CN113597429A - App669-711测定方法及测定用试剂盒 - Google Patents

App669-711测定方法及测定用试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113597429A
CN113597429A CN202080017569.2A CN202080017569A CN113597429A CN 113597429 A CN113597429 A CN 113597429A CN 202080017569 A CN202080017569 A CN 202080017569A CN 113597429 A CN113597429 A CN 113597429A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
app669
sample
blocking
app
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080017569.2A
Other languages
English (en)
Inventor
金子直树
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shimadzu Corp
Original Assignee
Shimadzu Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shimadzu Corp filed Critical Shimadzu Corp
Publication of CN113597429A publication Critical patent/CN113597429A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
    • G01N2470/04—Sandwich assay format
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2470/00—Immunochemical assays or immunoassays characterised by the reaction format or reaction type
    • G01N2470/04—Sandwich assay format
    • G01N2470/06—Second binding partner specifically binding complex of analyte with first binding partner
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

一种APP669‑711测定方法，包括：固定化工序，将能与APP669‑711的N末端免疫特异性地结合的第1抗体固定化于支撑体；封闭工序，将固定化有上述第1抗体的支撑体用封闭剂封闭；第1反应工序，使上述试样中的APP669‑711与固定化的上述第1抗体接触，从而使APP669‑711与上述第1抗体结合；试样去除工序，将未发生结合的上述试样去除；第2反应工序，使能与APP669‑711的C末端免疫特异性地结合的第2抗体与固定化的上述第1抗体上所结合的APP669‑711接触，从而使上述第2抗体与APP669‑711结合；第2抗体去除工序，将未发生结合的上述第2抗体去除；以及检测工序，检测结合于APP669‑711的上述第2抗体的存在。

Description

APP669-711测定方法及测定用试剂盒
技术领域
本发明涉及APP669-711测定方法及测定用试剂盒。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease；AD)是痴呆症的主要原因，占痴呆症整体的50-60％。据推测，在2001年已达2400万人以上的全世界痴呆症患者数，将在2040年达到8100万人。一般认为，阿尔茨海默病的发病与Aβ密切相关。Aβ为单次跨膜蛋白，由770个氨基酸残基构成，是淀粉样蛋白前体蛋白(APP)接受β分泌酶和γ分泌酶的蛋白水解而产生的。当由于Aβ的伴有纤维化的凝集而出现老年斑时，以此为诱因，微管相关蛋白(tau蛋白)在神经细胞内凝集、蓄积而引起神经功能障碍、神经细胞死亡。作为其结果，认为会引发极度的认知能力下降。众所周知的是，Aβ主要由40mer(Aβ1-40)和42mer(Aβ1-42)构成，还已知其会向脑脊液(CSF)中转移。另外，还显示出也向血液中转移的可能性。另外，近年获知CSF中也存在与Aβ1-40和Aβ1-42长度不同的Aβ样肽。
关于Aβ，在最近的研究中本发明人们报道了作为Aβ关联肽(Aβ样肽)之一的APP669-711与Aβ1-42的比值有望作为血液生物标志物(非专利文献1，专利文献1：国际公开WO2015/178398)。这些Aβ及Aβ关联肽可通过在免疫沉降法(IP)之后进行质谱分析(MALDI-TOF MS)来定量。
进一步地，本发明人们在专利文献2：国际公开WO2017/047529中公开了：将选自由Aβ及Aβ关联肽(Aβ样肽)的3个比值、即Aβ1-39/Aβ1-42、Aβ1-40/Aβ1-42及APP669-711/Aβ1-42组成的组中的2种以上比值用数学方法组合而成的数值有望作为血液生物标志物。这些Aβ及Aβ关联肽可通过在免疫沉降法(IP)之后进行质谱分析(MALDI-TOF MS)来定量。
综上，本发明人们发现，使用质谱(MALDI-TOF MS)定量的、作为Aβ关联肽之一的APP669-711与Aβ1-42的比值有望作为血液生物标志物候补。然后，本发明人们报道了：日本和澳大利亚的多个被检体显示，将该比值APP669-711/Aβ1-42和Aβ1-40/Aβ1-42的比值组合而得的复合生物标志物(composite biomarker)可以高精度地推断脑内淀粉样蛋白蓄积，为具有可靠性和通用性的生物标志物(非专利文献2)。
作为包含APP669-711的Aβ关联肽等生物标志物的分析技术，质谱(MALDI-TOF MS)是有用的。另一方面，作为此外的分析技术，夹心ELISA为广泛且常规地用作临床检查法的测定方法，并且廉价，因此可成为有用的分析技术。
目前，各厂商(和光纯药、IBL等)已经在销售能够分析血浆中的Aβ1-40、Aβ1-42的ELISA试剂盒。
图1为示意性示出Aβ1-40的夹心ELISA法的图。参照图1，Aβ1-40的N末端被固相化于微孔板上的特异性识别Aβ1-40的N末端的抗体捕获，Aβ1-40的C末端结合有特异性识别Aβ1-40的C末端的检测抗体。通过对检测抗体进行检测而测定Aβ1-40。
图2为示意性示出Aβ1-42的夹心ELISA法的图。参照图2，Aβ1-42的N末端被固相化于微孔板上的特异性识别Aβ1-42的N末端的抗体捕获，Aβ1-42的C末端结合有特异性识别Aβ1-42的C末端的检测抗体。通过对检测抗体进行检测而测定Aβ1-42。
专利文献3：日本特开2005-170951号公报公开了识别淀粉样蛋白β的N端部(Aβ1-16)的单克隆抗体BAN-52a及BAN-50a、以及特异性识别淀粉样蛋白β的C端部的单克隆抗体BA-27a、BS-85及BC-05a，公开了Aβ1-40、Aβ1-42特异性夹心EIA。
专利文献4：日本特开2014-208678号公报公开了特异性识别Aβ11-x的抗体，公开了针对Aβ11-40的夹心ELISA、以及针对Aβ11-x的蛋白质印迹。
但是，用免疫学测定方法分析APP669-x的手段尚属未知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2015/178398
专利文献2：国际公开WO2017/047529
专利文献3：日本特开2005-170951号公报
专利文献4：日本特开2014-208678号公报
非专利文献
非专利文献1：Kaneko N,Nakamura A,Washimi Y,Kato T,Sakurai T,Arahata Y,Bundo M,Takeda A,Niida S,Ito K,Toba K,Tanaka K,Yanagisawa K.:Novel plasmabiomarker surrogating cerebral amyloid deposition.Proc Jpn Acad Ser B PhysBiol Sci.2014；90(9):353-364.
