ES2933952T3

ES2933952T3 - Biomarcador indirecto para evaluar la acumulación de péptido beta amiloide intracerebral y método para el análisis del mismo

Info

Publication number: ES2933952T3
Application number: ES19166974T
Authority: ES
Inventors: Naoki Kaneko; Katsuhiko Yanagisawa
Original assignee: Shimadzu Corp; National Center for Geriatrics and Gerontology
Current assignee: Shimadzu Corp; National Center for Geriatrics and Gerontology
Priority date: 2014-05-22
Filing date: 2015-05-19
Publication date: 2023-02-15
Anticipated expiration: 2035-05-19
Also published as: EP3540442A1; CN106574930A; AU2015262399B2; EP3147668A4; AU2015262399B9; AU2015262399A2; EP3147668A1; EP3783364A3; JP2020193200A; EP3540442B1; AU2015262399A1; EP3783364A2; AU2021201434A1; JP7008268B2; EP3147668B1; WO2015178398A1; JPWO2015178398A1; JP6410810B2; CN106574930B; ES2769048T3

Abstract

La presente invención se refiere a métodos analíticos para determinar un estado de acumulación de Aβ cerebral, respectivos marcadores utilizados en dichos métodos y métodos respectivos para determinar la eficacia de una intervención médica con respecto a un estado de acumulación de Aβ cerebral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcador indirecto para evaluar la acumulación de péptido beta amiloide intracerebral y método para el análisis del mismo

La presente invención pertenece al campo de la neurociencia cerebral y al campo de la medicina clínica, y se refiere ^{a un método para análisis de un biomarcador indirecto para evaluar un estado de acumulación de péptido}p ^{amiloide cerebral (A}p^{). Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para análisis de un biomarcador indirecto para evaluar un estado de acumulación de A}p ^{cerebral utilizando, como índice, un nivel de péptido similar a A}p ^{y de péptido A}p ^{generado por la descomposición de la proteína precursora amiloide (APP, por sus siglas en inglés)}en una muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo. El biomarcador utilizado en el método analítico de la presente invención es un marcador que se utiliza, por ejemplo, para el diagnóstico presintomático, el cribado de sujetos con intervención preventiva de desarrollo (administración preventiva de fármacos terapéuticos, etc.) y la evaluación de la eficacia del fármaco de fármacos terapéuticos y profilácticos con respecto a la enfermedad de Alzheimer.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es la causa principal de demencia y ocupa del 50 al 60% de toda la demencia. El número de pacientes que padecían demencia era mayor o igual a 24 millones en el mundo en 2001, y se estima que ^{alcanzará los 81 millones en 2040 (Documento no de patente 1). Se considera que A}p ^{está profundamente involucrado en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. A}p ^{se produce como resultado de la proteólisis de la proteína}precursora amiloide (APP), que es una proteína transmembrana de un solo paso y está compuesta de 770 restos de ^{aminoácidos, por}p^{-secretasa y}Y^{-secretasa (véase Fig. 1). La aparición de placas seniles debido a la agregación de A}p ^{que acompaña a la fibrosis desencadena la agregación y la acumulación de proteína tau dentro de los neurocitos}para causar un mal funcionamiento del nervio y la muerte de las células neuronales. Se considera que esto da como ^{resultado un deterioro extremo de la capacidad cognitiva. Desde hace tiempo se sabe que A}p ^{consiste principalmente en 40 mer (A}p^{1-40) y 42 mer (A}p^{1-42) y migra hacia el líquido cefalorraquídeo (LCR) y la sangre. Además, en los últimos años, se ha dado a conocer la existencia de péptidos similares a A}p ^{que tienen longitudes diferentes de las de A}p^{1 -40 y A}p^{1-42 en LCR (Documento no de patente 2).}

La enfermedad de Alzheimer se desarrolla de forma latente y avanza lentamente. El diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer se realiza mediante ADAS-cog, MMSE, DemTect, SKT o una prueba de función cognitiva tal como una prueba del dibujo del reloj para examinar el síntoma clínico y el examen de hallazgos de imágenes mediante el diagnóstico de imagen por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés), tomografía por emisión de positrones (PET, por sus siglas en inglés) y similares en combinación. Si bien la MRI es un método de diagnóstico por imagen capaz de detectar la atrofia cerebral degenerativa, la atrofia cerebral no es específica para la enfermedad de Alzheimer. Mientras tanto, se conoce un método de diagnóstico por imagen que visualiza la retención de una molécula de ligando ^{que detecta específicamente depósitos de A}p ^{(PiB: compuesto-B de Pittsburgh), la PiB-PET. Se ha descubierto que el análogo de tioflavina T, denominado PiB (11C), se retiene en reflejo de A}p ^{que se acumula gradualmente en una}región específica del cerebro de un paciente que sufre un deterioro cognitivo leve (DCL) o enfermedad de Alzheimer ^{leve, y por lo tanto PiB-PET es una herramienta óptima para detectar depósitos de A}p^{. A partir de los hallazgos}patológicos de la necropsia de la enfermedad de Alzheimer, se descubre que una gran cantidad de placas seniles ya se ha acumulado incluso en el caso de un deterioro leve de la función cognitiva. Esto lleva a la inferencia de que la ^{agregación y la deposición de A}p ^{comienzan bastante antes de la exteriorización de la demencia, y el resultado que}respalda esta inferencia también se ha dado a conocer en los hallazgos de PiB-PET. Sin embargo, el examen PET requiere un enorme equipo y requiere un precio de examen costoso para realizar un examen, y por lo tanto no es adecuado como método que permite al ciudadano tener un examen amplio.

Un biomarcador en sangre o líquido cefalorraquídeo (LCR) es un índice útil capaz de detectar el desarrollo y la progresión de una enfermedad a nivel molecular. En la enfermedad de Alzheimer, se ha dado a conocer que una ^{disminución en la concentración de A}p^{1-42 en LCR o en la relación de concentración entre A}p^1-42/Ap^{1-40, y un}aumento en el valor tau total o en el valor tau de fosforilación son un marcador de diagnóstico útil (Documento de patente 1: JP-A-2010-19864, Documento no de patente 3). Sin embargo, la recolección de LCR es altamente invasiva y no es adecuada como método que permita que el ciudadano tenga un examen amplio.

^{En estas circunstancias, se espera la posibilidad de que A}p^{1 -42 exista en la sangre como marcador de diagnóstico de}la enfermedad de Alzheimer en un examen de sangre; sin embargo, se ha dado a conocer que la relación entre la ^{concentración de A}p^{1-42 en sangre y el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer es baja, a diferencia del comportamiento de A}p^{1 -42 en el LCR (Documento no de patente 3). La razón de esto no ha sido aclarada.}

Además, el Documento de Patente 2: JP-A-2013-63976 describe un anticuerpo monoclonal que no reconoce un ^{monómero A}p ^{soluble, pero se une específicamente sólo a un oligómero de A}p ^{soluble, y también describe un método}de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer utilizando el anticuerpo. El párrafo [0104] de la publicación describe un ^{método en el que cuando la relación entre el oligómero A}p ^{y el monómero A}p ^{en una muestra de un sujeto es mayor}que la de una persona sana normal, se determina que el sujeto es candidato para la enfermedad de Alzheimer.

^{El Documento no de patente 4 describe la existencia de 22 tipos de péptidos similares a A}p ^{y péptidos A}p ^obtenidosa partir de APP en plasma humano mediante la combinación de inmunoprecipitación y un espectrómetro de masas, y ^{también describe un método para cuantificar estos péptidos similares a A}p ^{y péptidos A}p^.

