新一代免疫层析肺炎球菌尿抗原测试已证明可用于诊断成人中的肺炎球菌性肺炎(Werno,A.M.,等人,Laboratory diagnosis of invasive pneumococcaldisease,Clin.Infect.Dis.2008；46:926-932)。使用免疫层析、酶联免疫吸附测定法或其它形式的数种商业的结果快速的测试现在可用于呼吸道病毒，包括流行性感冒和呼吸道合胞体病毒，帮助从肺炎中区分ARTI和流行性感冒。
核酸检测测试(NAT)例如PCR也针对主要的肺炎病原体研发成功，并且可用作多路复用平台。NAT能够从呼吸道病原体检测极低水平的核酸，不依赖于靶标微生物的存活性，并且可提供关于抗生素抗性表型的存在情况的信息。Murdoch D.R.,等人,Breathing New Life into PneumoniaDiagnostics,J of Clin Micro,2009；47(11):3405-3408)。尽管NAT表现出高水平的敏感性和特异性，其商业接受程度受运转该测试所需的成本和时间所限。Hindiyeh,M.,等人,Evaluation of the Prodesse Hexaplex multiplexPCR assay for direct detection of seven respiratory viruses in clinicalspecimens,Am.J.Clin.Pathol.2001；116:218-224。
总而言之，极为经常的是，肺炎的临床体征可以是极难捉摸的。在困境的核心，存留的问题是：“得到正确诊断的最快方式是什么？”。因为诊断得到得越快，治疗开始得越早。然而，由于延迟的诊断，在症状发作时间与抗生素疗法开始之间几乎总有大段的时间流逝。在实现肺炎的快速诊断和缩短的抗生素疗程的尝试中，现在正考虑使用生物标志物。
由于没有同时具有足够的敏感性和特异性的“金标准”来帮助得到“正确”的肺炎诊断，内科医生变得对使用生物标志物越来越感兴趣。“正确的”的诊断将是能够从形态学上鉴定成因性病原体的诊断。然而，70％患有经放射学证实为社区获得性肺炎(CAP)的患者并不具有所鉴定的成因性生物体。酝酿作为肺炎诊断中的辅助物的一些生物标志物包括C-反应蛋白、白细胞计数、免疫球蛋白和促炎细胞因子。存在其它的重要性提高的生物标志物，即原降钙素(PCT)和髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)。正在研究其在肺炎中的可能用途的另外其它可能的生物标志物包括肽素(copeptin)、皮质醇、内毒素、肾上腺髓质素原等(proadrenomedullin)。Hanssa Summah and Jie-Ming Qu,Biomarkers:A Definite Plus inPneumonia,Mediators Inflamm.2009:675753(Published online 2009November 16)。
慢性稳定型心力衰竭可能容易代谢失调，导致急性失代偿性心力衰竭(acute decompensated heart failure，ADHF)。ADHF在已存在心脏疾病的患者中使症状恶化，典型为呼吸短促(呼吸困难)、水肿和疲劳。它是急性呼吸窘迫的常见且潜在严重的成因，并且其最敏感的临床体征是颈静脉扩张。脑钠肽(BNP)是有据可查且经使用的用于ADHF诊断的生物标志物，其中相较于对照或参考水平血液中有升高的水平是此症状的诊断。
将急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎准确快速地检测为呼吸急促的成因对急诊科医生或全科医师是一项重要且耗费大量时间的问题。这是由于不准确或不完整的诊断加之所得的不正确治疗可能是致命的，因为不正确治疗或开始正确治疗的时间延误。
目前尚没有公认的或经常使用的用于检测肺炎的生物标志物。此外，没有能诊断患者是否患有ADHF和肺炎的单一生物标志物或生物标志物组。这极为重要，因为在诊断有ADHF的患者中肺炎诊断经常被漏掉，这种情形使这些患者的有效治疗严重地受损，并且可证明是致命的。人饥饿素信号肽(GHRsp)是切割自饥饿素(前饥饿素原)(1-117)(SEQ ID NO:1)的23个氨基酸的肽。人前饥饿素原的加工示于图1中。人GHRsp(1-23)被分开显示在SEQ ID NO:2中。美国专利申请系列号12/922444(公开号20110008808)描述并要求保护用于饥饿素信号肽和片段包括GHRsp(1-9)(SEQ ID No:3)的结合剂和测定法，据报道它们可用于预测、诊断、评估或监测对象中的急性心脏疾病、葡萄糖处理障碍以及糖尿病的方法中。
重要的是，例如，申请人已经发现饥饿素信号肽片段是新的并且可靠的肺炎生物标志物，还是新的并且可靠的急性失代偿性心力衰竭生物标志物，而且作为新的并且可靠的患有肺炎并发急性失代偿性心力衰竭的患者生物标志物。
概述
本文中描述并要求保护的发明具有许多属性和实施方案，包括但不限于此概述中提出或描述或参考的那些。其并非意在包括一切并且本文中描述并要求保护的发明不限于或不被此概述中鉴别的特征或实施方案限制，包括此概述的目的仅仅是示例，而非限制。
申请人作出以下发现，饥饿素信号肽(GHRsp)片段响应于肺炎感染可检测地被释放到循环中。在肺炎对象中，GHRsp片段水平不同于正常水平。GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)或二者可用作此病症的标志物。
申请人还作出以下发现，GHRsp片段响应于急性失代偿性心力衰竭(ADHF)且响应于肺炎和ADHF都存在的环境，而可检测地被释放到循环中。在患有ADHF、或肺炎并发ADHF的对象中，例如，GHRsp片段水平不同于正常水平。GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)或二者可用作任一情形的标志物。
本发明的目的是提供用于评估对象中的肺炎或疑似感染的方法和组合物。如本文所描述，对选自由GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)的一种或多种GHRsp片段标志物的测量，例如，可以在患有肺炎或疑似肺炎的对象中用于诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期(staging)、监测、分类和确定进一步诊断和治疗方案。
本发明的目的还有提供用于在对象中评估ADHF或疑似ADHF、或评估肺炎并发ADHF、或疑似肺炎并发ADHF的方法和组合物。如本文所描述，对选自由GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或GHRsp(1-10)(SEQ IDNO:4)的一种或多种GHRsp片段标志物的测量，例如，可以在患有ADHF或疑似ADHF、或肺炎并发ADHF、或疑似肺炎并发ADHF的对象中用于诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和治疗方案。
本发明还提供用于在对象中诊断、评估或监测肺炎、急性失代偿性心力衰竭、或肺炎并发急性失代偿性心力衰竭的GHRsp片段生物标志物测定法。
申请人在其发明的一方面提供在患有肺炎或者疑似肺炎、急性失代偿性心力衰竭或疑似急性失代偿性心力衰竭、肺炎并发急性失代偿性心力衰竭或疑似肺炎并发急性失代偿性心力衰竭的对象中用于诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和治疗方案的方法，该方法包括测量取自或衍生自对象的一个或多个样品中一种或多种GHRsp片段生物标志物的水平。
因此，本发明还提供用于肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或者肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的生物标志物测定法，包括使用任何已知的方法检测和测量生物学样品或来自对象的样品衍生物中GHRsp片段的水平，以便确定对象中肺炎感染的存在或状态、或对象中ADHF的存在或状态、或对象中肺炎并发ADHF的存在或状态，包括在患有肺炎或疑似肺炎、ADHF或疑似ADHF、或肺炎并发ADHF或疑似肺炎并发ADHF的对象中诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和治疗方案。
本发明还提供在患有肺炎或疑似肺炎的对象中在诊断、评估或监测肺炎中用于GHRsp片段生物标志物的测定法，包括：
(a)从样品中结合一种或多种GHRsp片段生物标志物；
(b)测量所结合的GHRsp片段生物标志物的水平；和
(c)将所述测量结果与已知GHRsp片段值相关联，以在患有肺炎或疑似肺炎的对象中进行诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类和/或进一步诊断技术和/或治疗方案的使用的确定。可使用任何GHRsp片段特异性的结合剂使GHRsp片段生物标志物被结合。
本发明还提供在患有ADHF或疑似ADHF的对象中在诊断、评估或监测急性失代偿性心力衰竭(ADHF)中用于GHRsp片段生物标志物的测定法，包括：
(a)从样品中结合一种或多种GHRsp片段生物标志物；
(b)测量所结合的GHRsp片段生物标志物的水平；和
(c)将所述测量结果与已知GHRsp片段值相关联，以在患有ADHF或疑似ADHF的对象中进行诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类和/或进一步诊断技术和/或治疗方案的使用的确定。可使用任何GHRsp片段特异性的结合剂使GHRsp片段生物标志物被结合。
本发明进一步提供在患有肺炎并发ADHF或疑似肺炎并发ADHF的对象中在诊断、评估或监测肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)中用于GHRsp片段生物标志物的测定法，包括：
(a)从样品中结合一种或多种GHRsp片段生物标志物；
(b)测量所结合的GHRsp片段生物标志物的水平；和
(c)将所述测量结果与已知GHRsp片段值相关联，以在患有肺炎并发ADHF或疑似肺炎并发ADHF的对象中进行诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类和/或进一步诊断技术和/或治疗方案的使用的确定。可使用任何GHRsp片段特异性的结合剂使GHRsp片段生物标志物被结合。
在一个实施方案中，GHRsp片段生物标志物是GHRsp(1-9)(SEQID NO:3)。在一个实施方案中，GHRsp片段生物标志物是GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。在另一实施方案中，GHRsp片段生物标志物是GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)和GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
在另一方面，联合一种或多种生物标志物的参考值或范围例如正常的(未感染的)参考值或范围来分析所述一种或多种GHRsp片段生物标志物的水平。
在另一方面，方法包括将取自或衍生自对象的一个或多个样品中的GHRsp片段生物标志物的水平与来自对照的GHRsp片段生物标志物的水平进行比较，其中测量水平与对照水平的偏差指示肺炎。与正常的(未感染的)对照对象的偏差可以为约10-20％、10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-900％、10-100％、或更高。
熟练的技术人员可以利用各种各样的方法得出用于这些方法中的期望阈值。例如，可以从正常对象群体确定阈值，其通过选择代表第75、第85、第90、第95或第99百分位的在这些正常对象中测量的GHRsp片段标志物的浓度。备选地，可以从“患病”的对象群体例如罹患肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发ADHF的对象群体确定阈值，其通过选择代表第75、第85、第90、第95或第99百分位的在这些对象中测量的GHRsp片段标志物的浓度。在另一备选方案中，可以从同一对象中GHRsp片段标志物的在先测量结果来确定阈值；换言之，可以利用对象中GHRsp片段标志物水平的短暂改变对对象指定风险。
然而，前述讨论并不意在暗指本发明的GHRsp片段标志物必须与对应的个体阈值进行比较。用于组合测定法结果的方法可包括使用多元逻辑回归、对数线性模型(loglinear modeling)、神经网络分析、n-of-m分析、决策树分析、计算标志物比率等。此列举并非意为限制性的。在这些方法中，可以将通过组合个体标志物而确定的复合结果看作如同其自身是标志物的情形；换言之，可以如本文针对个体标志物所描述的对复合结果确定阈值，并将个体患者的复合结果与此阈值进行比较。
也可以使用多个阈值来评估对象中的肺炎。例如，可以将被感染(例如感染有肺炎)和/或受影响(例如受心力衰竭影响)的第一亚群与未感染和/或未受影响的第二亚群组合到单一组中。然后将此组细分成三个或更多个等份(被称为三分份、四分份、五分份等，取决于再分的数量)。基于它们落入的细分组对对象分配优势比(odds ratio)。如果某人考虑三分份，则可以使用最低或最高的三分份作为参考用于与其它细分组比较。此参考细分组被分配优势比1。对第二个三分份分配相对于该第一三分份而言的优势比。换言之，与第一个三分份中的一些人相较，第二个三分份中的一些人可能三倍程度地更可能被感染。对第二个三分份也分配相对于该第一三分份而言的优势比。
可使用ROC分析来建立特定测试区分两个群体的能力。例如，可以使用从感染有肺炎的第一亚群和未感染的第二亚群建立的ROC曲线来计算ROC曲线，并且曲线下面积提供了测试质量的衡量。优选地，本文描述的测试提供大于0.5、优选至少0.6且更优选至少0.7的ROC曲线面积。相同的分析适用于受急性失代偿性心力衰竭(ADHF)影响的对象或感染有肺炎和ADHF二者并受其影响的对象。
申请人还惊讶地发现，GHRsp片段生物标志物的循环浓度在符合肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发ADHF的临床症状发作以后48-72时最高。此时峰值以例如1-2倍的级别高于、通常至少50％倍地高于正常对照群体。
因此，在又一方面，本发明提供用于预测、评估、诊断、分类或监测对象中肺炎的严重度的方法，该方法包括测量来自对象的生物学样品中GHRsp片段生物标志物的水平，并将所述GHRsp片段生物标志物的水平与来自对照值或参考值或者对照数值范围或参考数值范围的GHRsp和/或GHRsp片段水平进行比较，其中GHRsp片段生物标志物的测量水平数倍高于对照水平或预定的参考值或数值范围指示对象中肺炎的严重度。
在另一方面，本发明提供用于预测、评估、诊断、分类或监测对象中急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的严重度的方法，该方法包括测量来自对象的生物学样品中GHRsp片段生物标志物的水平，并将所述GHRsp片段生物标志物的水平与来自对照值或参考值或者对照数值范围或参考数值范围的GHRsp和/或GHRsp片段水平进行比较，其中GHRsp片段生物标志物的测量水平数倍高于对照水平或预定的参考值或数值范围指示对象中ADHF的严重度。
在再一方面，本发明提供用于预测、评估、诊断、分类或监测对象中肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的严重度的方法，该方法包括测量来自对象的生物学样品中GHRsp片段生物标志物的水平，并将所述GHRsp片段生物标志物的水平与来自对照值或参考值或者对照数值范围或参考数值范围的GHRsp和/或GHRsp片段水平进行比较，其中GHRsp片段生物标志物的测量水平数倍高于对照水平或预定的参考值或数值范围指示对象中肺炎并发ADHF的严重度。
GHRsp片段生物标志物为，例如GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
本发明还提供用于监测对象中对肺炎治疗的响应的方法，该方法包括测量取自或衍生自对象的样品中GHRsp片段生物标志物的水平，并将所述GHRsp片段生物标志物的水平与来自对照值或参考值或者对照数值范围或参考数值范围的GHRsp片段生物标志物水平进行比较，其中GHRsp的测量水平相对于对照水平、或预定参考值或数值范围的改变指示对治疗的响应。
本发明进一步提供用于监测对象中对急性失代偿性心力衰竭(ADHF)治疗的响应的方法，该方法包括测量取自或衍生自对象的样品中GHRsp片段生物标志物的水平，并将所述GHRsp片段生物标志物的水平与来自对照值或参考值或者对照数值范围或参考数值范围的GHRsp片段生物标志物水平进行比较，其中GHRsp的测量水平相对于对照水平、或预定参考值或数值范围的改变指示对治疗的响应。
本发明还提供用于监测对象中对肺炎并发急性失代偿性心力衰竭治疗的响应的方法，该方法包括测量取自或衍生自对象的样品中GHRsp片段生物标志物的水平，并将所述GHRsp片段生物标志物的水平与来自对照值或参考值或者对照数值范围或参考数值范围的GHRsp片段生物标志物水平进行比较，其中GHRsp的测量水平相对于对照水平、或预定参考值或数值范围的改变指示对治疗的响应。
再一次地，GHRsp片段生物标志物为，例如GHRsp(1-9)(SEQ IDNO:3)或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