非专利文献2：Nakamura A,Kaneko N,Villemagne VL,Kato T,Doecke J,Dore V,Fowler C,Li QX,Martins R,Rowe C,Tomita T,Matsuzaki K,Ishii K,Ishii K,ArahataY,Iwamoto S,Ito K,Tanaka K,Masters CL,Yanagisawa K.:High performance plasmaamyloid-βbiomarkers for Alzheimer’s disease.Nature.2018；554(7691):249-254.
发明内容
发明要解决的问题
为了构建肽特异性夹心ELISA而需要分别特异性识别N末端和C末端的抗体。APP669-711的C末端与Aβ1-40(即，APP672-711)的C末端相同，特异性识别APP669-711的C末端的抗体已存在。但是，不存在特异性识别APP669-711的N末端的抗体。
由于不存在识别APP669-711的N末端的抗体，因此不存在通过特异性定量APP669-711的夹心ELISA法进行分析的手段。
因此，本发明的目的在于，提供准备识别淀粉样蛋白β(Aβ)关联肽APP669-711的N末端的抗体及识别其C末端的抗体、并且特异性定量APP669-711的测定方法[特别是夹心ELISA法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)]。另外，本发明的目的在于，提供APP669-711测定用试剂盒[特别是夹心ELISA试剂盒]。
用于解决问题的方案
本发明人进行深入研究的结果是，为了制作识别APP669-711的N末端的抗体而对小鼠免疫了结合有KLH(keyhole limpet hemocyanin，匙孔血蓝蛋白)的合成肽VKMC，通过细胞融合和筛选取得了产生识别APP669-711的N末端的抗体的杂交瘤。使用该抗体构建了特异性定量APP669-711的夹心ELISA。由此，构成了APP669-711的ELISA试剂盒。
本发明首先基于作为新抗体的、特异性识别APP669-711肽的N末端的APP669-711N末端识别单克隆抗体。
本发明的第1方式涉及一种APP669-711测定方法，其测定试样中的APP669-711，所述测定方法包括：
固定化工序，将能与APP669-711的N末端免疫特异性地结合的第1抗体固定化于支撑体；
封闭工序，将固定化有上述第1抗体的支撑体用封闭剂封闭；
第1反应工序，使上述试样中的APP669-711与固定化的上述第1抗体接触，从而使APP669-711与上述第1抗体结合；
试样去除工序，将未发生结合的上述试样去除；
第2反应工序，使能与APP669-711的C末端免疫特异性地结合的第2抗体与固定化的上述第1抗体上所结合的APP669-711接触，从而使上述第2抗体与APP669-711结合；
第2抗体去除工序，将未发生结合的上述第2抗体去除；以及
检测工序，检测结合于APP669-711的上述第2抗体的存在。
本发明的第2方式涉及一种APP669-711的测定用试剂盒，其包含：
特异性识别APP669-711的N末端的APP669-711 N末端识别单克隆抗体(第1抗体)、
能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体(第2抗体)、及封闭剂。
发明的效果
根据本发明，使用特异性识别APP669-711的N末端的抗体，提供APP669-711夹心免疫测定法、特别是夹心ELISA法。
根据本发明，还提供APP669-711测定用试剂盒、特别是用于实施夹心ELISA法的成套试剂。作为包括APP669-711在内的Aβ关联肽等生物标志物的分析技术，质谱(MALDI-TOFMS)是有用的，但是夹心ELISA为广泛且常规地用作临床检查法的测定方法，并且廉价，因此可以说是更有用的分析技术。
附图说明
图1为示意性示出Aβ1-40的夹心ELISA法的图。
图2为示意性示出Aβ1-42的夹心ELISA法的图。
图3为示意性示出APP669-711的夹心ELISA法的图。
图4为示出实验例1-2中使用APP669-711 N末端特异性抗体克隆34-6E的直接ELISA的结果的图。横轴表示肽浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测得的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图5为示出实验例1-2中使用APP669-711 N末端特异性抗体克隆24-6G的直接ELISA的结果的图。横轴表示肽浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测得的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图6为示出实验例1-2中使用APP669-711 N末端特异性抗体克隆20-1A的直接ELISA的结果的图。横轴表示肽浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测得的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图7为示出实施例1中在APP669-711 N末端识别抗体的固相化工序中改变捕获抗体溶液浓度时的APP669-711 ELISA的反应性的图。横轴为APP669-711标准液的浓度(fmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测得的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
图8为示出实施例2中在APP669-711 N末端识别抗体的固相化工序中将捕获抗体溶液的pH设为9.6或7.4时的APP669-711 ELISA的反应性的图，横轴为APP669-711标准液的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。
图9示出实施例3中关于APP669-711的结果，为示出将样品稀释液中的抗Aβ抗体克隆4G8的浓度设为0、10、30、100、300、1000或3000ng/mL时的APP669-711 ELISA的反应性的图，横轴为样品稀释液中的抗Aβ抗体克隆4G8的浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。
图10为实施例3中关于Aβ1-40的结果，为示出将样品稀释液中的抗Aβ抗体克隆4G8的浓度设为0、3000ng/mL时的Aβ1-40 ELISA的反应性的图，横轴为样品稀释液中的抗Aβ抗体克隆4G8的浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。
具体实施方式
[1.APP669-711 N末端识别单克隆抗体]
本发明中使用的APP669-711 N末端识别单克隆抗体(第1抗体)特异性识别APP669-711肽的N末端。
为了制作识别APP669-711的N末端的抗体而对小鼠免疫结合有KLH的合成肽VKMC(序列号5)，通过细胞融合和筛选而取得产生识别APP669-711的N末端的抗体的杂交瘤。更详细的抗体制作将在实施例中说明。
该抗体为识别APP669-711的N末端的抗体，因此可以特异性识别包括APP669-711(序列号3)的属于APP669-x的各种肽的N末端。可以使用该APP669-711 N末端识别单克隆抗体，使试样中的APP669-711与上述APP669-711 N末端识别单克隆抗体进行免疫反应。
