JP2014521089A - 液体試料中のアミロイドベータオリゴマーの検出方法およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
Aβオリゴマーに対して選択的かつ特異的なアッセイを開発するために、本出願人は、先ず、ADDL、非原線維性のAβオリゴマー種に対して選択的でもあり、特異的でもある抗体を同定しようと努めた。フロイントアジュバント(第一および第二ワクチン、皮下的に)または不完全フロイントアジュバント(すべて後続ワクチン接種、腹腔内)のいずれかと1:1混合されたADDL Aβオリゴマー種でマウスを免疫することによって、抗ADDLマウスモノクローナル抗体、3B3を生成した(米国特許第7,811,563号および同第7,780,963号明細書)。各注射は、194±25μg全タンパク質と等価の精製ADDLから成った。最高力価血清を有するマウスからの脾臓をポリエチレングリコールの存在下でSP2/0骨髄腫細胞と融合させ、96ウェルプレートにプレーティングした。5%CO2を用いて37℃で10日間、200μLのヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン(HAT)選択培地中で細胞を培養した。10%ウシ胎仔血清(FBS)を補足したイスコフ変性ダルベッコ培地(IMDM)(Sigma−Aldrich、ミズーリ州セントルイス)を第10日に1回、前記培養物に供給し、培養上清を第14日に除去して、片側ELISAを用いて陽性、Aβオリゴマー抗体含有、ウェルについてスクリーニングした(実施例?)。抗体3B3を、Aβ単量体またはAβ原線維と比較してADDLを優先的に結合するその能力に基づき、さらなる開発のために選択した(図1A)。
下記配列(配列番号1)を有する軽鎖可変領域
下記配列(配列番号2)を有する重鎖可変領域
および
下記配列(配列番号3)を有する重鎖定常領域
抗Aβオリゴマー抗体19.3のAβオリゴマー選択性
Aβ40単量体と比較してAβオリゴマーに対する19.3の結合能を確認するために、別々のAβオリゴマーまたはAβ40単量体被覆プレートと共通の抗体滴定曲線を用いて片側ELISAを完了した(図1B)。19.3のEC50(半最大全Aβオリゴマー結合の測度)は、AβオリゴマーおよびAβ40についてそれぞれ1.6nMおよび4.3nMであった。この形式で、19.3抗体は、Aβ40単量体と比較してAβオリゴマーに対しておおよそ3倍大きい最大結合を明示し、その上、その能力はおおよそ3.7倍大きかった。図1Bに示すように、19.3は、Aβ40単量体と対比してAβオリゴマーに対して、両方が独立してアッセイプレート表面に固定化されているとき、より大きい親和度を有した。したがって、本明細書において同定される抗Aβオリゴマー抗体19.3は、Aβ40単量体に比べてAβオリゴマーを、各々が独立してアッセイプレートに結合しているとき、選択的に結合するが、本出願人は、AβオリゴマーとAβ単量体種の両方が、溶解状態でまたはアッセイプレート上に固定化されて、体液または組織試料中で見いだされるであろうように同時に存在するときの19.3の相対結合特性をさらに比較しようと努めた。
サンドイッチELISA形式での捕捉および検出抗体ペア(表1)のスクリーニングにおいて、捕捉抗体としての19.3と7305、抗Aβオリゴマー抗体(20C2、米国特許第7,780,963号明細書(この参考文献はその全体が参照により本明細書に援用されている))または82E1(Immunobiological Laboratories(IBL),Inc.、ミネソタ州ミネアポリス)のいずれかとの組み合わせは、Aβオリゴマー標準曲線においてカゼイン・ブロッキング・バッファー中で同等に動作し、各々が4pg/mLより下の検出限界(LoD)を与えた(図2A)。捕捉抗体と検出抗体の両方としての抗Aβオリゴマー抗体の使用はAβオリゴマーアッセイとして報告されているが、感度および選択性の絶対レベルがいずれも報告されておらず(6E10/6E10;Gandy et al.,2010,Ann.Neurol.,68:220−230)、または選択性がヒトCSF中のAβオリゴマーを測定するためのアッセイに望まれるものより低かった(82E1/82E1;Xia,et al.,2009,Arch.Neurol.,66:190−199)。
