JP7299566B2 - アミロイドベータに対するモノクローナル抗体、及びその抗体を用いるアミロイドベータ関連ペプチドの測定方法 - Google Patents

アミロイドベータに対するモノクローナル抗体、及びその抗体を用いるアミロイドベータ関連ペプチドの測定方法 Download PDF

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NITE BP-02998
本発明は、アミロイドベータに対するモノクローナル抗体、及びその抗体を用いるアミロイドベータ関連ペプチドの測定方法に関する。
アルツハイマー病（Alzheimer's disease；ＡＤ）は認知症の主な原因で、認知症全体の５０－６０％を占める。２００１年で２４００万人以上いた世界の認知症患者数は、２０３０年には８２００万人に達すると推定される。アルツハイマー病の発症にはＡβが深く関わっていると考えられている。アミロイドベータ（Ａβ）は、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成るアミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）がβセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受けることによって産生される（図１参照）。Ａβの線維化を伴う凝集により老人斑が出現すると、これを引き金にして神経細胞内にタウタンパク質が凝集蓄積し、神経機能不全や神経細胞死が引き起こされる。この結果として、極度の認知能力の低下が起こると考えられている。Ａβは主に４０mer（Ａβ１－４０）と４２mer（Ａβ１－４２）からなることが古くから知られており、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ移行することもわかっている。また、血液中へも移行する可能性も示唆されている。さらに近年では、Ａβ１－４０とＡβ１－４２とは長さの異なるＡβ様のペプチドがＣＳＦ中にも存在することが知られている。
Ａβについては、最近の研究で、本発明者らによって、Ａβ関連ペプチド（Ａβ様ペプチド）の一つであるＡＰＰ６６９－７１１とＡβ１－４２との比が血液バイオマーカーとして有望であることが報告されている（非特許文献１，特許文献１：国際公開ＷＯ２０１５／１７８３９８）。これらＡβ及びＡβ関連ペプチドは、免疫沈降法（ＩＰ）の後、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）を行うことにより定量されている。
さらに、本発明者らによって、特許文献２：国際公開ＷＯ２０１７／０４７５２９には、Ａβ及びＡβ関連ペプチド（Ａβ様ペプチド）についての３つの比、Ａβ１－３９／Ａβ１－４２、Ａβ１－４０／Ａβ１－４２、及びＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２からなる群より選ばれる２以上の比を数学的手法で組み合わせた数値が血液バイオマーカーとして有望であることが開示されている。これらＡβ及びＡβ関連ペプチドは、免疫沈降法（ＩＰ）の後、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）を行うことにより定量されている。
このように、本発明者らによって、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）を用いて、Ａβ関連ペプチドの一つであるＡＰＰ６６９－７１１とＡβ１－４２との比が血液バイオマーカー候補として有望であることが発見された。そして、その比ＡＰＰ６６９－７１１／Ａβ１－４２と、Ａβ１－４０／Ａβ１－４２の比とを組み合わせたcomposite biomarkerは脳内アミロイド蓄積を高精度に推定できることを日本とオーストラリアの多検体で示し、信頼性と汎用性のあるバイオマーカーであることが、本発明者らによって報告されている（非特許文献２）。
ＡＰＰ６６９－７１１を含むＡβ関連ペプチドなどのバイオマーカーの分析技術として、質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）は有用である。一方、その他の分析技術として、サンドイッチＥＬＩＳＡは、臨床検査法として広く一般的に使用されている測定法であり、かつ安価であることから、有用な分析技術となり得る。
現在、血漿中のＡβ１－４０やＡβ１－４２を分析可能なＥＬＩＳＡ Ｋｉｔは、各メーカー（和光純薬、ＩＢＬ等）から市販されている。
特許文献３：特開２００５－１７０９５１号公報では、アミロイドβのＮ端部（Ａβ１－１６）を認識するモノクローナル抗体BAN-52aおよびBAN-50aや、アミロイドβのＣ端部を特異的に認識するモノクローナル抗体BA-27a、BS-85およびBC-05aが開示されており、Ａβ１－４０やＡβ１－４２に特異的なサンドイッチＥＩＡが開示されている。
特許文献４：特開２０１４－２０８６７８号公報では、Ａβ１１－ｘを特異的に認識する抗体が開示され、Ａβ１１－４０に対するサンドイッチＥＬＩＳＡや、Ａβ１１－ｘに対するウェスタンブロットが開示されている。
これまで、血液バイオマーカー（Ａβ及びＡβ関連ペプチド）のための免疫沈降－質量分析（ImmunoPrecipitation－Mass spectrometry；ＩＰ－ＭＳ）では、抗Ａβ抗体クローン6E10を用いて免疫沈降（ＩＰ）が実施されている（非特許文献１，２，３，特許文献５，６，７，８）。クローン6E10はＡβに対するアフィニティが強く、古くから多くの研究者により免疫測定法やＩＰ－ＭＳで用いられいる（非特許文献４，５，６）。実際に他の市販クローンを用いたＩＰ－ＭＳのデータと比較しても、6E10は最も感度高くＡβ関連ペプチドを検出するというデータが得られており、優れた抗体クローンと言える。この6E10は、マウスの腹腔内にハイブリドーマ細胞を移植して、腹水中に抗体を産生させることで取得している。その後、産生された抗体をプロテインGで精製して、その精製品を磁性ビーズに結合させて抗体固定化ビーズを作成し、この抗体固定化ビーズをＩＰに用いている。
特許文献５：ＷＯ ２０１５／１１１４３０（特許文献６，米国公開ＵＳ ２０１６／０３３４４２０）には、ＡＰＰ切断型ペプチドの測定方法が開示されている。
特許文献７：特開２０１７－２０９８０号公報（特許文献８：米国公開ＵＳ ２０１７／００１６９１０）には、ポリペプチドの質量分析方法が開示されている。
国際公開ＷＯ２０１５／１７８３９８ 国際公開ＷＯ２０１７／０４７５２９ 特開２００５－１７０９５１号公報 特開２０１４－２０８６７８号公報 国際公開ＷＯ２０１５／１１１４３０ 米国公開ＵＳ ２０１６／０３３４４２０ 特開２０１７－２０９８０号公報 米国公開ＵＳ ２０１７／００１６９１０
Kaneko N, Nakamura A, Washimi Y, Kato T, Sakurai T, Arahata Y, Bundo M, Takeda A, Niida S, Ito K, Toba K, Tanaka K, Yanagisawa K. : Novel plasma biomarker surrogating cerebral amyloid deposition. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014; 90(9): 353-364. Nakamura A, Kaneko N, Villemagne VL, Kato T, Doecke J, Dore V, Fowler C, Li QX, Martins R, Rowe C, Tomita T, Matsuzaki K, Ishii K, Ishii K, Arahata Y, Iwamoto S, Ito K, Tanaka K, Masters CL, Yanagisawa K. : High performance plasma amyloid-β biomarkers for Alzheimer's disease. Nature. 2018; 554 (7691): 249-254. 6E10について：https://www.alzforum.org/antibodies/v-amyloid-1-16-or-app-6e10-0 Kim KS, Wen GY, Bancher C, Chen CM, Sapienza VJ, Hong H, Wisniewski HM. : Detection and quantitation of amyloid b-peptide with 2 monoclonal antibodies. Neurosci Res Commun. 1990; 7(2): 113-122. Ramakrishnan M, Kandimalla KK, Wengenack TM, Howell KG, Poduslo JF. : Surface plasmon resonance binding kinetics of Alzheimer's disease amyloid beta peptide-capturing and plaque-binding monoclonal antibodies. Biochemistry. 2009; 48(43): 10405-15. Wang R, Sweeney D, Gandy SE, Sisodia SS: The profile of soluble amyloid beta protein in cultured cell media. Detection and quantification of amyloid beta protein and variants by immunoprecipitation-mass spectrometry. J Biol Chem. 1996; 13; 271(50): 31894-902. 腹水法について：http://www.asas.or.jp/jsaae#old/news/3.html；（項目："Harvest Mouse And Technomouse －モノクローナル抗体産生をin vitroへ－"） 腹水法について：http://www.asas.or.jp/jsaae#old/news/3.html：（項目：抗体の形状 - 腹水 (Ascites Fluid)の欄）
6E10と同様に感度高くＡβ関連ペプチドを検出できる他の抗Ａβ抗体は知られていない。
また、6E10のように、モノクローナル抗体を腹水法で産生させることに関しては、一般的に動物倫理の観点から実施が難しくなってきている（非特許文献７）。また、腹水法では、宿主由来のＩｇＧが混入する可能性もある（非特許文献８）。
このような現状から、6E10と同様に感度高くＡβ関連ペプチドを検出できる、6E10に代わる新規な抗Ａβ抗体を産生させることが望まれる。また、6E10に代わる新規な抗Ａβ抗体を、腹水法のみならず培養上清からでも取得することも望まれる。
そこで、本発明の目的は、Ａβ関連ペプチドを検出できる新規な抗Ａβ抗体を提供することにある。また、本発明の目的は、腹水法のみならず培養上清からでも産生されるＡβ関連ペプチドを検出できる新規な抗Ａβ抗体を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、上記新規な抗Ａβ抗体を免疫化学的に用いて、生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法、すなわち、Ａβ関連ペプチドを検出できる新規な抗Ａβ抗体を用いた免疫沈降（ImmunoPrecipitation；ＩＰ）によるＡβ関連ペプチドの測定方法、免疫沈降－質量分析（ImmunoPrecipitation－Mass spectrometry；ＩＰ－ＭＳ）によるＡβ関連ペプチドの測定方法、及び連続的免疫沈降－質量分析（continuous ImmunoPrecipitation－Mass spectrometry；ｃＩＰ－ＭＳ）によるＡβ関連ペプチドの測定方法を提供することにある。
さらに、本発明の目的は、上記新規な抗Ａβ抗体を含む抗体固定化担体を含む、Ａβ関連ペプチドを測定するためのキットを提供することにある。
さらに、本発明の目的は、Ａβ３－８ペプチド（配列番号１）を認識できる新規な抗Ａβ抗体を提供することにある。