淀粉样蛋白前体蛋白(APP)为单次跨膜蛋白，由770个氨基酸残基构成。淀粉样蛋白前体蛋白(APP)由于β分泌酶和γ分泌酶而接受蛋白质分解，通过蛋白质分解而产生淀粉样蛋白·β肽(Aβ)。APP672-711和Aβ1-40表示同一肽(序列号1)。APP672-713与Aβ1-42表示同一肽(序列号2)。APP669-711(序列号3)属于APP669-x，在此，x的下限大于669，例如大于677，另外，上限没有特别限定，为770或更小。但是，从本发明的主旨、即APP669-x N末端识别单克隆抗体可以特异性识别APP669-x肽的N末端、可以进行免疫反应来看，x的上限值没有特别限定。若进行例示，作为APP669-x肽，可列举APP669-711(序列号3)、APP669-709、APP669-710、APP669-713等。
APP672-711(Aβ1-40)(序列号1)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
APP672-713(Aβ1-42)(序列号2)：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
APP669-711(序列号3)：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
KLH结合合成肽(序列号5)：
VKMC
[2.免疫测定法]
本发明的第1方式涉及一种APP669-711测定方法，其测定试样中的APP669-711，所述测定方法包括：
固定化工序，将能与APP669-711的N末端免疫特异性地结合的第1抗体固定化于支撑体；
封闭工序，将固定化有上述第1抗体的支撑体用封闭剂封闭；
第1反应工序，使上述试样中的APP669-711与固定化的上述第1抗体接触，从而使APP669-711与上述第1抗体结合；
试样去除工序，将未发生结合的上述试样去除；
第2反应工序，使能与APP669-711的C末端免疫特异性地结合的第2抗体与固定化的上述第1抗体上所结合的APP669-711接触，从而使上述第2抗体与APP669-711结合；
第2抗体去除工序，将未发生结合的上述第2抗体去除；以及
检测工序，检测结合于APP669-711的上述第2抗体的存在。
本发明方式的夹心型免疫测定法中，可以使用上述APP669-711 N末端识别单克隆抗体(第1抗体)及能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体(第2抗体)。
图3为示意性示出APP669-711的夹心ELISA法的图。参照图3，APP669-711的N末端被固相化于微孔板上的特异性识别APP669-711的N末端的抗体(第1抗体)捕获，APP669-711的C末端结合有特异性识别APP669-711的C末端的检测抗体(第2抗体)。通过对检测抗体进行检测而测定APP669-711。
APP669-711的C末端与Aβ1-40的C末端相同，能够识别此种C末端的抗体(第2抗体)有市售。
作为上述夹心型免疫测定法，可列举酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、化学发光免疫测定法(CIA)、荧光免疫测定法(FIA)、电化学发光免疫测定法(ECLIA)、生物发光免疫测定法(BLIA)、免疫PCR、免疫比浊法(TAI)及胶乳凝集比浊法(LA)等。
上述夹心型免疫测定法中进行固定化工序，所述固定化工序将能与APP669-711的N末端免疫特异性地结合的第1抗体固定化(固相化)于支撑体。
上述固定化工序中，按照常规方法使包含上述第1抗体的第1抗体溶液与支撑体表面接触而将第1抗体固相化于支撑体即可。
上述第1抗体溶液中的上述第1抗体的浓度没有特别限定，例如可以设为2.5～25μg/mL或5～20μg/mL。另外，上述第1抗体溶液的pH例如可以设为7～10附近的中性或弱碱性。例如，可以使用碳酸钠缓冲液(pH9.6)或磷酸盐缓冲液(pH7.4)。
可以将固定化中使用的第1抗体溶液从支撑体去除并适宜地进行洗涤。用于固定化的温度、时间等按照常规方法即可。
在上述固定化工序之后进行封闭工序，所述封闭工序将固定化有上述第1抗体的支撑体用封闭剂封闭。为了减少目标肽与支撑体表面的非特异性结合而进行封闭。
上述封闭工序中，可以使包含上述封闭剂的封闭溶液与固定化有上述第1抗体的支撑体表面接触、从而使上述封闭剂吸附于支撑体表面。
上述封闭工序中，可以使用通常所用的封闭剂。作为上述封闭剂，可列举例如牛血清蛋白、乳蛋白等。这些之中，在APP669-711的夹心型免疫测定法中优选乳蛋白。
上述封闭溶液中的上述乳蛋白的浓度没有特别限定，例如，可以设为2mg/mL以上或2.5～10mg/mL。也可以设为超过10mg/mL的浓度，例如15mg/mL或20mg/mL左右的浓度。
可以将封闭中使用的封闭溶液从支撑体去除并适宜地进行洗涤。用于封闭的温度、时间等按照常规方法即可。
上述夹心型免疫测定法中，在上述第1反应工序之前可以进行向上述试样中添加乳蛋白的乳蛋白添加工序。通过向试样中添加乳蛋白，能够减少目标肽与支撑体表面的非特异性结合，可以对封闭工序起到辅助作用。
上述乳蛋白添加工序中，可以将上述试样用含有2mg/mL以上或2～4mg/mL浓度的上述乳蛋白的稀释液稀释。也可以设为超过4mg/mL的浓度，例如10mg/mL或20mg/mL左右的浓度。关于稀释率，如果是用于制作标准曲线的标准物质的稀释，可以使用将吸光度等测定数据与标准物质浓度的关系用直线或曲线来表示的稀释率，在生物试样的情况下，可以使用使吸光度等测定数据落在标准曲线的范围内的稀释率。
进一步地，上述夹心型免疫测定法中，在上述第1反应工序之前可以还进行抗原亲和性物质添加工序，所述抗原亲和性物质添加工序向上述试样中添加能够结合于APP669-711的抗原亲和性物质。
这种情况下，就上述向试样中添加乳蛋白的工序与上述向试样中添加上述抗原亲和性物质的工序的顺序而言，先进行任一工序均可，也可以同时进行。
通过向试样中添加能够结合于目标多肽APP669-711的抗原亲和性物质，从而改变目标多肽的构象，使夹心免疫测定法中所使用的2种抗体各自所要结合的2个表位在空间距离上彼此远离。因此，2个部位的抗原抗体反应顺利地进行，可以以更高的灵敏度检测及定量目标多肽。
上述抗原亲和性物质只要是与目标多肽APP669-711具有亲和性、能够与其结合的物质即可，可列举抗体、肽、低分子化合物及核酸适配体等。这里的结合包括静电相互作用、范德华力、氢键、疏水性相互作用、偶极相互作用、分散力等利用分子间相互作用而实现的结合。为改变目标多肽APP669-711的构象、使夹心免疫测定法中使用的2种抗体各自所要结合的2个表位在空间距离上彼此远离的物质即可。
就作为上述抗原亲和性物质的抗体而言，可以使用具有不同于上述第1抗体及上述第2抗体所具有的抗原结合部位的抗原结合部位的抗体。
就作为上述抗原亲和性物质的肽而言，可以使用由2～12个氨基酸残基构成的肽，例如作为结合于Aβ的肽，可例示iAβ5(5个氨基酸)、D3(12个氨基酸)、NH2-D-Trp-Aib-OH(2个氨基酸)等。
就作为上述抗原亲和性物质的低分子化合物而言，可以使用能够结合于目标多肽的低分子化合物，可列举例如药物开发中使用的与某种蛋白质结合的低分子化合物。作为与Aβ结合的低分子化合物，可例示Scyllo-inositol等。还可列举各种抑制剂(例如各种StemoleculeTM低分子化合物)。
就作为上述抗原亲和性物质的核酸适配体而言，可列举DNA适配体、RNA适配体等。
上述抗原亲和性物质的添加量也取决于试样中的目标多肽APP669-711的量及抗原亲和性物质的种类，没有特别限定，只要为结合于目标多肽且改变该目标多肽的构象的量即可。例如，上述抗原亲和性物质的添加量可以以在包含目标多肽APP669-711的试样中的浓度计设为0.1ng/mL～100000ng/mL左右，优选设为0.1ng/mL～10000ng/mL左右，更优选设为0.1ng/mL～3000ng/mL左右。
这种情况下，优选上述抗原亲和性物质不作用于目标多肽APP669-711的N末端附近且不作用于上述目标多肽的C末端附近。不优选上述抗原亲和性物质与上述第1抗体发生对目标多肽的竞争、抑制，也不优选上述抗原亲和性物质与上述第2抗体发生对目标多肽的竞争、抑制。