Documentos de la técnica anterior

Documentos de patente

Documento de patente 1: JP-A-2010-19864

Documento de patente 2: JP-A-2013-63976

Documento de patente 3: (WO 2013/096451 A2) describe métodos para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: Blennow K, de Leon MJ, Zetterberg H.: Alzheimer's disease. Lancet. 2006 Jul 29; 368 (9533): 387-403

Documento no de patente 2: Portelius E, Westman-Brinkmalm A, Zetterberg H, Blennow K.: Determination of beta-amyloid peptide signatures in cerebrospinal fluid using immunoprecipitation-mass spectrometry. J Proteome Res. 2006 Apr; 5(4): 1010-6

Documento no de patente 3: Hampel H, Shen Y, Walsh DM, Aisen P, Shaw LM, Zetterberg H, Trojanowski JQ, Blennow K.: Biological markers of amyloid beta-related mechanisms in Alzheimer's disease. Exp Neurol. 2010 Jun; 223(2): 334-46

Documento no de patente 4: Kaneko N, Yamamoto R, Sato TA, Tanaka K.: Identification and quantification of amyloid beta-related peptides in human plasma using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014;90(3):104-17

Documento no de patente 5: (Bibl, M., et al., J. Neural. Transm. (2006) 113: 1771-1778) describe la diagnosis de CSF de la enfermedad de Alzheimer y la demencia con cuerpos de Lewy.

Documento no de patente 6: Bibl, M., et al., Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 2011; 31: 37-44) describe fluido cerebrospinal tau, p-tau 181 y p^38/4ü/42-amiloide en demencias frontotemporal y afasias progresivas primarias.

Documento no de patente 7 (Bibl, M., et al., J. Neural. Transm. (2012) 119: 805-813) describe que el fluido cerebrospinal p-amiloide 2-42 está disminuido en el Alzheimer peor no en la demencia frontotemporal.

Se ha descubierto que se ha depositado una gran cantidad de Ap antes de la exteriorización de la disminución de la función cognitiva en un paciente con enfermedad de Alzheimer (EA). Aunque PiB-PET es efectiva para detectar la acumulación de Ap, requiere un alto coste de examen y mucho tiempo para ejecutar el examen, y por lo tanto no es un método de diagnóstico que permita que la mayoría de las personas mayores se sometan fácilmente al examen. Por lo tanto, se ha exigido un método analítico simplificado capaz de detectar un aumento en la acumulación de Ap antes de la exteriorización de los síntomas clínicos.

Como se describió anteriormente, generalmente, un método de examen que utiliza un biomarcador existente en sangre o líquido cefalorraquídeo (LCR) como índice es un método efectivo capaz de detectar convenientemente el desarrollo y la progresión de una enfermedad a nivel molecular. El documento de patente 1 y el Documento no de patente 3 descritos anteriormente han dado a conocer que, en la enfermedad de Alzheimer, una disminución en la concentración de Ap1-42 en LCR o una relación de concentración entre Ap1-42/Ap1-40, y un aumento en el valor de tau total o en el valor de fosforilación de tau son marcadores de diagnóstico útiles. Por otro lado, sin embargo, el Documento no de patente 3 también ha dado a conocer que la relación entre la concentración de Ap1-42 en sangre y el desarrollo de EA es baja, a diferencia del caso de Ap1 -42 en LCR.

En informes anteriores con respecto a Ap en sangre, la correlatividad con EA se examina solo para concentraciones de dos tipos de Ap1-40 y Ap1 -42 en sangre. Sin embargo, se ha descubierto la existencia de péptidos Ap más cortos que se escinden en el lado N-terminal o en el lado C-terminal de Ap1 -40 en LCR además de Ap1-40 y Ap1 -42 mediante un método combinatorio de inmunoprecipitación y un espectrómetro de masas. En sangre, había sido técnicamente difícil detectar Ap que está presente en una cantidad menor que en LCR por inmunoprecipitación y un espectrómetro de masas; sin embargo, como resultado de la mejora en la inmunoprecipitación, se ha elucidado la existencia de 22 tipos de péptidos similares a Ap y péptidos Ap obtenidos a partir de APP en plasma humano, y se ha desarrollado un método para cuantificar estos péptidos (Documento no de patente 4).

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de análisis de un biomarcador para evaluar un estado de acumulación de Ap cerebral utilizando un péptido obtenido a partir de la proteína precursora amiloide (APP) en una muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo como índice. En particular, un objeto de la presente invención es proporcionar un método de análisis de un biomarcador para evaluar un estado de acumulación de Ap cerebral utilizando péptidos Ap obtenidos a partir de la proteína precursora amiloide (APP) en una muestra de sangre como índice, y un método para análisis del mismo. Más específicamente, un objeto de la presente invención es proporcionar un método de análisis de un marcador para ser utilizado, por ejemplo, para diagnóstico presintomático, cribado de sujetos con intervención preventiva de desarrollo (administración preventiva de fármacos terapéuticos, etc.) y evaluación de la eficacia del fármaco de fármacos terapéuticos y medicamentos profilácticos con respecto a la enfermedad de Alzheimer.

Como resultado de esfuerzos diligentes, los presentes autores han descubierto que el péptido Ap obtenido a partir de APP específica logra el objeto mencionado anteriormente, y consiguen la presente invención.

En la presente descripción, "Ap" se utiliza como una abreviatura de un péptido p amiloide. Es decir, "Ap" incluye Ap1-40 y Ap1-42. Un péptido distinto del Ap generado por la escisión de la proteína precursora amiloide (APP) se puede denominar un péptido similar a Ap. El péptido Ap y el péptido similar a Ap que se generan por escisión de la proteína precursora amiloide (APP) se puede denominar "péptido obtenido a partir de APP".

La presente invención incluye los siguientes aspectos.

(1) Un método analítico para determinar un estado de acumulación de Ap cerebral, cuyo método comprende:

una etapa de medición para someter una muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo obtenida a partir de un sujeto de ensayo a la detección de un marcador que contiene:

APP672-713 (Ap1-42) (SEQ ID NO.: 6), y

APP672-711 (Ap1-40) (SEQ ID NO.: 4),

para obtener niveles de medidas de:

APP672-713 (Ap1-42) y APP672-711 (Ap1-40) en la muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo;

una etapa de cálculo para calcular

una relación de nivel de APP672-711 (Ap1-40) a nivel de APP672-713 (Ap1-42):APP672-711 (Ap1-40)/APP672-713 (Ap1-42); y

una etapa de evaluación para determinar que una cantidad de acumulación de Ap cerebral del sujeto de ensayo es mayor que una cantidad de acumulación de Ap cerebral de una persona que tiene una función cognitiva normal que es negativa para la acumulación de Ap cerebral (NC-), cuando la relación del sujeto de ensayo es más alta que un nivel estándar, que es la relación de una persona que tiene una función cognitiva normal, que es negativa para la acumulación de Ap cerebral (NC-).

(2) El método analítico para determinar un estado de acumulación de Ap cerebral de acuerdo con el anterior (1), en donde la muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo se selecciona del grupo que consiste en sangre, líquido cefalorraquídeo, orina, fluidos secretados por el cuerpo, heces, saliva, y esputo.

En la presente invención, el término "nivel de marcador" significa básicamente una concentración, pero puede ser otras unidades aplicadas correspondientemente a la concentración por un experto en la materia. El término "sujeto de ensayo" incluye humanos y mamíferos que no sean humanos (rata, perro, gato, etc.). En la presente invención, la muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo se desecha en lugar de ser devuelta al sujeto de ensayo (por ejemplo, sujeto) del que se obtiene la muestra biológica. La intervención médica incluye la administración de un fármaco terapéutico o un fármaco profiláctico, terapia dietética, terapia de ejercicio, terapia de aprendizaje, operación quirúrgica y similares.