常磁性マイクロ粒子検出イムノアッセイシステム、Erenna(登録商標)Immunoassay System(Singulex(登録商標)、カリフォルニア州Almeda)を使用するサンドイッチELISAで19.3と7305(19.3x7305)の抗体ペアと、19.3と82E1(19.3x82E1)の抗体ペアの両方を評価して、ヒトおよび非ヒト霊長類液体試料中のAβオリゴマーの測定についてのアッセイ感度がさらに向上し得るかどうかを判定した。本発明の1つの実施形態では、ヒトCSF試料を使用してイムノアッセイを行った。
上の発見を用いて、本出願人は、CSF試料中のAβオリゴマーのレベルを検出および測定するための、19.3および82E1抗体ペアを使用する、選択的AβオリゴマーサンドイッチELISAを開発した。このアッセイは、生産を阻害するための、クリアランスを増加させるための、またはAβオリゴマーレベルを別様に修飾するための処置後の分析物、すなわちAβオリゴマー、レベルの変化(図9A)を評定するためにそれを使用するため、従来的には、薬力学的(PD)アッセイと呼ばれることになる。このPDアッセイは、AD患者と非AD患者とを区別するために使用することもでき、すなわち診断的であることもあり、疾患の進行をモニターするために使用することもでき、すなわち予後的であることもあり、またはAβオリゴマー濃度を変化させる疾患修飾処置の治療可能性をモニターするために使用することもできる。
実施例6の19.3x82E1 Aβオリゴマー選択的サンドイッチELISAを用いて、ヒトCSF試料中のAβオリゴマーの内因性レベルを測定した(図4Aおよび4B)。2つの別々の試料コホートにおいて、Aβオリゴマーの存在により生成される蛍光シグナルは、若年または健常同年齢対照のいずれかと比較して、(25未満のMMSEスコアを用いてADほぼ確実と臨床診断された)AD CSF中で有意に高かった。観察されたAβオリゴマーの絶対レベルは、p<0.0004のt−検定、二元配置マン・ホイットニー・スコア(t−test,two way Mann−Whitney score)で、Precision Medicine(カリフォルニア州ソラナビーチ)からのCSF試料中、AD(N=20)では2.1+/−0.61pg/mLおよび同年齢対照(N=10)では0.53+/−0.26pg/mLであった(図4A)。観察されたAβオリゴマーの絶対レベルは、p<0.0021のt−検定、二元配置マン・ホイットニー・スコアで、Bioreclamation(ニューヨーク州ヒックスヴィル)からのCSF試料中、AD(N=10)では1.66+/−0.5pg/mLおよび対照(N=10)では0.24+/−0.05pg/mLであった(図4B)。これらの2つのコホート(診断AD CSF試料の90%)を併せると0.42pg/mLのLLoRQより上であったが、同年齢対照の20%しかまたは若年対照の10%しかこの限界より上でなかった。すべての値は、0.04pg/mLのLoDより上であった。Bioreclamationから得たCSF試料中のAβ40およびAβ42単量体レベルを測定し(それぞれ図5Aおよび5B)、それらは、Aβ40についてはAD CSFと対照CSF間で同等であった(図5A)が、Aβ42についてはAD試料において有意に低減された(図5B)。これは、AD CSFの特徴として以前に報告されており(De Meyer,et al.,2010,Arch.Neurol.67.949−956;Jack,et al.,2010,Lancet Neurol.9:119−128)、これらの試料の正確な診断を確証した。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本出願人は、AD CSF試料中のより低いAβ42レベルは、AD脳のアミロイド沈着物中でのAβ42の保持に起因すると考える。これらの観察された差を特異的に検出および定量できることは、これらのバイオマーカーをADについての診断および予後判定手段として使用できることを示唆する。