更具体而言，优选上述抗原亲和性物质作用于上述目标多肽APP669-711的N末端起4个残基的部位至C末端起4个残基的部位为止的中间部位。进一步地，优选上述抗原亲和性物质作用于上述目标多肽APP669-711的N末端起6个残基的部位至C末端起6个残基的部位为止的中间部位。
在使用酶作为标记物的夹心ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，酶联免疫分析)的情况下，可以使用作为上述第1抗体的目标多肽的N末端识别抗体来作为固相化抗体(捕获抗体)、使用作为上述第2抗体的目标多肽的C末端识别抗体来作为检测抗体(标记抗体)。
本发明的夹心型免疫测定法除了可以用于使用酶作为标记物的夹心ELISA以外，还可以用于使用放射性同位素的放射免疫测定法(RIA)、使用化学发光物质的化学发光免疫测定法(CIA)、使用荧光发光物质的荧光免疫测定法(FIA)、使用金属络合物的电化学发光免疫测定法(ECLIA)、使用荧光素酶等生物发光物质的生物发光免疫测定法(BLIA)、用PCR扩增、检测标记在抗体上的核酸的免疫PCR、检测由于形成免疫复合体而产生的浊度的免疫比浊法(TAI)、检测由于形成免疫复合体而凝集的胶乳的胶乳凝集比浊法(LA)、在纤维素膜上进行反应的免疫层析法等。
就本发明的夹心型免疫测定法的基本操作而言，在向试样中添加抗原亲和性物质时也可以按照公知的操作来进行。
本发明中，目标APP669-711肽包含在生物体试样中。生物体试样包括：血液、脑脊液(CSF)、尿、体分泌液、唾液及痰等体液；以及粪便。血液试样包括全血、血浆及血清等。血液试样可通过对由个体采集的全血进行适当处理而制备。作为由采集的全血制备血液试样时所进行的处理，没有特别限定，可进行临床学上允许的任何处理。例如，可进行离心分离等。另外，在血液试样制备工序的中间阶段或制备工序的后阶段，可以适当地在冷冻等低温下保存血液试样。需要说明的是，本发明中，生物体试样不返送回来源个体而是废弃。就以血液试样为对象试样而言，试样采集的侵入性比固体和脑脊液低、另外为一般医学检查和体检等中用于筛查各种疾病的对象试样，因此是优选的。
[3.免疫测定用试剂盒]
本发明的第2方式涉及一种APP669-711测定用试剂盒，其包含：
特异性识别APP669-711的N末端的APP669-711 N末端识别单克隆抗体(第1抗体)、
能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体(第2抗体)、及封闭剂。
测定用试剂盒可以还包含能够结合于APP669-711的抗原亲和性物质。另外，上述封闭剂优选为乳蛋白。
另外，试剂盒中可以包含夹心型免疫测定法操作中使用的各种成分，例如用于制备试样溶液的稀释液、洗涤溶液等。
实施例
以下示出实施例来具体说明本发明，但是本发明不受这些实施例限制。关于以下用％表示的物质含量，在没有特别声明时，该物质为固体的情况下以重量基准来表示，该物质为液体的情况下以体积基准来表示。
[实验例1：APP669-711 N末端识别抗体的制作]
[实验例1-1：单克隆抗体的制作]
使用二价反应性试剂将合成肽VKMC(序列号4)的C末端的Cys结合至载体蛋白(KLH)。
使用注射器筒将该结合有KLH的合成肽与FCA(弗氏完全佐剂)混和、乳化，对于1只BALB/c小鼠，将200μg注射(免疫)至尾根部肌肉内。进一步将抗原与FICA(弗氏不完全佐剂)混和、乳化，以两周的间隔2次对1只小鼠皮下注射(追加免疫)50μg。然后对1只小鼠，将100μg末次免疫至腹腔。
末次免疫起3天后采集脾脏，分离淋巴细胞后，在-80℃冷冻保存。另外，从小鼠中采集全血，从血液分离血清后，在-40℃下冷冻保存。
将得到的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤在50％聚乙二醇存在下实施细胞融合。将融合细胞分注到8块96孔微孔板进行培养。在细胞融合起8天后，从96孔微孔板的各孔对培养上清进行取样，通过ELISA依次进行一次、二次筛选，用有限稀释法克隆阳性孔的细胞。然后通过ELISA依次进行一次、二次筛选，将阳性克隆的杂交瘤冷冻保存。
所取得的杂交瘤(克隆20-1A、24-6G、34-6E)进行高密度无血清培养。使用蛋白A从其培养上清中纯化抗体。
[实验例1-2：利用直接ELISA确认单克隆抗体的特异性]
通过直接ELISA 评价APP669-711 N末端识别抗体克隆20-1A、24-6G、34-6E的特异性。直接ELISA如下进行。
将合成肽APP669-711(PEPTIDE INSTITUTE,INC)、Aβ1-40(PEPTIDE INSTITUTE,INC)或APP668-677(序列号4)(Toray Research Center,Inc.)用碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释成50或500pmol/mL的各浓度。合成肽的序列如表1所示。将各合成肽溶液向96孔微孔板的各孔中各加入50μL，在4℃下孵育2小时而进行固相化。另外，也准备了空白孔。除去平板中的溶液，将4倍稀释Block Ace(DS Pharma)各加入100μL，在4℃孵育2小时而进行封闭。除去平板中的溶液，用PBST(0.05％的PBS中的Tween20)300μL洗涤。将用10倍稀释Block Ace稀释成0.5μg/mL的浓度的APP669-x N末端识别抗体各加入50μL，在4℃下孵育1小时。除去平板中的样品溶液，用PBST 300μL洗涤。将用10倍稀释Block Ace稀释4000倍的HRP标记-抗小鼠IgG抗体(ZYMED)溶液各加入50μL，在4℃下孵育1小时。除去平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤。加入ELISA POD底物TMB试剂盒(Nacalai Tesque)100μL，在暗处孵育30分钟而显色。加入2N硫酸100μL使显色反应停止。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
将这些结果示于图4～6。即，图4为示出使用APP669-711 N末端特异性抗体克隆34-6E的直接ELISA的结果的图。图5为示出使用APP669-711 N末端特异性抗体克隆24-6G的直接ELISA的结果的图。图6为示出使用APP669-711 N末端特异性抗体克隆20-1A的直接ELISA的结果的图。图4～6中，横轴表示肽浓度(pmol/mL)，纵轴表示用酶标仪测定的主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
由图4～6确认：APP669-711 N末端识别抗体的所有克隆即20-1A、24-6G、34-6E均与APP669-711反应。另一方面，对Aβ1-40、APP668-677则完全未确认到反应性。APP669-711与Aβ1-40相比仅N末端侧多3个氨基酸，此外的氨基酸序列与Aβ1-40相同，对Aβ1-40不显示反应这一点表明克隆20-1A、24-6G、34-6E识别APP669-711的N末端侧3个氨基酸。另外，APP668-677与APP669-711相比仅N末端侧多1个氨基酸，但是其不与克隆20-1A、24-6G、34-6E反应。该结果表明：克隆20-1A、24-6G、34-6E特异性识别APP669-711的N末端。
由以上的结果可确认：APP669-711 N末端识别抗体的3种克隆特异性识别APP669-711的N末端。
[表1]
Figure BDA0003235780200000141
[实施例1：捕获抗体的浓度研究]
为了确定捕获抗体(第1抗体)的合适浓度，对改变捕获抗体溶液的浓度而固相化(固定化)于支撑体表面时的ELISA反应性进行了评价。