La presente invención proporciona un método de análisis de un marcador para determinar un estado de acumulación de Ap cerebral de un sujeto de ensayo, que incluye una combinación de APP672-713 (Ap1-42) (SEQ ID NO.: 6) y APP672-711 (Ap1-40) (SEQ ID NO.: 4) en una muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo.

Al analizar el marcador en la muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo del sujeto de ensayo, es posible discriminar si la acumulación de Ap cerebral en el sujeto de ensayo es menor o igual al nivel estándar o si el Ap cerebral se acumula excesivamente. La presente invención es aplicable a la detección no solo de la etapa avanzada de la enfermedad de Alzheimer en la que se acumula excesivamente Ap cerebral y ha aparecido un trastorno cognitivo funcional, sino también de la etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer en la que se acumula excesivamente Ap cerebral pero no ha aparecido un trastorno funcional cognitivo.

Según la presente invención, como muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo, no solo se puede utilizar sangre, sino también líquido cefalorraquídeo (LCR), orina, fluidos secretados por el cuerpo, heces, saliva y esputo. Por lo tanto, en la etapa donde se han establecido el método preventivo y el método terapéutico preventivo para la enfermedad de Alzheimer, el análisis de un estado de acumulación de Ap cerebral para una persona que tiene una función cognitiva normal en un examen médico general, un examen físico completo y similares, es efectiva para el diagnóstico presintomático de la enfermedad de Alzheimer.

Al aplicar la presente invención antes y después de una intervención médica realizada para el sujeto de ensayo, es posible evaluar la eficacia del fármaco de un fármaco terapéutico o un fármaco profiláctico para la enfermedad de Alzheimer, o evaluar la eficacia de otro tratamiento. Además, la presente invención es útil para el seguimiento de un paciente que padece la enfermedad de Alzheimer.

[Fig. 1] La Fig. 1 muestra un diagrama que muestra esquemáticamente la vía de formación de péptidos Ap y p3 mediante escisiones de la proteína precursora amiloide (APP).

[Fig. 2] La Fig. 2 es un diagrama de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP672-713 (Ap1-42) y el SIL-Ap1 -38 estándar interno en cada grupo (NC-, NC+, DCL, EA) para APP672-713 (Ap1-42) en el Ejemplo 1.

[Fig. 3] La Fig. 3(A) y la Fig. 3(B) muestran cada una, una curva característica de funcionamiento del receptor (ROC) de cada grupo (NC+, d Cl ) versus el grupo NC- para la APP672-713 (Ap 1 -42)/SIL- Ap1-38.

[Fig. 4] La Fig. 4(C) y la Fig. 4(D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (EA, PiB+) versus el grupo NC- para APP672-713 (Ap1 -42)/SIL-Ap1-38.

[Fig. 5] La Fig. 5 es un diagrama de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP672-709 (Ap1 -38) y APP672-713 (Ap1-42) en cada grupo (NC-, N^c+, DCL, EA) en el ejemplo 1.

[Fig. 6] La Fig. 6 (A) y la Fig. 6 (B) muestran una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL) versus el grupo NC- para la APP672-709 (Ap1-38)/APP672-713 (Ap1-42).

[Fig. 7] La Fig. 7 (C) y la Fig. 7 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (EA, PiB+) versus el grupo NC- para la APP672-709 (Ap1-38)/APP672-713 (Ap1-42).

[Fig. 8] La Fig. 8 es un diagrama de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP674-711 (Ap3-40) y APP672-713 (Ap1-42) en cada grupo (NC-, Nc , DCL, EA) en el ejemplo 1.

[Fig. 9] La Fig. 9 (A) y la Fig. 9 (B) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL) versus el grupo NC- para APP674-711 (Ap3-40)/APP672-713 (Ap1-42).

[Fig. 10] La Fig. 10 (C) y la Fig. 10 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (EA, PiB+) versus el grupo NC- para APP674-711 (Ap3-40)/APP672-713 (Ap1-42).

[Fig. 11] La Fig. 11 es un diagrama de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP672-710 (Ap1-39) y APP672-713 (Ap1 -42) en cada grupo (NC-, NC+, DCL, EA) en el ejemplo 1.

[Fig. 12] La Fig. 12 (A) y la Fig. 12 (B) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL) versus el grupo NC- para la APP672-710 (Ap1-39)/APP672-713 (Ap1 -42).

[Fig. 13] La Fig. 13 (C) y la Fig. 13 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (EA, PiB+) versus el grupo NC- para la APP672-710 (Ap1 -39)/APP672-713 (Ap1 -42).

[Fig. 14] La Fig. 14 es un diagrama de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP672-711 (Ap1 -40) y APP672-713 (Ap1 -42) en cada grupo (NC-, NC+, DCL, EA) en el ejemplo 1.

[Fig. 15] La Fig. 15 (A) y la Fig. 15 (B) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL) versus el grupo NC- para la APP672-711 (Ap1 -40)/APP672-713 (Ap1 -42).

[Fig. 16] La Fig. 16 (C) y la Fig. 16 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (EA, PiB+) versus el grupo NC- para la APP672-711 (Ap1 -40)/APP672-713 (Ap1 -42).

[Fig. 17] La Fig. 17 es un diagrama de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre OxAPP672-711 (OxAp1 -40) y APP672-713 (Ap1 -42) en cada grupo (NC-, NC+, DCL, EA) en el ejemplo 1.

[Fig. 18] La Fig. 18 (A) y la Fig. 18 (B) muestran una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL) versus el grupo NC-para OxAPP672-711 (OxAp1 -40)/APP672-713 (Ap1 -42).

[Fig. 19] La Fig. 19 (C) y la Fig. 19 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (EA, PiB+) versus el grupo NC- para OxAPP672-711 (OxAp1-40)/APP672-713 (Ap1-42).

[Fig. 20] La Fig. 20 es un diagrama de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP669-711 y APP672-713 (Ap1-42) en cada grupo (NC-, NC+, DCL, EA) en el Ejemplo 1.

[Fig. 21] La Fig. 21 (A) y la Fig. 21 (B) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL) versus el grupo NC- para la APP669-711/APP672-713 (Ap1-42).

[Fig. 22] La Fig. 22 (C) y la Fig. 22 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (EA, PiB+) versus el grupo NC- para la APP669-711/APP672-713 (Ap1-42).

[Fig. 23] La figura 23 es un diagrama de dispersión del valor medio de acumulación de PiB de la región cortical (mcSUVR: relación de valor de captación estándar cortical medio) y APP669-711/APP672-713 (Ap1-42) en un total de 62 casos en el Ejemplo 1. Se indica una elipse de probabilidad (p=0.95) mediante una curva.

[1. Sujeto de ensayo]

En la presente invención, el sujeto de ensayo incluye humanos y mamíferos que no sean humanos (rata, perro, gato, etc.). En lo sucesivo, la descripción se realizará principalmente para el caso de los humanos, pero lo mismo se aplica a los mamíferos que no sean humanos.