類似して、上の発見を用いて、本出願人は、抗Aβオリゴマー19.3、IgG2、抗体、すなわち、治療用抗体で処置した患者からのCSF試料中の結合Aβオリゴマーのレベルを検出および定量するための、抗ヒトIgG2抗体x82E1抗体ペアを使用する、選択的サンドイッチELISAを開発した。このアッセイは、治療用(捕捉)抗体にin vivoで結合したAβオリゴマーを測定するためにそれを使用するため、従来的には、ターゲット・エンゲージメント・アッセイ(TEアッセイ)と呼ばれることになる。したがって、このTEアッセイを用いて、治療用抗体に結合したAβオリゴマーのレベルを測定して、その治療因子によるAβオリゴマーのエンゲージメントを確認することができる。いかなる理論にも拘束されることを望まないが、本出願人は、治療用抗Aβオリゴマー抗体に結合したAβオリゴマーのレベルは、ある期間にわたって該治療因子で処置を受けた被験体からのCSF試料におけるほうが低くなると考える。投与後に増加するまたは不変である結合Aβオリゴマーのレベルは、その治療因子がADの処置に適さないことを示唆することになる。あるいは、単にAβオリゴマーを離隔し、それらを治療用抗体に結合させることによる場合には、脳内のニューロンとの相互作用低減のため、急性パフォーマンスに関して恩恵を得ることができる。しかし、この恩恵をAβオリゴマー自体の変化と関連付けることはできない。ターゲット・エンゲージメント・アッセイは、最低でも、CSF中のAβオリゴマーをエンゲージする治療用抗体の能力を評定することになる。
以下の略号を本明細書において用いる:Ab:抗体;Aβ:アミロイドベータタンパク質;AD:アルツハイマー病;ADDL:アミロイドβ由来拡散性リガンド;aM:アトモル濃度;CSF:脳脊髄液;DE平均:検出事象平均;DMSO:ジメチルスルホキシド;HFIP:1,1,1,3,3,3ヘキサフルオロ−2−プロパノール;HMW:高分子量;LMW:低分子量;LoD:検出限界;;LLoRQ:信頼定量下限。
Aβ40およびAβ42(アミロイドβペプチド1−40、アミロイドβペプチド1−42)は、カリフォルニア州サニーヴェールのAmerican Peptide Co.から入手した。Aβ42をミズーリ州セントルイスのSigma−Aldrichの1,1,1,3,3,3ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)に溶解して、凝集用の「シード」として作用し得る任意の既存二次構造を排除した。HFIPを蒸発により除去し、Aβ42被膜を形成した。そのAβ42ペプチド被膜(100%HFIP溶媒からドライダウンさせた1mg Aβ42)を44μLのDMSOに溶解し、穏やかに混合しながらそれに1.956μLの冷F12培地(GIBCO(登録商標)、Invitrogen,カリフォルニア州カールズバッド、Cat#ME100014L1)を添加し、室温で18から24時間インキュベートした。試料を14,200gで10分間、室温で遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、4,000rpmで15分間、4℃でのスピンにより0.5mLカラムYM−50フィルターチューブ(Millipore、マサチューセッツ州ベッドフォード;Cat#UFC505096、0.5mL)に通して濾過した。フィルター挿入体を反転させることによってフィルター上残留物を回収し、新たな採取チューブに入れ、4,000rpmで5分間、4℃で遠心分離した。タンパク質濃縮物をBradford Assay(BioRad、カリフォルニア州ハーキュリーズ、Cat#_23236)によって濾過前に測定し、(Aβ単量体分子量(MW4513)に基づいて計算した)μMとして報告した。すべての試料を使用するまで−80℃で保管した。
A.ヒト化抗体ライブラリーのパニング
ヒト化抗ADDL抗体、h3B3の親和性成熟ライブラリー(米国特許第7,811,563号および同第7,780,963号明細書参照)を構築し、その中の軽鎖CDR3アミノ酸配列の一部をランダム突然変異誘発に付した。全CDR3領域をカバーするために、2つのサブライブラリーを造った。一方のライブラリーは、親重鎖可変領域と軽鎖CDR3の左半分における突然変異アミノ酸とから成り、他方は、親重鎖可変領域と軽鎖CDR3の右半分における突然変異アミノ酸とから成った。類似した戦略を3つのサブライブラリーに関する重鎖CDRランダム突然変異誘発に用いた。