本発明者は、鋭意検討の結果、Ａβ関連ペプチドを認識する抗体を作成するために、ＫＬＨ結合合成ペプチド DAEFRHDSGYEVHHQKC（配列番号１０：この配列は、Ａβ１－１６のＣ末端 Lys（Ｋ）に Cys（Ｃ）を結合させたものに相当する）をマウスへ免疫し、細胞融合とＥＬＩＳＡスクリーニングにより、Ａβ関連ペプチドを認識する抗体を産生するハイブリドーマ６クローンを取得した。その６クローンの抗体を用いてＩＰ－ＭＳで評価を行い、ＩＰ－ＭＳで血漿中Ａβ関連ペプチドを検出できる新規な抗体１クローンを取得した。この新規な抗Ａβ抗体を構成成分として含む、血漿中Ａβ関連ペプチドを測定するＩＰ－ＭＳのためのキットを構成することもできる。
本発明は、以下の発明を含む。
本発明の第１の態様は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマにより産生される、Ａβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体である。
また、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマである。
本発明の第２の態様は、生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
担体と、前記担体に結合した、上記のモノクローナル抗体とを含む抗体固定化担体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記抗体固定化担体に結合させる反応工程と、
前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記抗体固定化担体を洗浄する洗浄工程と、
酸性溶液を用いて前記抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、精製溶液を得る溶出工程と、
前記精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを質量分析で検出する工程と、
を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法である。
本発明の第３の態様は、生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
担体と、前記担体に結合した、上記のモノクローナル抗体とを含む第１抗体固定化担体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記第１抗体固定化担体に結合させる第１反応工程と、
前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記第１抗体固定化担体を洗浄する第１洗浄工程と、
酸性溶液を用いて前記第１抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、第１溶出液を得る第１溶出工程と、
前記第１溶出液に中性緩衝液を加えることにより前記溶出液のｐＨを中性にして、ｐＨが中性とされた第１精製溶液を得る中性化工程と、
担体と、前記担体に結合した、上記の抗体とを含む第２抗体固定化担体に、前記第１精製溶液を接触させて、前記第１精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを前記第２抗体固定化担体に結合させる第２反応工程と、
前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記第２抗体固定化担体を洗浄する第２洗浄工程と、
酸性溶液を用いて前記第２抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、第２精製溶液を得る第２溶出工程と、
前記第２精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを質量分析で検出する工程と、
を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法である。
本発明の第４の態様は、生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
上記のモノクローナル抗体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記モノクローナル抗体に結合させる反応工程と、
前記モノクローナル抗体に結合した前記Ａβ関連ペプチドを、サンドイッチ型免疫測定法、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、及び免疫細胞染色からなる群から選ばれる方法により検出する工程と、
を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法である。
本発明の第５の態様は、Ａβ３－８ペプチドを認識するモノクローナル抗体である。
また、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマにより産生される、Ａβ３－８ペプチドを認識するモノクローナル抗体である。
本発明によれば、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマ細胞クローン16-10Eが提供され、ハイブリドーマ細胞クローン16-10Eから産生されるＡβ関連ペプチドを認識する新規な抗Ａβ抗体が提供される。
本発明によれば、上記新規な抗Ａβ抗体クローン16-10Eを免疫化学的に用いて、生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法、すなわち、Ａβ関連ペプチドを免疫沈降（ImmunoPrecipitation；ＩＰ）により測定する方法、Ａβ関連ペプチドを免疫沈降－質量分析（ImmunoPrecipitation－Mass spectrometry；ＩＰ－ＭＳ）により測定する方法、Ａβ関連ペプチドを連続的免疫沈降－質量分析（continuous ImmunoPrecipitation－Mass spectrometry；ｃＩＰ－ＭＳ）による測定する方法が提供される。
さらに、本発明によれば、抗Ａβ抗体クローン16-10Eを含む抗体固定化担体を含む、Ａβ関連ペプチドを測定するためのキットが提供される。
さらに、本発明によれば、Ａβ３－８ペプチド（配列番号１）を認識する新規なモノクローナル抗体が提供される。
図１は、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の分解による、Ａβペプチドの生成経路を模式的に示す図である。 実施例１において、ハイブリドーマ（クローン5-1D, 8-1F）の培養上清を硫安沈殿とProtein Gにより精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した結果を示す図である。 実施例１において、ハイブリドーマ（クローン12-8H, 14-12E）の培養上清を硫安沈殿とProtein Gにより精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した結果を示す図である。 実施例１において、ハイブリドーマ（クローン16-10E, 40-10G）の培養上清を硫安沈殿とProtein Gにより精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した結果を示す図である。 実施例２において、ポジティブコントロールの6E10、及び、取得した６クローンを用いてＩＰ－ＭＳを行った結果を示す。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度である。各ＩＰ－ＭＳスペクトルは、上から、抗Ａβ抗体クローン6E10，5-1D, 8-1F, 12-8H, 14-12E, 16-10E、及び40-10Gについての結果である。 実施例３－１において、第一ＩＰにおける16-10Eの抗体固定化ビーズ量を変えたときのＩＰ－ＭＳスペクトルである。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度である。各ＩＰ－ＭＳスペクトルは、上から、抗Ａβ抗体クローン6E10（コントロール，第一ＩＰビーズ量：２９１μｇ），16-10E（第一ＩＰビーズ量：１１６４、５８２、２９１、１４５μｇ）についての結果である。使用した抗体ビーズ量は図６中の表の通りで、ビーズの重量を表示している。 実施例３－２において、第二ＩＰにおける16-10Eの抗体固定化ビーズ量を変えたときのＩＰ－ＭＳスペクトルである。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度である。各ＩＰ－ＭＳスペクトルは、上から、抗Ａβ抗体クローン6E10（コントロール，第二ＩＰビーズ量：７３μｇ），16-10E（第二ＩＰビーズ量：１４５、７３、３６、１８μｇ）についての結果である。使用した抗体ビーズ量は図７中の表の通りで、ビーズの重量を表示している。 実施例４において、クローン16-10Eおよび6E10の抗体を用いたＡβ３－８ペプチドの直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、Ａβ３－８濃度（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
［Ａβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体］
本発明のＡβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（National Institute of Technology and Evaluation；ＮＩＴＥ）特許微生物寄託センター（NITE Patent Microorganisms Depositary；ＮＰＭＤ）に受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマ（クローン16-10E）により産生されるモノクローナル抗体である。
受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８
受託日：２０１９年 ６月２７日
受託機関：独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター
292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８ １２２号室
上記受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマ（クローン16-10E）は、Ａβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体の産生能を有している。
本発明のＡβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体を作成するために、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）結合合成ペプチド DAEFRHDSGYEVHHQKC（配列番号１０）をマウスへ免疫し、細胞融合とスクリーニングにより、Ａβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（クローン16-10E）を取得した。より詳細な抗体作成は、実施例で述べられる。実施例で述べられるように、本発明のＡβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体は、腹水法ではなく、融合細胞の培養上清からでも取得され得る。
上記の配列DAEFRHDSGYEVHHQKC（配列番号１０）は、Ａβ１－１６のＣ末端 Lys（Ｋ）に Cys（Ｃ）を結合させたものに相当する。
また、本発明のＡβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体は、Ａβ３－８ペプチドEFRHDS（配列番号１）自体をも認識するモノクローナル抗体である。