En el método de la presente invención, el sujeto puede ser cualquier individuo, que incluye una persona que se espera que sea una persona sana normal, independientemente de la historia clínica anterior. Para una persona que se espera que sea una persona sana normal, se puede determinar un estado de acumulación de Ap cerebral en un examen médico general o un examen físico completo, preferiblemente mediante un análisis de sangre, y el método es particularmente efectivo para la detección/diagnóstico temprano de la enfermedad de Alzheimer. El método de la presente invención puede ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer para un sujeto sospechoso de ser candidato para la enfermedad de Alzheimer como resultado de ADAS-cog, MMSE, DemTect, SKT o una prueba de función cognitiva, tal como una prueba de dibujo de reloj para examinar los síntomas clínicos y la confirmación de hallazgos de imágenes mediante diagnóstico de imagen por resonancia magnética (MRI), tomografía por emisión de positrones (PET) y similares.

[2. Muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo]

El marcador utilizado en el método de la presente invención se puede detectar y analizar en una muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo de un sujeto. Por lo tanto, en el método de la presente invención, se analiza el nivel de un marcador en una muestra obtenida a partir del cuerpo vivo de un sujeto.

La muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo se puede seleccionar de fluidos corporales tales como sangre, líquido cefalorraquídeo (LCR), orina, fluidos secretados por el cuerpo, saliva y esputo; y heces. Entre estos, se prefiere la sangre para el diagnóstico y el diagnóstico presintomático de la enfermedad de Alzheimer en un examen médico general, un examen físico completo o similar.

La muestra de sangre es una muestra que se somete directamente a una etapa de medición del nivel del marcador e incluye sangre completa, plasma, suero y similares. La muestra de sangre se puede preparar tratando adecuadamente la sangre completa recolectada de un sujeto de ensayo. El tratamiento realizado en el caso de preparar una muestra de sangre a partir de sangre completa recolectada no está particularmente limitado, y se puede realizar cualquier tratamiento que sea clínicamente aceptable. Por ejemplo, se puede realizar una separación centrífuga o similar. La muestra de sangre sometida a la etapa de medición se puede almacenar adecuadamente a una temperatura baja tal como congelación en la etapa intermedia de la etapa de preparación o en la etapa posterior de la etapa de preparación. En la presente invención, la muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo, tal como una muestra de sangre, se desecha en lugar de ser devuelta al sujeto del que se obtiene.

[3. Marcador]

El marcador utilizado en el método analítico de la presente invención es una combinación de APP672-713 (Ap1-42) (SEQ ID NO.: 6) y APP672-711 (Ap1-40) (SEQ ID NO.: 4) en una muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo. Para estos marcadores, se ha observado una diferencia significativa entre el nivel en la muestra de plasma de una persona que tiene una función cognitiva normal, que es negativa para la acumulación de Ap cerebral, y el nivel en la muestra de plasma a partir de un sujeto que tiene Ap cerebral excesivamente acumulado.

APP672-713 (Ap1-42) (SEQ ID NO.: 6):

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

APP669-711 (SEQ ID NO.: 7):

VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV

APP672-709 (Ap1-38) (SEQ ID NO.: 1):

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG

APP674-711 (Ap3-40) (SEQ ID NO.: 2):

EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV

APP672-710 (Ap1-39) (SEQ ID NO.: 3):

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV

APP672-711 (AP1-40) (SEQ ID NO.: 4):

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV

OxAPP672-711 (OxAp1-40) (SEQ ID NO.: 5):

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGW (Met 706 está oxidado)

La proteína precursora amiloide (APP) es una proteína transmembrana de un solo paso y está compuesta por 770 restos de aminoácidos. La proteína precursora amiloide (APP) es proteolizada por la p secretasa y la ^ysecretasa, y se produce un péptido p amiloide (Ap) por la proteólisis. APP672-713 y Ap1-42 indican el mismo péptido (SEQ ID NO.: 6). APP672-711 y Ap1-40 indican el mismo péptido (SEQ ID NO.: 4).

La Tabla 1 muestra secuencias de aminoácidos de péptidos obtenidos a partir de APP, y la Tabla 2 muestra masas promedio teóricas de los mismos. Para estos péptidos, se realizó el análisis de un marcador para determinar un estado de acumulación de Ap cerebral.

[Tabla 1]

SEQ ID Péptidos obtenidos a partir Secuencia

NO. de APP VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA

669 713 1 APP672-709 (Ap1 -38) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG

2 APP674-711 (Ap3-40) EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV

3 APP672-710 (Ap1 -39) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV

4 APP672-711 (Ap1 -40) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV

5 OxAPP672-711 (OxAp1 - DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV

40)

6 APP672-713 (Ap1-42) DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA 7 APP669-711 VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV

[Tabla 2]

SEQ ID NO. Masa media teórica

1 4132.6

2 4144.7

3 4231.8

4 4330.9

5 4346.9

6 4515.1

7 4689.4

En las Tablas 1 a 2, "péptidos obtenidos a partir de APP" indica péptidos obtenidos a partir de APP, y "Masa promedio teórica" indica masa promedio teórica.

En las Tablas 1 a 2, OxAPP672-711 (OxAp1-40) de SEQ ID NO.: 17 indica un péptido oxidado en Met 706 en APP672-711 (Ap1-40) de SEQ ID NO.: 16.

En la enfermedad de Alzheimer, existe la enfermedad de Alzheimer familiar.

Para la enfermedad de Alzheimer familiar, por ejemplo, se conocen las siguientes secuencias de mutación.

Mutación sueca: los aminoácidos KM en APP670-671 están mutados en NL.

Mutación italiana: el aminoácido A en APP673 está mutado en V.

Mutación de Lovaina: el aminoácido E en APP682 está mutado en K.

Mutación islandesa: el aminoácido A en APP673 está mutado en T.

Mutación británica: el aminoácido H en APP677 está mutado en R.

Mutación de Tottori: el aminoácido D en APP678 está mutado en N.

Mutación italiana: el aminoácido A en APP673 está mutado en V.

Mutación ártica: el aminoácido E en APP693 está mutado en G.

Mutación de Iowa: el aminoácido D en APP694 está mutado en N.

Mutación holandesa: el aminoácido E en APP693 está mutado en Q.

[4. Análisis de marcador]

En la presente descripción, la siguiente clasificación se realiza desde el punto de vista del grado de avance de la enfermedad de Alzheimer.

NC-: una persona que es negativa para la acumulación de Ap cerebral, y no tiene un deterioro cognitivo.

NC+ : una persona que es positiva para la acumulación de Ap cerebral, pero no tiene un deterioro cognitivo. DCL: una persona que es positiva para la acumulación de Ap cerebral, y tiene un deterioro cognitivo leve. EA: una persona que es positiva para la acumulación de Ap cerebral, y tiene un deterioro cognitivo.

PiB+: grupo combinado del grupo NC+, el grupo DCL y el grupo EA; es decir, una persona determinada como positiva para la acumulación de Ap cerebral independientemente de la presencia o ausencia de un deterioro cognitivo.

Normalmente, un estado de acumulación de Ap cerebral se determina comparando la cantidad de acumulación de PiB entre la corteza cerebral y la sustancia blanca en base a una imagen de PiB-PET.

Un método para analizar el marcador de la presente invención incluye:

una etapa de medición para someter una muestra, obtenida a partir de un cuerpo vivo obtenida a partir de un sujeto de ensayo, a la detección de un marcador que contiene APP672-713 (Ap1-42) (SEQ ID NO.: 6) y APP672-711 (Ap1-40) (s Eq ID NO.: 4) para obtener niveles de medición de APP672-713 (Ap1-42) y APP672-711 (Ap1-40) en la muestra obtenida a partir del cuerpo vivo;

una etapa de cálculo para calcular una relación entre el nivel de APP672-711 (Ap1-40) y el nivel de APP672-713 (Ap1-42): APP672-711 /(Ap1-40)/APP672-713 (Ap1 -42); y

una etapa de evaluación para determinar que una cantidad de acumulación de Ap cerebral del sujeto de ensayo es mayor que una cantidad de acumulación de Ap cerebral de una persona que tiene una función cognitiva normal que es negativa para la acumulación de Ap cerebral (NC-), cuando la relación del sujeto de ensayo es más alta que un nivel estándar, que es una relación de la persona que tiene una función cognitiva normal que es negativa para la acumulación de Ap cerebral (NC-). Esto hace posible determinar un estado de acumulación de Ap cerebral, o ayudar a la determinación.

El término "nivel de marcador" significa básicamente una concentración, pero pueden ser otras unidades aplicadas correspondientemente a la concentración por un experto en la materia, por ejemplo, una intensidad de iones detectada en la espectrometría de masas. En la presente invención, la concentración del marcador en la muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo se analiza comparando un valor de medición y un valor estándar. Para un análisis más preciso, se prefiere que el valor de medición y el valor estándar a comparar sean valores basados en las muestras obtenidas a partir de un cuerpo vivo preparadas en las mismas condiciones (condición de pretratamiento, condición de almacenamiento y similares). Como el nivel estándar del marcador, se puede utilizar un valor de medición para una persona que tiene una función cognitiva normal que es negativa para la acumulación de Ap cerebral NC-. Alternativamente, un valor estándar de concentración establecido para una persona que tiene una función cognitiva normal que es negativa para la acumulación intracerebral de Ap NC- se puede utilizar como el nivel estándar del marcador.

Un marcador se mide, preferiblemente, mediante una prueba basada en la afinidad específica de la molécula biológica. La prueba basada en la afinidad específica de la molécula biológica es un método bien conocido por un experto en la materia y no está particularmente limitado, pero preferiblemente es un inmunoensayo. Los ejemplos específicos del inmunoensayo incluyen ensayos competitivos y no competitivos tales como transferencia Western, radioinmunoensayo, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) (se incluyen inmunoensayo sándwich, ensayo competitivo y ensayo de unión directa), inmunoprecipitación, reacción de precipitación, inmunodifusión, medición de inmunoaglutinación, análisis de reacción de unión al complemento, ensayo inmunoradiométrico, inmunoensayo de fluorescencia e inmunoensayo de proteína A. En el inmunoensayo, se detecta un anticuerpo que se une al marcador en una muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo.

En la presente invención, la medición del marcador se puede realizar utilizando una inmunoglobulina que tiene un sitio de unión a antígeno capaz de reconocer un péptido obtenido a partir de la proteína precursora amiloide (APP), o un vehículo inmovilizador de anticuerpos preparado utilizando un fragmento de inmunoglobulina que tiene un sitio de unión a antígeno capaz de reconocer un péptido obtenido a partir de la proteína precursora amiloide (APP). Mediante inmunoprecipitación utilizando el vehículo de inmovilización de anticuerpos, se puede detectar un péptido en la muestra mediante un espectrómetro de masas (Inmunoprecipitación-Espectrometría de masas: IP-MS, por sus siglas en inglés). Como se muestra en la sección de ejemplos, una muestra de sangre obtenida a partir de un sujeto de ensayo se somete a la detección de un marcador que contiene APP672-713 (Ap1-42) (SEQ ID NO.: 6) para obtener un nivel de medición de APP672-713 ( Ap1-42) en la muestra de sangre; y se determina que una cantidad de acumulación de Ap cerebral del sujeto de ensayo es mayor que una cantidad de acumulación de Ap cerebral de una persona que tiene una función cognitiva normal NC-, que es negativa para la acumulación de Ap cerebral, cuando el nivel de medición de APP672-713 (Ap1-42) del sujeto de ensayo es inferior a un nivel estándar que es un nivel de APP672-713 (Ap1-42) de la persona que tiene una función cognitiva normal NC-.

Ejemplos

En lo sucesivo, la presente invención se describirá específicamente con referencia a ejemplos, pero no se limita a estos ejemplos. Las Figs. 14 a 16 son conformes a la presente invención. Las Figs. 2 a 13 y 17 a 23 son para referencia. no representan la presente invención. A continuación, la cantidad de una materia indicada por % se basa en el peso cuando la materia es un sujeto, y se basa en el volumen cuando la materia es líquida a menos que se indique lo contrario. [Ejemplo experimental 1]

(1) Evaluación del rendimiento del diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer mediante el marcador utilizando una muestra clínica

Se prepararon muestras de plasma de casos clasificados en grupos de NC-, NC , DCL y EA en el Centro Nacional de Geriatría y Gerontología.

NC-: una persona que es negativa para la acumulación de Ap cerebral, y no tiene un deterioro cognitivo NC+: una persona que es positiva para la acumulación de Ap cerebral, pero que no tiene un deterioro cognitivo DCL: una persona que es positiva para la acumulación de Ap cerebral, y tiene un deterioro cognitivo leve EA: una persona que es positiva para la acumulación de Ap cerebral, y tiene un deterioro cognitivo

PiB : grupo combinado del grupo NC+, el grupo DCL y el grupo EA; es decir, una persona determinada como positiva para la acumulación de Ap cerebral independientemente de la presencia o ausencia de un deterioro cognitivo

Con el fin de determinar la positividad o negatividad de la acumulación de Ap cerebral, se adquirieron imágenes PiB-PET de los cerebros de los sujetos. Cuando la cantidad de acumulación de PiB de la corteza cerebral es mayor o equivalente a la cantidad de acumulación no específica de PiB de la materia blanca, el sujeto se determinó como positivo. Cuando solo se observó acumulación no específica a la sustancia blanca, y se observó poca acumulación en la corteza, el sujeto se determinó como negativo. El deterioro cognitivo se determinó de conformidad con los criterios NIA-AA publicados en 2011.

La Tabla 3 muestra la función y el número de casos de cada grupo.

[Tabla 3]

Esquema de muestra clínica

Grupo n PiB-PET Demencia

NC- 22 - -

NC+ 11 -

DCL 12

EA 17 +

Cuando se considera la aplicación al diagnóstico temprano de la enfermedad de Alzheimer, se supone que un marcador sanguíneo que muestra variación en el nivel de medición en el grupo NC+, que se determina como positivo para la acumulación de Ap cerebral, aunque no tiene un deterioro cognitivo en comparación con el grupo NC-, es efectivo para el diagnóstico. En otras palabras, es importante encontrar un marcador sanguíneo que tenga un rendimiento diagnóstico capaz de discriminar entre la positividad y la negatividad de la acumulación de Ap cerebral. Desde este punto de vista, los criterios para la evaluación se hicieron en el análisis de marcadores si existe una diferencia en el nivel de medición entre cada uno de los otros grupos y el grupo NC-.

(2) Preparación de perlas inmovilizadoras de anticuerpos

Se digirieron 250 pg de anticuerpo anti-Ap (6E10: Covance) que reconoce los restos 3-8 de Ap como un epítopo con 1250 pL de perlas de agarosa Ficin (Thermo) (suspensión al 33%) y se digirieron 100 pg de anticuerpo anti-Ap (4G8: Covance) que reconoce los restos 18-22 de Ap como un epítopo con 500 ng de lisil endopeptidasa (LysC), y los productos digeridos respectivos se separaron y recolectaron por cromatografía de exclusión por tamaño. La muestra fraccionada se examinó mediante SDS-PAGE reductora y no reductora, y se combinó una fracción correspondiente con F(ab')². Estas fracciones F(ab')²de 6E10 y 4G8 se redujeron respectivamente mediante cisteamina 30 mM para obtener F(ab'). Después se prepararon 5 pL (cantidad de perlas 150 pg) de perlas magnéticas amino (Dynabeads M-270 Amine: Invitrogen), y el PEG y las perlas se unieron covalentemente haciendo que los grupos NHS de SM (PEG)²⁴reaccionaran con grupos amino unidos en la superficie de las perlas a temperatura ambiente durante 30 minutos. Cada 0,25 pg de 6E10 F(ab') y 4G8 F(ab') se añadieron al mismo tiempo al SM (PEG)²⁴unido a perlas magnéticas, y se hizo que reaccionaran a temperatura ambiente durante 2 horas para unirse covalentemente un grupo maleimida y un grupo tiol. Finalmente, se hizo reaccionar L-cisteína 0,4 mM a temperatura ambiente durante 30 minutos para bloquear los grupos maleimida. Las perlas de inmovilización de anticuerpos preparadas se almacenaron a una temperatura de 4°C antes de su uso.

(3) Preparación del péptido estándar interno

Como péptido estándar interno, se utilizó Ap1-38 (denominado SIL-Ap1 -38) que es un AnaSpec marcado con isótopos estables (San José, CA, EE.UU.). En SIL-Ap1 -38, los átomos de carbono en Phe e Ile están sustituidos por ¹³C. Después de disolver un producto seco de SIL-Ap1 -38 en NaOH 50 mM, se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) mediante un sistema HPLC Prominence (Shimadzu Corp, Kyoto, Japón) instalado con un COSMOSIL (R) 5Diol-120-II [7.5 mm I.D. x 600 mm] columna (Nacalai Tesque, Kyoto). Los ajustes fueron los siguientes: fase móvil: Tris-HCl 40 mM, pH 8.0, velocidad de flujo: 1 ml/min, temperatura de la columna: 25°C, longitud de onda de detección: 214/280 nm. Parte de las fracciones recolectadas se sometieron a 15-20% de Tricine-SDS-PAGE en condiciones no reductoras, y las bandas se tiñeron con el kit Silver Staining (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). La fracción identificada como monómero se diluyó con Tris-HCl 40 mM, NaCl 150 mM, pH 8.0 que contenía 1 mg/ml de albúmina de suero bovino, y después se dispensó y almacenó a una temperatura de -80°C. Se extrajo parte de esto, y se midió la concentración de SIL-Ap 1 -38 utilizando un kit de ensayo amiloide p humano (1 -38) (FL) (Laboratorios Immuno-Biological; Gunma, Japón).

4) Medición de péptidos Ap y péptidos similares a Ap en plasma

Para un total de 62 casos, se realizó IP-MS utilizando perlas inmovilizadoras de anticuerpos con el uso de SIL-Ap1 -38 como el péptido estándar interno.

La inmunoprecipitación se realizó de la siguiente manera.

En 250 pL de plasma humano, se mezclaron 250 pL de un tampón de unión (0.2% (p/v) n-dodecil-p-D-maltosido (DDM), 0.2% (p/v) n-nonil-p-D-tiomaltosido (NTM), GlcNAc 800 mM, Tris-HCl 100 mM, NaCl 300 mM, pH 7.4) que contiene SIL-Ap1 -38 10 pM. El precipitado contenido en la muestra de plasma se eliminó por centrifugación utilizando Ultrafree-MC, dispositivos de filtro centrífugo, DV 0.65 pm. Se lavaron 500 pL de Proteína G Plus Agarosa (suspensión al 50%; Pierce, Rockford, IL) una vez con 400 pL de H²O, y después se lavaron tres veces con 400 pL de un tampón de lavado (0.1% (p/v) DDM, 0.1 % (p/v) NTM, Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4). En la Proteína G Plus Agarosa resultante, la muestra de plasma obtenida previamente se mezcló y se incubó a una temperatura de 4°C durante 1 hora. Después de retirar la Proteína G Plus agarosa de la muestra de plasma, la muestra de plasma se mezcló con 150 pg de perlas inmovilizadoras de anticuerpos que se lavaron dos veces con un tampón OTG-glicina (1% de n-octilp-D-tioglucósido (OTG), Glicina 50 mM, pH 2.8) y tres veces con 100 pL de un tampón de lavado, y la mezcla se incubó a una temperatura de 4°C durante 1 hora para capturar péptidos similares a Ap y péptidos Ap. Posteriormente, las perlas se lavaron una vez con 500 pL de un tampón de lavado, cuatro veces con 100 pL de un tampón de lavado y dos veces con 20 pL de acetato de amonio 50 mM. Además, después de lavar una vez con 20 pL de H²O, los péptidos similares a Ap y péptidos Ap capturados en las perlas inmovilizadoras de anticuerpos se eluyeron con 2.5 pL de acetonitrilo al 70% que contenía ácido clorhídrico 5 mM. Cada 0.5 pL del eluato se vertió en 4 pocillos en una placa pFocusMAL™ de 900 pm. Después de mezclar 0.5 pL de una disolución matriz (0.5 mg/ml de CHCA, 0.2% (p/v) de MDPNA), la medición se realizó mediante MS TOF lineal.

Como valor de medición de péptidos similares a Ap y péptidos Ap en plasma, se utilizó un valor promedio entre las relaciones de intensidad máxima de cada uno de los péptidos similares a Ap y péptidos Ap con respecto al péptido estándar interno (SIL-Ap1 -38) obtenido en 4 pocillos medidos por TOF lineal. Para corregir una variación de señal en la intensidad máxima de MS, se proporcionaron los siguientes criterios. Se adquieren cuatro espectros de masas en una inmunoprecipitación única y, por lo tanto, se obtienen cuatro relaciones de intensidad máxima para un péptido. Una relación de intensidad máxima que está entre 0.7 y 1.3 veces la mediana de las cuatro relaciones de intensidad máxima en un péptido determinado se considera un valor atípico y no se utiliza en el procesamiento de datos para promediar. Si bien el número de datos de la relación de intensidad máxima utilizada para promediar un determinado péptido es cuatro como máximo, el número de datos disminuye cuando la intensidad máxima es menor que el límite de detección (S/N <3), o surge un valor atípico. Cuando el número de datos de la relación de intensidad máxima utilizada en el promedio es inferior a tres, la relación de intensidad en el pico se define como no detectable (N/D) en la inmunoprecipitación en ese momento.

La figura 2 es un gráfico de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP672-713 (Ap1-42) y el estándar interno SIL-Ap1 -38 en cada grupo para APP672-713 (Ap1-42). La Fig. 3(A), la Fig. 3(B), la Fig. 4(C) y la Fig. 4(D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (NC+, d Cl , eA, PiB+) versus el grupo NC- para APP672-713 (Ap1 -42)/SIL-Ap1 -38.

En cada gráfico de caja y bigotes, el rango indicado por la caja en cada grupo representa el rango de contribución de la relación de intensidad (rango del cuartil) de las muestras cuya concentración se clasifica entre el 25 y el 75% de todas las muestras, y las líneas horizontales que se muestran arriba y debajo de la caja, respectivamente, indican el valor máximo y el valor mínimo de las muestras dentro del rango desde el extremo superior y el extremo inferior de la caja hasta 1.5 veces el rango del cuartil, y la barra horizontal en la caja indica la mediana de la relación de intensidad.

Una diferencia estadística significativa entre cada uno de los otros grupos y el grupo NC- se sometió a ensayo mediante el uso de una prueba de Dunnett, y se determinó que existe una diferencia significativa cuando P<0.05. El límite de detección o inferior se estableció en 0. Como resultado, se detectaron nueve tipos de péptidos similares a Ap y péptidos Ap en el 60% o más casos, y entre estos, en APP672-713 (Ap1 -42), hubo una diferencia estadísticamente significativa en NC+, DCL y EA en comparación con NC- (Fig. 2). Para evaluar el rendimiento diagnóstico de APP672-713 (Ap1-42), se prepararon curvas ROC de grupos NC+, DCL, EA, PiB+ versus grupo NC-. Las áreas bajo las curvas ROC (a Uc ) fueron NC- vs NC+ = 0.789, NC- vs DCL = 0.746, NC- vs EA = 0.864, Nc - vs PiB+ = 0.808, y mostraron valores relativamente altos (Fig. 3(A), Fig. 3(B), Fig. 4(C) y Fig. 4(D)).

Como se muestra en la Fig. 2, para APP672-713 (Ap1-42), la relación de intensidad APP672-713 (Ap1-42)/SIL-Ap1-38 disminuyó en NC+, DCL y EA con una diferencia estadísticamente significativa en comparación con NC-. Como se muestra en la Fig. 3 (A), la Fig. 3 (B), la Fig. 4 (C) y la Fig. 4 (D), el AUC: NC- vs NC+= 0.789, NC- vs DCL = 0.746, NC- vs EA=0.864 reveló que APP672-713 (Ap1 -42) tenía una capacidad relativamente alta de discriminar entre NC- y NC+, NC- y DCL, y NC- y EA. El NC- vs PiB+ = 0.808 reveló que el rendimiento capaz de detectar al sujeto que es positivo para la acumulación cerebral de Ap es relativamente alto. En consecuencia, esto sugiere que APP672-713 (Ap1-42) es un marcador sanguíneo capaz de estimar un estado de acumulación de Ap cerebral, y por lo tanto tiene la posibilidad de ser utilizado para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.

(5) Análisis más específico

Para observar una diferencia más clara entre cada grupo (NC+, DCL, EA) y NC-, se realizó la siguiente investigación.

La Fig.5 es un diagrama de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP672-709 (Ap1 -38) y APP672-713 (Ap1 -42) en cada grupo. La Fig. 6 (A), la Fig. 6 (B), la Fig. 7 (C) y la Fig. 7 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL, EA, PiB+) versus el grupo NC-APP672-709 (Ap1 -38)/APP672-713 (Ap1 -42).

La Fig. 8 es un gráfico de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP674-711 (Ap3-40) y APP672-713 (Ap1-42) en cada grupo. La Fig. 9 (A), la Fig. 9 (B), la Fig. 10 (C) y la Fig. 10 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL, EA, PiB+) versus el grupo NC- para APP674-711 (Ap3-40)/APP672-713 (Ap1-42).

La Fig. 11 es un gráfico de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP672-710 (Ap1-39) y APP672-713 (Ap1-42) en cada grupo. La Fig. 12 (A), la Fig. 12 (B), la Fig. 13 (C) y la Fig. 13 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL, EA, PiB+) versus el grupo NC- para APP672-710 (Ap1-39)/APP672-713 (Ap1-42).

La Fig. 14 es un gráfico de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP672-711 (Ap1-40) y APP672-713 (Ap1-42) en cada grupo. La Fig. 15 (A), la Fig. 15 (B), la Fig. 16 (C) y la Fig. 16 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL, EA, PiB+) versus el grupo NC- para APP672-711 (Ap1-40)/APP672-713 (Ap1-42).

La Fig. 17 es un gráfico de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre OxAPP672-711 (OxAp1-40) y APP672-713 (Ap1-42) en cada grupo. La Fig. 18 (A), la Fig. 18 (B), la Fig. 19 (C) y la Fig. 19 (D) muestran cada una, una curva ROC de cada grupo (NC+, DCL, EA, PiB+) versus el grupo NC- para OxAPP672-711 (OxAp1-40)/APP672-713 (Ap1 -42).

La Fig. 20 es un gráfico de caja y bigotes que muestra la relación de intensidad entre APP669-711 y APP672-713 (Ap1-42) en cada grupo. La Fig. 21 (A), la Fig. 21 (B), la Fig. 22 (C) y la Fig. 22 (D) muestran cada una, una curva ^rO^cde cada grupo (NC+, DCL, EA, PiB+) versus el grupo NC- para APP669-711/APP672-713 (Ap1-42).

Entre los nueve tipos de péptidos similares a Ap y péptidos Ap detectados en el 60% o más de los casos, las intensidades máximas respectivas de ocho tipos distintos de APP672-713 (Ap1-42) se dividieron por la intensidad máxima de APP672-713 (Ap1-42), y los valores resultantes (relaciones) se analizaron comparativamente. Como resultado, en APP672-709 (Ap1-38)/APP672-713 (Ap1-42), APP674-711 (Ap3-40)/APP672-713 (Ap1-42), APP672-710 (Ap1 -39)/APP672-713 (Ap1-42), APP672-711 (Ap1-40)/APP672-713 (Ap1-42), OxAPP672-711 (OxAp1-40)/^aP^p672-713 (Ap1-42) y APP669-711/APP672-713 (Ap1-42), se observó un aumento estadísticamente significativo en NC+, DCL y EA en comparación con NC- (Fig. 5, 8, 11, 14, 17 y 20). Se demostró que APP669-711/APP672-713 (Ap1-42) en particular tiene una fuerte tendencia a aumentar a medida que avanza la enfermedad de Alzheimer (Fig. 20).

Para evaluar el rendimiento diagnóstico de APP672-709 (Ap1-38)/APP672-713 (Ap1-42), APP674-711 (Ap3-40)/APP672-713 (Ap1-42), APP672-710 (Ap1-39)/APP672-713 (Ap1-42), APP672-711 (Ap1-40)/APP672-713 (Ap1-42), OxAPP672-711 (OxAp1-40)/APP672-713 (Ap1-42) y APP669-711/APP672-713 (Ap1-42), se prepararon curvas ROC de grupos NC+, DCL, EA y PiB+ versus grupo NC-. Como resultado, en todos estos seis tipos de relaciones, se observó un alto AUC, revelando que la capacidad de discriminar entre NC- y NC+, NC- y DCL, y NC- y EA es alta, y el rendimiento capaz de detectar el sujeto que es positivo para la acumulación de Ap cerebral es alto [Fig. 6(A), Fig. 6(B), Fig. 7(C) y Fig. 7(D); Fig. 9(A), Fig. 9(B), Fig. 10(C) y Fig. 10(D); Fig. 12(A), Fig. 12(B), Fig. 13(C) y Fig. 13(D); Fig. 15(A), Fig. 15(B), Fig. 16(C) y Fig. 16(D); Fig. 18(A), Fig. 18(B), Fig. 19(C) y Fig. 19(D); Fig. 21(A), Fig. 21(B), Fig. 22(C) y Fig. 22(D)].

Con referencia a la Fig. 21 (A), la Fig. 21 (B), la Fig. 22(C) y la Fig. 22(D), el AUC del grupo NC+, DCL, EA versus NC-fue de 0.930 o más en la curva ROC de APP669-711/APP672-713 (Ap1-42) en particular, revelando que la capacidad de discriminar entre NC- y NC+, NC- y DCL, y NC- y EA es muy alta. n C- vs PiB+ = 0.969 también reveló que el rendimiento capaz de detectar al sujeto que es positivo para la acumulación cerebral de Ap es muy alto. Por consiguiente, esto sugiere que estos seis tipos de relaciones son marcadores sanguíneos capaces de estimar un estado de acumulación de Ap cerebral, y por lo tanto tienen la capacidad de utilizarse para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.

A continuación, para APP672-709 (Ap1-38)/APP672-713 (Ap1-42), APP674-711 (Ap3-40)/APP672-713 (Ap1-42), APP672-710 (Ap1 -39)/APP672-713 (Ap1-42), APP672-711 (Ap1-40)/APP672-713 (Ap1-42), OxAPP672-711 (OxAp1-40)/APP672-713 (Ap1-42) y APP669-711/APP672-713 (Ap 1 -42) en el que se observó un aumento estadísticamente significativo en NC+, DCL, EA en comparación con NC-, la discriminación de la enfermedad de Alzheimer se evaluó estableciendo un punto de corte. En cada curva ROC en las Figs. 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 18, 19, 21 y 22, "cada péptido/APP672-713 (Ap1-42)", que muestra el valor más alto de "sensibilidad-(1 -especificidad)", se estableció como un punto de corte. El punto de corte establecido, la especificidad en ese caso y la sensibilidad, el valor predictivo positivo (VPP), el valor predictivo negativo (VPN), la precisión de cada grupo (NC+, DCL, EA, PiB+) versus el grupo NC- se muestran en la tabla 4.

[Tabla 4] Evaluación del rendimiento diagnóstico

Sensibilidad Valor predictivo positivo, VPP ^{Valor predictivo negativo,}

_VPNPrecisión App672-709(api-38) / app672-713(ap1-42)

Punto de corte = 7.895, Especificidad = 0.682

NC- vs NC+ 1.000 0.611 1.000 0.788 NC- vs DCL 0.833 0.588 0.882 0.735 NC- vs EA 0.765 0.650 0.789 0.718 NC- vs pib+ 0.850 0.829 0.714 0.790 App674-711 (ap3-40) / app672-713(api-42)

Punto de corte = 1.181, Especificidad = 0.909

NC- vs NC+ 0.900 0.818 0.952 0.906 NC- vs DCL 0.833 0.833 0.909 0.882 NC- vs EA 1.000 0.895 1.000 0.949 NC- vs pib+ 0.923 0.947 0.870 0.918 App672-710(ap1-39) / app672-713(ap1-42)

Punto de corte = 1.932, Especificidad = 0.864

NC- vs NC+ 0.909 0.769 0.950 0.879 NC- vs DCL 0.833 0.769 0.905 0.853 NC- vs EA 0.941 0.842 0.950 0.897 NC- vs pib+ 0.900 0.923 0.826 0.887 Sensibilidad Valor predictivo positivo, VPP ^{Valor predictivo negativo,}

_VPNPrecisión App672-709(api-38) / app672-713(ap1-42)

App672-711(api-40) / app672-713(ap1-42)

Punto de corte = 111.7, Especificidad = 0.773

NC- vs NC+ 0.909 0.667 0.944 0.818 NC- vs DCL 0.750 0.643 0.850 0.765 NC- vs EA 0.647 0.688 0.739 0.718 NC- vs pib+ 0.750 0.857 0.630 0.758 Oxapp672-711(oxap1-40) / APP672-713(Ap1-42)

Punto de corte = 3.431, Especificidad = 0.864

NC- vs NC+ 0.818 0.750 0.905 0.848 NC- vs DCL 0.727 0.727 0.864 0.818 NC- vs EA 0.824 0.824 0.864 0.846 NC- vs pib+ 0.795 0.912 0.704 0.820 APP669-711 / APP672-713(Ap1-42)

Punto de corte = 0.914, Especificidad = 0.955

NC- vs NC+ 0.818 0.900 0.913 0.909 NC- vs DCL 0.917 0.917 0.955 0.941 NC- vs EA 1.000 0.944 1.000 0.974 NC- vs pib+ 0.925 0.974 0.875 0.935

En la tabla 4,

Punto de corte: punto de corte,

Valor predictivo positivo, VPP = (número de verdaderos positivos) / (número de verdaderos positivos número de falsos positivos),

Valor predictivo negativo, VPN = (número de verdaderos negativos) / (número de verdaderos negativos número de falsos negativos),

Precisión = (número de verdaderos positivos número de verdaderos negativos) / número de casos totales.

APP669-711/APP672-713 (Ap1-42) muestra valores numéricos muy altos en la especificidad, sensibilidad, valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo negativo (VPN) y precisión, revelando que tiene una alta capacidad de discriminar entre NC- y NC+, DCL, EA y PiB+, y en particular, es efectiva para la determinación de la positividad de la acumulación de Ap cerebral. La capacidad muy alta de discriminar entre NC- y NC+, DCL y EA también indica la aplicabilidad para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Con respecto a otros cinco tipos de relaciones, muestran valores altos en especificidad, sensibilidad, valor predictivo positivo (VPP), valor predictivo negativo (VPN) o precisión, revelando que tienen una alta capacidad de discriminar entre NC- y NC+, DCL, EA, y PiB+, y en particular, muestran la posibilidad efectiva para la determinación de la positividad de la acumulación cerebral de Ap. La alta capacidad de discriminar entre NC- y NC , DCL y EA también indica la aplicabilidad para ayudar al diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer.

(6) Análisis de correlación con el valor de medición PiB

La acumulación de Ap cerebral es un índice patológico importante para la enfermedad de Alzheimer, y se sabe que la acumulación excesiva de Ap comienza mucho antes de la exteriorización de la demencia. PiB es un agente radiactivo que se une específicamente con el agregado de Ap, y al medir la acumulación de PiB con el uso de PET, es posible formar una imagen de la acumulación de Ap cerebral. Para investigar si APP669-711/APP672-713 (Ap1-42) en plasma, que muestra la capacidad de determinar con alta precisión un sujeto que es positivo para la acumulación de Ap cerebral, refleja un estado de acumulación de Ap cerebral, se analizó la correlación entre APP669-711/APP672-713 (Ap1-42) y el valor medio de acumulación de PiB de la región cortical (mcSUVR: relación del valor de captación estándar cortical medio).

La figura 23 es un diagrama de dispersión para un total de 62 casos, en los que el eje horizontal representa el valor medio de acumulación de PiB (mcSUVR) y el eje vertical representa la relación APP669-711/APP672-713 (Ap1-42).

El valor medio de acumulación de PiB se midió cuantificando la acumulación de PiB de la corteza y determinando la

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método analítico para determinar un estado de acumulación de Ap cerebral, cuyo método comprende: una etapa de medición en la que una muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo obtenida de un sujeto de ensayo se somete a detección de un marcador que contiene:

APP672-713 (Ap1-42) (SEQ ID NO.: 6) y

APP672-711 (Ap1-40) (SEQ ID NO.: 4),

para obtener niveles de medida de:

una etapa de cálculo en la que se calcula una relación de nivel de APP672-711 (Ap1 -40) a nivel de APP672-713 (Ap1-42): APP672-711 (Ap1-40)/APP672-713 (Ap1 -42); y

una etapa de evaluación en la que se determina que una cantidad de acumulación de Ap cerebral del sujeto de ensayo es mayor que una cantidad de acumulación de Ap cerebral de una persona que tiene una función cognitiva normal, que es negativa para la acumulación de Ap cerebral (NC-), cuando la relación del sujeto de ensayo es más alta que un nivel estándar, que es una relación de la persona que tiene una función cognitiva normal, que es negativa para la acumulación de Ap cerebral (NC-).

2. El método analítico para determinar un estado de acumulación de Ap cerebral según la reivindicación 1, en donde la muestra obtenida a partir de un cuerpo vivo se selecciona del grupo que consiste en sangre, líquido cefalorraquídeo, orina, fluidos secretados por el cuerpo, heces, saliva y esputo.