将作为捕获抗体的APP669-711 N末端识别抗体(克隆34-6E)用碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释为2.5、5、10或20μg/mL的各浓度，向96孔板的各孔中分别加入抗体溶液50μL，在4℃下孵育6小时，由此将捕获抗体固相化。去除平板中的抗体溶液，分别加入20％Blocking One(Nacalai Tesque)100μL，在4℃下孵育2小时而进行封闭。将APP669-711标准液用反应液(包含200ng/mL抗Aβ抗体克隆4G8的、5％的PBST中的Blocking One)稀释，制备各种浓度的APP669-711标准液。去除平板中的20％Blocking One，用PBST 300μL洗涤3次。向平板中分别加入APP669-711标准液50μL，在4℃下孵育过夜。去除平板中的APP669-711标准液，用PBST 300μL洗涤3次。
分别加入HumanβAmyloid(1-40)ELISA Kit(和光纯药)中包含的识别C末端的HRP标记抗体(克隆BA27)溶液50μL，在4℃下孵育2小时。去除平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤5次。加入ELISA POD基质TMB试剂盒(Nacalai)100μL，在暗处孵育15分钟而使其显色。加入2N硫酸100μL终止显色反应。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
将这些结果示于图7。图7为示出在APP669-711 N末端识别抗体的固相化工序中改变捕获抗体溶液的浓度时的、APP669-711 ELISA的反应性的图，横轴为APP669-711标准液的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。
使N末端识别抗体(克隆34-6E)的浓度从2.5μg/mL升至5μg/mL时，APP669-711浓度80fmol/mL下的吸光度升高43％(图7)。而且，从5μg/mL升至10μg/mL时仅升高9％。根据该结果，N末端识别抗体的浓度优选为5μg/mL以上。
[实施例2：捕获抗体的固相化中的pH的研究]
对设捕获抗体溶液的pH为9.6或7.4并将捕获抗体(第1抗体)固相化(固定化)于支撑体表面时的ELISA反应性进行评价。
将作为捕获抗体的APP669-711 N末端识别抗体(克隆34-6E)用碳酸钠缓冲液(pH9.6)或磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释成20μg/mL的浓度，向96孔板的各孔中分别加入抗体溶液50μL，在4℃下孵育6小时，由此将捕获抗体固相化。去除平板中的抗体溶液，分别加入20％Blocking One(Nacalai Tesque)100μL，在4℃下孵育2小时而进行封闭。将APP669-711标准液或Aβ1-40标准液用样品稀释液(包含200ng/mL抗Aβ抗体克隆4G8的、5％的PBST中的Blocking One)稀释，由此制备各种浓度的APP669-711标准液。去除平板中的20％BlockingOne，用PBST 300μL洗涤3次。将APP669-711标准液向平板中分别加入50μL，在4℃下孵育过夜。去除平板中的APP669-711标准液，用PBST 300μL洗涤3次。
分别加入识别C末端的HRP标记抗体(克隆BA27)溶液50μL，在4℃下孵育2小时。去除平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤5次。加入ELISA POD基质TMB试剂盒(Nacalai)100μL，在暗处孵育15分钟而使其显色。加入2N硫酸100μL终止显色反应。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
将这些结果示于图8。图8为示出在APP669-711 N末端识别抗体的固相化工序中设捕获抗体溶液的pH为9.6或7.4时的、APP669-711 ELISA的反应性的图，横轴为APP669-711标准液的浓度(fmol/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。
将N末端识别抗体固相化时的抗体溶液的pH不论为9.6还是为7.4，均未确认到对吸光度的影响。即，确认抗体溶液为中性或弱碱性都能够进行N末端识别抗体的固相化(图8)。
[实施例3：向样品稀释液添加抗Aβ抗体的效果]
对向稀释液中添加作为抗原亲和性物质的抗Aβ抗体时的ELISA反应性进行了评价，所述稀释液是用于稀释包含抗原APP669-711的样品的液体。
将作为捕获抗体的APP669-711 N末端识别抗体(克隆34-6E)用碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释成20μg/mL的浓度，向96孔板的各孔中分别加入抗体溶液50μL，在4℃下孵育6小时，由此将捕获抗体固相化。去除平板中的抗体溶液，分别加入20％Blocking One(Nacalai Tesque)100μL，在4℃下孵育2小时而进行封闭。将APP669-711标准液或Aβ1-40标准液用样品稀释液(包含各种浓度的抗Aβ抗体克隆4G8的、5％的PBST中的Blocking One)稀释，由此制备各种抗Aβ抗体浓度的APP669-711标准液(APP669-711浓度10fmol/mL)或Aβ1-40标准液(Aβ1-40浓度10fmol/mL)。去除平板中的20％Blocking One，用PBST 300μL洗涤3次。对平板分别加入APP669-711标准液或Aβ1-40标准液50μL，在4℃下孵育过夜。去除平板中的APP669-711标准液或Aβ1-40标准液，用PBST 300μL洗涤3次。
分别加入识别C末端的HRP标记抗体(克隆BA27)溶液50μL，在4℃下孵育8小时。去除平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤5次。加入ELISA POD基质TMB试剂盒(Nacalai)100μL，在暗处孵育15分钟而使其显色。加入2N硫酸100μL终止显色反应。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
将这些结果示于图9及图10。图9为关于APP669-711的结果，为示出将样品稀释液中的抗Aβ抗体克隆4G8的浓度设为0、10、30、100、300、1000或3000ng/mL时的APP669-711ELISA的反应性的图，横轴为样品稀释液中的抗Aβ抗体克隆4G8的浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。图10为关于Aβ1-40的结果，为示出将样品稀释液中的抗Aβ抗体克隆4G8的浓度设为0、3000ng/mL时的Aβ1-40ELISA的反应性的图，横轴为样品稀释液中的抗Aβ抗体克隆4G8的浓度(ng/mL)，纵轴表示450nm/650nm的吸光度(Absorbance)。
与未向样品稀释液中加入抗Aβ抗体4G8的情况(即0ng/mL)相比，加入了抗Aβ抗体4G8时吸光度上升(图9)。调查了向样品稀释液中加入抗Aβ抗体4G8时与Aβ1-40的交叉性，没有看到交叉反应，因此确认为APP669-711特异性(图10)。由以上的结果可知，向样品稀释液添加抗Aβ抗体4G8的方式对于提高APP669-711的ELISA反应性有用。
[实施例4：封闭剂的研究]
通过添加回收试验调查了使用作为封闭剂的2种试剂时血浆样品中的干扰物质对测定结果的影响，所述2种试剂为包含牛血清蛋白的Blocking One(Nacalai Tesque)或包含乳蛋白的Block Ace(雪印)。
将作为捕获抗体的APP669-711 N末端识别抗体(克隆34-6E)用碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释成20μg/mL的浓度，向96孔板的各孔中分别加入抗体溶液50μL，在4℃下孵育6小时，由此将捕获抗体固相化。去除平板中的抗体溶液，分别加入20％Blocking One或10mg/mL Block Ace100μL，在4℃下孵育2小时而进行封闭。将APP669-711标准液用2种样品稀释液(包含120ng/mL抗Aβ抗体克隆4G8的、5％的PBST中的Blocking One或4mg/mL的PBST中的Block Ace)分别稀释，由此制备标准曲线用APP669-711标准液。另外，制备了将人血浆用2种样品稀释液分别稀释4倍的样品、及向该血浆样品中添加各种浓度的APP669-711而成的样品。去除平板中的封闭剂，用PBST 300μL洗涤3次。将APP669-711标准液及人血浆样品向平板中分别加入50μL，在4℃下孵育过夜。去除平板中的APP669-711标准液及人血浆样品，用PBST 300μL洗涤3次。