公知のクローン6E10は、Ａβ３－８をエピトープとするＡβ関連ペプチドを認識する抗体として用いられているが、実施例の欄で示されるようにＡβ３－８ペプチドそれ自体とは反応性が無い。このことから、本発明の抗Ａβ抗体クローン16-10Eとクローン6E10とでは、Ａβ３－８ペプチドEFRHDS（配列番号１）に対する反応性が異なっており、本発明のＡβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体は、新規な抗体である。
［Ａβ関連ペプチド］
Ａβ関連ペプチドは、全長７７０残基のアミノ酸から成るアミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）がβセクレターゼ、及びγセクレターゼなどのプロテアーゼによってタンパク質分解を受けることによって産生され、種々の分子種が含まれ得る（図１参照）。前述のように、本発明の抗Ａβ抗体クローン16-10Eは、Ａβ３－８ペプチドEFRHDS（配列番号１）を認識するので、本発明において、前記抗Ａβ抗体が認識するＡβ関連ペプチドとは、好ましくは、少なくともＡβの第３－８番のペプチド配列EFRHDS（配列番号１）を含むものを意図する。
前記Ａβ関連ペプチドとして、限定されることなく、次のペプチドを例示することができる。ＡＰＰ６６３－７１１，ＡＰＰ６６４－７１１，ＡＰＰ６６６－７０９，ＡＰＰ６６６－７１１，ＡＰＰ６６９－７０９（配列番号７），ＡＰＰ６６９－７１０（配列番号８），ＡＰＰ６６９－７１１（配列番号９），ＡＰＰ６６９－７１３，ＡＰＰ６７１－７１１，ＡＰＰ６７２－７０８（配列番号２），ＡＰＰ６７２－７０９（配列番号３），ＡＰＰ６７２－７１０（配列番号４），ＡＰＰ６７２－７１１（配列番号５），ＡＰＰ６７２－７１３（配列番号６），ＡＰＰ６７４－７１１，ＡＰＰ６７４－６７９（配列番号１）。
ＡＰＰ６７４－６７９（Ａβ３－８）（配列番号１）
EFRHDS
ＡＰＰ６７２－７０８（Ａβ１－３７）（配列番号２）
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVG
ＡＰＰ６７２－７０９（Ａβ１－３８）（配列番号３）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
ＡＰＰ６７２－７１０（Ａβ１－３９）（配列番号４）
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV
ＡＰＰ６７２－７１１（Ａβ１－４０）（配列番号５）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６７２－７１３（Ａβ１－４２）（配列番号６）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
ＡＰＰ６６９－７０９（Ａβ（－３－３８））（配列番号７）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
ＡＰＰ６６９－７１０（Ａβ（－３－３９））（配列番号８）
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV
ＡＰＰ６６９－７１１（Ａβ（－３－４０））（配列番号９）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
上記のように、ＡＰＰ６７４－６７９とＡβ３－８とは同じペプチドを表す。同様に、ＡＰＰ６７２－７０９とＡβ１－３８とは同じペプチドを表し、ＡＰＰ６７２－７１１とＡβ１－４０とは同じペプチドを表し、ＡＰＰ６７２－７１３とＡβ１－４２とは同じペプチドを表し、ＡＰＰ６６９－７０９とＡβ（－３－３８）とは同じペプチドを表し、ＡＰＰ６６９－７１０とＡβ（－３－３９）とは同じペプチドを表し、ＡＰＰ６６９－７１１とＡβ（－３－４０）とは同じペプチドを表す。その他についても同様である。
［抗体固定化担体］
本発明の抗体固定化担体は、担体と、前記担体に結合した上記本発明のＡβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体とを含んでいる。
用いる担体の素材としては、公知のものを使用することができ、例えば、アガロース、セファロース、デキストラン、シリカゲル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸系ポリマー、フッ素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、及び磁性体からなる群から選ばれてよい。
担体の形状は、平面状、球状及びその他の形状を問わない。例えば、担体は、目的物質の分離及び／又は濃縮に用いられるチップ、ビーズ又はマイクロデバイス内の流路壁を構成するものであってよい。担体表面には、結合性官能基を有する。
前記抗体は、スペーサを介して前記担体に結合していてもよい。スペーサとしては、公知のものを使用することができ、例えば高分子重合体が挙げられる。高分子重合体の例としては、アルキレン基、及びオキシアルキレン基が挙げられる。
また例えば、スペーサは、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリサッカライド、生分解性高分子、及び脂質重合体からなる群から選ばれる有機高分子重合体であってよい。ポリオキシアルキル化ポリオール及びポリビニルアルキルエーテルにおけるアルキル基は、例えば炭素数１～６、好ましくは１～３でありうる。ポリサッカライドの例としては、デキストラン、ムコ多糖、及びキチン類が挙げられる。ムコ多糖の例としては、ヒアルロン酸が挙げられる。生分解性高分子の例としては、ＰＬＡ（ポリ乳酸；poly(lactic acid)）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸－グリコール酸；poly(lactic-glycolic acid)）が挙げられる。
スペーサは、上述の例示の１種を含むものであってもよいし、上述の例示から任意に選択される２種以上を含むものであってもよい。また、スペーサは直鎖であってもよいし、分岐していてもよい。
本発明において用いる抗体固定化担体は、担体、及び抗体、及び用いる場合にはスペーサ物質のそれぞれの要素が有する、共有結合性官能基、イオン結合性官能基及び水素結合性官能基などの結合性官能基を介し、各々を、官能基の種類に応じて公知の方法により結合させることで調製することができる。本発明の実施の態様において、連続的免疫沈降－質量分析（ｃＩＰ－ＭＳ）によるＡβ関連ペプチドの測定を行う場合には、第１抗体固定化担体及び第２抗体固定化担体が同じものであってもよいし、異なっていてもよい。
［Ａβ関連ペプチドの測定方法］
（免疫沈降－質量分析（ImmunoPrecipitation－Mass spectrometry；ＩＰ－ＭＳ）によるＡβ関連ペプチドの測定方法）
本発明の第２の態様は、生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
担体と、前記担体に結合した、上記のモノクローナル抗体とを含む抗体固定化担体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記抗体固定化担体に結合させる反応工程と、
前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記抗体固定化担体を洗浄する洗浄工程と、
酸性溶液を用いて前記抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、精製溶液を得る溶出工程と、
前記精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを質量分析で検出する工程と、
を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法である。
（連続的免疫沈降－質量分析（continuous ImmunoPrecipitation－Mass spectrometry；ｃＩＰ－ＭＳ）によるＡβ関連ペプチドの測定方法）
また、本発明の第３の態様は、生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
担体と、前記担体に結合した、上記のモノクローナル抗体とを含む第１抗体固定化担体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記第１抗体固定化担体に結合させる第１反応工程と、
前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記第１抗体固定化担体を洗浄する第１洗浄工程と、
酸性溶液を用いて前記第１抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、第１溶出液を得る第１溶出工程と、
前記第１溶出液に中性緩衝液を加えることにより前記溶出液のｐＨを中性にして、ｐＨが中性とされた第１精製溶液を得る中性化工程と、
担体と、前記担体に結合した、上記の抗体とを含む第２抗体固定化担体に、前記第１精製溶液を接触させて、前記第１精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを前記第２抗体固定化担体に結合させる第２反応工程と、
前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記第２抗体固定化担体を洗浄する第２洗浄工程と、
酸性溶液を用いて前記第２抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、第２精製溶液を得る第２溶出工程と、
前記第２精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを質量分析で検出する工程と、
を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法である。
このように、連続的免疫沈降－質量分析（ｃＩＰ－ＭＳ）においては、中性化工程を経て、その後、結合反応工程と、洗浄工程と、解離及び溶出工程とが繰り返される。以下に、連続的免疫沈降－質量分析（ｃＩＰ－ＭＳ）について詳述するが、その説明には、免疫沈降－質量分析（ＩＰ－ＭＳ）についての説明も含まれている。すなわち、免疫沈降－質量分析（ＩＰ－ＭＳ）の場合には、第１溶出工程の第１溶出液が質量分析に付されるとよい。
（第１結合反応工程）
まず、前記第１抗体固定化担体に、生体試料の含有液（通常は、生体試料と結合溶液とを含む）を接触させて、前記第１抗体固定化担体と前記生体試料中に含まれる標的Ａβ関連ペプチドとを結合させる。
生体試料には、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、体分泌液、唾液、及び痰などの体液； 及び糞便が含まれる。血液試料には、全血、血漿及び血清などが含まれる。血液試料は、個体から採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から血液試料の調製を行う場合に行われる処理としては特に限定されず、臨床学的に許容されるいかなる処理が行われてよい。例えば遠心分離などが行われうる。また、結合工程に供される血液試料は、その調製工程の中途段階又は調製工程の後段階において、適宜冷凍など低温下での保存が行われたものであってよい。なお、本発明において生体試料は、由来元の個体に戻すことなく破棄される。血液試料を対象試料とすることは、試料採取が固体や脳脊髄液である場合に対して低侵襲であること、また、一般の健康診断や人間ドック等における種々の疾患のスクリーニングのための対象試料であることからも好ましい。
結合溶液としては、通常の免疫沈降法（ＩＰ）で用いられる結合溶液を用いることができる。結合溶液組成は、非特異的吸着を抑制するために界面活性剤を含んでいることが好ましい。前記界面活性剤としては、抗体等のタンパク質の変性を起こしにくく、洗浄工程で容易に除去でき、たとえ後段の質量分析において混入していたとしても標的Ａβ関連ペプチドのシグナルを抑制しない中性の界面活性剤が好ましい。具体的には、マルトースを親水性部分に持つ中性界面活性剤、トレハロースを親水性部分に持つ中性界面活性剤、及びグルコースを親水性部分に持つ中性界面活性剤等が挙げられる。これらの中性界面活性剤の疎水性部については、特に限定しないが、炭素数が７～１４程度のアルキル基が好ましい。結合溶液は、これらから選ばれる界面活性剤を含む中性緩衝液が好ましい。