高タンパク質結合プレートをPBS中の100pmol/ウェル Aβ40または50pmol/ウェル Aβオリゴマーのいずれかで、一晩、4℃で被覆した。翌日、プレートをPBS+0.05%Tween−20で5回洗浄し、一晩、カゼイン・ブロッキング・バッファー(Thermo Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム)および0.05%Tween−20でブロッキングした。実施例2において同定した19.3抗体を0から15μg/mLでの12点3倍希釈系列で試験した。2時間、室温でのインキュベーション後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼコンジュゲート型抗ヒトIgG(ThermoScientific、マサチューセッツ州ウォルサム)を0.08μg/mLで添加した。45分間、室温でのインキュベーション後、プレートを洗浄し、Tropix CDP star(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)を添加した。30分後にEnVision(登録商標)プレートリーダーで発光を検出した(PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサム)。GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ)ソフトウェアを用いて曲線フィットを完了した。
AβオリゴマーおよびAβ単量体での競合結合アッセイにより、19.3抗体を使用してAβオリゴマーに対する結合の選好を実証した。カゼイン・バッファー・ブロッキング段階まで、上の実施例3のようにAβオリゴマープレートを調製した。100pmol/ウェルを使用して、同様にAβ40単量体被覆プレートを調製した。実施例2からの19.3抗体を4nM(上の実施例3で決定したとおりのAβオリゴマーについてのEC50)で各ウェルのカゼイン・ブロッキング・バッファー・マトリックスに塗布し、振盪しながら30分間、室温でAβオリゴマーまたはAβ40と相互作用させた。AβオリゴマーまたはAβ40のいずれかについての、10μMで出発する12点3倍濃度曲線を抗体含有ウェルに適用した。Aβオリゴマーで被覆したプレートについては、Aβ40をウェルに添加した;Aβ40プレートについては、Aβオリゴマーをウェルに添加した。それらのプレートを1時間半、室温でインキュベートした。残留抗体結合の検出とEC50計算の両方を上の実施例3において判定した。
A.Aβオリゴマーアッセイ:サンドイッチELISAを前記競合Aβオリゴマー調製またはヒトCSFに適用した。19.3Aβオリゴマー選好性抗体を一晩、4℃で重炭酸ナトリウムバッファー(ThermoFisher #28382、マサチューセッツ州ウォルサム)中、1ウェルにつき0.5μgで被覆した。翌日、0.05%Tween 20を有するリン酸緩衝食塩水(PBS−T)でそれらのウェルを洗浄し、0.1%Tweenを添加したPBS(ThermoFisher #37528、マサチューセッツ州ウォルサム)中、200μL/ウェルのカゼインバッファーで一晩、4℃でブロッキングした。Aβオリゴマー標準物質またはSEC画分をカゼインバッファーで希釈し、100μL/ウェルで添加した。標準曲線の線形範囲内のシグナルを与える希釈物を計算に使用した。翌日、プレートをPBS−Tで5回洗浄し、ビオチン−82E1(IBL、番号10326、カナダ国オンタリオ州トロント)を1時間、室温でカゼインバッファー中100μL/ウェルで添加した。それらのプレートを再びPBS−Tで洗浄し、Neutravidin−AP(ThermoFisher #31002、マサチューセッツ州ウォルサム)を30分間、室温で添加した。最後に、追加のPBS−T洗浄後、Tropix(登録商標)CDP(登録商標)−Star化学発光基質(Life Technologies(商標)、カリフォルニア州カールズバッド)を30分間、添加した。EnVision(登録商標)(PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサム)プレートリーダーで発光を定量した。