分别加入识别C末端的HRP标记抗体(克隆BA27)溶液50μL，在4℃下孵育2小时。去除平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤5次。加入ELISA POD基质TMB试剂盒(Nacalai)100μL，在暗处孵育15分钟而使其显色。加入2N硫酸100μL终止显色反应。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
由向血浆中以已知浓度添加APP669-711时的、相对于理论值的实测值，求出添加回收率(表2)。其结果是，Blocking One的情况下回收率平均为67％，而Block Ace的情况下回收率为90％。由该结果可知，与包含牛血清蛋白的Blocking One相比，包含乳蛋白的Block Ace能够抑制血浆中的干扰物质对定量值的影响。
[表2]
Figure BDA0003235780200000191
[实施例5：封闭工序的封闭剂浓度的研究]
为了评价封闭工序中的、封闭溶液中的Block Ace(雪印)的合适浓度，改变封闭溶液的浓度而进行添加回收试验。
将作为捕获抗体的APP669-711 N末端识别抗体(克隆34-6E)用碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释成20μg/mL的浓度，向96孔板的各孔中分别加入抗体溶液50μL，在4℃下孵育6小时，由此将捕获抗体固相化。去除平板中的抗体溶液，分别加入2.5、5或10mg/mL的BlockAce 100μL，在4℃下孵育2小时而进行封闭。将APP669-711标准液用样品稀释液(包含120ng/mL的抗Aβ抗体克隆4G8的、4mg/mL的PBST中的Block Ace)稀释，由此制备标准曲线用APP669-711标准液。另外，制备了将人血浆用样品稀释液稀释4倍的样品、及向该血浆样品中添加各种浓度的APP669-711而成的样品。去除平板中的封闭剂，用PBST 300μL洗涤3次。将APP669-711标准液及人血浆样品向平板中分别加入50μL，在4℃下孵育过夜。去除平板中的APP669-711标准液及人血浆样品，用PBST 300μL洗涤3次。
分别加入识别C末端的HRP标记抗体(克隆BA27)溶液50μL，在4℃下孵育2小时。去除平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤5次。加入ELISA POD基质TMB试剂盒(Nacalai)100μL，在暗处孵育15分钟而使其显色。加入2N硫酸100μL终止显色反应。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
由向血浆中以已知浓度添加APP669-711时的、相对于理论值的实测值求出添加回收率(表3)。其结果是，在任一封闭溶液中的Block Ace浓度下回收率平均均为90％以上，确认能够没有问题地进行定量。
[表3]
Figure BDA0003235780200000211
[实施例6：样品稀释液的封闭剂浓度的研究]
为了评价样品稀释液中的Block Ace(雪印)的合适浓度，改变样品稀释液中的Block Ace浓度而进行添加回收试验。
将作为捕获抗体的APP669-711 N末端识别抗体(克隆34-6E)用碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释成20μg/mL的浓度，向96孔板的各孔中分别加入抗体溶液50μL，在4℃下孵育6小时，由此将捕获抗体固相化。
去除平板中的抗体溶液，分别加入10mg/mL的Block Ace 100μL，在4℃下孵育2小时而进行封闭。将APP669-711标准液用样品稀释液(包含120ng/mL的抗Aβ抗体克隆4G8的、1、2或4mg/mL的PBST中的Block Ace)稀释，由此制备标准曲线用APP669-711标准液。另外，制备了将人血浆用样品稀释液稀释4倍的样品及向该血浆样品中添加各种浓度的APP669-711而成的样品。去除平板中的封闭剂，用PBST 300μL洗涤3次。将APP669-711标准液及人血浆样品向平板中分别加入50μL，在4℃下孵育过夜。去除平板中的APP669-711标准液及人血浆样品，用PBST 300μL洗涤3次。
分别加入识别C末端的HRP标记抗体(克隆BA27)溶液50μL，在4℃下孵育2小时。去除平板中的溶液，用PBST 300μL洗涤5次。加入ELISA POD基质TMB试剂盒(Nacalai)100μL，在暗处孵育15分钟而使其显色。加入2N硫酸100μL终止显色反应。用酶标仪测定主波长450nm/副波长650nm的吸光度(Absorbance)。
由向血浆中以已知浓度添加APP669-711时的、相对于理论值的实测值求出添加回收率(表4)。其结果是，有越降低样品稀释液中的Block Ace浓度、回收率平均值也降低的倾向。
[表4]
Figure BDA0003235780200000231
(1)
一种APP669-711测定方法，其测定试样中的APP669-711，所述测定方法包括：
固定化工序，将能与APP669-711的N末端免疫特异性地结合的第1抗体固定化于支撑体；
封闭工序，将固定化有上述第1抗体的支撑体用封闭剂封闭；
第1反应工序，使上述试样中的APP669-711与固定化的上述第1抗体接触，从而使APP669-711与上述第1抗体结合；
试样去除工序，将未发生结合的上述试样去除；
第2反应工序，使能与APP669-711的C末端免疫特异性地结合的第2抗体与固定化的上述第1抗体上所结合的APP669-711接触，从而使上述第2抗体与APP669-711结合；
第2抗体去除工序，将未发生结合的上述第2抗体去除；以及
检测工序，检测结合于APP669-711的上述第2抗体的存在。
(2)
根据上述(1)所述的方法，其中，上述封闭工序中，上述封闭剂为乳蛋白。
(3)
根据上述(1)或(2)所述的方法，其中，上述封闭工序中，使包含上述封闭剂的封闭溶液与固定化有上述第1抗体的支撑体接触。
(4)
根据上述(3)所述的方法，其中，上述封闭工序中，上述封闭剂为乳蛋白，上述封闭溶液中的上述乳蛋白的浓度为2.5～10mg/mL。
(5)
根据上述(1)～(4)中任一项所述的方法，其中，在上述第1反应工序之前还包括乳蛋白添加工序，所述乳蛋白添加工序向上述试样中添加乳蛋白。
(6)
根据上述(5)所述的方法，其中，上述乳蛋白添加工序中，将上述试样用以2～4mg/mL的浓度包含上述乳蛋白的稀释液稀释。
(7)
根据上述(1)～(6)中任一项所述的方法，其中，上述固定化工序中，使包含上述第1抗体的第1抗体溶液与支撑体接触。
(8)
根据上述(7)所述的方法，其中，上述第1抗体溶液中的上述第1抗体的浓度为5～20μg/mL。
(9)
根据上述(7)或(8)所述的方法，其中，上述第1抗体溶液的pH为中性或弱碱性。
(10)
根据上述(1)～(9)中任一项所述的方法，其中，在上述第1反应工序之前还包括抗原亲和性物质添加工序，所述抗原亲和性物质添加工序向上述试样中添加能够结合于APP669-711的抗原亲和性物质。
(11)
根据上述(1)～(10)中任一项所述的方法，其中，上述试样为选自由血液、脑脊液、尿、粪便、及体分泌液组成的组中的生物体来源试样。
(12)
一种APP669-711测定用试剂盒，其包含：
特异性识别APP669-711的N末端的APP669-711 N末端识别单克隆抗体(第1抗体)、