マルトースを親水性部分に持つ中性界面活性剤としては、
n-Decyl-β-D-maltoside (DM) [cmc: 0.087%]
n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM) [cmc: 0.009%]
n-Nonyl-β-D-thiomaltoside (NTM) [cmc: 0.116%]
等が挙げられる。ＣＭＣは、臨界ミセル濃度である。
トレハロースを親水性部分に持つ中性界面活性剤としては、
α-D-Glucopyranosyl-α-Dglucopyranoside monooctanoate (Trehalose C8) [cmc: 0.262%]
α-D-Glucopyranosyl-α-Dglucopyranoside monododecanoate (Trehalose C12) [cmc: 0.008%]
α-D-Glucopyranosyl-α-Dglucopyranoside monomyristate (Trehalose C14) [cmc: 0.0007%]
等が挙げられる。
グルコースを親水性部分に持つ中性界面活性剤としては、
n-Octyl-β-D-thioglucoside (OTG) [cmc: 0.278%]
n-Octyl-β-D-glucoside (OG) [cmc: 0.731%]
n-Heptyl-β -D-thioglucoside (HTG) [cmc: 0.883%]
等が挙げられる。
上記の中性界面活性剤を１種又は複数を組み合わせて用いることができる。用いる担体や、抗体、及び標的ポリペプチドに合わせて適宜、用いる中性界面活性剤が選ばれる。
結合溶液としての中性緩衝液における界面活性剤濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００１～１０％（ｖ／ｖ）であり、０．０１～５％（ｖ／ｖ）が好ましく、０．０５～２％（ｖ／ｖ）がより好ましい。このような界面活性剤濃度とすることにより、抗体と、結合されるべき対象ポリペプチドとの結合反応が良好に得られやすい。中性緩衝液の中性とは、ｐＨ６．５～８．５程度を意味する。また、緩衝液組成としては、Tris緩衝液、リン酸緩衝液、HEPES緩衝液などが挙げられる。
さらに、第１結合工程前に血液試料の前処理を実施しても良い。この前処理は、例えば、血液試料に含まれるIgGやIgMなどの抗体の除去が行われる。血液試料中には、結合工程で用いる担体に固定化された抗体に結合する試料由来抗体が含まれている。よって、この試料由来抗体を結合工程前に除去することにより、当該試料由来抗体が結合工程で用いる抗体に結合することを防ぐことができる。試料由来の抗体の除去は、血液試料を、Protein G, Protein A, Protein L, 抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgA抗体、抗IgY抗体、抗IgD抗体、抗IgE抗体などが結合している担体に接触させることにより行うことができる。本発明においては、２回連続でアフィニティ精製を行う場合には、第１結合工程前に血液試料の前処理を実施しなくても良い。
（第１洗浄工程）
次に、第１結合工程により得られた前記第１抗体固定化担体と前記標的Ａβ関連ペプチドとの結合体を、洗浄溶液を用いて洗浄する。
洗浄工程において、まず、前記洗浄溶液として界面活性剤を含む中性緩衝液を用いて洗浄を行い、その後、前記洗浄溶液として界面活性剤を含まない中性緩衝液を用いて洗浄を行うことが好ましい。
前記洗浄溶液としての界面活性剤を含む中性緩衝液は、上述した結合溶液としての界面活性剤を含む中性緩衝液と同様のものを用いることができる。まず、前記界面活性剤を含む中性緩衝液を用いて洗浄を行うことにより、不要成分、例えば疎水性の高い血中タンパク質、脂質、糖脂質などの通常の除去を行う。中性緩衝液の中性は、体液に近いｐＨが好ましく、例えば、ｐＨ６．５～８．５が好ましく、ｐＨ７．０～８．０がより好ましい。このような中性緩衝液での洗浄を行うことにより、この洗浄工程での抗原抗体結合体における標的Ａβ関連ペプチドの担体からの解離を防止できる。
その後、界面活性剤を含まない中性緩衝液を用いて洗浄を行うことが好ましい。界面活性剤を含まない中性緩衝液を用いて洗浄を行うことにより、以降の操作における泡立ち等の不都合を防ぎやすい。
洗浄工程においては、担体表面を洗浄溶液の０．０１～５００ＭＰａ、好ましくは０．０５～３００ＭＰａ、さらに好ましくは０．１～２００ＭＰａの流体圧に供することによって、不要な成分を除去することができる。上記範囲を下回ると、所望の洗浄効果が得られない傾向にある。上記範囲を上回ると、抗体と結合された対象ポリペプチドとの結合が切断されるおそれがある。洗浄条件をより高圧で行うことにより、抗体固定化担体への非特異吸着物質の除去効率を向上させ、その結果、結合された対象ポリペプチドの分析の感度向上（Ｓ／Ｎ比の向上）に資することとなる。
なお、洗浄の具体的手法は特に限定されるものではない。例えば球状担体の場合は、洗浄液内で撹拌することによって洗浄することができる。平面担体の場合は、洗浄ノズルから高圧洗浄液を噴射することによって洗浄することができる。より具体的には、平面担体上における特定の領域を高圧洗浄するために、当該領域の面積に応じた内径を有する洗浄ノズルを用いることができる。このノズルは、例えば二重管で構成され、内管は担体表面へ洗浄液を噴射する注水専用として、外管は担体表面へ噴射した洗浄液を吸引する排水専用として機能させることができる。
（第１解離溶出工程）
次に、洗浄後の前記第１抗体固定化担体と前記標的Ａβ関連ペプチドとの結合体について、前記抗体固定化担体から前記標的Ａβ関連ペプチドを、酸性水溶液を溶出液として用いて解離させる。
抗原が結合している抗体（抗原抗体複合体）から抗原を解離させるために、酸性水溶液を抗原抗体複合体に接触させる。本発明においては、酸性水溶液を用いて、前記標的Ａβ関連ペプチドが結合している抗体固定化担体から前記標的Ａβ関連ペプチドを解離させ、溶出させる。
酸性水溶液は、界面活性剤を含むことが好ましい。酸性水溶液中に界面活性剤を含んでいると、前記担体から前記標的Ａβ関連ペプチドの解離が効率よく起こる。その結果、結合された標的Ａβ関連ペプチドの回収率の向上に資することとなる。上記界面活性剤の濃度がＣＭＣ濃度未満であると、界面活性剤の効果が得られず、前記標的Ａβ関連ペプチドの解離の効率はよくない。例えば、５０ｍＭ Glycine緩衝液（ｐＨ２．８）に０．１％ ＤＤＭを含ませた水溶液を用いると、より高い溶出効率が得られやすい。酸性水溶液の酸性とは、ｐＨ１～３．５程度を意味する。
また、酸性水溶液中に界面活性剤を含めることにより、溶出された標的Ａβ関連ペプチドがチューブや試験管、マイクロプレート等へ吸着することを防ぎ、その吸着による標的Ａβ関連ペプチドのロスを抑える効果がある。
通常、解離に用いた界面活性剤を含む酸性水溶液を溶出液としても用いて、担体から解離された前記標的Ａβ関連ペプチドを溶出させることができる。あるいは、当業者が溶出液を適宜選択するとよい。連続的免疫沈降－質量分析（ｃＩＰ－ＭＳ）の場合、第１解離溶出工程において、前記酸性水溶液は、次の第２反応工程の反応効率を低下させないために、有機溶媒を含まないことが好ましい。免疫沈降－質量分析（ＩＰ－ＭＳ）の場合には、第１溶出液は有機溶媒を含むことが好ましい。
解離工程においては、担体表面を溶出液に接触させることにより前記標的Ａβ関連ペプチドを解離させて、溶出させることができる。必要に応じて、溶出液内で担体を攪拌してもよい。このようにして、第１溶出液を得る。免疫沈降－質量分析（ＩＰ－ＭＳ）の場合には、第１溶出液が質量分析に付されるとよい。
（中性化工程）
得られた第１溶出液に中性緩衝液を加えることにより前記溶出液のｐＨを中性にして、ｐＨが中性とされた第１精製溶液を得る。中性化工程において、前記中性緩衝液は、上述した結合溶液としての中性緩衝液と同様のものを用いることができる。前記中性緩衝液は、界面活性剤を含んでいることが好ましい。中性緩衝液の中性は、体液に近いｐＨが好ましく、例えば、ｐＨ６．５～８．５が好ましく、ｐＨ７．０～８．０がより好ましい。第１精製溶液のｐＨとしては、例えば、ｐＨ６．５～８．５が好ましく、ｐＨ７．０～８．０がより好ましい。このようなｐＨ範囲とすることにより、次の第２反応工程の高い反応効率が得られやすい。また、中性化工程において、前記中性緩衝液は、次の第２反応工程の反応効率を低下させないために、有機溶媒を含まないことが好ましい。
（第２結合反応工程）
次に、前記第２抗体固定化担体に、前記第１精製溶液を接触させて、前記第２抗体固定化担体と前記第１精製溶液に含まれる標的Ａβ関連ペプチドとを結合させる。
前記第１精製溶液は、上記の操作により、既に結合溶液を含んでいる。しかしながら、この段階で、第１結合反応工程と同様な、通常の免疫沈降法（ＩＰ）で用いられる結合溶液をさらに追加してもよい。
前記第２反応工程に付される前記第１精製溶液の液量が、前記第１反応工程に付される前記生体試料の含有液（前記生体試料及び結合溶液を含む生体試料液）の液量よりも小さいことが好ましい。本発明の形態において、前記第２反応工程に付される前記第１精製溶液の液量が、前記第１反応工程に付された前記生体試料液の液量（すなわち、前記生体試料及び結合溶液の合計の液量）よりも小さいと、第２反応工程における標的Ａβ関連ペプチドに対する抗体との結合効率が高くなり、標的Ａβ関連ペプチドのロスをより少なくすることができる。すなわち、多くの場合、アフィニティ精製において標的となるＡβ関連ペプチドに対する抗体との結合率は１００％ではないため、アフィニティ精製を行う度に大なり小なり標的Ａβ関連ペプチドのロスが生じる。１回だけアフィニティ精製をするよりも、２回連続でアフィニティ精製する方が夾雑物質は減少するが、同時に標的Ａβ関連ペプチドも減少してしまう。このため、２回目の標的Ａβ関連ペプチドに対する抗体との結合効率を高くして標的Ａβ関連ペプチドのロスを少なくするために、２回目のアフィニティ精製では反応溶液量（すなわち、第１精製溶液の液量）を小さくした方が好ましい。
前記第１反応工程に付された前記生体試料液の液量（すなわち、前記生体試料及び結合溶液の合計の液量）に比べて、前記第２反応工程に付される前記第１精製溶液の液量を、少なくすることが好ましい。前記第１反応工程に付された前記生体試料液の液量を基準として、前記第２反応工程に付される前記第１精製溶液の液量を、体積で表して、例えば、０．１～５０％程度、好ましくは０．５～２０％程度、さらに好ましくは１～１０％程度とするとよい。このことは、第１溶出工程に用いる酸性溶液の量を少なくして第１溶出液の量を少なくする、中性化工程に用いる中性緩衝液の量を少なくする等して、第１精製溶液の液量を少なくすることによって行い得る。
また、前記第２反応工程における前記第２抗体固定化担体の量が、前記第１反応工程における前記第１抗体固定化担体の量よりも少ないことが好ましい。本発明の形態において、前記第２反応工程における前記第２抗体固定化担体の量が、前記第１反応工程における前記第１抗体固定化担体の量よりも少ないと、質量分析で計測する時の試料溶液となる溶出液（第２精製溶液）の液量を小さくでき、結果として、標的Ａβ関連ペプチドがより濃縮されて高感度に検出できる。すなわち、質量分析で計測する時の試料溶液量は小さい方が標的Ａβ関連ペプチドが濃縮されて高感度に検出できる。質量分析で計測する時の試料溶液となる溶出液量を小さくするためには、２回目のアフィニティ精製で使用する抗体固定化担体量は少なくした方が好ましい。また、非特異的吸着物質や抗体固定化担体由来の夾雑物質の混入を低減させることにも効果がある。
前記第１反応工程における前記第１抗体固定化担体の量を基準として、前記第２反応工程における前記第２抗体固定化担体の量を、担体の表面積で表して、例えば、１～５０％程度、好ましくは５～２５％程度とするとよい。第１抗体固定化担体と、前記第２抗体固定化担体とが同じものであれば、担体の表面積は、担体の重量、担体の個数と同じことを意味する。
（第２洗浄工程）
第２結合工程により得られた前記第２抗体固定化担体と前記標的Ａβ関連ペプチドとの結合体を、洗浄溶液を用いて洗浄する。
洗浄工程において、まず、前記洗浄溶液として界面活性剤を含む中性緩衝液を用いて洗浄を行い、その後、前記洗浄溶液として界面活性剤を含まない中性緩衝液を用いて洗浄を行うことが好ましい。
前記洗浄溶液としての界面活性剤を含む中性緩衝液は、上述した結合溶液としての界面活性剤を含む中性緩衝液と同様のものを用いることができる。まず、前記界面活性剤を含む中性緩衝液を用いて洗浄を行うことにより、不要成分、例えば疎水性の高い血中タンパク質、脂質、糖脂質などの通常の除去を行う。中性緩衝液の中性は、体液に近いｐＨが好ましく、例えば、ｐＨ６．５～８．５が好ましく、ｐＨ７．０～８．０がより好ましい。このような中性緩衝液での洗浄を行うことにより、この洗浄工程での抗原抗体結合体における標的Ａβ関連ペプチドの担体からの解離を防止できる。
その後、界面活性剤を含まない中性緩衝液を用いて洗浄を行うことが好ましい。界面活性剤を含まない中性緩衝液を用いて洗浄を行うことにより、以降の操作における泡立ち等の不都合を防ぎやすい。さらに、検出工程において界面活性剤の混入によるイオン化抑制（イオンサプレッション）を低減させることもできる。
洗浄工程においては、担体表面を洗浄溶液の０．０１～５００ＭＰａ、好ましくは０．０５～３００ＭＰａ、さらに好ましくは０．１～２００ＭＰａの流体圧に供することによって、不要な成分を除去することができる。上記範囲を下回ると、所望の洗浄効果が得られない傾向にある。上記範囲を上回ると、抗体と結合された対象Ａβ関連ペプチドとの結合が切断されるおそれがある。洗浄条件をより高圧で行うことにより、抗体固定化担体への非特異吸着物質の除去効率を向上させ、その結果、結合された対象Ａβ関連ペプチドの分析の感度向上（Ｓ／Ｎ比の向上）に資することとなる。
なお、洗浄の具体的手法は、第１洗浄工程において説明したものと同様であり、特に限定されるものではない。
（第２解離溶出工程）
次に、洗浄後の前記第２抗体固定化担体と前記標的Ａβ関連ペプチドとの結合体について、前記抗体固定化担体から前記標的Ａβ関連ペプチドを、酸性水溶液を溶出液として用いて解離させる。
抗原が結合している抗体（抗原抗体複合体）から抗原を解離させるために、酸性水溶液を抗原抗体複合体に接触させる。本発明の形態においては、酸性水溶液を用いて、前記標的ポリペプチドが結合している抗体固定化担体から前記標的ポリペプチドを解離させ、溶出させる。酸性水溶液は、有機溶媒を含むことが好ましい。酸性水溶液中に有機溶媒を含んでいると、前記担体から前記標的Ａβ関連ペプチドの解離が効率よく起こる。その結果、結合された標的Ａβ関連ペプチドの回収率の向上に資することとなる。この際の有機溶媒としては、水と任意の割合で混和する有機溶媒、例えば、アセトニトリル、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、クロロホルム等が挙げられる。また、酸性水溶液中の有機溶媒の濃度は、特に限定されないが、例えば、１０～９０％（ｖ／ｖ）程度とするとよく、２０～８０％（ｖ／ｖ）程度とすることが好ましく、２５～７０％（ｖ／ｖ）程度とすることがより好ましい。上記範囲の酸性水溶液中の有機溶媒の濃度とすると、前記担体から前記標的Ａβ関連ペプチドの解離が効率よく起こる。その結果、結合された標的Ａβ関連ペプチドの分析の感度向上（Ｓ／Ｎ比の向上）に資することとなる。上記有機溶媒の濃度が１０％（ｖ／ｖ）未満であると、有機溶媒の効果が得られず、前記標的ポリペプチドの解離の効率はよくない。例えば、５ｍＭ酢酸に７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを含んだ水溶液を用いることと、より高い溶出効率が得られやすい。酸性水溶液の酸性とは、ｐＨ１～３．５程度を意味する。
通常、解離に用いた有機溶媒を含む酸性水溶液を溶出液としても用いて、担体から解離された前記標的Ａβ関連ペプチドを溶出させることができる。あるいは、当業者が溶出液を適宜選択するとよい。
解離工程においては、担体表面を溶出液に接触させることにより前記標的Ａβ関連ペプチドを解離させて、溶出させることができる。必要に応じて、溶出液内で担体を攪拌してもよい。このようにして、第２精製溶液を得る。
（検出工程）
次に、得られた第２精製溶液に含まれる標的Ａβ関連ペプチドを、質量分析によって検出する。質量分析法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析法などによる質量分析法であることが好ましい。例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置、ＥＳＩ－ＱｑＱ（エレクトロスプレーイオン化－三連四重極）型質量分析装置、ＥＳＩ－Ｑｑ－ＴＯＦ（エレクトロスプレーイオン化－タンデム四重極－飛行時間）型質量分析装置、ＥＳＩ－ＦＴＩＣＲ（エレクトロスプレーイオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置等を用いることができる。
マトリックス及びマトリックス溶媒は、分析対象（Ａβ関連ペプチド）に応じて当業者が適宜決定することができる。
マトリックスとしては、例えば、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５-ジヒドロキシ安息香酸（２，５－ＤＨＢ）、シナピン酸、３－アミノキノリン（３－ＡＱ）等を用いることができる。
マトリックス溶媒としては、例えば、アセトニトリル（ＡＣＮ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メタノール、エタノール及び水からなる群から選択して用いることができる。より具体的には、ＡＣＮ－ＴＦＡ水溶液、ＡＣＮ水溶液、メタノール－ＴＦＡ水溶液、メタノール水溶液、エタノール－ＴＦＡ水溶液、エタノール溶液などを用いることができる。ＡＣＮ－ＴＦＡ水溶液におけるＡＣＮの濃度は例えば１０～９０体積％であり、ＴＦＡの濃度は例えば０．０５～１体積％、好ましくは０．０５～０．１体積％でありうる。
マトリックス濃度は、例えば０．１～５０ｍｇ/ｍＬ、好ましくは０．１～２０ｍｇ/ｍＬ、あるいは０．３～２０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは０．５～１０ｍｇ/ｍＬでありうる。
ＭＡＬＤＩ質量分析による検出系を用いる場合、マトリックス添加剤（コマトリックス）が併用されることが好ましい。マトリックス添加剤は、分析対象（ポリペプチド）及び／又はマトリックスに応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、マトリックス添加剤として、ホスホン酸基含有化合物を用いることができる。具体的には、ホスホン酸基を１個含む化合物として、ホスホン酸（Phosphonic acid）、メチルホスホン酸（Methylphosphonic acid）、フェニルホスホン酸（Phenylphosphonic acid）、及び1-ナフチルメチルホスホン酸（1-Naphthylmethylphosphonic acid）等が挙げられる。また、ホスホン酸基を２個以上含む化合物として、メチレンジホスホン酸（Methylenediphosphonic acid；ＭＤＰＮＡ）、エチレンジホスホン酸（Ethylenediphosphonic acid）、エタン-1-ヒドロキシ-1,1-ジホスホン酸（Ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid）、ニトリロトリホスホン酸（Nitrilotriphosphonic acid）、及びエチレンジアミノテトラホスホン酸（Ethylenediaminetetraphosphonic acid）等が挙げられる。上記のホスホン酸基含有化合物の中でも、１分子中に２以上、好ましくは２～４個のホスホン酸基を有する化合物が好ましい。
ホスホン酸基含有化合物の使用は、例えば抗体固定化担体表面に残存した洗浄溶液の金属イオンが解離工程後の溶出液に混入した場合に有用である。この金属イオンは質量分析においてバックグラウンドへ悪影響を与える。ホスホン酸基含有化合物の使用には、このような悪影響を抑制する効果がある。
なお、上記マトリックス添加剤以外にも、より一般的な添加剤、例えばアンモニウム塩及び有機塩基からなる群から選ばれる物質が使用されても良い。
マトリックス添加剤は、水中又はマトリックス溶媒中０．１～１０ｗ/ｖ％、好ましくは０．２～４ｗ/ｖ％の溶液に調製することができる。マトリックス添加剤溶液及びマトリックス溶液は、例えば、１：１００～１００：１、好ましくは１：１０～１０：１の体積比で混合することができる。
（免疫測定によるＡβ関連ペプチドの測定方法）
さらに、本発明の第４の態様は、生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
上記のモノクローナル抗体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記モノクローナル抗体に結合させる反応工程と、
前記モノクローナル抗体に結合した前記Ａβ関連ペプチドを、サンドイッチ型免疫測定法、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、及び免疫細胞染色からなる群から選ばれる方法により検出する工程と、
を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法である。
これらの反応工程、及び検出工程は、当業者に公知の方法を用いるとよい。例えば、サンドイッチ型免疫測定法においては、標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）の場合、第１の抗体として上記抗Ａβモノクローナル抗体を固相化抗体（捕捉抗体）として用いて、前記第２の抗体としての標的Ａβ関連ペプチドに対する他の抗体を検出抗体（標識抗体）として用いるとよい。
サンドイッチ型免疫測定法において、標識物質として酵素を利用するサンドイッチＥＬＩＳＡの他に、放射性同位元素を利用する放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光物質を利用する化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、蛍光発光物質を利用する蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、金属錯体を利用する電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ルシフェラーゼなどの生物発光物質を利用する生物発光免疫測定法（ＢＬＩＡ）、抗体に標識された核酸をＰＣＲで増幅させて検出するイムノＰＣＲ、免疫複合体形成により発生する濁度を検出する免疫比濁法（ＴＡＩ）、免疫複合体形成により凝集するラテックスを検出するラテックス凝集比濁法（ＬＡ）、セルロース膜上で反応させるイムノクロマト法などを用いてもよい。
この新規な抗Ａβ抗体クローン16-10Eを構成成分として含む、血漿中Ａβ関連ペプチドを測定するＩＰ－ＭＳのためのキットが提供される。具体的には、抗Ａβ抗体（クローン16-10E）が前述の担体に結合した抗体固定化担体を構成成分として含むＡβ関連ペプチドを測定するためのキットが提供される。
キットは、さらに、ＩＰ－ＭＳ（ｃＩＰ－ＭＳも含む）測定法の操作に用いる各種成分、例えば、試料溶液調製用の希釈液、洗浄溶液等を含ませることができる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。以下において％で示される物の量は、特に断りがない場合は、その物が固体である場合は重量基準、液体である場合は体積基準で示されている。
中性界面活性剤は、以下の略称で表す。
n-Decyl-β-D-maltoside （ＤＭ）
n-Dodecyl-β-D-maltoside （ＤＤＭ）
n-Nonyl-β-D-thiomaltoside（ＮＴＭ）
［実施例１：抗Ａβ抗体の作成］
合成ペプチド DAEFRHDSGYEVHHQKC（配列番号１０：この配列は、Ａβ１－１６のＣ末端 Lys（Ｋ）に Cys（Ｃ）を結合させたものに相当する）を用いた。前記合成ペプチド DAEFRHDSGYEVHHQKC のＣ末端の Cys を、二価反応性試薬を用いてキャリアタンパク質ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）に結合させた。
このＫＬＨ結合合成ペプチドをＦＣＡ（フロインドコンプリートアジュバンド）と注射筒を用いて混和して乳化させ、BALB/cマウス１匹に対して２００μｇを尾根部筋肉内に注射（免疫）した。免疫から２週間後、マウスより試血し、Ａβに対する抗体活性が上昇していることを確認した。その後、採血・腸骨リンパ節採取を行った。
得られたリンパ球とマウスミエローマを５０％ポリエチレングリコール存在下で細胞融合を実施した。融合細胞を９６ウェルマイクロプレート４枚に分注して培養した。細胞融合から８日後、９６ウェルマイクロウェルプレートの各ウェルから培養上清をサンプリングし、ＥＬＩＳＡにより一次スクリーニングを実施し、陽性ウェルについては、さらに二次スクリーニングを行った。スクリーニングにより選ばれた陽性ウェルの細胞を限界希釈法にてクローニングした。その後、ＥＬＩＳＡにより一次、二次スクリーニングを順次行い、陽性の６クローンのハイブリドーマを凍結保存した。
取得したハイブリドーマ（クローン5-1D, 8-1F, 12-8H, 14-12E, 16-10E, 40-10G）を培養した。各培養上清を硫安沈殿し、その後、Protein Gを用いて抗体を精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した（図２，３，４）。精製抗体はＢｒａｄｆｏｒｄ法によりタンパク定量を行った。
図２～４は、ハイブリドーマの培養上清を硫安沈殿とProtein Gにより精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにて確認した結果を示す図であり、図２は、ハイブリドーマ（クローン5-1D, 8-1F）についての結果、図３は、ハイブリドーマ（クローン12-8H, 14-12E）についての結果、図４は、ハイブリドーマ（クローン16-10E, 40-10G）についての結果をそれぞれ示す。なお、各図において、溶出画分１，２，及び３とは、Protein Gアフィニティークロマトグラフィーの際の溶出画分を示している。
［実施例２：抗Ａβ抗体によるＩＰ－ＭＳ］
抗Ａβモノクローナル抗体を用いた免疫沈降（ＩＰ）と質量分析（ＭＳ）を組み合わせたＩＰ－ＭＳを用いてヒト血漿中Ａβ関連ペプチドを測定した。
ＩＰにおいては、抗Ａβ抗体クローン5-1D, 8-1F, 12-8H, 14-12E, 16-10E、及び40-10G を、それぞれ磁性ビーズである Dynabeads Epoxy（Thermo Fisher Scientific）に共有結合させて抗体固定化ビーズを作成し、これら抗体固定化ビーズを使用した。また、クローン6E10（BioLegend）を用いて作成した抗体固定化ビーズをポジティブコントロールとして用いた。クローン6E10は、Ａβ関連ペプチドのＡβ３－８残基をエピトープとする抗Ａβ抗体（ＩｇＧ）である。
Ａβ１－４０，Ａβ１－４２又はＡＰＰ６６９－７１１をスパイクした血漿２５０μＬと、内部標準ペプチド（internal standard）を含む反応溶液［８００ｍＭ GlcNAc、０．２％（ｗ／ｖ） ＮＴＭ、０．２％（ｗ／ｖ） ＤＤＭ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４）］２５０μＬとを混合し、混合物を上記各抗体固定化ビーズ［ビーズ量（ビーズの重さ）２９１μｇ］と混ぜて、１時間、４℃で抗原抗体反応させた（第一ＩＰ）。
前記内部標準（internal standard）ペプチドとして、１１ｐＭ安定同位体標識（SIL）されたＡβ１－３８（AnaSpec製，San Jose, CA, USA，ＳＩＬ－Ａβ１－３８と称する）を使用した。ＳＩＬ－Ａβ１－３８は Phe と Ile の炭素原子が 13Ｃで置換されている。
抗原抗体反応後、抗体ビーズを洗浄し、ＤＤＭを含むグリシン緩衝液（ｐＨ２．８）を用いてＡβ関連ペプチドを溶出した。
抗原抗体反応後、抗体固定化ビーズを第一洗浄緩衝液で洗浄した［第一洗浄緩衝液（０．１％ ＤＤＭ、０．１％ ＮＴＭ、５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）１００μＬで３回洗浄し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで２回洗浄］。その後、抗体固定化ビーズに捕捉されたＡβ関連ペプチドをＤＤＭを含むグリシン緩衝液（０．１％ ＤＤＭを含有する５０ ｍＭ Glycine buffer，ｐＨ２．８）で溶出した。得られた溶出液にＤＤＭを含むトリス緩衝液［８００ｍＭ GlcNAc、０．２％（ｗ／ｖ） ＤＤＭ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４）］を加えてｐＨを中性（ｐＨ７．４）に戻した。その後、もう一度、中性の溶出液を抗体固定化ビーズ［ビーズ量（ビーズの重さ）７３μｇ］と１時間、４℃で接触させて、Ａβ関連ペプチドを抗原抗体反応させ（第二ＩＰ）、第二洗浄緩衝液で洗浄［第二洗浄緩衝液（０．１％ ＤＤＭ、１５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）１００μＬで５回洗浄し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで２回洗浄、純水３０μＬで１回洗浄］後、抗体固定化ビーズに捕捉されたＡβ関連ペプチドを溶出液（５ｍＭ ＨＣｌ, ０．１ｍＭ Methionine, ７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）で溶出した。このようにして、２段階ＩＰ操作によるＡβ関連ペプチドを含む各溶出液を得た。
Ｌｉｎｅａｒ ＴＯＦ用のマトリックスとして、α-cyano-4-hydroxycinnamic acid（ＣＨＣＡ）を用いた。マトリックス溶液は、ＣＨＣＡ １ｍｇを７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル１ｍＬで溶解することによって調製した。マトリックス添加剤として、０．４％（ｗ／ｖ） methanediphosphonic acid（ＭＤＰＮＡ）を用いた。１ｍｇ／ｍＬ ＣＨＣＡ溶液と０．４％（ｗ／ｖ）ＭＤＰＮＡを等量混合し、マトリックス／マトリックス添加剤溶液［０．５ｍｇ／ｍＬ ＣＨＣＡ／０．２％（ｗ／ｖ）ＭＤＰＮＡ］を得た。
予め、マトリックス／マトリックス添加剤溶液の０．５μＬをμFocus MALDI plateTM 900 μm (Hudson Surface Technology, Inc., Fort Lee, NJ)の各ｗｅｌｌ上へ滴下し、乾燥させた。
上記μFocus MALDI plateTM 900 μmの４ｗｅｌｌ上へ、ＩＰ後の各溶出液を滴下して乾燥させた。
マススペクトルデータはＡＸＩＭＡ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ (Shimadzu/KRATOS, Manchester, UK)を用いて、ポジティブイオンモードのＬｉｎｅａｒ ＴＯＦで取得した。Ｌｉｎｅａｒ ＴＯＦのｍ／ｚ値はピークのアベレージマスで表示した。ｍ／ｚ値は外部標準として、human angiotensin IIとhuman ACTH fragment 18-39、bovine insulin oxidized beta-chain、bovine insulinを用いてキャリブレーションした。
結果を図５に示す。図５は、ポジティブコントロールの6E10、及び、取得した６クローンを用いてＩＰ－ＭＳを行った結果を示す。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度である。各ＭＳスペクトルは、上から、抗Ａβ抗体クローン6E10，5-1D, 8-1F, 12-8H, 14-12E, 16-10E、及び40-10Gについての結果である。
Ａβ関連ペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。実施例１にて作成した抗Ａβ抗体クローン5-1D, 8-1F, 12-8H, 14-12E, 16-10E、及び40-10Gのうち、16-10EをＩＰで使用したときのみ、ポジティブコントロールの6E10と同等のスペクトルを示した。その他の５種の抗体クローンでは、表示されたマスレンジ（ｍ／ｚ値：４１００～４８００）においてＡβ関連ペプチドピークが検出されなかった。この結果から、16-10EがＩＰ－ＭＳによる血漿Ａβ関連ペプチド測定に有用なクローンであることが判明した。
Figure 0007299566000001
［実施例３：16-10Eを用いた抗体ビーズの使用量を変えたときのＩＰ－ＭＳ評価］
［実施例３－１：第一ＩＰにおいて16-10E抗体ビーズ量を変えたときのＩＰ－ＭＳ］
ハイブリドーマ16-10Eを通常の増殖培地で拡大培養した後、無血清培地に順化させた。その後、徐々に拡大培養して最終的に３００ｍＬで培養した。生細胞数が２０％以下になった時点で培養上清を回収した。その培養上清をProtein Aカラムを用いて精製し、ＰＢＳで透析した。抗体溶液を無菌ろ過した後、一部をサンプリングして２８０ｎｍの吸光度を測定し、抗体濃度を算出した。
精製したクローン16-10E抗体溶液をDynabeads Epoxy（Thermo Fisher Scientific）に接触させることにより16-10E抗体をDynabeads Epoxyに共有結合させて、抗体固定化ビーズを準備した。また、クローン6E10を用いて作成した抗体固定化ビーズを比較対照として用いた。
市販の血漿２５０μＬと内部標準ペプチド（ＳＩＬ－Ａβ１－３８）を含む反応溶液２５０μＬとを混合し、混合物を各抗体固定化ビーズと混ぜて、１時間、４℃で抗原抗体反応させた（第一ＩＰ）。第一ＩＰで使用した16-10E抗体ビーズ量（ビーズの重量）を１４５、２９１、５８２、１１６４μｇの４段階に変化させた。6E10抗体固定化ビーズ量については２９１μｇを使用した。
抗原抗体反応後、抗体固定化ビーズを第一洗浄緩衝液で洗浄した［第一洗浄緩衝液（０．１％ ＤＤＭ、０．１％ ＮＴＭ、５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）１００μＬで１回洗浄し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで１回洗浄］。その後、抗体固定化ビーズに捕捉されたＡβ関連ペプチドをＤＤＭを含むグリシン緩衝液（０．１％ ＤＤＭを含有する５０ ｍＭ Glycine buffer，ｐＨ２．８）で溶出した。得られた溶出液にＤＤＭを含むトリス緩衝液［８００ｍＭ GlcNAc、０．２％（ｗ／ｖ） ＤＤＭ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、３００ｍＭ Tris-HCl buffer（ｐＨ７．４）］を加えてｐＨを中性（ｐＨ７．４）に戻した。その後、もう一度、中性の溶出液を同じクローンの抗体ビーズと１時間、４℃で接触させて、Ａβ関連ペプチドと抗原抗体反応させた（第二ＩＰ）。第二ＩＰ工程においては、16-10E抗体ビーズ、及び6E10抗体ビーズの使用量（ビーズの重量）は共に７３μｇで固定した。第二洗浄緩衝液で洗浄［第二洗浄緩衝液（０．１％ ＤＤＭ、１５０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）１００μＬで２回洗浄し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで１回洗浄、純水３０μＬで１回洗浄］後、抗体固定化ビーズに捕捉されたＡβ関連ペプチドを溶出液（５ｍＭ ＨＣｌ, ０．１ｍＭ Methionine, ７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル）で溶出した。このようにして、２段階ＩＰ操作によるＡβ関連ペプチドを含む各溶出液を得た。
実施例２と同様にして、予め、マトリックス／マトリックス添加剤溶液の０．５μＬをμFocus MALDI plateTM 900 μm (Hudson Surface Technology, Inc., Fort Lee, NJ)の各ｗｅｌｌ上へ滴下し、乾燥させた。
上記μFocus MALDI plateTM 900 μmの４ｗｅｌｌ上へ、ＩＰ後の各溶出液を滴下して乾燥させた。
実施例２と同様にして、マススペクトルデータを取得した。
結果を図６に示す。図６は、第一ＩＰにおける16-10Eの抗体固定化ビーズ量を変えたときのＩＰ－ＭＳスペクトルである。6E10を比較対照とした。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度である。各ＩＰ－ＭＳスペクトルは、上から、抗Ａβ抗体クローン6E10（コントロール，第一ＩＰビーズ量：２９１μｇ），16-10E（第一ＩＰビーズ量：１１６４、５８２、２９１、１４５μｇ）についての結果である。使用した抗体ビーズ量は図６中の表の通りで、ビーズの重量を表示している。
これらの結果から、第一ＩＰで16-10E抗体固定化ビーズ量を変えても、いずれも同等のマススペクトルが得られ、6E10抗体固定化ビーズで検出されているＡβ関連ペプチドは全て検出されていることを確認できた。
［実施例３－２：第二ＩＰにおいて16-10E抗体ビーズ量を変えたときのＩＰ－ＭＳ］
使用した抗体固定化ビーズ量以外は、実施例３－１と同様に16-10E抗体固定化ビーズを用いてＩＰ－ＭＳを実施した。第一ＩＰでは、16-10E抗体固定化ビーズ、及び6E10抗体固定化ビーズの使用量は共に２９１μｇで固定し、第二ＩＰでは16-10E抗体ビーズ使用量を１８、３６、７３、１４５μｇの４段階で変化させた。6E10抗体ビーズ量については７３μｇを使用した。
結果を図７に示す。図７は、第二ＩＰにおける16-10Eの抗体固定化ビーズ量を変えたときのＩＰ－ＭＳスペクトルである。6E10を比較対照とした。横軸はｍ／ｚ、縦軸はイオンの相対強度である。各ＩＰ－ＭＳスペクトルは、上から、抗Ａβ抗体クローン6E10（コントロール，第二ＩＰビーズ量：７３μｇ），16-10E（第二ＩＰビーズ量：１４５、７３、３６、１８μｇ）についての結果である。使用した抗体ビーズ量は図７中の表の通りで、ビーズの重量を表示している。
これらの結果から、第二ＩＰで16-10E抗体固定化ビーズ量を変えても、いずれも同等のマススペクトルが得られ、6E10抗体固定化ビーズで検出されているＡβ関連ペプチドは全て検出されていることを確認できた。
実施例３－１及び３－２のように、16-10E抗体ビーズの使用量を変えても、6E10抗体ビーズと同様に血漿中のＡβ関連ペプチドを検出できることが示された。
［実施例４：クローン16-10Eと6E10のＡβ反応性の違い］
９６ウェルプレートのウェルにＡβ３－８ペプチド（配列番号１）溶液（１０、１００ｎｍｏｌ／ｍＬ）を５０μＬずつ入れ、４℃で一晩インキュベートすることで固相化した。Ａβ３－８ペプチドを固相化していないウェルも用意した（すなわち、No antigen）。その後、各ウェルのＡβ３－８ペプチド溶液を捨て、ブロッキングを行った後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、実施例３で取得したクローン16-10Eの抗体（２μｇ／ｍＬ）５０μＬを各ウェルに入れた。４℃で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＨＲＰ標識-抗マウスＩｇＧ－Ｆｃ溶液を５０μＬを入れた。４℃で１時間インキュベーションした後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライ）を１００μＬ加えて、暗所での３０分インキュベーションで発色させた。２Ｎ硫酸を１００μＬ加えて発色反応を止めた。マイクロプレートリーダーで主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を測定した。
結果を図８に示す。図８は、クローン16-10Eおよび6E10の抗体を用いたＡβ３－８ の直接ＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。横軸は、Ａβ３－８濃度（ｎｍｏｌ／ｍＬ）を表し、縦軸は、マイクロプレートリーダーで測定された主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度（Absorbance）を表す。
その結果、クローン16-10Eでは、Ａβ３－８を固相化したウェルの吸光度が高く、16-10EはＡβ３－８と反応性があることを示した。
一方、クローン16-10Eの代わりにクローン6E10を用いた以外は同様の実験を行い、各ウェルの主波長４５０ｎｍ／副波長６５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、クローン6E10では、Ａβ３－８を固相化していないウェルと同等レベルの吸光度で、6E10はＡβ３－８と反応性が無いことが判明した。つまり、クローン6E10は、Ａβ３－８をエピトープとするＡβ関連ペプチドを認識する抗体として用いられているが、Ａβ３－８ペプチドそれ自体とは反応性が無いことが判明した。
これらの結果から、クローン16-10Eとクローン6E10とでは、Ａβ３－８ペプチドに対する反応性の違いが存在することが明らかとなった。
クローン16-10Eは、Ａβ３－８ペプチドを認識する新規なモノクローナル抗体である。
（１）
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマにより産生される、Ａβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体。
（２）
担体と、前記担体に結合した上記（１）に記載のモノクローナル抗体とを含む抗体固定化担体。
（３）
上記（２）に記載の抗体固定化担体を含む、Ａβ関連ペプチドを測定するためのキット。
（４）
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマ。
（５）
Ａβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体の産生能を有する、上記（４）に記載のハイブリドーマ。
（６）
生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
担体と、前記担体に結合した、上記（１）に記載のモノクローナル抗体とを含む抗体固定化担体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記抗体固定化担体に結合させる反応工程と、
前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記抗体固定化担体を洗浄する洗浄工程と、
酸性溶液を用いて前記抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、精製溶液を得る溶出工程と、
前記精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを質量分析で検出する工程と、
を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法。
（７）
前記酸性溶液は、界面活性剤を含む酸性溶液である、上記（６）に記載の方法。
（８）
前記生体試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、上記（６）又は（７）に記載の方法。
（９）
前記生体試料が、全血、血漿又は血清である、上記（６）又は（７）に記載の方法。
（１０）
前記質量分析において、マトリックス支援レーザー脱離イオン化型質量分析装置を用いる、上記（６）～（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）
生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
担体と、前記担体に結合した、上記（１）に記載のモノクローナル抗体とを含む第１抗体固定化担体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記第１抗体固定化担体に結合させる第１反応工程と、
前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記第１抗体固定化担体を洗浄する第１洗浄工程と、
酸性溶液を用いて前記第１抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、第１溶出液を得る第１溶出工程と、
前記第１溶出液に中性緩衝液を加えることにより前記溶出液のｐＨを中性にして、ｐＨが中性とされた第１精製溶液を得る中性化工程と、
担体と、前記担体に結合した、上記（１）に記載の抗体とを含む第２抗体固定化担体に、前記第１精製溶液を接触させて、前記第１精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを前記第２抗体固定化担体に結合させる第２反応工程と、
前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記第２抗体固定化担体を洗浄する第２洗浄工程と、
酸性溶液を用いて前記第２抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、第２精製溶液を得る第２溶出工程と、
前記第２精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを質量分析で検出する工程と、
を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法。
（１２）
前記第２反応工程に付される前記第１精製溶液の液量が、前記第１反応工程に付される前記生体試料の含有液の液量よりも小さい、上記（１１）に記載の方法。
（１３）
前記第２反応工程における前記第２抗体固定化担体の量が、前記第１反応工程における前記第１抗体固定化担体の量よりも少ない、上記（１１）又は（１２）に記載の方法。
（１４）
前記第１溶出工程において、前記酸性溶液は、界面活性剤を含む酸性溶液である、上記（１１）～（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）
前記第２溶出工程において、前記酸性溶液は、有機溶媒を含む酸性溶液である、上記（１１）～（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）
前記生体試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、上記（１１）～（１５）のいずれかに記載の方法。
（１７）
前記生体試料が、全血、血漿又は血清である、上記（１１）～（１５）のいずれかに記載の方法。
（１８）
前記質量分析において、マトリックス支援レーザー脱離イオン化型質量分析装置を用いる、上記（１１）～（１７）のいずれかに記載の方法。
（１９）
生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
上記（１）に記載のモノクローナル抗体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記モノクローナル抗体に結合させる反応工程と、
前記モノクローナル抗体に結合した前記Ａβ関連ペプチドを、サンドイッチ型免疫測定法、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、及び免疫細胞染色からなる群から選ばれる方法により検出する工程と、
を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法。
（２０）
Ａβ３－８ペプチド（配列番号１）を認識するモノクローナル抗体。
（２１）
独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマにより産生される、Ａβ３－８ペプチドを認識するモノクローナル抗体。

Claims (19)

  1. 独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマにより産生される、Ａβ関連ペプチドを認識するモノクローナル抗体であって、
    Ａβ３－８ペプチド（配列番号１）を認識するモノクローナル抗体。
  2. 担体と、前記担体に結合した請求項１に記載のモノクローナル抗体とを含む抗体固定化担体。
  3. 請求項２に記載の抗体固定化担体を含む、Ａβ関連ペプチドを測定するためのキット。
  4. 独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ－０２９９８で寄託されているハイブリドーマであって、
    Ａβ３－８ペプチド（配列番号１）を認識するモノクローナル抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
  5. 生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
    担体と、前記担体に結合した、請求項１に記載のモノクローナル抗体とを含む抗体固定化担体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記抗体固定化担体に結合させる反応工程と、
    前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記抗体固定化担体を洗浄する洗浄工程と、
    酸性溶液を用いて前記抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、精製溶液を得る溶出工程と、
    前記精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを質量分析で検出する工程と、
    を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法。
  6. 前記酸性溶液は、有機溶媒を含む酸性溶液である、請求項５に記載の方法。
  7. 前記生体試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 前記生体試料が、全血、血漿又は血清である、請求項５又は６に記載の方法。
  9. 前記質量分析において、マトリックス支援レーザー脱離イオン化型質量分析装置を用いる、請求項５～８のいずれかに記載の方法。
  10. 生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
    担体と、前記担体に結合した、請求項１に記載のモノクローナル抗体とを含む第１抗体固定化担体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記第１抗体固定化担体に結合させる第１反応工程と、
    前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記第１抗体固定化担体を洗浄する第１洗浄工程と、
    酸性溶液を用いて前記第１抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、第１溶出液を得る第１溶出工程と、
    前記第１溶出液に中性緩衝液を加えることにより前記溶出液のｐＨを中性にして、ｐＨが中性とされた第１精製溶液を得る中性化工程と、
    担体と、前記担体に結合した、請求項１に記載の抗体とを含む第２抗体固定化担体に、前記第１精製溶液を接触させて、前記第１精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを前記第２抗体固定化担体に結合させる第２反応工程と、
    前記Ａβ関連ペプチドが結合した前記第２抗体固定化担体を洗浄する第２洗浄工程と、
    酸性溶液を用いて前記第２抗体固定化担体から前記Ａβ関連ペプチドを解離させ溶出させ、第２精製溶液を得る第２溶出工程と、
    前記第２精製溶液中の前記Ａβ関連ペプチドを質量分析で検出する工程と、
    を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法。
  11. 前記第２反応工程に付される前記第１精製溶液の液量が、前記第１反応工程に付される前記生体試料の含有液の液量よりも小さい、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記第２反応工程における前記第２抗体固定化担体の量が、前記第１反応工程における前記第１抗体固定化担体の量よりも少ない、請求項１０又は１１に記載の方法。
  13. 前記第１溶出工程において、前記酸性溶液は、界面活性剤を含む酸性溶液である、請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 前記第２溶出工程において、前記酸性溶液は、有機溶媒を含む酸性溶液である、請求項１０～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記生体試料が、血液、脳脊髄液、尿、糞便、及び、体分泌液からなる群から選ばれる生体由来試料である、請求項１０～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 前記生体試料が、全血、血漿又は血清である、請求項１０～１４のいずれかに記載の方法。
  17. 前記質量分析において、マトリックス支援レーザー脱離イオン化型質量分析装置を用いる、請求項１０～１６のいずれかに記載の方法。
  18. 生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法であって、
    請求項１に記載のモノクローナル抗体に、生体試料の含有液を接触させて、前記生体試料中のＡβ関連ペプチドを前記モノクローナル抗体に結合させる反応工程と、
    前記モノクローナル抗体に結合した前記Ａβ関連ペプチドを、サンドイッチ型免疫測定法、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫組織学的染色、フローサイトメトリー、免疫沈降、アフィニティークロマトグラフィー、及び免疫細胞染色からなる群から選ばれる方法により検出する工程と、
    を含む生体試料中のＡβ関連ペプチドを測定する方法。
  19. Ａβ３－８ペプチド（配列番号１）を認識するモノクローナル抗体。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20240125794A1 (en) * 2021-02-25 2024-04-18 Shimadzu Corporation Quality control standard solution used in peptide assay, and quality control of peptide assay

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003506321A (ja) 1999-06-16 2003-02-18 ボストン・バイオメデイカル・リサーチ・インステイテユート インビボのβ−アミロイドレベルの免疫学的制御
JP2013035843A (ja) 2004-10-25 2013-02-21 Merck Sharp & Dohme Corp 抗ａｄｄｌ抗体およびこの使用
WO2015178398A1 (ja) 2014-05-22 2015-11-26 株式会社 島津製作所 脳内のアミロイドβペプチド蓄積状態を評価するサロゲート・バイオマーカー及びその分析方法
JP2017020980A (ja) 2015-07-14 2017-01-26 株式会社島津製作所 ポリペプチドの質量分析方法
WO2017047529A1 (ja) 2015-09-16 2017-03-23 株式会社 島津製作所 脳内のアミロイドβ蓄積状態を評価するマルチプレックスバイオマーカー及びその分析方法
JP2018524370A (ja) 2015-07-16 2018-08-30 プロビオドルグ エージー ヒト化抗体
WO2019167128A1 (ja) 2018-02-27 2019-09-06 株式会社 島津製作所 サンドイッチ型免疫測定法
WO2019167830A1 (ja) 2018-02-27 2019-09-06 株式会社 島津製作所 ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体、及び免疫測定法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4374316B2 (ja) 1993-01-25 2009-12-02 武田薬品工業株式会社 β−アミロイドまたはその誘導体に対する抗体およびその用途
WO2004029629A1 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Janssen Pharmaceutica N.V. N-11 truncated amyloid-beta nomoclonal antibodies, compositions, methods and uses
CN101245105A (zh) * 2003-03-28 2008-08-20 森托科尔公司 抗淀粉状蛋白抗体、组合物、方法和用途
CN102089000A (zh) * 2008-07-08 2011-06-08 默沙东公司 用于治疗阿尔茨海默病的疫苗
US20110263450A1 (en) * 2008-09-26 2011-10-27 The University Of Melbourne Alzheimer's disease biomarkers
JP2014521089A (ja) * 2011-07-13 2014-08-25 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション 液体試料中のアミロイドベータオリゴマーの検出方法およびその使用
US10942190B2 (en) 2014-01-21 2021-03-09 Shimadzu Corporation Measurement method for amyloid precursor protein cleavage peptides

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003506321A (ja) 1999-06-16 2003-02-18 ボストン・バイオメデイカル・リサーチ・インステイテユート インビボのβ−アミロイドレベルの免疫学的制御
JP2013035843A (ja) 2004-10-25 2013-02-21 Merck Sharp & Dohme Corp 抗ａｄｄｌ抗体およびこの使用
WO2015178398A1 (ja) 2014-05-22 2015-11-26 株式会社 島津製作所 脳内のアミロイドβペプチド蓄積状態を評価するサロゲート・バイオマーカー及びその分析方法
JP2017020980A (ja) 2015-07-14 2017-01-26 株式会社島津製作所 ポリペプチドの質量分析方法
JP2018524370A (ja) 2015-07-16 2018-08-30 プロビオドルグ エージー ヒト化抗体
WO2017047529A1 (ja) 2015-09-16 2017-03-23 株式会社 島津製作所 脳内のアミロイドβ蓄積状態を評価するマルチプレックスバイオマーカー及びその分析方法
WO2019167128A1 (ja) 2018-02-27 2019-09-06 株式会社 島津製作所 サンドイッチ型免疫測定法
WO2019167830A1 (ja) 2018-02-27 2019-09-06 株式会社 島津製作所 ＡＰＰ６６９－ｘのＮ末端を特異的に認識する抗体、及び免疫測定法

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