在本发明方法的一个实施方案中，对连续取自对象的样品(或样品衍生物)两次或更多次地测量GHRsp片段生物标志物水平。在多个实施方案中，每48小时、每24小时、每12小时、或更频繁地取样。在这些时间段内的单个或多个GHRsp片段生物标志物测量包含在本发明内。在初始取样或测定后的任意时间点对随后取自或衍生自对象的样品进行的GHRsp片段生物标志物测量或额外的GHRsp片段生物标志物测量也包含在内。
在一个实施方案中，生物学样品是血液、血清、血浆、唾液、组织液、尿液或泪液。在一个优选的实施方案中，样品是血液或血浆。
可以在同时获得的样品中测量标志物，或者可以从在不同(例如，较早或较晚)时间获得的样品确定标志物。也可以对相同或不同的体液样品测量个体标志物。例如，可以在血清或血浆样品中测量一个GHRsp片段标志物，并且可在尿液样品中测量另一GHRsp片段标志物。此外，可能性分配可以将个体GHRsp片段标志物测定结果与一个或多个额外变量的短暂改变相组合。
在一个实施方案中，评估或测量步骤包括检测GHRsp片段生物标志物与选择性地结合GHRsp片段生物标志物的结合剂之间的结合。在一个实施方案中，测量步骤包括：
(a)将GHRsp片段生物标志物与结合剂结合；
(b)测量所结合的GHRsp片段生物标志物的水平；和
(c)将该结果与对象中肺炎感染、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎与ADHF的组合的存在或状态结果相关联。
在另一方面，本发明的GHRsp片段生物标志物结合剂结合或检测：
(a)GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)；
(b)GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)；
(c)(a)或(b)的任一者的抗原变体。
结合剂可用于诊断、评估或监测例如肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发ADHF，其与GHRsp片段释放到循环中相关联。在一个实施方案中，结合剂是抗-GHRsp片段抗体或其抗原结合片段。最通常的情况是，抗体是单克隆或多克隆抗体，或者(若需要的话)双特异性、嵌合或人源化的抗体。在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。
在一个实施方案中，抗体所结合或检测的GHRsp片段生物标志物是GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)或二者。抗体可以结合GHRsp片段的N端或C端。序列优选为人序列。
结合剂选择性地结合的特定抗原性(antigenic)肽包括人GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)和/或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)、或抗原性结合片段、或其抗原性变体。
在某些实施方案中，测定方法是免疫测定。用于这些测定的抗体及其结合片段将特异性地结合全长的目标GHRsp片段标志物，并且还可以结合与之“相关”(该术语在下文中定义)的一种或多种诊断性多肽。本领域技术人员知晓许多免疫测定形式。可使用定量的、半定量的或定性的测定。优选测定是定量的。
本发明还提供饥饿素信号肽片段测定法用于例如肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发ADHF的评估的用途。
在一个实施方案中，使用固定化到固相上的抗体或抗体片段来测量GHRsp片段生物标志物的结合。
可以有用地使用选自RIA、ELISA、荧光免疫测定、荧光免疫计量测定和免疫放射计量测定的测定法来测量GHRsp片段生物标志物的水平。
在另一实施方案中，可以使用质谱法来测量GHRsp片段生物标志物的水平。
本发明的方法还包括测量肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发ADHF的一种或多种非GHRsp片段标志物的水平，并将该水平与来自对照的标志物水平进行比较，其中测量水平与非GHRsp标志物对照水平的偏差，连同与GHRsp对照或参考水平相差的GHRsp测量水平，诊断出肺炎，或者可以用于监测例如肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF。
在另一方面，本发明提供用于诊断、评估或监测对象中的肺炎的方法，所述方法使用用于一种或多种GHRsp片段生物标志物的(一种或多种)测定法，结合白细胞计数和/或用于原降钙素(PCT)、髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)、C-反应蛋白、免疫球蛋白和促炎细胞因子中的一种或多种的(一种或多种)测定法。在一个实施方案中，GHRsp片段生物标志物是GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)和/或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
在另一方面，本发明提供用于诊断、评估或监测对象中的肺炎的方法，所述方法使用用于一种或多种GHRsp片段生物标志物的测定法，结合用于肽素(copeptin)、皮质醇、内毒素和/或肾上腺髓质素原(proadrenomedullin)的一种或多种的(一种或多种)测定法。在一个实施方案中，GHRsp片段生物标志物是GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)和/或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
在又一方面，本发明提供用于诊断、评估或监测对象中的急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发ADHF的方法，所述方法使用用于一种或多种GHRsp片段生物标志物的(一种或多种)测定法，结合白细胞计数和/或用于原降钙素(PCT)、髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)、C-反应蛋白、免疫球蛋白、促炎细胞因子、脑钠尿蛋白质(BNP)、N端BNP原(NT-BNP)、血尿素氮、胰石蛋白、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T中的一种或多种的(一种或多种)测定法。在一个实施方案中，GHRsp片段生物标志物是GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)和/或GHRsp(1-10)(SEQID NO:4)。
本发明还涉及GHRsp片段结合剂在制备GHRsp片段测定中的用途，所述测定用于评估例如对象中的肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发ADHF，或者涉及GHRsp片段生物标志物结合剂在制备用于对象中的肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF的预后、评估、诊断或监测工具中的用途，所述工具即用于患有上述提及的病症或病症组合的任意者的对象中的肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF的诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和治疗方案的工具。
在一个实施方案中，预后、评估、诊断、监测工具被校正为测量在至少约0.1pmol/L、至少约1pmol/L、至少约5pmol/L或至少约10pmol/L的范围内的GHRsp水平。
在另一方面，本发明提供用于诊断、评估或监测对象中的肺炎的试剂盒，所述试剂盒包括结合至GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或结合至GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)或二者的GHRsp片段结合剂。在一个实施方案中，该试剂盒被校正为测量在至少约0.1pmol/L、至少约1pmol/L、至少约5pmol/L、或至少约10pmol/L的范围内的GHRsp片段水平。在一个实施方案中，该试剂盒还包括用于诊断、评估或监测患有肺炎或疑似肺炎的对象的说明书，即，用作在患有肺炎或疑似肺炎的对象中进行肺炎诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和/或治疗方案中的一种或多种或者全部的工具。例如，说明书可依据在样品或样品的衍生物中测量GHRsp片段水平，和将测量水平与对照或参考水平进行比较，来描述用于诊断、评估或监测对象中的肺炎的方法。与对照或参考水平相差的测量GHRsp片段生物标志物水平将指示着肺炎。在一个实施方案中，得到多于一种的样品用于GHRsp片段生物标志物水平的测量。
在另一方面，本发明提供用于诊断、评估或监测对象中的急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的试剂盒，所述试剂盒包括结合至GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或结合至GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)或二者的GHRsp片段结合剂。在一个实施方案中，该试剂盒被校正为测量在至少约0.1pmol/L、至少约1pmol/L、至少约5pmol/L、或至少约10pmol/L的范围内的GHRsp片段水平。在一个实施方案中，该试剂盒还包括用于诊断、评估或监测患有ADHF或疑似ADHF的对象的说明书，即，用作在患有ADHF或疑似ADHF的对象中进行ADHF诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和/或治疗方案中的一种或多种或者全部的工具。例如，说明书可依据在样品或样品的衍生物中测量GHRsp片段水平和将测量水平与对照或参考水平进行比较，来描述用于诊断、评估或监测对象中的ADHF的方法。与对照或参考水平相差的测量GHRsp片段生物标志物水平将指示着ADHF。在一个实施方案中，得到多于一种的样品用于GHRsp片段生物标志物水平的测量。
在又一方面，本发明提供用于诊断、评估或监测对象中的肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的试剂盒，所述试剂盒包括结合至GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或结合至GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)或二者的GHRsp片段结合剂。在一个实施方案中，该试剂盒被校正为测量在至少约0.1pmol/L、至少约1pmol/L、至少约5pmol/L、或至少约10pmol/L的范围内的GHRsp片段水平。在一个实施方案中，该试剂盒还包括用于诊断、评估或监测患有肺炎并发ADHF或疑似肺炎并发ADHF的对象的说明书，即，用作在患有肺炎并发ADHF或疑似肺炎并发ADHF的对象中进行肺炎并发ADHF诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和/或治疗方案中的一种或多种或者全部的工具。例如，说明书可从在样品或样品的衍生物中测量GHRsp片段水平和将测量水平与对照或参考水平进行比较，来描述用于诊断、评估或监测对象中的肺炎并发ADHF的方法。与对照或参考水平相差的测量GHRsp片段生物标志物水平将指示着肺炎并发ADHF。在一个实施方案中，得到多于一种的样品用于GHRsp片段生物标志物水平的测量。
在多个相关方面，本发明还涉及用于实施本文所述方法的装置和试剂盒。合适的试剂盒包括适合于实施用于所描述的GHRsp片段标志物中至少一种的测定的试剂连同用于实施所描述的阈值比较的说明书。
在某些实施方案中，用于实施这些测定的试剂提供于测定装置中，并且这些测定装置可包含于此试剂盒中。优选的试剂可包含一种或多种固相抗体，其包含检测结合至固体支撑体的既定生物标志物靶标的抗体。在夹心免疫测定中，这些试剂可还包含一种或多种可检测地标记的抗体，所述可检测地标记的抗体包含检测结合至可检测标记物的既定生物标志物靶标的抗体。可作为测定装置的部分提供的额外的任选元件在下文中描述。
可检测标记物可包括自身可检测的分子(例如，荧光部分、电化学标记物、ecl(电化学发光)标记物、金属螯合物、胶态金属颗粒等)以及可间接检测的分子，所述可间接检测的分子通过产生可检测的反应产物(例如，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等的酶)或通过使用自身可被检测的特异性结合分子(例如，结合至第二抗体的标记抗体、生物素、洋地黄毒苷、麦芽糖、寡聚组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐、ssDNA、dsDNA等)。
可使用领域内公知的多种光学、声学和电化学方法实施从单一信号形成元件的信号生成。检测模式的实例包括荧光、放射化学检测、反射率、吸收率、电流分析法、导电性、阻抗、干涉量度学、椭圆光度法等。在这些方法的某些当中，固相抗体偶联到变换器(例如，衍射光栅、电化学传感器等)用于生成信号，而在其它之中，信号由在空间上与固相抗体分离的变换器(例如，采用激发光源和光学探测器的荧光计)生成。此列举并非是限制性的。也可采用基于抗体的生物传感器来确定分析物的存在状况或量，其任选地消除对于标记分子的需求。
在另一方面，本发明提供GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)——由申请人发现并分离的一种新的肽。因此，如本文所述，还提供分离的和/或纯化的GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)肽(包括人GHRsp(1-10)(SEQID NO:4)及其物种变体)、GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)结合剂(包括抗-GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)抗体和抗体结合片段)、用于GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)的测定(包括免疫测定)以及它们在检测生物学样品中的GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)的用途。GHRsp(1-10)(SEQID NO:4)结合剂和测定可用于对与GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)片段释放到循环中相关联的生物学事件或障碍的诊断、评估、监测等中。这些事件或障碍如本文所述包括肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)和肺炎并发ADHF，并且可用于在患有肺炎或疑似肺炎、ADHF或疑似ADHF、或肺炎并发ADHF或疑似肺炎并发ADHF的对象中诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和治疗方案。
以下提供本发明的这些和其它方面，其不限于或不被此概述中的信息所限制。
附图简介
图1是概括人类前饥饿素原的加工，导致游离信号N-饥饿素和饥饿素肽的生成的示意图。
图2显示了对于分别来自大鼠(SEQ ID NO:5)、人(SEQ ID NO:2)、绵羊(SEQ ID NO:6)、猪(SEQ ID NO:7)、小鼠(SEQ ID NO:8)、狗(SEQ ID NO:9)和猫(SEQ ID NO:10)的饥饿素信号肽序列的一致性比对(SEQ ID NO:11)。
图3显示了GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)生物标志物抗血清的交叉反应性数据的表格。
图4显示了放射免疫测定结果，其表明血液中的GHRsp(1-9)免疫反应性显示出与人类对象中的肺炎的显著相关性，ROC为0.714。这些数据是基于来自123个抽样人类患者的初始人群(cohort)的n＝23个患有经证实的肺炎感染的患者。
图5显示了放射免疫测定结果，其表明血液中的GHRsp(1-9)(SEQID NO:3)免疫反应性显示出与人类对象中的肺炎的显著相关性，ROC为0.654。这些数据是基于来自286个抽样人类患者的总群组的n＝52个患有经证实的肺炎感染的患者(其包括来自初始人类患者群组的23个患者；图4)。
图6显示了放射免疫测定结果，其表明血液中的GHRsp(1-9)(SEQID NO:3)免疫反应性显示出与急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的显著相关性，ROC为0.601。还示出C-反应蛋白(CRP)的ROC曲线。
图7显示了放射免疫测定结果，其表明血液中的GHRsp(1-9)(SEQID NO:3)免疫反应性显示出与肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的显著相关性，ROC为0.751。还示出C-反应蛋白(CRP)的ROC曲线。