能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体(第2抗体)、及封闭剂。
(13)
根据上述(12)所述的试剂盒，还包含能够结合于APP669-711的抗原亲和性物质。
(14)
根据上述(12)或(13)所述的试剂盒，其中，上述封闭剂为乳蛋白。
序列表
<110> 株式会社岛津制作所（SHIMADZU CORPORATION）
<120> APP669-711测定方法及测定用试剂盒
<130> 9191065WO01
<150> JP 2019-037265
<151> 2019-03-01
<160> 5
<210> 1
<211> 40
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 2
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 2
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1 5 10 15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
20 25 30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
35 40
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 3
Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His
1 5 10 15
His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly
20 25 30
Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
35 40
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 4
Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His
1 5 10
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 5
Val Lys Met Cys
1

Claims (14)

1.一种APP669-711测定方法，其测定试样中的APP669-711，所述测定方法包括：
固定化工序，将能与APP669-711的N末端免疫特异性地结合的第1抗体固定化于支撑体；
封闭工序，将固定化有所述第1抗体的支撑体用封闭剂封闭；
第1反应工序，使所述试样中的APP669-711与固定化的所述第1抗体接触，从而使APP669-711与所述第1抗体结合；
试样去除工序，将未发生结合的所述试样去除；
第2反应工序，使能与APP669-711的C末端免疫特异性地结合的第2抗体与固定化的所述第1抗体上所结合的APP669-711接触，从而使所述第2抗体与APP669-711结合；
第2抗体去除工序，将未发生结合的所述第2抗体去除；以及
检测工序，检测结合于APP669-711的所述第2抗体的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述封闭工序中，所述封闭剂为乳蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述封闭工序中，使包含所述封闭剂的封闭溶液与固定化有所述第1抗体的支撑体接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述封闭工序中，所述封闭剂为乳蛋白，所述封闭溶液中的所述乳蛋白的浓度为2.5～10mg/mL。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，在所述第1反应工序之前还包括乳蛋白添加工序，所述乳蛋白添加工序向所述试样中添加乳蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述乳蛋白添加工序中，将所述试样用以2～4mg/mL的浓度包含所述乳蛋白的稀释液稀释。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，所述固定化工序中，使包含所述第1抗体的第1抗体溶液与支撑体接触。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第1抗体溶液中的所述第1抗体的浓度为5～20μg/mL。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所述第1抗体溶液的pH为中性或弱碱性。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，在所述第1反应工序之前还包括抗原亲和性物质添加工序，所述抗原亲和性物质添加工序向所述试样中添加能够结合于APP669-711的抗原亲和性物质。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述试样为选自由血液、脑脊液、尿、粪便、及体分泌液组成的组中的生物体来源试样。
12.一种APP669-711测定用试剂盒，其包含：
特异性识别APP669-711的N末端的APP669-711 N末端识别单克隆抗体(第1抗体)、
能够识别APP669-711的C末端的单克隆抗体或多克隆抗体(第2抗体)、及封闭剂。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，还包含能够结合于APP669-711的抗原亲和性物质。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其中，所述封闭剂为乳蛋白。
CN202080017569.2A 2019-03-01 2020-01-14 App669-711测定方法及测定用试剂盒 Pending CN113597429A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019037265 2019-03-01
JP2019-037265 2019-03-01
PCT/JP2020/000787 WO2020179224A1 (ja) 2019-03-01 2020-01-14 Ａｐｐ６６９－７１１の測定方法、及び測定用キット

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113597429A true CN113597429A (zh) 2021-11-02

Family

ID=72337567

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080017569.2A Pending CN113597429A (zh) 2019-03-01 2020-01-14 App669-711测定方法及测定用试剂盒

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220137071A1 (zh)
EP (1) EP3932942A4 (zh)
JP (1) JP7207517B2 (zh)
CN (1) CN113597429A (zh)
WO (1) WO2020179224A1 (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102089659A (zh) * 2008-05-08 2011-06-08 武田药品工业株式会社 Aβ寡聚物的测定方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0694716A (ja) * 1992-02-05 1994-04-08 Kanebo Ltd 免疫測定法