臨床確認されたAD、若年対照、または同年齢対照患者からのCSF試料をBioReclamation(ニューヨーク州ヒックスヴィル)またはPrecision Med(カリフォルニア州ソラナビーチ)から購入した。一般に是認されている精神状態短時間検査(MMSE)を用いて認知診断を行った。AD CSFにおいて不変であるか有意に低減されると報告されているELISA(実施例5B)によるAβ40およびAβ42単量体のそれぞれの測定によって、試料の性質を確認した。
霊長類CSF中の19.3の存在を確認するために、大槽がポートされた赤毛猿のコホートにおいて抗Aβオリゴマー抗体19.3についての研究を行った。6匹のサル(雄3匹/雌3匹)に抗体19.3(20mg/kg)の単回静脈内ボーラスを投与した。CSF試料を大槽ポート(cisterna magna port)から様々な時点で採取し、CSF中の抗体19.3の濃度を抗ヒトIgG ELISAアッセイで決定した。本出願人は、抗体19.3が霊長類CSFに入ることができ、最初の24時間の間、濃度が上昇し、約100ng/mLでピークに達することを発見した。この濃度が、ターゲット・エンゲージメント・アッセイの開発のためにヒトCSFにスパイクした抗Aβオリゴマー抗体19.3のレベルを導いた。
常磁性マイクロ粒子ベースのイムノアッセイプラットホーム(Erenna(登録商標)イムノアッセイシステム、Singulex(登録商標)、カリフォルニア州Almeda)を使用してAβオリゴマーサンドイッチELISAを行って、ヒト試料またはAβオリゴマー標準物質中のオリゴマーレベルを決定した。捕捉用のマイクロ粒子(MP)は、1mgのMPにつき12.5μgの捕捉試薬、Aβオリゴマー抗体19.3を結合させることによって調製した(下記方法を参照されたい)。それらの19.3結合MPをアッセイバッファー(1%Triton X−100、d−デスチオビオチン、0.1%ウシ血清アルブミンを有するTrisバッファー)中100μg/mLに希釈し、(3%ウシ血清アルブミンを含有するTrisバッファーで希釈した)100uLのCSF試料または標準物質に100uLで添加し、その後、2時間、25℃でインキュベートした。それらのMPを磁性ベッドによって保持し、アッセイ希釈剤を使用してTHydroflexプレートウォッシャー(Tecan、スイス国メンネドルフ)を使用する単一洗浄段階で未結合材料を除去した。Alexa蛍光標識検出抗体、82E1(下記実施例のとおりに調製したもの)を500pg/mLの最終濃度に希釈し、0.2μmフィルター(Pall 4187、ニューヨーク州フォートワシントン)に通して濾過した。その抗体を20μL/ウェルの個々の試料粒子に添加した。それらのELISAプレートをJitterbug(Boekel、ペンシルバニア州フィースターヴィル)で振盪しながら1時間、25℃でインキュベートした。ウェルをアッセイバッファーで4回洗浄し、一切の未結合検出試薬を除去した。MP/19.3/Aβオリゴマー/82E1複合体を新たなプレートに移し、バッファーを吸引除去し、10μL/ウェルの溶出バッファーを添加し、その後、Jitterbugにおいて速度5で振盪しながら5分間、25℃でインキュベートした。溶出したfluor標識検出抗体82E1を、10μL/ウェルの中和バッファーが入っている384プレートに移し、常磁性マイクロ粒子検出器(Erenna(登録商標)、Singulex(登録商標)、カリフォルニア州アラメダ)を用いて1ウェルあたりの読取り時間60秒で読み取った。
1.Aβオリゴマー抗体(19.3)のダイナビーズ(Dynabeads)(MPビーズ)への結合:磁石を使用して50μLダイナビーズから上清を除去する。5μgの19.3を含有する200μLの抗体結合・洗浄バッファー、例えばRIPAバッファー[#9806、Cell Signaling Technologies、マサチューセッツ州ベヴァリー]にダイナビーズを懸濁させる。回転させながら室温で10分間、インキュベートする。19.3/MPビーズ複合体から磁石で上清を除去する。その複合体を200μLの結合・洗浄バッファーで洗浄する。
Alexa Fluor 546の82E1へのカップリング:Alexa Fluor 546(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)に匹敵する蛍光タグに、その製造業者のプロトコルに従って、82E1をカップリングさせた。簡単に言うと、82E1を1mg/mLに希釈し、十分の一の容量の1M重炭酸ナトリウムバッファーを添加した。この82E1溶液(100μL)をAlexa Fluor 546色素のバイアルに添加し、そのバイアルに蓋をし、穏やかに反転させてその色素を溶解し、室温で1時間撹拌した。カラムをスピンさせて一切の非標識蛍光タグを検出抗体から分離し、この間にそのカラムにComponent C(BioGel(登録商標)P−30、BioRad、カリフォルニア州ハーキュリーズ)精細サイズ排除精製樹脂を負荷する。ゲルバッファーを排液した後、100μLの19.3/MPビーズおよび色素反応容量をスピンカラムの頂部の樹脂の中央に添加し、ゲルベッドに吸収させた。そのカラムに室温で100μLの溶出バッファー(0.2mMアジ化ナトリウムを有する、0.01Mリン酸カリウム、0.15M NaCl、pH7.2)をゆっくりと添加した。追加の溶出バッファーを添加し、カラムを実行するときに照明して染色された/タグ付きの抗体の前面を見えるようにした。第一カラム色素ラインは、標識抗体である。遊離色素はカラムベッドに残存し、そのスピンカラムを廃棄する。
治療用抗体と共に使用するために、in vitroまたはin vivoで形成された抗体/Aβオリゴマー複合体を検出するためのターゲット・エンゲージメント・アッセイとして使用するためのAβオリゴマー複合体サンドイッチELISAを行って、ターゲット・エンゲージメントを証明することまたは19.3/Aβオリゴマー複合体を低減させる治療用抗体の効力を実証することができる。抗ヒトIgG2または抗ヒトカッパ(両方ともSouthern Biotech、アラバマ州Birmingnamからのもの)のいずれかを、4℃で一晩、重炭酸ナトリウムバッファー(BupH Carbonate−Bicarbonate Buffer pack、#28382、Thermo Fisher Scientific Inc、マサチューセッツ州ウォルサム)中、1ウェルにつき0.5μgで被覆した。翌日、それらのウェルを、0.05%Tween 20を有するリン酸緩衝食塩水(PBS−T;Sigma−Aldrich、ミズーリ州セントルイス)で洗浄し、0.1%Tweenを有するPBS中の200μL/ウェルのカゼインバッファーを添加して一晩、摂氏4度(4°Celcius)でブロックした。19.3抗体を微量遠心管(Axygen,Inc.、カリフォルニア州ユニオンシティー、MCT−175−L−C)の中のカゼインバッファー(Thermo Fisher Scientific Inc、マサチューセッツ州ウォルサム)またはヒトCSFに0.100μg/mLでスパイクした。19.3レベルを一定に保ってAβオリゴマーを様々な濃度でスパイクして、標準曲線を得た。抗体(19.3)/Aβオリゴマー複合体の形成を可能にするために試料を4℃で一時間撹拌させた。100μL試料/ウェルを抗ヒトIgG2または抗ヒトカッパ被覆プレート(n=3)に塗布し、プレート振盪器を用いて一晩、4℃でインキュベートした。翌日、それらのプレートをPBS−Tで5回洗浄し、ビオチン−82E1(IBL、ミネソタ州ミネアポリス、番号10326)を100μL/ウェルで添加し、1時間、室温で、カゼイン・ブロッキング・バッファー(Sigma−Aldrich Corp.、ミズーリ州セントルイス)、0.1%Tween 20で1:5000希釈した。それらのプレートを再びPBS−Tで洗浄し、Neutravidin−AP(ThermoFisher、マサチューセッツ州ウォルサム、#31002)をカゼインバッファーで1:20,000希釈し、その後、30分間、室温で添加した。追加のPBS−T洗浄後に30分間、Tropix CDP star発光基質(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー、T2214)を塗布した。EnVisionプレートリーダー(PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサム)で発光を定量した。
Claims (13)
- 患者から得た生体試料中の対象となるニューロン由来タンパク質(NDPOI)のレベルを判定するための方法であって、
(a)NDPOIを有する生体試料を哺乳動物から得る段階;
(b)前記生体試料と捕捉抗体/常磁性マイクロ粒子ビーズ(抗体/MPビーズ)とを、NDPOI/捕捉抗体/MPビーズ複合体を形成するために十分な条件下で接触させる段階;
(c)段階(b)の前記NDPOI/捕捉抗体/MPビーズ複合体と蛍光標識検出抗体とを、POI/捕捉抗体/MPビーズ/検出抗体複合体を形成するために十分な条件下で接触させる段階;および
(d)段階(c)の前記複合体から生成される蛍光シグナルを検出する段階(この場合、段階(d)の前記蛍光シグナルがNDPOIの量を表す)
を含む方法。 - 前記NDPOIがAβオリゴマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が、19.3、7305、82E1およびW02から成る群より選択される抗Aβオリゴマー抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記検出抗体が、82E1、7305および6E10から成る群より選択される抗Aβオリゴマー抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が19.3であり、および前記検出抗体が82E1である、請求項1に記載の方法。
- 患者から得た生体試料中の対象となるニューロン由来タンパク質(NDPOI)のレベルを判定することによりアルツハイマー病を有する患者を同定するための請求項記載の方法であって、前記NDPOIがAβオリゴマーであり、および0.5pg/mLから11pg/mLの範囲のAβオリゴマーレベルを有する患者がアルツハイマー病を有すると判定される方法。
- アルツハイマー病を処置するための治療の治療効力を判定するための方法であって、
(a)対象となるニューロン由来タンパク質(NDPOI)を有する生体試料を患者から得る段階;
(b)前記生体試料と捕捉抗体/常磁性マイクロ粒子ビーズ(抗体/MPビーズ)とを、NDPOI/捕捉抗体/MPビーズ複合体を形成するために十分な条件下で接触させる段階;
(c)段階(b)の前記NDPOI/捕捉抗体/MPビーズ複合体と蛍光標識検出抗体とを、NDPOI/捕捉抗体/MPビーズ/検出抗体複合体を形成するための条件下で接触させる段階;および
(d)段階(c)の前記複合体から生成される蛍光シグナルであって、前記NDPOIの量を表す蛍光シグナルを検出する段階;
(e)試験治療薬を、それを必要とする前記患者に投与する段階;
(f)NDPOIを有する第二の生体試料を前記患者から得る段階;
(g)前記患者からの前記第二の生体試料を用いて段階(b)から(d)を繰り返す段階;および
(h)前記第二の生体試料から検出された前記蛍光シグナルと第一の生体試料からの前記シグナルとを比較する段階(この場合、前記検出される蛍光シグナルの低下が有効な治療薬を表す)
を含む方法。 - 前記NDPOIがAβオリゴマーである、請求項8に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が19.3であり、前記検出抗体が82E1である、請求項8に記載の方法。
- 対象となるニューロン由来タンパク質(NDPOI)に結合した治療抗体のターゲット・エンゲージメントを判定するための方法であって、
(a)哺乳動物に治療抗体を投与する段階;
(b)NDPOIを有する生体試料を前記哺乳動物から得る段階;
(c)前記生体試料と捕捉抗体/常磁性マイクロ粒子ビーズ(抗体/MPビーズ)とを、NDPOI/捕捉抗体/MPビーズ複合体を形成するために十分な条件下で接触させる段階;
(d)段階(b)の前記NDPOI/捕捉抗体/MPビーズ複合体と蛍光標識検出抗体とを、NDPOI/捕捉抗体/MPビーズ/検出抗体複合体を形成するための条件下で接触させる段階;および
(e)段階(c)の前記複合体から生成される蛍光シグナルであって、前記NDPOI/治療抗体のターゲット・エンゲージメントを表す蛍光シグナルを検出する段階
を含む方法。 - 前記NDPOIがAβオリゴマーである、請求項11に記載の方法。
- 前記捕捉抗体が19.3であり、前記検出抗体が82E1である、請求項11に記載の方法。
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