发明详述
本发明的实践可包括或采用在本领域技术之内的分子生物学(包括重组和杂交瘤技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的多种常规技术。这些技术在文献中有充分阐释，并且包括但不限于(仅以示例的方式)：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,second edition(Sambrook等人,1989)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,third edition(Sambrook and Russel,2001)，其共同地并且独立地在文中提及为“Sambrook”；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.,1987)；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir&C.C.Blackwell,eds.)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller&M.P.Calos,eds.,1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人,eds.,1987,包括至2001年的补编)；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人,eds.,1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人,eds.,1991)；The Immunoassay Handbook(D.Wild,ed.,StocktonPress NY,1994)；Bioconjugate Techniques(Greg T.Hermanson,ed.,Academic Press,1996)；Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff,W.H.Albert,and N.A.Staines,eds.,Weinheim:VCH Verlags gesellschaftmbH,1993)，Harlow and Lane(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York，以及Harlow and Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(其共同地并且独立地在文中提及为Harlow and Lane),Beaucage等人eds.,Current Protocols in NucleicAcid Chemistry John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000)；以及Agrawal,ed.,Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Synthesis and PropertiesHumana Press Inc.,New Jersey,1993)。
应理解的是，本发明不限于本文所描述的特定的方法学、方案、构造和试剂，并且这些可以改变。还应理解的是，本文所使用的术语仅仅是出于描述特定的实施方案，而并非意在限定本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求所限定。如本文所使用和在所附权利要求中的，单数形式“一个”、“该”(a、an、the)包括复数提及，除非上下文清楚地另外指明。因此，例如，提及“GHRsp片段”是对一个或多个此种肽以及其抗原变体和物种变体及等位变体的提及，并且包括现在已知或以后开发的所有等同物。
除非另外限定，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员之一普遍理解的那些相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中，可以使用任何与本文描述的那些相似或等同的方法、装置和材料，现在描述多种方法、装置和材料。
对本文公开的数字范围(例如1至10)的提及意在还包含对在该范围内的所有相关数字(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及对在该范围内的有理数的任何范围(例如2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)的提及，因此本文具体公开的所有范围的所有子范围被具体公开。这些仅仅是具体意指内容的实例，并且所列举的最低值与最高值之间的所有可能的数值组合都将被认为以相似的方式在本申请中具体陈述。
下列术语在本文中使用时具有以下含义。
术语“抗体”指具有特异性结构的免疫球蛋白分子，其与包含用于合成抗体的抗原的分子，或者与和其密切相关的抗原特异性地相互作用(结合)。如本文中使用的，术语“抗体”广泛地包括全长抗体以及其结合片段。还包括了单克隆和多克隆抗体、多价和单价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、嵌合抗体、人抗体、人源化抗体和已经亲和力成熟的抗体。如果抗体优先结合GHRsp，例如与非GHRsp多肽具有低于25％，或低于10％，或低于1％或低于0.1％交叉反应性的那些抗体，则抗体选择性或特异性地结合本发明的GHRsp多肽。通常，对于抗原或表位，抗体可具有至少约10-6或10-7M，或至少约10-8M、10-9M、10-10、10-11或10-12M的结合亲和力(解离常数(Kd)值)。可以使用表面等离子体共振例如或者Scatchard分析来评估结合亲和力。
当关于抗体使用时，如本文中使用的“抗原结合片段”或“抗体片段”或“结合片段”意指完整抗体的一部分，所述部分优选地保留了该抗体片段的大部分或全部，或者最少至少一种的正常结合功能。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、线性抗体、双抗体、单链抗体(ScFV)和多特异性抗体。
如本文中使用的，术语“抗原性(antigenic)变体”指与具体鉴别的序列不同的多肽序列，其中缺失、替换或添加了1至6个或更多个氨基酸残基。具体考虑1、2、3、4、5或6个氨基酸的替换、添加或缺失。变体可以是天然存在的等位抗原性变体，或非天然存在的抗原性变体。变体可以来自相同的物种或其他物种，可以涵盖同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些实施方案中，用于本发明中的多肽的抗原性变体具有与亲代多肽相同或相似的生物学活性，包括信号肽活性或抗原性结合性质。术语“抗原性变体”当涉及多肽时，涵盖了所有类型的本文定义的多肽。术语“抗原性变体”涵盖天然存在的、重组产生的和合成法产生的多肽。通常在至少5、6或7个氨基酸位置的比较窗口上发现同一性。例如，对于GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)，比较窗口可以覆盖至少5、6、7或8个氨基酸位置，或者肽的全长。在GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)的情况下，比较窗口可以覆盖至少5、6、7、8或9个氨基酸位置，或者覆盖肽的全长。
在一个实施方案中，抗原性变体包括这样的肽，所述肽的序列通过不过度影响肽的抗原性的1、2或更多个保守氨基酸替换、缺失、添加或插入，而不同于GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。保守性替换是领域内已知的，不需要在此重复。通常它们包括将一个氨基酸替换为具有相似特征的另一个氨基酸，例如下列组中的替换：缬氨酸、甘氨酸；甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。保守性替换的实例还可见于序列表所示的GHRsp的序列，其中显示了不同哺乳动物物种中较之人序列的替换。其他保守性替换可以得自表2。替换、缺失、添加或插入可以通过领域内已知的诱变方法制备。技术人员将知晓用于制备表型沉默的氨基酸替换的方法。参见例如Bowie等人,1990,Science 247,1306；Kunkel,T；1985,PNAS,85p 488。
可使用抗原性变体制备用于本发明测定中的结合剂，例如抗体结合剂。
如本文中使用的术语“结合剂”是指能够结合GHRsp片段或其抗原性变体的任何固体或非固体的材料。在一个实施方案中，该术语是指结合GHRsp片段或其抗原性变体的任何天然的或非天然的分子。结合剂的实例包括蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、脂质和小分子化合物。一种选择性的或特异性的结合剂是抗体或其抗原结合片段。
本发明的GHR信号肽片段试剂通常与载体(例如药学上或兽医学上可接受的载体)或稀释剂组合以产生组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗的盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。合适的稀释剂和赋形剂还包括，例如水、盐水、葡萄糖、甘油、或类似物以及它们的组合。此外，如果需要，也可以存在诸如润湿剂或乳化剂和/或pH缓冲剂的物质。此外，还有增强对抗原例如GHRsp诸如GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)的免疫应答的佐剂或其它物质。
如本文中使用的术语“诊断”是指技术人员可以评估和/或确定患者是否罹患给定疾病或病症的概率(“可能性”)所凭借的方法。在本发明的情形中，“诊断”包括使用肺炎标志物的测定结果，最优选为免疫测定的结果，任选地连同其它临床特征，从而对对象得出肺炎诊断(即，存在或不存在)，其中样品得自或衍生自该对象并进行分析。在本发明的情形中，“诊断”还包括使用急性失代偿性心力衰竭(ADHF)标志物或肺炎并发ADHF标志物的测定结果，最优选为免疫测定的结果，任选地连同其它临床特征，从而对对象得出ADHF或肺炎并发ADHF的诊断(即，存在或不存在)，其中样品得自或衍生自该对象并进行分析。“确定”这样的诊断并不意在暗指诊断结果被100％证实。熟练的临床医生将不会在信息真空的情况下使用生物标志物结果，而是测试结果连同其它临床指征(clinicalindicia)以得出诊断。因此，相对于在预定诊断阈值另一侧的测量水平，在预定诊断阈值一侧的测量生物标志物水平指示着对象中更大的疾病发生的可能性。相似地，预后风险标志着给定过程或结果将要发生的概率(“可能性”)。预后指示物的水平或水平改变，其与增加的发病可能(例如肺功能恶化，包括渗血(bloody effusion)、弥漫性肺泡损伤，出血(haemorrhage)等)相关，被提及为在患者的不良结果上“指示增高的可能性”。
术语“表位”包括能够与抗体和/或T细胞受体特异性结合的任何抗原性(例如蛋白质)决定簇。即，在抗原上的位点，B和/或T细胞应答所述位点。表位决定簇通常由化学活性的表面分子团(例如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特异性的三维结构特征和特异性的电荷特征。表位一般包括至少3个、5个或8-10个氨基酸。氨基酸可以是连续的，或者通过三级折叠并列的非连续氨基酸。构象性表位或非构象性表位区别在于在变性溶剂的存在下结合前者的特性丧失，而结合后者的特性不会丧失。
多肽的“片段”是多肽的子序列(subsequence)，其实施特异性抗体结合所需的功能和/或提供多肽的三维结构。该术语可以指多肽、多肽聚合物例如二聚体或其他多聚体、融合多肽、多肽片段、多肽抗原性变体，或其衍生物。在一个实施方案中，片段保留有本发明的GHRsp(1-9)(SEQID NO:3)、GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)或其他多肽或者本文描述的多肽的抗原性结合特性。
“GHRsp”是指人类前饥饿素原序列(SEQ ID NO:1)的完整23个氨基酸GHR信号肽。还提及为“GHRsp(1-23)”，其分开显示于SEQ IDNO:2中。GHRsp片段生物标志物包括GHRsp衍生的或GHRsp相关的多肽，包括GHRsp的抗原性变体或片段，基本上由GHRsp的抗原性变体或片段组成，或由GHRsp的抗原性变体或片段组成。可用作GHRsp片段生物标志物的片段包括GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)，即GHRsp(1-23)的前九个氨基酸，以及GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)，即GHRsp(1-23)的前十个氨基酸。在一个实施方案中，GHRsp(1-23)(SEQ ID NO:2)和GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)起到抗体可结合的抗原多肽的作用。GHRsp(1-23)(SEQ ID NO:2)和GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)的变体和片段包括保留至少其抗原性结合功能的抗原性变体和片段。
当应用于本文公开的多肽序列时，术语“分离的”用于指从其天然的细胞环境中移出的序列。可以通过任何方法或方法的组合获得分离的分子，包括生物化学、重组和合成的技术。可以通过至少一个纯化步骤制备多肽序列。
在一个实施方案中，“高于”或“低于”对照或参考值的水平，或相对于对照或参考值的改变、差异或偏差是统计学显著的。在另一者中，可通过借助测定法参考限度或参考间隔来确定更高水平、更低水平、偏差和改变。
“分离的抗体”是已经与其天然环境的组分分开或回收或分开且回收的经过鉴别的抗体。例如，与包括酶和激素的蛋白质分开。在一个实施方案中，将抗体纯化至以抗体重量计至少95％或96％或97％或98％或99％。可以通过例如Lowry方法确定纯度。通常将通过至少一个纯化步骤制备抗体。
如本文中使用的术语“质谱”是指基于离子的质量电荷比来过滤、检测和测量离子的方法。参见例如US 5,719,060、US 6,204,500、US 6,107,623、US 6,124,137、US 6,225,047、US 6,268,144、US 7,057,165和US 7,045,366。常见的质谱技术包括基质辅助激光解吸离子化(MALDI)和表面增强激光解吸离子化(SELDI)。两种都可以与飞行时间分析仪偶联(MALDI-TOF和SELDI-TOF)，这允许在非常短的离子脉冲中分析飞克摩尔水平的分析物。例如在US 5,719,600、US 6,124,137和US 6,225,047中讨论的，可用于本发明中的SELDI版本，还包括表面增强的亲和捕获(SEAC)、表面增强的整齐解吸(SEND)和表面增强的光不稳定的附着和解离(SEPAR)。
如本文中使用的，“单克隆抗体”意指抗体，其是针对单个靶抗原的高度特异性抗体。单克隆抗体可获得自同质或基本同质的抗体群体，其中除了微量存在的天然突变外，每种单克隆抗体是同一的和/或结合相同的表位。使用本领域已知的方法制备单克隆抗体。
如本文中使用的，术语“纯化的”不需要绝对纯度。在一个实施方案中，纯化的是指，例如，样品中的多肽或抗体的至少90％或95％或98％或99％的同质性。
如本文中使用的，术语“将信号与分析物的存在情况或量相关联”反映了测定信号通常通过使用标准曲线与分析物的存在情况或量相关联，所述标准曲线利用已知的目标分析物的浓度算出。在本文中使用术语时，如果测定能产生指示生理学相关浓度的分析物的存在情况或量的可检测信号，测定被“配置为检测”分析物。由于抗体表位在约4-8个氨基酸的级别，配置为检测目标标志物的免疫测定也将检测与标志物序列相关的多肽，只要那些多肽含有结合测定中所使用的(一种或多种)抗体所必需的表位。如本文中涉及生物标志物(例如本文描述的GHRsp标志物中的一种)使用的术语“相关标志物”是指一种或多种抗原性变体，所述抗原性变体可以作为标志物自身的替代物或独立的生物标志物被检测出。该术语还指代生物学样品中存在的一种或多种多肽，所述多肽衍生自复合至额外物种(如结合蛋白质、受体、肝素、脂质、糖等等)的生物标志物前体。
优选地，在样品中测量分析物。如本文中使用的术语“样品”或“生物学样品”意指取自或源自对象的任何样品。这样的样品可以得自对象，或者可以得自意欲提供给对象的生物学材料。例如，样品可以得自被评估用于可能的向对象进行的输血的血液，并且分析物测量过去常常评估血液预先存在的肺炎感染。取自或衍生自任何对象例如来自正常健康对象和/或无肺炎临床病史的健康对象的样品包括在内。优选的样品是体液样品。如本文中使用的术语“体液样品”是指出于例如诊断、预后、分类或评估目标对象例如患者的目的获得的体液的样品。在某些实施方案中，可以出于确定进展中的肺炎感染的结果或肺炎治疗方案的效果的目的获取这样的样品。样品可以是领域中已知的其中可检测到GHRsp片段的任何样品。任何体液例如血液、血浆、血清、脑脊液、唾液、痰、尿液、胸腔积液、组织液、滑液、淋巴、泪液以及例如组织。此外，本领域技术人员将认识到，遵循分馏或纯化程序，例如将全血分离成血清或血浆组分，将更容易分析某些体液样品。
如本文中使用的术语“对象”是指人或非人的生物体。如本文中使用的“对象”优选是哺乳动物，包括人和非人哺乳动物例如猫、狗、马、牛、绵羊、鹿、小鼠、大鼠、灵长类(包括大猩猩、恒河猴和黑猩猩)、负鼠以及其他的驯养的农场动物或动物园动物。因此，本文中描述的方法和组合物可适用于人类和动物疾病二者。此外，尽管对象优选为活的生物体，但本文描述的本发明也可以用于死后分析。优选的对象是人，最优选为“患者”，如本文中使用的“患者”是指可接受或正在接受疾病或病症医疗护理的活人。这包括正被调查病理学病症的无确定疾病的人。
术语“治疗”(“treat”、“treating”或“treatment”)和“预防”是指减轻、改善、管理、预防、压抑、停止或逆转肺炎感染进展的治疗性或预防性措施，所述肺炎感染的特征是显示出与正常的对照水平有差异的GHRsp片段水平。
生物标志物可被理解为与特定病理学或生理学状态相关联的任何生物分子。理想地，肺炎生物标志物、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)生物标志物或肺炎并发ADHF生物标志物应是在没有炎症的情况下检测不到或其值非常低的标志物；其应随着炎性过程增加而升高，应随着炎症消解而降低。对于生物标志物存在增长的需求用于评估其在肺炎、ADHF或患有肺炎和ADHF二者的患者的诊断中的用途。参见Schuetz P,Christ-CrainM,Mueller B.Procalcitonin and other biomarkers to improve assessmentand antibiotic stewardship in infections–hope or hype？Swiss MedicalWeekly.2009；139(23-24):318–326。申请人的发明满足这些需求。
本领域技术人员将会理解，本发明上下文中的术语“生物标志物”和“标志物”可互换地使用，并且意指相同的事物。
饥饿素(GHR)是由胎盘、肾、下丘脑和垂体中的内分泌细胞所产生的多肽激素。在胃(饥饿素产生的主要位点)中，排列于基底的上皮细胞产生饥饿素。饥饿素参与能量平衡的调节。饥饿素通过活化下丘脑摄食中枢，作用于增加食欲、食物消耗最终增加个体体重。饥饿素诱发高血糖，抑制胰岛素释放。饥饿素及其受体还见于心血管组织中(Garcia,E等人；Ghrelin and Cardiovascular health,Current Opinion in Pharmacology,vol6,Issue 2,2006,p.142-147)。如SEQ ID NO:1所示，前GHR原是117个氨基酸的分子(参见表1，下文)。其由经二硫键连接的两个多肽链(A和B)组成。前饥饿素原(1-117)(SEQ ID NO:1)被切割，得到23个氨基酸的信号肽(SEQ ID NO:2；参见表2，下文)、94个氨基酸的饥饿素原和28个氨基酸的饥饿素激素。人前饥饿素原的加工示于图1中。
表1-饥饿素序列
与通常观点不同，申请人已经发现，GHRsp片段在肺炎中在循环中出现，GHRsp片段可用作肺炎的循环标志物。例如，在肺炎对象中，GHRsp的水平将高于正常的对照或参考水平。
申请人还惊讶地发现，GHRsp片段在患有急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的对象的循环中以及在患有肺炎并发ADHF的对象的循环中出现，GHRsp片段可用作肺炎的循环标志物。例如，在这些对象中，GHRsp的水平将高于正常的对照或参考水平。
本发明涉及通过测量一种或多种GHRsp片段标志物用于在患有肺炎或疑似肺炎的对象中诊断、鉴别诊断、风险分层、监测、分类和确定治疗方案的方法和组合物以及试剂盒。本发明还涉及通过测量一种或多种GHRsp片段标志物用于在患有急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或疑似ADHF的对象中诊断、鉴别诊断、风险分层、监测、分类和确定治疗方案的方法和组合物以及试剂盒。本发明进一步涉及通过测量一种或多种GHRsp片段标志物用于在患有肺炎并发ADHF或疑似肺炎并发ADHF的对象中诊断、鉴别诊断、风险分层、监测、分类和确定治疗方案的方法和组合物以及试剂盒。在多个实施方案中，将选自GHRsp(1-9)(SEQ IDNO:3)、或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)(参见表1，上文)、或者例如与之相关的一种或多种标志物的一种或多种标志物的测量浓度与对象的状态相关联。在多个实施方案中，用于确定GHRsp片段标志物的量、浓度或存在情况的测定提供了定量结果(例如，以pmol/L计的测量结果)、半定量结果(例如，在一定范围或多个浓度中的浓度)或定性结果(例如，“是-否”感染)。定量的、半定量的和定性的测定是领域内已知的，不需要在此描述。
本发明提供用于在对象中预测、诊断或监测肺炎和/或确定在对象上待实施的进一步诊断和/或治疗对象的方法，该方法包括：
(a)测量来自对象的生物学样品中的GHRsp片段的水平；和
(b)将GHRsp片段的水平与来自对照或参考水平的GHRsp片段水平进行比较，
其中测量水平与对照或参考水平的偏差指示肺炎。此外，本发明的GHRsp片段标志物方法的结果和GHRsp片段水平与对照或参考水平的比较允许在患有肺炎或疑似肺炎的对象中进行风险分层、监测、分类和治疗方案的确定。
本发明还提供在对象中预测、诊断或监测急性失代偿性心力衰竭(ADHF)和/或确定在对象上待实施的进一步诊断和/或治疗对象的方法，该方法包括：
(a)测量来自对象的生物学样品中的GHRsp片段的水平；和
(b)将GHRsp片段的水平与来自对照或参考水平的GHRsp片段水平进行比较，
其中测量水平与对照或参考水平的偏差指示ADHF。此外，本发明的GHRsp片段标志物方法的结果和GHRsp片段水平与对照或参考水平的比较允许在患有ADHF或疑似ADHF的对象中进行风险分层、监测、分类和治疗方案的确定。
本发明进一步提供在对象中预测、诊断或监测肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)和/或确定在对象上待实施的进一步诊断和/或治疗对象的方法，该方法包括：
(a)测量来自对象的生物学样品中的GHRsp片段的水平；和
(b)将GHRsp片段的水平与来自对照或参考水平的GHRsp片段水平进行比较，
其中测量水平与对照或参考水平的偏差指示肺炎并发ADHF。此外，本发明的GHRsp片段标志物方法的结果和GHRsp片段水平与对照或参考水平的比较允许在患有肺炎并发ADHF或疑似肺炎并发ADHF的对象中进行风险分层、监测、分类和治疗方案的确定。
可使用定量的、半定量的或定性的测定方法来测量GHRsp片段。
一般而言，如本文中提及的，偏差将是相较于对照水平更高的测量水平的GHRsp片段，尽管这不是必须的。
具体的抗原肽片段的实例是GHRsp 1-9(SEQ ID NO:3)和GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
本发明的具体多肽包括具有如在所附序列表中提出的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽。还考虑的是如本文定义的这些多肽的抗原性变体和片段，或与SEQ ID NO:3或4的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％氨基酸同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，抗原性变体或片段是功能上等同的抗原性变体或片段。换言之，抗原性变体或片段保留有SEQ ID NO:3或4作为抗原的功能。在抗GHRsp片段抗体的制备中可使用该多肽。
除了领域内已知的计算机/数据库方法之外，可通过领域内已知的物理方法鉴定多肽抗原性变体，已知方法例如，通过由Sambrook等人(Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Ed.Cold Spring Harbor Press,1987)记载的重组DNA技术通过利用针对本发明的多肽产生的抗体来筛选表达库(同样为Sambrook等人)，或者通过借助这些抗体从天然来源鉴定多肽。
可使用领域内熟知的肽合成方法制备包括抗原性变体多肽的多肽，例如使用固相技术的直接肽合成(例如Merrifield,1963,in J.Am Chem.Soc.85,2149；Stewart等人,1969,in Solid-Phase Peptide Synthesis,WHFreeman Co,San Francisco California；Matteucci等人J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191,1981以及Atherton等人,in Solid Phase Peptide Synthesis:a practical approach,.IRL press(1989))，或者自动化合成，例如使用来自Applied Biosystems(California,USA)的合成器。还可以使用合成方法生产多肽的突变形式，例如如Adelmen等人；DNA 2,183(1983)描述的对编码氨基酸序列的DNA的位点特异性诱变。还参见Protein ProtocolsHandbook；Walker,J.Humana Press 2002。
可以将多肽片段和抗原性变体多肽分离用于制备结合剂，包括例如抗体结合剂。它们可使用领域内熟知的多种技术从天然来源中分离或纯化，包括，例如HPLC、离子交换层析和免疫层析(例如Deutscher,1990,Ed,Methods in Enzymology,Vol.182,Guide to Protein Purification,andProtein Protocols Handbook)。如上所述，在其它用途之中，多肽和抗原性变体在产生抗体和产生配体中具有实用性。
广泛而言，本发明提供用于评估肺炎的饥饿素信号肽片段测定的制备和用途以及相关的试剂盒和制成品，所述制成品可包括使用说明书或与之相关联。
在另一方面，本发明提供用于评估对象中的肺炎感染的方法，包括实施配置为检测得自对象的体液样品中的饥饿素信号肽片段以提供测定结果的测定方法；和将测定结果与对象中肺炎感染的存在情况或状态相关联。在一个实施方案中，关联步骤包括将测定结果与对象中肺炎感染的存在情况或状态的风险分层、疾病分期、分类和监测中的一种或多种相关联。在另一实施方案中，关联步骤包括基于测定结果对对象分配治疗方案。在另一实施方案中，关联步骤包括评估对象中肺炎感染治疗方案之后的临床结果。
在又一方面，本发明提供用于评估对象中的急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的方法，包括实施配置为检测得自对象的体液样品中的饥饿素信号肽片段以提供测定结果的测定方法；和将测定结果与对象中ADHF的存在情况或状态相关联。在一个实施方案中，关联步骤包括将测定结果与对象中ADHF的存在情况或状态的风险分层、疾病分期、分类和监测中的一种或多种相关联。在另一实施方案中，关联步骤包括基于测定结果对对象分配治疗方案。在另一实施方案中，关联步骤包括评估对象中ADHF治疗方案之后的临床结果。
在再一方面，本发明提供用于评估对象中的肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的方法，包括实施配置为检测得自对象的体液样品中的饥饿素信号肽片段以提供测定结果的测定方法；和将测定结果与对象中肺炎并发ADHF的存在情况或状态相关联。在一个实施方案中，关联步骤包括将测定结果与对象中肺炎并发ADHF的存在情况或状态的风险分层、疾病分期、分类和监测中的一种或多种相关联。在另一实施方案中，关联步骤包括基于测定结果对对象分配治疗方案。在另一实施方案中，关联步骤包括评估对象中肺炎并发ADHF治疗方案之后的临床结果。
在再一实施方案中，测定结果是饥饿素信号肽片段的测量浓度，并且关联步骤包括将浓度与阈值浓度进行比较。在一个实施方案中，阈值是在早些的时间点从对象得到的饥饿素信号肽片段的浓度。在其它实施方案中，阈值是从正常对象群体得到的饥饿素信号肽片段的浓度和/或从对象群体得到的饥饿素信号肽片段的浓度。在再一实施方案中，阈值是为了从对象群体将患有例如肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发ADHF的第一亚群相对于不患有这些病症或病症组合的第二亚群区分开而选择的饥饿素信号肽片段的浓度。
在再一实施方案中，基于肺炎的一种或多种症状，包括咳嗽生痰、发热、胸腔积液、吸气时剧烈胸痛和呼吸急促，选择对象以评估肺炎。
在再一实施方案中，基于急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的一种或多种症状，包括呼吸急促(呼吸困难)、水肿和疲劳，选择对象以评估ADHF。
在再一实施方案中，基于肺炎的一种或多种症状(包括咳嗽生痰、发热、胸腔积液、吸气时剧烈胸痛和呼吸急促)和/或ADHF的一种或多种症状(包括呼吸急促(呼吸困难)、水肿和疲劳)，选择对象以评估肺炎并发ADHF。
在再一实施方案中，关联步骤包括基于测定结果评估对象中肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF是否改善或恶化。
在另一方面，本发明提供用于监测对象对肺炎治疗的响应的方法，该方法包括测量来自对象的生物学样品中肺炎的GHRsp片段生物标志物的水平，并将所述GHRsp片段的水平与来自对照、参考的GHRsp片段水平或参考范围进行比较，其中来自对照或参考水平的GHRsp片段生物标志物的测量水平的改变指示着对治疗的响应。
在又一方面，本发明提供用于监测对象对急性失代偿性心力衰竭(ADHF)治疗的响应的方法，该方法包括测量来自对象的生物学样品中ADHF的GHRsp片段生物标志物的水平，并将所述GHRsp片段的水平与来自对照、参考的GHRsp片段水平或参考范围进行比较，其中来自对照或参考水平的GHRsp片段生物标志物的测量水平的改变指示着对治疗的响应。
在另一方面，本发明提供用于监测对象对肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)治疗的响应的方法，该方法包括测量来自对象的生物学样品中肺炎并发ADHF的GHRsp片段生物标志物的水平，并将所述GHRsp片段的水平与来自对照、参考的GHRsp片段水平或参考范围进行比较，其中来自对照或参考水平的GHRsp片段生物标志物的测量水平的改变指示着对治疗的响应。
技术人员读后将会理解，出于评估目的，GHRsp片段生物标志物水平通常将与参考值或范围或对照值关联。
如本文中使用的，对照可以是从中取得GHRsp片段生物标志物样品并确定平均GHRsp片段生物标志物水平的个体或群体。通常，个体或群体将包括正常健康个体或未知罹患肺炎或例如急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的病症或二者的一组个体。来自实施例的数据显示，大多数个体中的GHRsp片段生物标志物水平低于12pmol/L，中位对照水平为约11.1pmol/L。这些数据还显示，患有肺炎的个体中的GHRsp片段生物标志物水平大于17pmol/L，且中位水平为约17.8pmol/L。备选地，对照水平可基于事先测试的个体或群体的多个读数进行评估。备选地，对照可以是在早些时间取自同一对象的一个或多个读数或者这些读数的均值。
来自实施例的数据还显示，患有急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的个体中的GHRsp片段生物标志物水平大于16pmol/L，且中位水平为约16.1pmol/L，而患有肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的个体中的GHRsp片段生物标志物水平大于19pmol/L，且中位水平为19.75pmol/L。相对于对照水平，这些数据证实了使用GHRsp片段作为肺炎并发ADHF以及ADHF的生物标志物的临床可用性。
应理解，取决于被评估的患者，测量样品中GHRsp片段生物标志物水平的步骤可以是对单一样品的单一测量，或是对数个样品的重复测量。测量可包括，例如，在不同时间取自或衍生自对象的样品中对GHRsp片段生物标志物的1至20个测量，1至10个、1至5个、1至3个、1个或2个、或2个或3个测量。在一个实施方案中，测量在肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)治疗之前和之后取样的样品上、或肺炎和ADHF均存在的患者上进行。也可以用单一或重复的测量来建立GHRsp片段生物标志物水平与正常对照水平或者相关的参考水平或范围或者事先对患者测量的水平相比较是否升高或降低。
在一个实施方案中，该方法包括测量在入院的第一个小时内取样的至少一个样品中的GHRsp片段生物标志物水平，接着测量在入院的约4-8小时、或约6-12小时、或约12至24小时或以上时间内取样的1个或2个样品中的GHRsp片段生物标志物水平，或测量GHRsp片段的初始水平。
以上定义的生物学样品可以是任何生物学材料，GHRsp片段生物标志物可位于或分泌于所述生物学材料中。在一个实施方案中，生物学样品是循环生物学样品，例如血液、血清或血浆。
标志物测定
通常，免疫测定涉及将含有或疑似含有目的生物标志物的样品与特异性地结合该生物标志物的至少一种抗体接触。然后产生信号，指示着通过样品中的多肽结合至抗体而形成的复合物的存在情况或量。于是将该信号与样品中生物标志物的存在情况或量(定量地、半定量地或定性地)相关联。技术人员熟知许多方法和装置用于生物标志物的检测和分析。参见，例如美国专利号6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524；和5,480,792，以及The Immunoassay Handbook,David Wild,ed.StocktonPress,New York,1994，其各自通过引用其整体(包括所有表格、附图和权利要求)并入本文。
领域内知晓的测定装置和方法可以以多种夹心、竞争性或非竞争性测定形式利用标记分子来生成信号，所述信号与目的生物标志物的存在情况或量相关。合适的测定形式还包括层析、质谱和蛋白质“印迹”方法。此外，可采用某些方法和装置例如生物传感器和光学免疫测定来确定分析物的存在情况或量，而不需标记分子。参见，例如美国专利号5,631,171；和5,955,377，其各自通过引用其整体(包括所有表格、附图和权利要求)并入本文。本领域技术人员还认识到，包括但不限于BeckmanACCESS.RTM.、Abbott AXSYM.RTM.、Roche ELECSYS.RTM.、DadeBehring STRATUS.RTM.系统的机器人仪器包括在能够实施免疫测定的免疫测定分析仪之中。但可以利用任何合适的免疫测定，例如酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定等等。
可将抗体或其它多肽固定化到多种固体支撑体上用于测定中。可用于固定特定的结合成员的固相包括在固相结合测定中发展成和/或用作固相的那些。合适的固相的实例包括膜过滤器、纤维素基纸材、珠子(包括聚合颗粒、乳胶颗粒和顺磁颗粒)、玻璃、硅片、微粒、纳米颗粒、Tenta凝胶、Agro凝胶、PEGA凝胶、SPOCC凝胶和多孔板。可通过在固体支撑体上的阵列中涂覆抗体或多种抗体来制备测定条。然后可将该测定条浸渍到测试样品中，然后通过洗涤和检测步骤快速处理以生成可检测的信号，例如有色点。可通过直接缀合至测定装置表面或者通过间接结合使抗体或其它多肽结合至测定装置的特定区域。在后一种情况的实例中，抗体或其它多肽可被固定化到颗粒或其它固体支持物上，该固体支持物被固定化在装置表面。
生物学测定需要检测方法，对结果定量的最常用方法之一是将可检测的标记物缀合至蛋白质或核酸，该蛋白质或核酸对所研究的生物学系统中的组分之一有亲和力。可检测的标记物可以包括其自身可检测的分子(例如，荧光部分、电化学标记物、金属螯合物等)以及可通过产生可检测的反应产物而被间接检测的分子(例如，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等等的酶)或者通过自身可检测的特定结合分子而被间接检测的分子(生物素、洋地黄毒苷、麦芽糖、寡聚组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐、ssDNA、dsDNA等)。
固相和可检测标记物缀合物的制备经常包括化学交联剂的使用。交联试剂含有至少两个反应基，大致分为同官能性交联剂(含有相同的反应基)和异官能性交联剂(含有不同的反应基)。通过胺、巯基偶联或非特异性地反应的同双官能-性交联剂可得自许多商业来源。马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物、α-卤代酰基和吡啶基二硫化物是硫醇反应性基团。马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物以及α-卤代酰基与巯基反应形成硫醚键，而吡啶基二硫化物与巯基反应产生混合二硫化物。吡啶基二硫化物产物是可断裂的。亚氨酸酯也非常适用于蛋白质-蛋白质交联。多种异双官能性交联剂(各结合了用于成功缀合的不同属性)是市售的。
在某些方面，本发明提供用于分析所描述的肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发ADHF的生物标志物的试剂盒。该试剂盒包含用于分析至少一个测试样品的试剂，其包含至少一种针对标志物的抗体。该试剂盒还可包括用于实施本文描述的诊断和/或预后关联中的一种或多种的装置和说明书。优选的试剂盒将包含用于对分析物实施夹心测定的抗体对，或用于对分析物实施竞争性测定的标记物种。优选地，抗体对包含缀合至固相的第一抗体和缀合至可检测标记物的第二抗体，其中第一和第二抗体各自结合肺炎标志物。最优选地，各抗体是单克隆抗体。关于使用试剂盒和进行关联的说明书可以是标签形式，其是指在其制备、运输、销售或使用期间的任意时刻附属于或以其他方式随附于试剂盒的任何书面或记录材料。例如，术语标签涵盖广告传单和小册子、包装材料、说明书、录音带或录像带、计算机磁盘和直接印在试剂盒上的字迹。
抗体
如上所述，如本文中使用的一种或多种抗体是指衍生自、仿效或基本上由一种免疫球蛋白基因或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的能够特异性结合抗原或表位的肽或多肽。参见，例如Fundamental Immunology,3rdEdition,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993)；Wilson(1994；J.Immunol.Methods 175:267-273；Yarmush(1992)J.Biochem.Biophys.Methods 25:85-97。术语抗体包括抗原结合部分，即保留结合抗原的能力的“抗原结合位点”(例如，片段、子序列、互补决定区(CDR))，包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，其是包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。单链抗体也通过引用包括在术语“抗体”中。
关于抗体和片段的进一步讨论，参见例如PNAS USA 81:6851-6855(1984),Protein Eng 8(10)1057-1062(1995)；The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,vol.113,Springer-verlag 1994,Rosenburg andMoore Eds；PNAS USA 90:6444-6448(1993)；Nature 321:522-525(1986)；Nature 332:323-329(1988),及WO 2005/003154。
还包括通过用GHRsp片段或其抗原性变体免疫动物(例如小鼠、大鼠或兔)而获得的抗血清。抗体可结合GHRsp片段组中的共同GHRsp片段序列，或结合特定的GHRsp片段，或者甚至结合GHRsp片段集合。简而言之，制备多克隆抗体的方法是熟练的技术人员已知的。可以在哺乳动物产生多克隆抗体，例如，通过一次或多次注射免疫试剂，以及需要时注射佐剂。通常，通过多次皮下或腹腔内注射，将免疫剂和/或佐剂注射到哺乳动物中。免疫剂可以包括GHRsp、或其片段或抗原性变体、或其融合蛋白。将免疫剂与已知在被免疫的哺乳动物是免疫原性的蛋白质缀合是有用的。此类免疫原性蛋白质的实例包括但不限于钥孔虫血蓝蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可以使用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL TDM佐剂(单磷酰酯A，合成的海藻糖dicorynomycolate)。本领域技术人员可以选择免疫方法而无需过度实验。
可以使用本领域普遍已知的杂交瘤方法制备单克隆抗体。参见例如Kohler and Milstein,1975(Kohler Continuous Cultures of Fused CellsSecreting Antibody of Predefined Specficity.Nature,(5517)256,495-497),US 4,196,265,US 4,816,567and Golemis(上文)。杂交瘤细胞可以培养在合适的培养基中，备选地，杂交瘤细胞可以在体内生长，如在哺乳动物的腹水中。优选的永生细胞系是鼠骨髓瘤细胞系，可获得自例如美国典型培养物收藏中心(American Type Culture Collection,Virginia,USA)。可以使用免疫测定筛选分泌目标抗体的永生细胞系。筛选中可以使用GHRsp或其片段或抗原抗体的序列。
用于确定由杂交瘤细胞生产的单克隆抗体的结合特异性的普遍已知的手段包括免疫沉淀、放射连接的免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)和Western印迹(Lutz等人,Exp.Cell.Res.175:109-124(1988)，Golemis(上文)和Howard(上文))。例如，如上所述，可以通过Munson等人,Anal Biochem 107:220(1980)中描述的Scatchard分析，确定单克隆抗体的结合亲和力。可以类似地筛选来自经免疫的动物的样品多克隆抗体的存在。
还可以从重组的宿主细胞获得单克隆抗体。可以从杂交瘤细胞系获得编码抗体的DNA。然后，将DNA置入表达载体中，转染进入宿主细胞(例如，COS细胞、CHO细胞、大肠杆菌细胞)中，并在宿主细胞中生产抗体。然后使用标准技术分离和/或纯化抗体。
还可以通过重组DNA方式来产生单克隆抗体或片段(参见例如美国专利号4,816,567)。DNA修饰如人重链和轻链恒定结构域的编码序列替代来代替同源鼠序列(以上美国专利号4,816,567)也是可能的。抗体可以是单价抗体。用于制备单价抗体的方法在本领域是众所周知的(美国专利号5,334,708、5,821,047以及7,476,724)。本文还考虑(US 6,020,153)嵌合(US 4,816,567)、双价抗体(US 5,843,708)以及多价抗体的生产。
还可以使用用于单克隆抗体生产的其它已知技术如从噬菌体文库生产。参见例如，Nature 352：624-628(1991)。
可以通过常规的免疫球蛋白纯化方法，例如，逆相HPLC、蛋白A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基或腹水液中分离或纯化由细胞分泌的单克隆抗体。参见例如，Scopes,ProteinPurification:Principles and Practice,Springer-Verlag,NY(1982)。
双特异性抗体也可以是有用的。这些抗体是单克隆抗体，优选人抗体或人源化抗体，其对于至少两种不同的抗原具有结合特异性。例如GHRsp或其抗原性变体或片段，以及抗原，所述抗原选自包括前饥饿素原、ANP、ANP-SP、CK-MB、TnT、TnI、BNP、BNP-SP、NT-BNP、肌红蛋白、LDH、天冬氨酸转氨酶、H-FABP、缺血修饰白蛋白、内皮素、肾上腺髓质素、肾素以及血管紧张素II的组。本文还考虑具有多于两种的特异性的抗体例如三特异性抗体。
用于制备双特异性抗体的方法在本领域是已知的。参见例如Milsteinand Cuello 198319，Suresh等人,198620和Brennan等人,198521。
本文中描述的免疫测定中所用的抗体优先地与本发明的肺炎标志物特异性结合。术语“特异性结合”并非旨在表明抗体排他地与其预期的靶标结合，因为如上所述，抗体与呈现抗体结合表位的任何多肽结合。而是，如果抗体对其预期的靶标的亲和力比其对不呈现适当表位的非靶标分子的亲和力高约5倍，则抗体“特异性结合”。优选地，抗体对靶标分子的亲和力是其对非靶标分子亲和力的至少约5倍，优选为10倍，更优选为25倍，甚至更优选为50倍，最优选为100倍或更多。在优选的实施方案中，抗体以至少约10-6、或10-7M、或至少约10-8M、或10-9M、或10-10、或10-11或10-12M的亲和力进行结合。
按Kd＝koff/kon计算亲和力(koff是解离速率常数，Kon是缔合速率常数，Kd是平衡常数)。可通过在平衡时测量不同浓度(c)下标记的配体的结合分数(r)来确定亲和力。利用Scatchard等式：r/c＝K(n-r)对数据进行作图：其中r＝平衡时每摩尔受体的结合配体的摩尔数；c＝平衡时游离配体浓度；K＝平衡缔合常数；n＝配体结合位点数/受体分子。通过作图分析，将r/c绘于Y-轴，将r绘于X-轴上，由此制得Scatchard图。通过Scatchard分析进行抗体亲和力测定是本领域中熟知的。参见例如Erp等人,J.Immunoassay 12:425-43,1991；Nelson and Griswold,Comput.Methods Programs Biomed.27:65-8,1988。
许多出版物中讨论了利用噬菌体展示技术来产生和筛选用于与选定分析物结合的多肽库。参见例如Cwirla等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,6378-82,1990；Devlin等人,Science 249,404-6,1990,Scott and Smith,Science 249,386-88,1990；和Ladner等人，美国专利号5,571,698。噬菌体展示法的基本概念是建立编码待筛选多肽的DNA与多肽之间的物理缔合。这种物理缔合由噬菌体颗粒提供，该噬菌体颗粒将多肽显示为包围编码多肽的噬菌体基因组的衣壳的一部分。多肽与其遗传物质之间的物理缔合的建立允许同时群集筛选非常大量的带有不同多肽的噬菌体。展示对靶标具有亲和力的多肽的噬菌体结合至靶标，并且这些噬菌体通过对靶标的亲和力筛选得到富集。由这些噬菌体展示的多肽的种类(identity)可由其各自的基因组来确定。利用这些方法，于是可通过常规的手段大量合成经鉴定对期望靶标具有结合亲和力的多肽。参见例如美国专利号6,057,098，该专利通过引用其整体并入本文，包括所有表格、附图和权利要求。
然后可以对由这些方法产生的抗体进行选择，其是首先通过与纯化的目标多肽的亲和力和特异性进行筛选，如有需要，将结果与抗体对于期望排除结合的多肽的亲和力和特异性进行比较。筛选程序可涉及将纯化的多肽固定在微量滴定板的单独孔中。然后将含潜在抗体或抗体组的溶液置入各自的微量滴定孔中并孵育约30分钟至2小时。然后清洗微量滴定孔并将标记的第二抗体(例如，如果培养的抗体是小鼠抗体，则为与碱性磷酸酶缀合的抗小鼠抗体)添加至孔中并孵育约30分钟，然后清洗。将底物加入孔中，在固定多肽的抗体存在之处出现颜色反应。
然后可以在选定的测定设计中对如此鉴定的抗体进一步分析亲和力和特异性。在靶蛋白质免疫测定的开发中，纯化的靶蛋白质用作标准物，用其判断使用已选定抗体的免疫测定的敏感性和特异性。因为各种抗体的结合亲和力可能会有所不同；某些抗体对(例如，在夹心测定中)可能会在空间上彼此干扰等，所以抗体的测定性能是比抗体的绝对亲和力和特异性更重要的量度。
测定关联
如本文中关于生物标志物使用所用的术语“关联”是指将患者中生物标志物的存在情况或量与已知罹患肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发ADHF的人中或已知没有肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF的人中的生物标志物的存在情况或量进行比较。通常，这采取的形式是将生物标志物浓度形式的测定结果与选择为指示肺炎存在或不存在或者一些日后结果的可能性的预定阈值进行比较。
选择诊断阈值在其它之事项中涉及考虑疾病的概率、在不同测试阈值下真假诊断的分布、和基于诊断对治疗(或治疗失败)后果的估计。可以以多种方式确定合适的阈值。例如，利用心肌钙蛋白诊断急性心肌梗塞的一个建议诊断阈值是见于正常群体中的浓度的第97.5百分位。另一方法是查看同一患者的系列样本，其中先前的“基线”结果用于监测生物标志物水平的短暂改变。
如在以下实施例中关于肺炎和/或急性失代偿性心力衰竭和GHRsp片段所描述的，也可采用群体研究来选择判定阈值。源自二战期间开发用于雷达图像分析和ROC分析的信号检测理论领域的接收者操作特征(“ROC”)常用于选择能最好地区分“患病”亚群与“未患病”亚群的阈值。当人测试为阳性但实际上未患病时，这种情况下出现的是假阳性。另一方面，当人测试为阴性时，表明其是健康的，而实际上却患病时，出现的是假阴性。为绘制ROC曲线，随着判定阈值的连续变化，确定真阳性率(TPR)和假阳性率(FPR)。因为TPR相当于敏感性，FPR等于1-特异性，所以有时称ROC图为敏感性对(1-特异性)制图。完美的测试在ROC曲线下的面积将为1.0；随机测试的面积为0.5。选择阈值以提供可接受的特异性和敏感性水平。
在这种环境下，“患病”意指具有一种特征的群体(存在疾病或病症或出现一些结果)，“未患病”意指没有该特征的群体。虽然单个判定阈值是这种方法的最简单应用，但可使用多个判定阈值。例如，低于第一阈值，可以以相对高的置信度指定疾病的不存在，高于第二阈值，也可以以相对高的置信度指定疾病的存在。介于两阈值之间可视为不确定。这仅仅旨在是示例性的。
除阈值比较外，将测定结果与患者分类(疾病存在或不存在、结果的可能性等)相关联的其它方法包括决策树、规则集、贝叶斯(Bayesian)方法和神经网络方法。这些方法可产生代表受试者归属多个分类中的一个分类的程度的概率值。
测试精度的量度可按Fischer等人，Intensive Care Med.29:1043-51，2003中所述获得，并用于确定给定生物标志物的有效性。这些量度包括敏感性和特异性、预测值、概率比、诊断优势比和ROC曲线面积。ROC图的曲线下面积(“AUC”)等于分类器分级随机选择的阳性例高于随机选择的阴性例的概率。ROC曲线下的面积可认为等同于Mann-Whitney U测试(该测试所测试的是在所考虑的两组中得到的分数之间的中值差，如果所述组是连续数据组的话)或等同于Wilcoxon秩检验。
如以上所讨论的，合适的测试可呈现这些不同测量的一种或多种以下结果：特异性大于0.5，优选为至少0.6，更优选为至少0.7，且相应的敏感性大于0.2、0.3或0.4，还更优选为至少0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，最优选为大于0.95；敏感性大于0.5，优选为至少0.6、0.7或0.8，甚至更优选为至少0.9，最优选为至少0.95，且相应的特异性大于0.2、0.3或0.4，还更优选为至少0.5、0.6、0.7、0.8或0.9，最优选为大于0.95；至少75％敏感性，与至少75％特异性组合；ROC曲线面积大于0.5，优选为至少0.6，更优选为0.7；优势比不同于1，优选为至少约2或更大或约0.5或更小，更优选为至少约3或更大或约0.33或更小，还更优选为至少约4或更大或约0.25或更小，甚至更优选为至少约5或更大或约0.2或更小，最优选为至少约10或更大或约0.1或更小；阳性概率比(计算为敏感性/(1-特异性))大于1，至少为2，更优选为至少3，还更优选为至少5，最优选为至少10；和或阴性概率比(计算为(1-敏感性)/特异性)小于1，小于或等于0.5，更优选为小于或等于0.3，最优选为小于或等于0.1。
在以下实施例中示出表明GHRsp片段测量用于检测肺炎的有效性的范例ROC曲线。最初，在送至新西兰克赖斯特彻奇医院的急诊科时从123名连续患者(其主要诉求是呼吸急促/呼吸困难)中抽取血液样品。123名患者中有23名(18.6％)通过独立的诊断金标准被确定为患有肺炎，诊断金标准包括临床检查、胸部x光片和对痰液实验室分析肺炎链球菌细菌。肺炎患者的中位GHRsp片段为11.1pmol/L，而没有肺炎的患者的中位值为8.8pmol/L。然后通过所描述的GHRsp片段RIA分析所制备的血浆样品。对这些表现值的后续分析反映了GHRsp能够检测肺炎，伴以0.714的ROC曲线下面积(AUC)(p<0.01)。从ROC曲线中，结果还显示11.1pmol/L下83％特异性/48％敏感性，13.1pmol/L下92％特异性/35％敏感性。这些数据证实了GHRsp片段测定用于有意义的决策的适合性并表现出良好水平的临床有效性。
额外的临床指征可以与本发明的肺炎标志物测定结果相组合。这些包括胸部x光片和对痰液实验室分析肺炎链球菌感染等，以及测定C-反应蛋白、白细胞计数、免疫球蛋白、促炎细胞因子、原降钙素(PCT)和髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)。
采用这种方式的组合测定结果/临床指征可包括使用多元逻辑回归、对数线性模型、神经网络分析、n-of-m分析、决策树分析等。此列举并非意在限制。
本领域技术人员容易理解，本发明非常适合实现所提到的目的和得到所提到的结果和优点以及其中所固有的那些。本文中所提供的进一步描述和实施例代表某些实施方案，它们是示例性的，并不旨在限制本发明的范围。
肽测定
在一个实施方案中，测量步骤包括检测GHRsp片段生物标志物与结合(包括选择性地或特异性地结合)GHRsp或其片段或抗原性变体的结合剂之间的结合。作为该测量中的事先步骤，GHRsp片段生物标志物多肽可以与结合GHRsp或其片段或抗原性变体的结合剂结合。
因此，在一个实施方案中，本发明提供用于生物学样品中的GHRsp片段生物标志物的测定，所述测定包括使用任何已知方法检测和测量样品中GHRsp片段生物标志物的水平。
在一个实施方案中，本发明提供用于GHRsp片段生物标志物的测定，包括：
(a)结合生物学样品中的一种或多种GHRsp片段生物标志物多肽；以及
(b)测量所结合的GHRsp片段生物标志物多肽的水平。
在一个实施方案中，GHRsp片段生物标志物多肽是GHRsp(1-9)(SEQID NO:3)或其抗原性变体或片段。将理解的是，在一个实施方案中，可以在测定中结合多于一种类型的GHRsp多肽，例如GHRsp(1-9)(SEQID NO:3)和GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
在一个实施方案中，使用结合剂结合GHRsp片段生物标志物多肽。结合剂可以是选择性的(特异性的)结合剂。换言之，其与其它生物学事件标志物具有低交叉反应性，对饥饿素具有更特定的交叉反应性。在一个实施方案中，结合剂是抗体或其抗原结合片段。当在测定时中使用抗体时，可针对GHRsp片段生物标志物的任何抗原部分产生抗体，包括N端或C端。在一个实施方案中，针对GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)或其抗原性变体或片段产生抗体。
本发明还涉及这样的结合剂、抗体和抗体的抗原结合片段以及它们在测定中的用途，或在制备GHRsp片段的测定、预后工具、诊断工具或监测工具中的用途。测定或工具可用于监测对象中的肺炎，或者其可用于监测对象中的急性失代偿性心力衰竭(ADHF)，或者其可用于监测患有肺炎和ADHF二者的对象。
在一个实施方案中，抗体结合GHRsp的N端(1-9)。结合剂选择性结合的特异性抗原肽的实例包括GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)。
可以通过本领域已知的任何工具，包括特异性(基于抗体的)和非特异性(例如HPLC固相)的工具，检测GHRsp片段生物标志物的结合。最常见的是，使用上述测定，例如ELISA或RIA，来检测本文中的抗体。单独的竞争性结合测定、夹心测定、非竞争性测定、荧光免疫测定、免疫荧光测量测定或免疫放射测定、发光测定、化学发光测定，和质谱分析，如表面增强的激光解吸和离子化(SELDI)、电喷雾离子化(ESI)、基质辅助的激光解吸离子化(MALDI)、傅立叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)，或与非特异性的结合剂的组合(例如层析形式)也是可行的。参见例如Golemis,E and Howard G(上文)。
方便地，可以将抗体固定在固体底物上，以便于洗涤和分离GHRsp/抗体复合物。可以使用已知的技术实现抗体与固体支持物的结合。参见例如Handbook of Experimental Immunology,4th edition,BlackwellScientific Publications,Oxford(1986)。对于抗体有用的固体底物包括玻璃、尼龙、纸和塑料。类似地，GHRsp可以被吸附到固体底物上，例如吸附性硅胶或树脂颗粒，或任选地用离子交换、逆相(例如C18包被)或其他材料包被或衍生化的硅芯片。底物的形式可以是珠、平板、管、棍或生物芯片。生物芯片的实例包括可获得自Perkin Elmer,USA的Ciphergen、ProteinChip阵列(Ciphergen Biosystems(CA,USA))和Packard BioChips。还参见US 6,225,047，US 6,329,209。生物芯片可包括层析表面。具有可寻址的位置以及精细的微滴度板的生物芯片或平板是特别有用的。还优选使用的是多元系统，其中，使用含有针对多个分析物的抗体的珠子来测量单个样品中的分析物的水平。待测量的分析物可以包括其它标志物，以及GHRsp或其抗原性变体或片段。适合用于本文中的多元珠系统的一个实例是Luminex Flurokine Multianalyte Profiling系统。
抗体测定方法是本领域普遍已知的，参见例如US 5,221,685、US5,310,687、US 5,480,792、US 5,525,524、US 5,679,526、US 5,824,799、US5,851,776、US 5,885,527、US 5,922,615、US 5,939,272、US 5,647,124、US5,985,579、US 6,019,944、US 6113,855、US 6,143,576，而关于未标记的测定，参见US 5,955,377和US 5,631,171，关于测定形式和条件的描述还参见Zola,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques pp147-158(CRCPress,Inc 1987)，Harlow and Lane(1998)Antibodies,A LaboratoryManual,Cold Spring Harbour Publications,New York以及US2005/0064511。本文引用的所有文献都通过引用全文整合到本文中。
免疫测定分析仪也是普遍已知的，并且除其他已经详细描述过的之外，包括Beckman Access、Abbott AxSym、Roche ElecSys和Dade BehringStatus系统22。
可以直接或间接地检测由GHRsp片段生物标志物与抗体结合形成复合物。使用标记，例如荧光、发光、放射性核素、金属、染料等进行直接检测。间接检测包括结合可检测的标记，例如地高辛或酶(例如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)，以形成标记的抗体，随后进行通过添加检测试剂来检测标记的步骤。
例如，辣根过氧化物酶可以与底物(如邻-苯二胺二盐酸盐(OPD)和过氧化物)孵育，以生成可以测量其吸光值的显色产物，或与鲁米诺和过氧化物孵育，以产生可以在光度计中测量的化学发光，如本领域已知地。生物素或地高辛可以与和它们强有力地结合的结合剂反应。例如，蛋白质抗生物素蛋白和链霉亲和素将强有力地结合生物素。然后，通过与蛋白质直接反应，或者通过使用通常可获得的交联剂(例如MCS和碳二亚胺)，或者通过添加螯合剂，共价结合或连接另外的可测量的标记。
一般而言，通过例如离心，来分离复合物和未复合的试剂。如果抗体是被标记的，则通过检测到的标记的量来反映复合物的量。备选地，可以通过与抗体结合，来标记GHRsp片段生物标志物，并通过当抗体标记的GHRsp片段生物标志物与含有未标记的GHRsp片段生物标志物的生物学样品孵育时，测量已结合的经标记的GHRsp片段生物标志物的减少，在竞争性测定中检测所述GHRsp片段生物标志物。可以使用其他免疫测定，例如夹心测定。
在一个实施方案中，在与抗体接触后，通常在4℃ 18至25小时过夜，或在25℃至40℃ 1至2至4小时，将与结合剂(抗体)结合的经标记的GHRsp片段生物标志物与未结合的经标记的GHRsp片段生物标志物分开。在溶液相的测定中，通过添加与固相颗粒(例如纤维素或磁性材料)偶联的抗γ球蛋白抗体(第二抗体)，完成分离。第二抗体是在与第一抗体使用的物种不同的物种中产生的，并且结合第一抗体。因此，所有的第一抗体都通过第二抗体与固相结合。通过离心或磁力吸引从溶液中去除该复合物，并且使用与其结合的标记测量所结合的经标记的肽。用于分离结合的和游离的标记的其他选项包括形成从溶液中沉淀的免疫复合物，通过聚乙二醇沉淀抗体，或将游离的经标记的肽与木炭结合并通过过滤离心从溶液中去除。通过恰当的方法，例如上文所述那些，测量分开的结合的或游离相中的标记。
竞争性结合测定也可以配置为固相测定，所述固相测定易于实施，并因此比上述测定更优选。这一类型的测定使用具有孔的平板(通常被称为ELISA或免疫测定平板)、固体珠或管表面。第一抗体吸附于或共价结合在平板、珠子或管的表面上，或者通过抗γ球蛋白或抗Fc区第二抗体间接结合，所述第二抗体吸附于平板或与平板共价结合。将样品和经标记的肽(如上)同时或顺序添加到平板中，并且在允许样品中的GHRsp和经标记的肽之间的抗体竞争结合的条件下孵育。之后，可以吸去未结合的经标记的肽，并漂洗平板，留下与附着在平板上的与抗体结合的经标记的肽。然后，可以使用上述技术测量经标记的肽
夹心型测定具有更高的特异性、速度和更大的测量范围。在该类型的测定中，如上所述，将过量的GHRsp片段生物标志物的第一抗体通过吸附、共价偶联或抗Fc或γ球蛋白抗体，附着至ELISA板的孔、珠子或管，用于进行固相竞争性结合测定。将样品流体或提取物与附着在固相上的抗体接触。因为抗体是过量的，因此该结合反应通常很快。还将GHRsp片段生物标志物的第二抗体与第一抗体同时或相继地与样品孵育。选择与GHRsp片段生物标志物上的位点结合的第二抗体，所述位点不同于第一抗体的结合位点。此两种抗体反应导致了样品的GHRsp片段生物标志物夹在两种抗体之间的夹心物。第二抗体通常用如上所述用于竞争性结合测定的便于检测的化合物标记。备选地，可以将特异性结合第二抗体的经标记的第三抗体与样品接触。在洗去未结合的材料后，可以通过竞争性结合测定中概述的方法，测量和定量结合的经标记的抗体。
还可以使用量尺(dipstick)型测定。这些测定是本领域普遍已知的。它们可以使用例如小颗粒，如附着了特异性抗体的金或有色的乳胶颗粒。可以将待测量的液体样品添加到预载了颗粒的膜或纸条的一端，允许其沿着纸条迁移。样品中的抗原与颗粒的结合改变了颗粒与捕获位点结合的能力，所述捕获位点含有颗粒的结合剂(例如抗原或抗体)，进一步沿纸条。有色颗粒在这些位点的积累导致了依赖于样品中的竞争抗原的浓度的显色。其他量尺方法可以使用与纸或膜条共价结合的抗体，来捕获样品中的抗原。应用与酶(如辣根过氧化物酶)偶联的第二抗体的后续反应，和产生颜色、荧光或化学发光输出的与底物的孵育，将使得能够定量样品中的抗原。
如下列实例中所讨论的，在一个实施方案中，放射性免疫测定(RIA)是使用的实验室技术。在一种RIA中，在与抗体的竞争性结合中使用了放射性标记的抗原和未经标记的抗原。常见的放射性标记包括125I、131I、3H和14C。
涉及用特异性抗体和放射性标记的抗体结合蛋白沉淀GHRsp片段生物标志物的放射免疫测定可以测量沉淀物中的经标记的抗体的量，与样品中的GHRsp片段生物标志物的量成比例。备选地，生产经标记的GHRsp片段生物标志物，并使用未标记的抗体结合蛋白。然后加入待测试的生物学样品。经标记的GHRsp片段生物标志物的计数的减少与样品中的GHRsp片段生物标志物的量成比例。
在RIA中，分离游离的GHRsp片段生物标志物与结合的GHRsp片段生物标志物也是可行的。这涉及用第二抗体沉淀GHRsp片段生物标志物/抗体复合物。例如，如果GHRsp片段生物标志物/抗体复合物含有兔抗体，则可以使用驴抗兔抗体来沉淀复合物并计算标记的量。例如在LKB，Gammamaster计数器中。参见Hunt PJ,等人,Immunoreactive aminoterminal pro brain natriuretic peptide(NT-proBNP):a new marker ofcardiac impairment.Clin.Endocrinol.199747:287-296。
本发明的方法还包括测量非GHRsp片段生物标志物的一种或多种其它标志物的水平，所述标志物为肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎和ADHF的组合的标志物。可以比较其他标志物的水平与来自对照群体的平均对照水平。测量水平与平均对照水平的差异是肺炎的诊断。
已关于GHRsp片段生物标志物较高的水平或水平的增加描述了本发明的方法，所述水平提示了肺炎。还考虑了高于或低于对照水平的测量差异。
也已关于GHRsp片段生物标志物较高的水平或水平的增加描述了本发明的方法，所述水平提示了急性失代偿性心力衰竭或提示了肺炎并发急性失代偿性心力衰竭。还考虑了高于或低于对照水平的测量差异。
将GHRsp片段生物标志物的水平与其他标志物关联，可以增加GHRsp片段生物标志物的预测、诊断或监控价值。在肺炎、急性失代偿性心力衰竭或对象患有肺炎和急性失代偿性心力衰竭二者的情况下，将GHRsp片段生物标志物的水平与已知的肺炎和急性失代偿性心力衰竭的生物标志物组合可以增加对患者结果的诊断价值。
已知的肺炎和急性失代偿性心力衰竭的生物标志物的实例包含但不限于，脑钠尿蛋白质(BNP)、NT-BNP原、C-反应蛋白(CRP)、血尿素氮(BUN)、原降钙素(PCT)、胰石蛋白和肌钙蛋白。
使用单个测试样品，可以同时或分别进行对多个肽标志物的分析。同时的双位点或多位点形式的测定是优选的。多元化珠、微阵列或生物芯片系统是特别有用的。珠、测定或芯片可以具有多个精细的、通常是可寻址的位置，包含一种或多种标志物的抗体，所述标志物包括GHRsp和GHRsp片段。一种或多种标志物包括一种以上的GHRsp片段生物标志物。例如，测定GHRsp片段生物标志物的N端和C端片段，并组合测定结果是有用的。许多其他的此类标志物组合是可能的。US2005/0064511、US 6,019,944和Ng and Ilang,J.Cell Mol.Med.,6:329-340(2002)提供了对可用于本发明中的微阵列、芯片、毛细管装置和技术的描述。Luminex提供了可用于本发明中的多元化珠系统。还参见The Protein Protocols Handbook(上文)。适用于单独或顺序测定的实验室分析仪包括AxSym(Abbott,USA)、ElecSys(Roche)、Access(Beckman)、(Bayer)和Nichols(Nichols Institute)免疫测定系统。
在一个实施方案中，在单个表面例如芯片或阵列上，实施多种多肽的同时测定。
在另一种实施方案中，对一种或多种非GHRsp标志物进行单独测定，并将结果与GHRsp片段生物标志物的结果核对或组合。
在监控对象时，可以随时间采集多个生物学样品。连续采样允许随时间测量标志物水平特别是GHRsp片段生物标志物的改变。采样可以为事件发作的大致时间、事件的严重程度、提示哪种治疗方案是恰当的、对于所应用的治疗方案的应答或长期预后提供信息。可以在护理场所进行分析，例如在救护车、医生办公室、临床表现时，住院期间、出院患者中，或者在常规的健康筛查过程中。
本发明的方法还可以与一种或多种风险因子的分析联合实施，所述风险因子例如但不限于年龄、体重、身体活动的水平和事件的家族史。测试结果还可以与本发明的方法联合使用。例如，葡萄糖耐量测试、ECG结果和临床检查。GHRsp的循环水平的统计学显著的改变，以及一种或多种额外的风险因子或测试结果可用于更准确地诊断、预测或监测对象的病况。
本文的方法还可以用作治疗指南(guide)。例如开始何种治疗以及何时治疗监测、检测治疗的有利或不利影响以及如果需要或在需要时(取决于结果)对治疗方案的调节。这可以改善患者的短期、中期和长期结果。
在另一实施方案中，本发明提供GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)——由申请人发现并分离的一种新的肽。因此，如本文所述，还提供分离的和/或纯化的GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)肽(包括人GHRsp(1-10)(SEQID NO:4)及其物种变体)。还包括GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)结合剂(包括抗-GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)抗体和抗体结合片段)、用于GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)的测定(包括免疫测定)以及它们在检测生物学样品中的GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)的用途。GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)结合剂和测定可用于对与GHRsp(1-10)(SEQID NO:4)片段释放到循环中相关联的生物学事件或障碍的诊断、评估、监测等中。这些事件或障碍如本文所述包括肺炎，并且可用于在患有肺炎或疑似肺炎的对象中诊断、预后、风险分层、评估、疾病分期、监测、分类以及确定进一步诊断和治疗方案。
肺炎
申请人已经显示GHRsp片段生物标志物的水平与肺炎感染相关(图4)。因此，申请人已经提供了有用的早期和特异性的肺炎标志物。这将允许早期诊断肺炎，并允许医生区别此类病例与其他感染，以及区分于呼吸急促的其他病因。这显著地缩短了目前等待其它测试所经历的窗口期。因此可以更早实施更精确的诊断和治疗，降低发病率和死亡率，给出更好的预后结果。GHRsp测试以加快诊断允许迅速引入治疗。还可以通过重复测试来监测治疗的效果，并恰当地调整疗法。
优选通过使GHRsp片段生物标志物与例如抗体(包括本发明的抗体)的结合剂结合并测量结合的GHRsp片段生物标志物的存在情况或量，来检测样品中GHRsp片段生物标志物的存在。
如上所述，结合或选择性结合GHRsp包括其抗原性变体和片段的抗体构成本发明的另一方面，并且抗体可以通过以上讨论的技术制备。抗体可用于本发明的方法和测定中。
在又一方面，本发明提供用于诊断、评估或监测对象中的肺炎的试剂盒，包括GHRsp片段生物标志物结合剂(或用于多个GHRsp片段生物标志物的结合剂)，其包括本发明的抗体或抗原结合片段。当试剂盒用于诊断时，在一个实施方案中，例如，从对象得到生物学样品，并且可以定期地获取一个或多个额外的样品并进行分析。试剂盒可以校正为测量在至少约0.1pmol/L、至少约1pmol/L、至少约5pmol/L、至少约10pmol/L或其它水平的范围内的GHRsp水平。
可以按照已知技术，例如利用具有已知水平的GHRsp片段生物标志物的血液样品、或各自具有不同已知水平的GHRsp的一组校准，来实现测定校准。用于诊断试剂盒的试验条通常是在制备期间加以校准。参见例如US 6,780,645。试剂盒可用于测量生物学样品中的GHRsp片段生物标志物的水平。检测试剂可以是互补于GHRsp或GHRsp标志物的片段的寡核苷酸序列、或结合于由标志物编码的多肽的抗体。试剂可以结合于固体基质(如上面所讨论的)或与用于将它们结合于基质的试剂共同包装。固体基质或底物可以具有珠子、平板、管、浸渍片、条带或生物芯片的形式(所有如上面所讨论的)。
检测试剂包括洗涤试剂和能够检测结合抗体(如标记的第二抗体)的试剂、或能够与标记抗体反应的试剂。
试剂盒还可方便地包括对照试剂(阳性和/或阴性)和/或用于检测多肽或抗体的工具。试剂盒还可以包括使用说明书，例如在肺炎发作或入院的6、4或2小时内从对象获取生物学样品，测量样品中的GHRsp水平，将其与对照水平进行比较，以及将结果和肺炎感染状况相关联。通常，GHRsp标志物水平相比于对照的增加指示着肺炎。
最通常的是，试剂盒形式化为用于本领域已知的测定，在一种实施方式中为PCR、Northern杂交或Southern ELISA测定(如本领域中已知的)。
试剂盒还可包括指示肺炎的靶标或标志物的一个或多个额外的测定(或额外测定的使用说明书)。这些包括原降钙素、髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)、C-反应蛋白、免疫球蛋白和促炎细胞因子。其还可包括一种或多种GHRsp片段生物标志物组合用于肽素、皮质醇、内毒素和/或肾上腺髓质素原中的一种或多种的一种或多种测定。在一个实施方案中，GHRsp片段生物标志物是GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)。在另一实施方案中，GHRsp片段生物标志物是GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)。在另一实施方案中，GHRsp片段生物标志物是GHRsp(1-9)和GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
试剂盒将由一个或多个容器组成，还可以包括收集装置，例如，瓶、袋(例如静脉输液袋)、小瓶、注射器和试管。至少一个容器装有对诊断或监测肺炎有用的产物。产物通常是核酸分子、多肽或结合剂，特别是抗体或抗原结合片段，或包括任何上述物质的组合物。在优选的实施方案中，在容器上或与容器相关的说明书或标签提示了组合物是用于诊断或监测肺炎的。其他组分可以包括针头、稀释剂和缓冲液。有用地，试剂盒可以包括至少一个容器，所述容器包含缓冲液，例如磷酸盐缓冲溶液、林格氏溶液和葡萄糖溶液。
试剂盒中理想地包括结合或选择性结合GHRsp片段生物标志物(和任选的非GHRsp片段生物标志物)的结合剂。在一个实施方案中，结合剂是抗体，优选本发明的抗体或抗原结合片段。测定和试剂盒中使用的抗体在一个实施方案中可以是单克隆或多克隆抗体，并且可以在任何以上讨论的哺乳动物中制备。抗体可针对本发明的原生GHRsp片段生物标志物肽序列进行制备，例如，GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)和/或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)，或者是基于其或包括其的合成肽，或者可以针对单独的外源序列或融合至另一序列的外源序列产生。
在一个试剂盒实施方案中，将GHRsp片段生物标志物检测试剂固定在固体基质上，例如多孔条带或芯片，形成至少一个GHRsp片段生物标志物检测位点。多孔条带的测量或检测区可以包括多个检测位点，此类检测位点含有GHRsp片段生物标志物检测试剂。位点可以排列成条、十字或点，或其他排列方式。测试条或芯片还可以含有阴性和/或阳性对照的位点。对照位点可以备选地位于不同的条带或芯片上。不同的检测位点可以含有不同量的经固定的核酸或抗体，例如在第一检测位点中较高的量，和之后位点中较低的量。在添加测试生物学样品后，表现出可检测的信号的位点的数量提供了存在于样品中的GHRsp片段生物标志物的量的定量或半定量的指示。
试剂盒中还包括用于样品分析的装置，所述装置包含用于进行样品测试的、具有恰当组分(标志物、抗体和试剂)的一次性测试药筒。装置方便的包括测试区和测试结果窗口。免疫层析筒是此类装置的实例。参见例如US 6,399,398；US 6,235,241和US 5,504,013。
备选地，装置可以是电动装置，其允许输入、储存和评估相对于对照水平和其他标志物水平的经测量的标志物的水平。US 2006/0234315提供了此类装置的实例。还可用于本发明中的是Ciphergen的Protein其可用于使用Ciphergen的Protein的软件包处理SELDI结果。
急性失代偿性心力衰竭(ADHF)
慢性稳定型心力衰竭可能容易代谢失调，导致急性失代偿性心力衰竭(ADHF)。ADHF在已存在心脏疾病的患者中使症状恶化，典型为呼吸短促(呼吸困难)、水肿和疲劳。它是急性呼吸窘迫的常见且潜在严重的成因，并且其最敏感的临床体征是颈静脉扩张。脑钠肽(BNP)是有据可查且经使用的用于ADHF诊断的生物标志物，其中相较于对照或参考水平血液中有升高的水平是此症状的诊断。
肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)
将急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎(或二者)准确快速地检测为呼吸急促的成因对急诊科医生和全科医师是一项重要且耗费大量时间的问题。这是由于不准确或不完整的诊断加之所得的不正确治疗可能是致命的，因为不正确治疗或开始正确治疗的时间延误。
目前，没有能诊断患者是否患有肺炎和ADHF的单一生物标志物或生物标志物组。这极为重要，因为在诊断有ADHF的患者中肺炎诊断经常被漏掉，这种情形使这些患者的有效治疗被严重影响，并且可证明是致命的。如在以下的实施例中所示，申请人首次证实GHRsp片段作为可靠的且可预测的肺炎和ADHF的循环生物标志物的有效性。
参考以下非限制性实验部分将得到对本发明的进一步理解，非限制性实验部分是说明性的，并非旨在以任何方式限制本发明或权利要求。数据支持了本文描述的化合物和组合物用于诊断、评估或监测对象中的肺炎的用途。
实施例
方法
所有的人类方法都经过新西兰卫生部上南地区伦理委员会(UpperSouth Regional Ethics Committee of the Ministry of Health,New Zealand)的批准，并且根据《赫尔辛基宣言》实施。
化学品
使用温和的Fmoc固相合成方法，通过Mimotopes(Australia)合成合成的人GHR信号肽GHRsp(1-9)，(SEQ ID NO:3)。所有的缓冲液试剂都购自(UK)和/或Sigma(Mo,USA)。合成GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)，其C端具有半胱氨酸延伸用于定向的载体偶联。GHRsp(1-9)还以酪氨酰残基C段延伸，用于同一肽的示踪物制剂。
人类研究
对于该研究，血液样品最初从123名主要诉求是呼吸急促/呼吸困难的送至克赖斯特彻奇医院的急诊科的患者获得。
如果患者≥18岁，并且在克赖斯特彻奇医院ED以呼吸短促的主要诉求急诊，则他们适合该研究。如果患者不能提供知情同意或者如果有明确的创伤相关的呼吸短促(例如，挤压伤或贯通伤)，则他们被排除。对于符合入选标准且已提供知情同意的那些患者，收集以下信息：现病症(presenting complaint)、既往病史、特别着重于心血管和呼吸道发现的身体检查、常规生化和血液学以及(如果急诊医生(ED)要求的话)心脏损伤标志物、胸部x光线和超声波心动描记术(如有的话)。
然后将血液样品放入冰上的管中并于+4.0℃和2700g下离心5分钟，然后将血浆储存于-80℃直至分析。
血浆提取
如前所述，在SepPak Cartridges(Waters,USA)上提取所有的血浆样品(Hunt PJ,等人,Immunoreactive amino terminal pro brain natriureticpeptide(NT-proBNP)),干燥并在RIA和HPLC之前储藏在-20℃。
激素浓度分析
如下通过特异性RIA测量，对血浆样品测定GHRsp：
GHRsp RIA
为了测量人GHRsp片段生物标志物肽，RIA针对人前饥饿素原(1-23)信号序列(SEQ ID NO:1)的氨基酸1-9(SEQ ID NO:3)。
抗体生成
通过在室温下温和搅拌，将前GHR原(1-9)Cys10在PBS(pH 7.0)中与经苹果酰胺处理的N-e-马来酰亚胺己酸琥珀酰亚胺酯(EMCS)衍生化的BSA偶联。用弗氏佐剂(2ml)乳化经偶联的肽，按每月1次的时间间隔，在4-5个位点皮下注射(共2ml)到2只新西兰白兔中。在注射12天后，给兔子放血，评估抗体滴度，直到达到足够的水平。对于RIA，使用最终稀释为1:15,000的抗血清确定GHRsp IR。该抗血清与图3所示的肽和药物都没有可检测到的交叉反应性，包括人前BNP(1-13)、前BNP(1-76)、前ANP(1-30)、胰岛素、血管紧张素II、血管紧张素(1-7)、硬骨鱼紧张肽II、CNP、生长素释放肽、C-生长素释放肽(52-117)、前CNP(1-15)、肾上腺髓质激素、尿皮质素I、尿皮质素II、BNP-SPn(1-10)、ANP-SPc(16-25)、ANP-SP(1-10)、INS-SPn(1-9)。按Klee,GG,Interferencein hormone immunoassays Clin Lab Bed,2004,24:1-18评估交叉反应性。
碘化法和测定方法
如之前所述，通过氯胺T方法碘化GHRsp(1-9)Tyr1，并在逆相HPLC(RP-HPLC)上纯化。Brennan等人,“Preparation of bispecific antibodiesby chemical recombination of monoclonal immunoglobulin G1fragments”Science 229:81-83(1985)。从该制品中，测试在RP-HPLC之后形成的碘化示踪形式。所有的样品、标准品、放射性示踪物和抗血清溶液都在基于钾的测定缓冲液中稀释。Hunt PJ,等人,Immunoreactive amino terminalpro brain natriuretic peptide(NT-proBNP):a new marker of cardiacimpairment.Clin.Endocrinol.199747:287-296。该测定孵育物由100μL样品或标准品(0-640pmol人前GHR原(1-9))与100μL抗血清组合而组成，经过旋涡混合并在4℃下孵育24小时。然后，加入100μL示踪物(4000-5000cpm)，并在4℃下再孵育24小时。最后，通过固相第二抗体方法(驴抗绵羊Sac-IDS Ltd,英格兰)分离游离的和结合的免疫反应性，并在Gammamaster计数器(LKB,Uppsala,瑞典)中计数。
统计学分析
所有的结果都表示为平均值±SEM。使用双边ANOVA重复测量，随后为最小显著性差异post-hoc测试，分析时间-过程数据。使用一般的线性回归模型，进行血浆激素浓度的关联分析。在所有分析中，认为P值<0.05是显著的。
结果
为确定饥饿素信号肽的1-9氨基酸片段是否存在于人的循环中，使用针对前饥饿素原(1-23)的残基1-9的特异性放射免疫测定(RIA)。血浆提取物的稀释表现出与标准曲线的平行性(未示出)。在测试的初始123名患者中，23名经临床检查、胸部x光线和对肺炎链球菌(Pneumococcus)菌株的验证性痰液分析确定为患有肺炎。
未感染患者(无肺炎)中GHRsp(1-9)的中位血浆浓度确定为8.8pmol/L(n＝100)。感染患者(患有肺炎)中GHRsp(1-9)的中位血浆浓度确定为11.1pmol/L(n＝23)。这些结果的ROC曲线呈现于图4中，AUC为0.714(P<0.01)。
在测试的所有286名患者中，经临床检查、胸部x光线和对肺炎链球菌菌株的验证性痰液分析确定，有52名已经证实了肺炎感染。这包括上面提及的初始分析中的n＝23名患者(图4)。
未感染患者(无肺炎)中GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)的中位血浆浓度确定为11.1pmol/L。感染患者(患有肺炎)中GHRsp(1-9)(SEQID NO:3)的中位血浆浓度确定为17.8pmol/L(n＝52)。这些结果的ROC曲线呈现于图5中，AUC为0.654(P<0.001)。
这些数据还反映了在具有肺炎感染的患者中对于GHRsp在>18.9pmol/L下85.2％的特异性和45.3％的敏感性。
此外，在测试的所有286名患者中，经临床检查(例如，颈静脉扩张的存在)以及循环中的BNP以高于对照或参考样品中水平的水平存在而确定，有117名已经证实了急性失代偿性心力衰竭。
未感染患者(无急性失代偿性心力衰竭)中GHRsp(1-9)(SEQ IDNO:3)的中位血浆浓度再次确定为11.1pmol/L。ADHF患者中GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)的中位血浆浓度确定为16.1pmol/L(n＝117)。这些结果的ROC曲线呈现于图6中，AUC为0.601(P<0.01)。
这些数据还反映了在患有急性失代偿性心力衰竭的患者中对于GHRsp在>18.9pmol/L下82.3％的特异性和26.5％的敏感性。
最后，在测试的所有286名患者中，在肺炎感染的情况下通过常规临床检查、胸部X光线和对肺炎链球菌菌株的验证性痰液分析而确定，以及在急性失代偿性心力衰竭的情况下通过常规临床检查(例如，颈静脉扩张的存在)以及循环中的BNP以高于对照或参考样品中水平的水平存在而确定，有8名被证实为患有肺炎和急性失代偿性心力衰竭(ADHF)二者。
未感染/未受影响的患者(即，无肺炎和急性失代偿性心力衰竭)中GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)的中位血浆浓度确定为11.1pmol/L。患有肺炎并发急性失代偿性心力衰竭的那些患者中GHRsp(1-9)(SEQ IDNO:3)的中位血浆浓度确定为19.75pmol/L(n＝8)。这些结果的ROC曲线呈现于图6中，AUC为0.751(P<0.001)。
这些数据还反映了在患有肺炎并发急性失代偿性心力衰竭的患者中对于GHRsp在>18.9pmol/L下80.6％的特异性和75.0％的敏感性。
图6和图7中还显示了C-反应蛋白(CRP)(一种已知的炎症生物标志物)的ROC曲线。对于31.5mg/L的GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)，在急性失代偿性心力衰竭(ADHF)中，CRP的ROC AUC为0.409(P<0.001)，特异性为74.2％且敏感性为15.8％，并且对于31.5mg/L的GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)，在肺炎并发ADHF中，CRP的ROC AUC为0.561(P<0.001),特异性为78.4％且敏感性为37.5％，经比较这些数据证实GHRsp片段作为肺炎并发ADHF以及ADHF的生物标志物的优异临床实用性。
除非另外阐述，否则GHRsp的血浆水平在患者送至急诊科后立刻测量。
结论
此证据首次书面证明了前饥饿素原的信号肽片段存在于肺炎患者的循环中并且显著升高。通过ROC AUC测量为0.714(p<0.01)(n＝23)，申请人证实了血液中GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)的测量可用作快速的肺炎生物标志物。进一步数据支持了在肺炎患者的血液中还检测到GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)的结果。
根据ROC曲线，结果还显示在11.1pmol/L下83％的特异性/48％的敏感性，以及在13.1pmol/L下92％的特异性/35％的敏感性。这些数据证实了GHRsp片段测定作为有意义的决策工具的适合性并表现出良好水平的临床有效性。
当患者群组扩大到包括总共286名经测试的患者(其中n＝52名已经证实了肺炎感染)时，这些数据的显著性得到进一步证实。为避免疑问，证实了肺炎感染的n＝52人群包括初始测量的n＝23人群。对于>18.9pmol/L的GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)，ROC AUC测量为0.654(p<0.001)，特异性为85.2％且敏感性为45.3％，申请人进一步证实，血液中GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)的测量可用作快速的肺炎生物标志物。
申请人还呈现证据显示，前饥饿素原的信号肽片段在患有急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的患者的循环中以及在患有肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的患者中存在并且显著升高。
对于>18.9pmol/L的GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)，ROC AUC测量为0.601(P<0.01)(n＝117)，特异性为82.3％且敏感性为26.5％，申请人显示血液中的GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)测量可用作快速的急性失代偿性心力衰竭(ADHF)生物标志物。
而且，对于>18.9pmol/L的GHRsp(1-9)，ROC AUC测量为0.751(P<0.001)(n＝8)，特异性为80.6％且敏感性为75.0％，申请人显示血液中的GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)测量可用作肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)患者的快速生物标志物。
再次地，这些数据进一步证实了GHRsp片段测定作为有意义的决策工具的适合性并表现出良好水平的临床有效性。
响应于肺炎、急性失代偿性心力衰竭的以及肺炎并发急性失代偿性心力衰竭的患者中的GHRsp肽(1-9)(SEQ ID NO:3)和(1-10)(SEQ IDNO:4)的增加支持了它们作为这些适应症的生物标志物的用途。GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)和GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)的测量还具有在患有肺炎、急性失代偿性心力衰竭的患者中以及在患有肺炎并发急性失代偿性心力衰竭的患者中作为长期预后和结果的标志物的潜力。
本领域技术人员当然可以理解，上述说明是作为实例提供的，本发明不限于此。
                      ***
本发明并不受上述特定的优选实施方案所限。本领域普通技术人员可以想到的是，可以对所披露的优选实施方案进行各种修改而不偏离本发明的构思。所有这样的修改意在落入本发明的范围内。
本文引用或提及的所有专利、出版物、科学文章、网站、以及其它文献和材料指示着本发明所属领域技术人员的水平，每个这样的参考文献和材料通过引用并入本文至这样一种程度，就如同它已经通过单独引用其整体而并入或整体地记载入本文。申请人保留将来自任何这些专利、出版物、科学文章、网站、电子方式可获得的信息、以及其它参考材料或文献的任何和所有材料和信息实体地(physically)并入本说明书的权利。
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在本说明书中披露的所有特征可以以任何组合加以组合。因此，除非另有明确陈述，所披露的每个特征仅是等效或类似特征的通用系列的一个实例。
应当理解的是，虽然已连同详细描述来描述了本发明，但上述描述用来说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围是由所附权利要求的范围加以限定。因此，根据上述内容，应当理解的是，虽然为说明的目的本文已描述了本发明的具体实施方案，但可以进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。其它方面、优点、以及修改是在以下权利要求的范围内并且本发明仅受限于所附权利要求。
本文描述的具体方法和组合物代表优选实施方案并且是示例性的，而不是用于限制本发明的范围。鉴于本说明书，本领域技术人员将明了其它目的、方面、以及实施方案，并且它们包括在本发明的精神内，如由权利要求的范围所限定的。本领域技术人员显而易见的是，可以对本文披露的本发明进行多种替代和修改而不偏离本发明的范围和精神。本文说明性地描述的发明可以适当地在没有任何要素或多种要素、或限制或多种限制(其在本文中并没有明确披露为必不可少的)的条件下实施。因此，例如，在本文的每种情况下，在本发明的实施方案或实施例中，术语“包含”、“包括”、“含有”等要广泛而没有限制地加以理解。本文说明性地描述的方法和过程可以适当地以步骤的不同次序来实施，并且它们不一定限于在本文或权利要求中所指定的步骤次序。
已采用的术语和措辞是用作描述而不是限制的术语，并且并不是要使用这样的术语和措辞来排除所示和所描述的特点的任何等同替代或其一部分，而是应当明了，在如要求的本发明的范围内各种修改是可能的。因此，应当理解，虽然通过各种实施方案和/或优选实施方案以及可选的特点，已具体披露了本发明，但本领域技术人员可以采取的本文所披露构思的任何及所有修改和变化被认为是在如所附权利要求所限定的本发明的范围内。
本文已广泛和一般地描述了本发明。属于属类披露内容的每个更窄的种和亚属组也形成本发明的一部分。这包括本发明的带有附带条件或负面限制而从属中消除任何主题的属类描述，不论本文中是否明确列举缺失的材料。
还应当理解，如在本文中以及在所附权利要求中所使用的，单数形式“一”、“一种”以及“该”包括复数提及(除非上下文另有明确规定)，术语“X和/或Y”是指“X”或“Y”或者“X”和“Y”二者，以及名词后的字母“s”是指上述名词的复数和单数形式。此外，在按照马库什组来描述本发明的特征或方面的情况下，它是指，并且本领域技术人员将明了，本发明包括马库什组的任何个体成员和成员的任何亚组并且还按照马库什组的任何个体成员和成员的任何亚组加以描述，以及申请人保留修改申请或权利要求的权利以具体提到马库什组的任何个体成员或成员的任何亚组。
其它实施方案落在以下权利要求内。本专利不可以解释为限于本文具体和/或明确披露的具体实施例或实施方案或方法。在任何情况下，本专利不可以解释为限于由专利局的任何审查员或任何其它官员或雇员作出的任何陈述，除非这样的陈述是由申请人采用书面回应形式确定地表达和无限定条件或保留地表达。

Claims (32)

1.用于评估对象中的肺炎感染、或用于评估对象中的急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或用于评估对象中的肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的方法，包括实施配置为检测得自对象的体液样品中的饥饿素信号肽片段以提供测定结果的测定方法；和将测定结果与对象中肺炎感染的存在或状态相关联，或者将测定结果与对象中急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的存在或状态相关联或者将测定结果与对象中肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的存在或状态相关联。
2.根据权利要求1的方法，其中所述关联步骤包括将测定结果与对象中肺炎感染、ADHF或肺炎并发ADHF的存在或状态的风险分层、疾病分期、分类和监测中的一种或多种相关联。
3.根据权利要求1或权利要求2的方法，其中所述关联步骤包括基于测定结果对对象指定治疗方案。
4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述关联步骤包括在对象中肺炎感染、ADHF或肺炎并发ADHF的治疗方案之后评估临床结果。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述测定结果是饥饿素信号肽片段的测量浓度，并且所述关联步骤包括将所述浓度与阈值浓度进行比较。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中基于肺炎的一种或多种症状，包括咳嗽生痰、发热、胸腔积液、吸气时剧烈胸痛和呼吸急促，选择对象以评估肺炎。
7.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中基于ADHF的一种或多种症状，包括呼吸急促(呼吸困难)、水肿和疲劳，选择对象以评估ADHF。
8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述关联步骤包括基于测定结果评估对象中肺炎感染是否改善或恶化，基于测定结果评估对象中ADHF是否改善或恶化，或基于测定结果评估对象中肺炎并发ADHF是否改善或恶化。
9.根据权利要求5的方法，其中阈值是在早些的时间点从对象得到的饥饿素信号肽片段的浓度。
10.根据权利要求5的方法，其中阈值是从正常对象群体得到的饥饿素信号肽片段的浓度。
11.根据权利要求5的方法，其中阈值是从肺炎对象群体、ADHF对象群体或患有肺炎并发ADHF的群体得到的饥饿素信号肽片段的浓度。
12.根据权利要求5的方法，其中阈值是为了从对象群体分别将患有肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF的第一亚群相对于不患有肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF的第二亚群区分开而选择的饥饿素信号肽片段的浓度。
13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中所述测定方法包括饥饿素信号肽片段结合剂，所述饥饿素信号肽片段结合剂结合：
(a)GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)；或
(b)GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
14.根据权利要求13的方法，其中通过使饥饿素信号肽片段与选择性结合GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)的结合剂结合来检测样品中的饥饿素信号肽片段的水平。
15.根据权利要求13或14的方法，其中所述饥饿素信号肽片段结合剂是多克隆、单克隆、双特异性、嵌合或人源化的抗体或其抗原结合片段。
16.根据权利要求15的方法，其中饥饿素信号肽片段或结合剂用可检测标志物标记。
17.根据权利要求1-16中任一项的方法，其中体液样品是来自循环来源的样品。
18.根据权利要求1-17中任一项的方法，其中使用质谱、或使用选自RIA、ELISA、免疫荧光计量测定和免疫放射计量测定的测定来测量饥饿素信号肽片段的水平。
19.用于诊断对象中的肺炎、用于诊断对象中的急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或用于诊断对象中的肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的测定，包括：
(a)从生物学样品中结合饥饿素信号肽片段；和
(b)确定结合的饥饿素信号肽片段的存在或量；和
(c)将所述结合的饥饿素信号肽片段的存在或量与参考或对照值相关联，以诊断所述对象是否患有肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF，
其中样品中结合的饥饿素信号肽片段的存在或量与参考或对照值的偏差分别指示着肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF。
20.根据权利要求19的测定，其中饥饿素信号肽片段的量高于对照量指示着肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF。
21.权利要求19或权利要求20的测定，其中所述方法用于评估或监测对象中对于肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF治疗的响应，其中饥饿素信号肽片段的测量水平相对于对照水平的改变指示着对治疗的响应。
22.权利要求19-21中任一项的测定，其中测定包括测量来自对象的多个生物学样品中的饥饿素信号肽片段的水平。
23.根据权利要求1-18中任一项的方法，其中生物学样品是血液、血浆、血清、唾液、组织液、尿液或组织样品。
24.根据权利要求1-18或23中任一项的方法，其进一步包括测量肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF的一种或多种非GHRsp标志物的水平。
25.根据权利要求24的方法，其中非GHRsp标志物选自由原降钙素(PCT)、髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)、C-反应蛋白(CRP)、免疫球蛋白和促炎细胞因子、脑钠尿蛋白质(BNP)、N端BNP原(NT-BNP)、血尿素氮(BUN)、胰石蛋白和肌钙蛋白组成的组。
26.饥饿素信号肽片段结合剂在制备用于评估对象中的肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的预后、诊断或监测的测定中的用途。
27.用于预测、诊断或监测肺炎、急性失代偿性心力衰竭(ADHF)或肺炎并发急性失代偿性心力衰竭(ADHF)的试剂盒，包括饥饿素信号肽片段结合剂；以及任选的用于根据从对象的生物学样品中测量的饥饿素信号肽片段水平预测、诊断或监测对象中的肺炎、ADHF或肺炎并发ADHF的说明书。
28.根据权利要求27的试剂盒，其中GHRsp结合剂选择性地结合GHRsp(1-9)(SEQ ID NO:3)和/或GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
29.根据权利要求27或权利要求28的试剂盒，其中试剂盒被校正为测量在0.1-350pmol/L、1-300pmol/L或5-250pmol/L的范围内的GHRsp水平。
30.分离的GHRsp(1-10)肽，其包含氨基酸序列MPSPGTVCSL(SEQ ID NO:4)。
31.组合物，其包含根据权利要求30的分离肽和药学上可接受的载体。
32.分离的抗体或抗原结合抗体片段，所述分离的抗体或抗原结合抗体片段结合GHRsp(1-10)(SEQ ID NO:4)。
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