JP4374316B2 (ja) 1993-01-25 2009-12-02 武田薬品工業株式会社 β−アミロイドまたはその誘導体に対する抗体およびその用途
WO2004029629A1 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Janssen Pharmaceutica N.V. N-11 truncated amyloid-beta nomoclonal antibodies, compositions, methods and uses
EP2006392B1 (en) * 2006-04-13 2013-03-27 EIDIA Co., Ltd. METHOD FOR TESTING ALZHEIMER'S DISEASE BY ASSAYING DEGRADATION RATE OF beta-AMYLOID IN BLOOD AND DIAGNOSTIC REAGENT
WO2011070174A1 (en) * 2009-12-11 2011-06-16 Araclon Biotech, S.L. Methods and reagents for improved detection of amyloid beta peptides
EP2780717B1 (en) * 2011-11-16 2016-12-21 sphingotec GmbH Adrenomedullin assays and methods for determining mature adrenomedullin
US20130273574A1 (en) * 2012-03-13 2013-10-17 Janssen Alzheimer Immunotherapy Oligomeric a-beta in the diagnosis, prognosis, and monitoring of alzheimer's disease
ES2933952T3 (es) 2014-05-22 2023-02-15 Shimadzu Corp Biomarcador indirecto para evaluar la acumulación de péptido beta amiloide intracerebral y método para el análisis del mismo
JP6424757B2 (ja) * 2015-07-14 2018-11-21 株式会社島津製作所 ポリペプチドの質量分析方法
AU2016322342B2 (en) * 2015-09-16 2019-07-25 National Center For Geriatrics And Gerontology Multiplex biomarker for use in evaluation of state of accumulation of amyloid β in brain, and analysis method for said evaluation
TW201827467A (zh) * 2016-11-03 2018-08-01 比利時商健生藥品公司 焦穀胺酸類澱粉蛋白－β之抗體及其用途
JP6870468B2 (ja) * 2017-05-15 2021-05-12 株式会社島津製作所 ペプチドの分析方法
CN111770935A (zh) * 2018-02-27 2020-10-13 株式会社岛津制作所 特异性识别APP669-x的N末端的抗体及免疫测定法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102089659A (zh) * 2008-05-08 2011-06-08 武田药品工业株式会社 Aβ寡聚物的测定方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3932942A1 (en) 2022-01-05
JP7207517B2 (ja) 2023-01-18
WO2020179224A1 (ja) 2020-09-10
JPWO2020179224A1 (ja) 2021-11-25
EP3932942A4 (en) 2022-12-07
US20220137071A1 (en) 2022-05-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2828282T3 (en) Biomarkers
JP6889780B2 (ja) 遺伝子バリアントを認識する抗体
EP2754672B1 (en) Antibody capable of binding to specific region of periostin, and method of measuring periostin using the same
EP3859332B1 (en) Glycated hemoglobin (%) assay method
JP2024056971A (ja) ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体、及び免疫測定法
US11719697B2 (en) Immunoassay and antibodies for the detection of chromogranin A
JP5252339B2 (ja) Ｐａｄ４及び抗ｐａｄ４抗体の測定方法並びに関節リウマチの検出方法
JP6027744B2 (ja) ヒトインスリン測定方法及び測定試薬
RU2607588C2 (ru) Способ получения агента, связывающегося с препро-вазопрессином или с его фрагментами
AU2011282245A1 (en) Signal biomarkers
CN107110848B (zh) 以脱氧羟腐胺缩赖氨酸合酶基因作为指标使用的动脉硬化及癌的检测方法
JP2008203041A (ja) ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼａ１測定方法および検査試薬
WO2021065306A1 (ja) 血液試料を検体とするタウタンパク質検出方法
CN113597429A (zh) App669-711测定方法及测定用试剂盒
JP5280916B2 (ja) 抗ラットオステオカルシンモノクローナル抗体
WO2019167128A1 (ja) サンドイッチ型免疫測定法
CA2771954A1 (en) Pneumonia biomarkers
WO2023190560A1 (ja) ヒトｂ型ナトリウム利尿ペプチド又はその前駆体若しくは分解物を検出するための方法、組成物、及びキット
WO2014177701A1 (en) Process for diagnosing a human subject with diseases affecting the kidneys, or at risk of acquiring diseases affecting the kidneys
CN114729935A (zh) 使用免疫反应的分析物的测量方法和测量试剂
WO2023056462A1 (en) Pathologic tdp-43 as a biomarker for the diagnosis of tdp-43 proteinopathy
CN113727995A (zh) 检测癌的方法和检测试剂
JP2007127472A (ja) グリシル化ガストリン（ｇｌｙｃｉｎｅ−ｅｘｔｅｎｄｅｄｇａｓｔｒｉｎ）の分析方法
WO2014073653A1 (ja) 腎炎の病変部位の検査方法およびそのための試薬
JP2015137272A (ja) 新規のペプチド及び疾患の検出方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination