MX2014000480A

MX2014000480A - Metodo para la deteccion de oligomeros beta amiloide en una muestra de fluidos y usos de los mismos.

Info

Publication number: MX2014000480A
Application number: MX2014000480A
Authority: MX
Inventors: Alexander Mccampbell; Mary Savage; Paul Shughrue; Abigail Wolfe
Original assignee: Merck Sharp & Dohme
Priority date: 2011-07-13
Filing date: 2012-07-09
Publication date: 2014-06-23
Also published as: CA2840976A1; WO2013009703A2; RU2014105172A; BR112014000671A2; WO2013009703A8; EP2732289A2; US20130052670A1; AU2012282825B2; JP2014521089A; EP2732286A4; CN103782171B; DK2732289T3; US20140120037A1; EP2732286A1; EP2732289B1; CN103782171A; WO2013009667A1; AU2012282825A1; WO2013009703A3; ES2666840T3

Abstract

La invención en la presente se dirige a un inmunoensayo de oligómero Aß selectivo capaz de detectar confiable y sensiblemente oligómeros Aß en una muestra biológica de un paciente;e una modalidad el ensayo inventivo usa un par de anticuerpos anti-oligómero A, 19.3 y 82E1, para detectar y cuantificar los oligómeros Aß en una muestra de fluido cerebroespinal (CSF); el ensayo inventivo puede usarse para diferenciar pacientes con la enfermedad de Alzheimer (AD) de pacientes sin AD y/o estratificar los pacientes con AD de acuerdo con la gravedad de su enfermedad; el ensayo inventivo también puede ser usado como un ensayo de acoplamiento de objetivo que puede medir oligómeros Aß unidos a un punto final subrogado para la evaluación de la eficacia terapéutica y/o acoplamiento de objetivo.

Description

MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE OLIGÓMEROS BETA AMILOIDE EN UNA MUESTRA DE FLUIDOS Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un método para la detección de oligómeros beta amiloide (?ß) asociados con la enfermedad de Alzheimer (AD) en una muestra biológica. La invención también proporciona métodos para diagnosticar y evaluar tratamientos para la AD.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa devastadora caracterizada por la acumulación de placa ß amiloide (?ß) en las regiones del cerebro involucradas en el aprendizaje y la memoria. Aunque alguna vez se pensó que estas grandes placas insolubles causaban la AD, evidencia actual inidca que pequeños oligómeros difundibles de ?ß pueden ser los responsables. Los ligandos difundibles derivados de amiloide (ADDLs) son una especie de oligómeros de ?ß que pueden ser generada in vitro con propiedades similares a los oligómeros ?ß endógenos (Pat. de EEUU No. 6,218,506; Klein, et al., 2004, Neurobiol. Aqinq 25:569-580; Lambert, et al., 1998; Proa Nati. Acad. Sci. U. S. A.. 95:6448-6453. Los oligómeros ?ß están presentes en el cerebro de pacientes de AD, se unen a las neuronas, y e inducen déficits en la morfología neuronal en la memoria. Estudios con anticuerpos que se unen a los oligómeros ?ß han mostrado una mejora tanto en la morfología neuronal como en la memoria.

Aunque los ensayos para medir los monómeros ?ß son conocidos, que usan la actividad de las enzimas de ß- y ?-secretasa en la proteína precursora amiloide (APP), pocos ensayos han sido reportados que específicamente y confiablemente detectan los oligómeros ?ß en una muestra de fluido humano, tal como fluido cerebroespinal (CSF), tanto en control normal como en AD (Georganopoulou, et al., 2005, Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A,, 102:2273-2276; Fukumoto, et al., 2010, FASEB J., 24:2716-2726; Gao, et al., 2010, PLoS One. 2010 Dec. 30; 5(12):e15725). los ensayos de oligómero ?ß reportados han empleado un número de acercamientos, incluyendo los anticuerpos específicos de ADDL acoplados a una plataforma de amplificación de PCR de un bio-código de barras (Georganopoulou, et al., 2005), ELISAs de epítopos de superposición (Gandy, et al, 2010., Ann. Neurol., 68:220-230.; Xia, et al., 2009, Arch. Neurol.. 66:190-199), también apareado primero con cromatografía de exclusión de tamaño (Fukomoto, et al., 2010), y métodos de matrices de afinidad a amiloide (Gao, et al., 2010; Tanghe, et al., 2010, Int. J. Alz. Dis.. Sep. 2, pii: 17314), seguido por la disociación del oligómero y la medición con anticuerpos a monómeros ?ß.

Los oligómeros ?ß también han sido detectados usando electroforesis en gel seguido por transferencia western de cualquiera de CSF o cerebro (Klyubin et al., 2008, J. Neurosci.. 28:4231-4237; Hillen, et al., 2010, J. Neurosci.. 30:10369-10379), o subsiguiente a la cromatografía de explusción de tamaño (Shankar, et al., 2011 , Methods Mol. Biol., 670:33-44), con base en el peso molecular de los oligómeros que se mantienen después del procedimiento electroforético. Sin embargo, las técnicas electroforéticas y de transferencia no proporcionan la sensibilidad requerida para ver esas especies en CSF de control normal (Klyubin, et al., 2008). Además, los hallazgos por Georganopoulou demuestran un intervalo de 1000 veces de concentraciones de oligómero ?ß y representa la concentración como fM. Las especies de oligómero ?ß representan un amplio intervalo de pesos moleculares y, como tal, la asignación de una molaridad precisa es problemática. El ensayo de Georganopoulou es semi-cuantitativo y exhibe un intervalo de concentración de objetivo analítico de tres órdenes de magnitud, con un límite inferior de detección a 100 aM. Los métodos más reportados (Georganopoulou, et al. 2005; Gao, et al., 2010; Fukumoto, et al., 2010; Gandy, et al., 2010) no evaluó la selectividad entre las señales de los oligómeros ?ß en comparación con los monómeros ?ß, así que las concentraciones notadas requieren ser revisadas con precaución. El ensayo de Xia (Xia, et al., 2009, Arch. Neurol., 66:190-199), el ensayo como se comercializa por Immunobiological Laboratories, Inc. (Minneapolis, MN) reclama 320 veces la selectividad para sus dímeros ?ß1-16 en comparación con el monómero ?ß40, pero carece de la selectividad necesaria para evitar una reactividad cruzada con monómero ?ß en el CSF. Ya que se formula la hipótesis de que los oligómeros ?ß en el CSF están presentes a niveles de fM y monómeros ?ß de CSF están presentes entre 1.5-2 nM, un ensayo que mide selectivamente los oligómeros ?ß en una muestra de CSF debe tener una selectividad excepcional para los oligómeros ?ß sobre los monómeros.

Además de medir los niveles de oligómero ?ß dentro del CSF humano como un potencial biomarcador de enfermedad, los oligómeros ?ß también han sido usados como un objetivo para los anticuerpos monoclonales terapéuticos para tratar AD (vea, por ejemplo, Pat. de EEUU No. 7,811 ,563, 7,780,963 y 7,731,962. Se cree que estos anticuerpos tiene acceso al CNS y eliminan las especies tóxicas de ADDL del cerebro, a través de 1) cambio catalítico por la activación mediada por Fe de microglia, 2) eliminación de complejos de anticuerpo/ADDL en la vasculatura del cerebro, o 3) digestión enzimática de los ADDLs después de la unión del anticuerpo y un acceso mejorado de las enzimas degradativas, tal como neprilisin, enzima de degradación de insulina, plasmina; enzimas de conversión de endotelina (ECE-1 y -2), metaloproteinasas de matriz (M P-2, -3 y -9), y enzima de conversión de angiotensina (ACE). Así, una meta de un ensayo de oligómero ?ß selectivo es medir el cambio farmacodinámico (PD) en los oligómeros ?ß del sistema nervioso central despés de tratamiento con un anticuerpo anti-oligómero u otro tratamiento que altera la formación o eliminación de monómero/oligómero ?ß. Además, un ensayo que pueda específicamente habilitar la detección de oligómeros ?ß unidos a un anticuerpo anti-oligómero ?ß, es decir, un ensayo de acoplamiento de objetivo (TE), sería invaluable para la evaluación del anticuerpo terapéutico después del tratamiento.

La presente invención proporciona tales ensayos que son capaces de detectar confiable y sensiblemente los oligómeros ?ß en una muestra de fluido humano.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a un ensayo de oligómero ?ß selectivo capaz de detectar confiable y sensiblemente oligómeros ?ß en una muestra biológica, es decir muestra de fluido, de un paciente. Los ensayos inventivos usan un par de anticuerpos anti-oligómero ?ß altamente selectivos, 19.3 y 82E1 , para detectar y cuantificar oligómeros ?ß en una muestra de fluido cerebroespinal (CSF). En una modalidad, la invención es un ensayo farmacodinámico (PD) de oligómero ?ß selectivo que puede diferenciar a los pacientes con la enfermedad de Alzheimer (AD) de los pacientes sin AD y/o estratificar a los pacientes con AD de acuerdo a la gravedad de su enfermedad. En incluso otra modalidad, la invención es un ensayo de acoplamiento de objetivo (TE) de oligómero ?ß selectivo que puede medir oligómeros ?ß unidos como un punto final subrogado para la evaluación de la eficacia terapéutica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A-1C son representaciones gráficas que muestran la selectividad del anticuerpo anti-ADDL, 19.3, ña unión a las especies de ADDL de los oligómeros ?ß (barra media de cada conjunto), en comparación al monómero ?ß o fibril ?ß. La Figura 1A muestra la unión de ELISA de un panel de anticuerpos humanizados (h3B3) y anti-ADDL de afinidad madurada (14.2, 7.2, 11.4, 9.2, 13.1 , 17.1 , y 19.3) y tres anticuerpos de comparación (Comp 1, 2, y 3) al ?ß monomérico, ADDLs y ?ß fibrilar. El anticuerpo comparativo 2 es conocido por ser un anticuerpo no selectivo para ADDLs. Los fondos de este ensayo se determinaron al remover el anticuerpo de captura de la ELISA (sin mAb). Las barras de error representan el error estándar de la media. La Figura 1 B muestra, en un ELISA de un lado con placas revestidas con cualquiera de oligómero ?ß ( A) o monómero ?ß (¦), las afinidades relativas y las máximas características de unión del anticuerpo humanizado 19.3. La Figura 1C muestra una ELISA competitiva y las afinidades relativas de 19.3 para los oligómeros ?ß (A) y monómero ?ß (¦) revestidos en una placa de ELISA en la presencia de las especies competitivas en solución.

Las Figuras 2A-2C son representaciones gráficas que muestran la sensibilidad de los tres pares de anticuerpos en un formato ELISA sándwich usando quimioluminiscencia (EnVision® Multilable Reader, Perkin Elmer, Waltham, MA), como el método de detección y sus afinidades relativas para los oligómeros ?ß. La Figura 2A muestra representaciones del anticuerpo anti-oligómero ?ß 19.3 como el anticuerpo de captura y 82E1 como el anticuerpo de detección sobre un intervalo de concentraciones de oligómero ?ß. La Figura 2B y 2C representan 6E10 y 19.3, respectivamente, tanto como los anticuerpos de captura y detección. El par de ELISA sándwich 19.3 x 82E1 (Figura 2A) fue significativamente más sensible al detectar los oligómeros ?ß en comparación con los otros pares (Figura 2B y 2C).

La Figura 3 es una representación gráfica de la sensibilidad y selectividad para la detección de oligómeros ?ß (¦) en comparación con el monómero ?ß (A) usando los anticuerpos anti-oligómero ?ß 19.3 y 82E1 medido usando un detector de micro-partículas paramagnéticas, tal como el detector digital Erenna® (Singulex®, Almeda, CA). Uso del detector de micro partículas paramagnéticas significativamente mejoraron la sensibilidad para detectar los oligómeros ?ß con el par de anticuerpos 19.3/82E1.

Las Figuras 4A y 4B son representaciones gráficas de los niveles de oligómeros ?ß detectados en muestras de fluido cerebroespinal (CSF). La Figura 4A muestra que los niveles de los oligómeros ?ß fueron cuatro veces mayores en pacientes con AD en comparación con un control de edad coincidente, es decir, pacientes sin AD, en una evaluación ciega usando el método inventivo en la presente. Las diferencias fueron estadísticamente significativas para p < 0.0004 determinado usando una prueba t de dos vías y análisis de rangos de Mann Whitney, asumiendo que la población no era Gaussiana. La Figura 4B muestra que los niveles de oligómero ?ß fueron ocho veces mayores en los pacientes con AD en comapración con el control joven, es decir, pacientes sin AD, en una evaluación ciega usando el método inventivo en la presente. Las diferencias también fueron estadísticamente significativas entre estos grupos usando el mismo método estadístico como en la Figura 4A para un valor de p < 0.0021.

Las Figuras 5A y 5B son representaciones gráficas de los niveles de monómero ?ß en el CSF de cualquiera de AD clínicamente confirmado o control joven, es decir pacientes sin AD con una disminución correspondiente en los niveles de monómero ?ß42 y niveles sin cambio de monómero ?ß40 en las muestras de AD. Esto es representativo del patrón general observado para pacientes con AD y confirmó el estado de enfermedad de las muestras evaluadas en la Figura 4B. La Figura 5A muestra los niveles reducidos de monómero ?ß42 en las muestras de AD CSF. Las diferencias fueron estadísticamente significativas para p < 0.002 determinado usando una prueba t de dos vías y análisis de rangos de Mann Whitney, asumiendo que la población no era Gaussiana. La Figura 5B muestra los niveles sin cambio entre los dos grupos de monómero ?ß40.

La Figura 6 es una representación gráfica de la correlación entre las puntuaciones del Examen Mini-Mental State Exam (MMSE), como una medida del desempeño cognoscitivo, y los niveles de oligómero ?ß medido usando el ensayo inventivo descrito en la presente. Todos los pacientes representados en la Figura 4B se incluyeron en esta correlación. La correlación a -0.7445pg/mL de oligómeros ?ß fue significativa con p < 0.0001.

Las Figuras 7A y 7B son representaciones gráficas del ensayo de acoplamiento de objetivo. La Figura 7A es una representación de los complejos de anticuerpo anti-oligómero ?ß 19.3/oligómero ?ß formados ex vivo con salpicado en CSF humano (·) o búfer de Caseína (A). La Figura 7B es una representación de complejos de anticuerpo anti-oligómero ?ß 19.3/oligómero ?ß formados ex vivo con salpicado en CSF humano (·) o búfer de Caseína (Á). Sensibilidad diferencia fue observada en la detección de complejos de 19.3/oligómero ?ß en una ELISA de acoplamiento de objetivo de anti-cadena Kapa humana (captura) x 82E1 (detección) (Ejemplo 9). El anticuerpo de captura anti-Kapa diferenció deficientemente el anticuerpo anti-oligómero ?ß 19.3 de las especies de anticuerpo endógeno en el CSF humano.

La Figura 8 es una representación gráfica de la PK de un anticuerpo anti-ADDL 19.3 evaluado en fluido cerebroespinal de primate (tres macacos machos) (CSF) usando un modelo de macaco con puerto de cisterna magna después de la administración de una dosis IV de bolo de 20 mg/kg.

Aproximadamente a las 24 horas después de la dosis, el anticuerpo 19.3 estuvo presente en el CSF a 100 ng/mL.

Las Figuras 9A y 9B son representación gráficas del ELISA sándwich de oligómero ?ß, es decir el Ensayo Farmacodinámico (PD), y el ELISA sándwich de oligómero ?ß/anticuerpo, es decir el Ensayo de Acoplamiento de Objetivo, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los solicitantes en la presente proporcionan métodos capaces de detectar confiable y sensiblemente los oligómeros ?ß en el CSF de un paciente para uso tanto como una medida farmacodinámica y de acoplamiento de objetivo de oligómeros ?ß. Los métodos inventivos pueden diferenciar los pacientes con AD de los sin AD y estratifican el estado de enfermedad de AD con base en los niveles elevados de oligómeros ?ß de CNS en los pacientes con AD, similar a los usos previamente reportados para una proporción de tau/Abeta42 de CSF (De Meyer, et al., 2010, Arch. Neurol., 67:949-56). Más aún, un ensayo de oligómero ?ß, que detecta las especies más neurotóxicas, puede correlacionarse mejor y ser una medida más dinámica de los cambios en el desempeño cognoscitivo, en comparaicón con la deficiente correlación observada para los niveles de monómero ?ß. Los solicitantes demuestran en la presente po vez primera que un anticuerpo anti-oligómero ?ß administrado periféricamente puede penetrar la barrera de sangre-cerebro y unirse a los oligómeros ?ß y, cuando se usan en los métodos inventivos en la presente, pueden proporcionar un ensayo de punto final subrogado para la evaluación de agentes terapéuticos de AD.

Los solicitantes en la presente han desarrollado un ensayo altamente sensible para detectar y medir los niveles de una proteína neuronalmente derivada en una muestra biológica, es decir, una muestra de fluido, y usos de los mismos. En una modalidad de la invención, la proteína neuronalmente derivado es un oligómero ?ß y la muestra de fluido es una muestra de fluido cerebroespinal (CSF). El método inventivo usa dos anticuerpos anti-oligómero ?ß selectivos en un ELISA sándwich usando detección de micro partículas paramagnéticas. Aunque los oligómeros ?ß han sido encontrados en muestras biológicas, particularmente en CSF (Georganopoulou, et al., 2005; Klyubin, et al., 2008), los límites asociados con los métodos de detección conocidos (incluyendo tanto la sensibilidad como la selectividad) no han habilitado la detección confiable, por si solos, la cuantificación de los oligómeros ?ß para uso para clasificar el estado de la enfermedad del paciente o para el desarrollo de agentes terapéuticos de AD. Usando dos anticuerpos anti-oligómero ?ß,19.3 y 82E1 , junto con la detección de micro partículas paramagnéticas, los Solicitantes en la presente fueron capaces de desarrollar un ensayo de ELISA sándwich para detectar oligómeros ?ß en una muestra biológica a un límite de detección de 40 fg/mL. Usando este ensayo, los Solicitantes en la presente demuestran elevaciones altamente significativas en los oligómeros ?ß en muestras de AD clínicamente confirmadas en comparación con cualquiera de los jóvenes o controles de edad coincidente. Estas mismas muestras fueron usadas para medir los niveles de monómero ?ß42 y ?ß40 y se confirmó que en las muestras de AD de monómero ?ß42 fue significativamente reducido en comparación con los controles, aunque los niveles de monómero de ?ß40 no cambiaron. El ensayo inventivo de ELISA sándwich de oligómero ?ß demostró correlaciones significativas entre la concentración de oligómero de ?ß y el desempeño en una prueba cognoscitiva ampliamente usada para medir la gravedad del AD, conocido como el Examen de Estado Mini-Mental (MMSE); a mayor puntuación cognoscitiva (hasta un valor de 30, que es cognoscitivamente normal) menor el nivel del oligómero ?ß en el CSF. El ensayo de ELISA sandwich de oligómero ?ß inventivo puede ser utilizado con muestras adicionales de pacientes para generar más correlaciones con un fluido conocido, formación de imegen y biomarcadores cognoscitivos.

Además del ensayo farmacodinámico anterior, los Solicitantes han desarrollado un acoplamiento de objetivo (TE) que tienen la selectividad para un complejo de lgG2 humano/anti-oligómero ?ß de manera que puede ser usado con muestras de CSF humano. Como se describe en los ejemplos que siguen, el ensayo de TE descrito en la presente supera el desafío de distinguir selectivamente un anticuerpo lgG2 humano no nativo (un anticuerpo lgG2 anti-oligómero ?ß) de la plétora de anticuerpos IgG endógenos presentes en CSF humano. La selectividad del ensayo de TE se logró usando una captura de isotipo anti-lgG2 altamente selectivo (Southern Biotech, Birmingham, AL, #9060-05), un anticuerpo capaz de capturar un complejo de anticuerpo 2 de IgG de oligómero ?ß IgG 2/oligómero ?ß de entre las especies de lgG2 endógenas presentes en CSF humano. La detección del oligómero ?ß unido al anticuerpo19.3/isotipo lgG2 fue efectuada con un anticuerpo comercial, 82E1 (Immunobiological Laboratories, Inc., Minneapolis, MN). Este enfoque habilitó la detección confiable y consistente de los complejos de anticuerpo lgG2-19.3/oligómero ?ß, ya sea en búfer, en extractos de cerebro Tg2576 transgénico de animales tratados con un anticuerpo de oligómero ?ß, o en muestras de CSF humano salpicadas con un anticuerpo exógeno y oligómero ?ß.

Para habilitar un ensayo de sensibilidad única para detectar los complejos de un anticuerpo lgG2 anti-oligómero ?ß terapéutico unido a un oligómero ?ß, el anticuerpo anti-lgG2 humano es unido a una micropartícula magnética (MP) como se describe en el siguiente ensayo farmacodinámico (PD). El complejo MP/anti-lgG2 humano se mezcla con una muestra de CSF tomada de un individuo que fue dosificado con un anticuerpo anti-oligómero ?ß terapéutico del isotipo lgG2 (anticuerpo lgG2 terapéutico). Este anticuerpo anti-oligómero ?ß terapéutico será unido a cualquier especie de oligómero ?ß presente en la muestra de CSF del individuo. Este complejo MP/anti-lgG2/anti-oligómero ?ß/oligómero ?ß es mezclado con un segundo anticuerpo anti-oligómero ?ß, 82E1 , al que se une un tinte fluorescente (flúor). El complejo MP/anti-lgG2/anti-oligómero ?ß/oligómero ?ß/82?1 -flúor es lavado bien por virtud de propiedades magnéticas de las micropartículas y el complejo 82E1 -flúor es separado de las perlas para reducir los fondos. Las moléculas simples del 82E1-flúor representan los niveles originales complejos de anti-oligómeros ?ß/oligómero ?ß que estuvieron presentes en el CSF de los individuos dosificados. Este ensayo permitirá la confirmación de que el anticuerpo lgG2 terapéutico se acopló al oligómero ?ß anticuerpo lgG2 terapéutico (Figura 9B). Con la eliminación del oligómeros ?ß durante el tratamiento, el anticuerpo lgG2 terapéutico se acoplará a pocos oligómeros ?ß y de esta manera exhibirá una señal reducida. Entonces, el ensayo de acoplamiento del anticuerpo lgG2 terapéutico permitirá evaluar al anticuerpo terapéutico. El ensayo farmacodinámico (Figura 9A) también exhibirá una señal reducida, que se atribuirá a la presencia reducida de oligómeros ?ß, tal como después del tratamiento. En consecuencia, el ensayo farmacodinámico puede usarse como un subrogado de punto final para la evaluación de la eficacia de cualquier terapéutico usado para el tratamiento de AD.

La invención en la presente es un ensayo de ELISA sándwich sensible y selectivo que detecta y cuantifica los oligómeros ?ß endógenos en muestras de CSF de ambos individuos con AD y de control humano. El desarrollo del ensayo inventivo comienza la identificación de un hibridoma de ratón que produce anticuerpos selectivos para los oligómeros ?ß sobre ambos monómeros ?ß y fibrilos. El anticuerpo anti-oligómero ?ß selectivo, desarrollado por los Solicitantes (solicitud co-pendiente PCT/US2011/XXXXXX, que reclama prioridad de USSN 61/364,210) y referido en la presente como 19.3, se humanizó a un isotipo lgG2 y se caracterizó además por la afinidad a los oligómeros ?ß por ELISA de un lado, con un EC50 de aproximadamente 1.6 nM. Evaluaciones adicionales de la afinidad del anticuerpo 19.3 para los ADDLs en solución y en la fase sólida, en comparación al monómero ?ß, demostraron que el 19.3 tuvo aproximadamente 600 veces mayor selectividad para los oligómeros ?ß que cuando se evaluó en un formato de ELISA competitivo. La sensibilidad y selectividad del 19.3 para los oligómeros ?ß sugirió una utilidad potencial en un ELISA sándwich para la detección del oligómero ?ß.

El anticuerpo 19.3 fue evaluado como un reactivo de captura potencial para los oligómeros ?ß en combinación con tres diferentes anticuerpos como anticuerpos de detección 19.3, 7305 (Pat. de EEUU No. 7,780,963, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad), y 82E1 , después de su biotinilación, en un formato de ELISA sándwich. El 19.3 biotinilado fue examinado como un anticuerpo de detección y se apareó con 19.3 como el anticuerpo de captura, en una prueba de epítopos de superposición. La presencia de epítopos de superposición sería indicativa de una construcción de ?ß con múltiples epítopos, lo que sugiere la presencia de un dímero o de oligómeros ?ß de orden superior. El ELISA de epítopo de superposición 19.3 x 19.3 tuvo un limite de detección (LoD) para los oligómeros ?ß de 98 pg/mL (Figura 2C). Los ELISA sándwich para el par de anticuerpos 19.3 y 82E1 ("ELISA sándwich 19.3 x 82E1") (Figura 2A), así como el ELISA sándwich 19.3 x 7305 (datos no mostrados), (LoD) de 1.3 pg/mL, un limite de cuantificación confiable (LoRQ) de 4.2 pg/mL para los oligómeros ?ß y la proporción de la señal de oligómeros ?ß/monómero ?ß fue aproximadamente 1,000:1, mostrando que el ensayo fue 1 ,000 veces más selectivo para los oligómeros ?ß sobre el monómero ?ß40. Los solicitantes encontraron que el ensayo de epítopo sin superposición, es decir el ELISA sándwich 19.3 x 82E1, fue más sensible en comparación a los resultados publicados recientemente para un ensayo similar que emplea el anticuerpo ?ß 6E10 comercial (Figura 2B), lo que tuvo como resultado un limite de detección para los oligómeros ?ß de 98 pg/mL (Covance, Princeton, NJ) (Gandy, et al., 2010, Ann. Neurol., 68:220-230) e igualmente sensible en comparación al ensayo de epítopo se superposición ensayo empleando el anticuerpo 82E1 comercial (Xia, et al. 2009, Arch. Neurol.. 66:190-199) (Immunobiological Laboratories, Inc., Minneapolis, MN). Aunque los ELISA sándwich realizados usando detección de quimioliminiscencia (Figuras 2A, 2B, y 2C) fueron suficientes para detectar los estándares del oíigómero ?ß, reportes previos de niveles de oíigómero ?ß en CSF en el intervalo f (fg/mL) sugirieron que un ensayo de oíigómero ?ß a base de ELISA selectivo podría requerir de diez a cien veces mayores niveles de sensibilidad para detectar y cuantificar confiablemente los oligómeros ?ß en una muestra de CSF.

Para aumentar la sensibilidad del ensayo de ELISA sándwich, los Solicitantes evaluaron el desempeño de dos pares de anticuerpos en un sistema de detección de micro partículas paramagnéticas, específicamente el sistema Erenna® (Singulex®, Almeda, CA),que emplea la detección de un anticuerpo de detección marcado fluorescente que está desacoplado del complejo de ELISA sándwich. El desempeño del 19.3 x 82E1 ELISA sándwich 19.3 x 82E1 fue mejorado de manera que el par de anticuerpos 19.3 x 82E1 permitió la detección de las señales del oíigómero ?ß en muestras de CSF de AD a mayores niveles en comparación con cualquiera de muestras de edad coincidente o de control más jóvenes. Más específicamente, el ensayo LoD mejoró aproximadamente treinta veces, a 0.04 pg/mL, mientras que el LoRQ mejoró diez veces, a 0.42 pg/mL. De manera similar, la proporción de oligómero ?ß/monómero ?ß también fue mejorada, a 5,000:1. Como se midió con este ensayo, las muestras de CSF de AD tuvieron niveles reducidos de ?ß42 y niveles sin cambio de ?ß40 que fueron característicos de pacientes con AD. Tomados juntos, el ELISA sándwich 19.3 x 82E1 usando un sistema de detección de micropartículas paramagnéticas, fue capaz de medir confiable y específicamente las especies del oligómero ?ß en CSF humano.

El término "oligómeros ?ß" como se usa en la presente se refiere a especies de multímero de monómero ?ß que resultan de la auto-asociación de especies monoméricas. Los oligómeros ?ß son predominantemente multímeros de ?ß42, aunque los oligómeros ?ß de ?ß40 han sido reportados. Los oligómeros ?ß pueden comprender un intervalo dinámico de dímeros, trímeros, tetrámeros, y especies de orden superior después de la agregación de monómeros ?ß sintéticos in vitro o después de aislamiento/extracción de especies de ?ß de cerebro o fluidos corporales humanos. Los ADDLs son una especie de oligómeros ?ß.

El término "proteína neuronalmente derivada" o "proteína neuronalmente derivada de interés" como se usa en la presente se refiere a una proteína que se genera en y/o por las neuronas en el cerebro que será medido por los ensayos inventivos en la presente. En una modalidad de la invención en la presente, la proteína neuronalmente derivada es un oligómero ?ß que está presente en la muestra de fluido cerebroespinal (CSF) de un humano. Esta proteína se distingue de otros oligómeros ?ß que pueden ser formados de ?ß en células o tejidos diferentes de neuronas.

El término "ADDLs" o "ligandos difundibles de ß amiloide" o "ligandos de demencia derivados de ß amiloide" como se usa en la presente se refiere a estructuras oligoméricas neurotóxicas, solubles, globulares, no fibrilares que comprende dos o más monómeros de proteína ?ß. Las estructuras oligoméricas de orden superior pueden ser obtenidas no sólo de ?ß42, sino también de cualquier proteina ?ß capaz de establemente formar las estructuras oligoméricas ?ß?? solubles no fibrilares, tal como ?ß43 o ?ß40. La patente de E.U.A. No. 6,218,506 y WO 01/10900.

El término "fibrilos ?ß" o "fibrilos" o "amiloide fibrilar" como se usa en la presente se refiere a especies insolubles de ?ß que son detectadas en tejido de cerebro humano y de ratón transgénico debido a si birefringencia con tintes tales como tioflavina S. Las especies de ?ß que forman estructuras del tipo de fibra comprendidas de monómeros ?ß incluyen láminas plegadas de ß. Se cree que estas especies son precursores inmediatos de las estructuras de placa amiloide extracelular encontradas en el cerebro de AD.

El término "monómero ?ß40" o "monómero ?ß42" como se usa en la presente se refiere al producto directo de la disociación enzimática, es decir la actividad de la proteasa aspártica, por ß-secretasa y ?-secretasa en el precursor de proteína amiloide (APP) en un ambiente libre de células o celular. La disociación de APP por ß-secretasa genera las especies de ?ß comenzando en Asp 1 (numeración desde la secuencia peptídica de ?ß después de la disociación), mientras la ?-secretasa libera el extremo C de ?ß, predominanemente en cualquiera de los residuos 40 o 42.

El término "anticuerpo de captura" o "anticuerpo de captura de oligómero ?ß" o "anticuerpo de captura anti-lgG2 humano" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo que es usado como el anticuerpo de captura en los ensayos en la presente. El anticuerpo de captura como se usa en la presente se une a un oligómero ?ß o complejo de oligómero ?ß/anticuerpo que son medidos y/o detectados en la muestra de fluido. En una modalidad de la invención el anticuerpo de captura es el anticuerpo anti-oligómero ?ß 19.3 y el complejo detectado es 19.3/oligómeros ?ß. En otra modalidad el anticuerpo de captura es an anticuerpo de captura anti-lgG2 humano y el complejo detectado es lgG2/19.3/oligómeros ?ß.

El término "IgG" o "lgG2" como se usa en la presente se refiere a cualquier proteína que funciona como una molécula de anticuerpo. Cada IgG está compuesto de cuatro cadenas peptídicas— dos cadenas pesadas ? y dos cadenas ligeras. Cada IgG tiene dos sitios de unión a antígeno. Hay cuatro subclases de IgG (lgG1 , 2, 3, y 4) en humanos, nombrados en orden de su abundancia en suero (lgG1 siendo el más abundante). La estructura de las regiones colgantes da a cada una de las cuatro clases de IgG su perfil biológico único.

El término "cadena ligera kapa" como se usa en la presente se refiere a la porción de la Inmunoglobulina G (IgG) que contiene tanto un dominio de unión a antigeno como una región constante. Hay dos cadenas ligeras por molécula de anticuerpo, que pueden ser de cualquiera del tipo kapa o lamba, codificadas en los cromosomas 2 o 22, respectivamente. Dos cadenas ligeras kapa serán producidas dentro de los linfocitos B, junto con dos cadenas pesadas, ensambladas vía enlaces de bisulfuro para formar una molécula de anticuerpo de IgG completa, y secretada para funcionar como parte del sistema de defensa inmune humoral.

El término "muestra biológica" o "muestra de fluido" como se usa en la presente se refiere a cualquier tipo de fluido, en comparación a un tejido, o un vertebrado. Ejemplos típicos que pueden ser usados en los ensayos en la presente son sangre, orina, lágrimas, saliva, y fluido cerebroespinal, que es usado en una modalidad de la invención. Todos los otros tipos de fluidos también pueden ser usados si están presentes los oligómeros ?ß.

El término "enfermedad de Alzheimer" o "AD" o "trastorno amiloidogénico" como se usa en la presente se refiere al espectro de demencias o deterioro cognoscitivo que resulta de la degradación neuronal asociada con la formación o deposición de placas ?ß o maraña neurofibrilar en el cerebro del espectro de enfermedades, incluyendo pero no limitado a, Síndrome de Down, demencia del cuerpo de Lewy, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer preclínica, deterioro cognoscitivo suave debido a enfermedad de Alzheimer, activación temprana de la enfermedad de Alzheimer (EOD), enfermedad de Alzheimer familiar (FAD), deterioro cognositivo por el avance de la demencia debido a la enfermedad de Alzheimer (Jack, et al., 2011 , Alzheimer's Dement., May 7(3):257-262), y enfermedades asociadas con la presencia del alelo ApoE4.

El término "límite de detección" de "LoD" como se usa en la presente se refiere a la sensibilidad de los ensayos a la concentración más baja que puede ser detectada por encima de una muestra que es idéntica excepto por la ausencia de los oligómeros ?ß. La señal en la ausencia de los oligómeros ?ß es definida como el "Fondo". Coo se usa en la presente, el LoD para los oligómeros ?ß fue definida como > 3 desviaciones estándar por encima de la media del fondo.

El "límite inferió de cuantificación confiable" o "LLoRQ" como se usa en la presente se refiere a la sensibilidad del ensayo en combinación con el coeficiente de variabilidad para indicar la concentración más baja que puede ser confiable y reproduciblemente diferenciada del fondo. Este límite típicamente define el intervalo de trabajo práctico del ensayo en el extremo bajo de sensibilidad y es la concentración que suministra un coeficiente de variabilidad de < 20% a través> tres valores medidos.

Identificación y caracterización de anticuerpo de captura anti-oligómero A3 selectivo Para desarrollar un ensayo selectivo y específico para los oligómeros ?ß, los Solicitantes primero pensaron identificar un anticuerpo que fuera tanto selectivo para y específico para ADDLs, una especie no fibrilar de oligómeros ?ß. Fue generado un anticuerpo monoclonal de ratón anti-ADDL, 3B3, {Pát. de EEUU Nos. 7,811 ,563 y 7,780,963) al inmunizar ratones con las especies de oligómero ?ß?? de ADDL mezcladas 1 :1 con cualquiera de Freund (primera y segunda vacuna, subcutáneamente) o Adyuvante Incompleto de Freund (todas las vacunaciones subsiguientes, intraperitoneales). Cada inyección consistió de ADDLs purificados equivalentes a 194 ± 25 pg totales de proteina. El bazo del ratpon con la titulación más alta en suero fue fundido con células de mieloma SP2/0 en la presencia de polietilen glicol y se colocaron en placas en placas de 96 pozos. Las células fueron cultivadas a 37°C con 5% de CO2 por 10 días en 200 pL de medio de selección de hipoxantins-aminopterins-timidins (HAT). Los cultivos fueron alimentados una vez con Medio de Dulbeco Modificado de Iscove (IMDM), (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) en el día 10, y los sobrenadantes del cultivo fueron removidos en el día 14 para examinar para positivo, los pozos que contenían el anticuerpo de oligómeros ?ß usando un ELISA de un lado (Ejemplo?). El anticuerpo 3B3 fue seleccionado para desarrollo adicional con base en su capacidad de unirse preferencialmente a los ADDLs en comparación al monómero ?ß o fibrilos ?ß (Figura 1A).

El clon de ratón 11/3B3 fue convertido a un anticuerpo lgG2 humano y se designó como 19.3. Las regiones de dominio variable de cadena ligera y pesada de 3B3 que codifican el dominio de unión del oligómero ?ß fueron secuenciadas y ADNc generado que codifica esos CDR se introdujo en un contexto de lgG2 humano. Se generó una biblioteca de maduración de afinidad con los dominios variables de cadena pesada y ligera de 3B3 introducido dentro del vector de despliegue de fago. Los productos de la ligación se transfectaron dentro de células TG1 de E.coli y se tituló el sobrenadante de cultivo de fago producido, se concentró y se hicieron alícuotas para la adsorción de la biblioteca de fago. La adsorción de la biblioteca de fago luego fue conducida usando oligómeros ?ß biotinilados. Los fagos unidos a los oligómeros ?ß biotinilados fueron eluidos y agregados de nuevo a células TG1 de E.coli. Los oligómeros ?ß biotinilados fueron preparados usando los mismos métodos (Ejemplo 1) que los oligómeros ?ß, pero comenznando con el péptido AB42 biotinilado en el extremo N (American Peptide, Sunnyvale, CA). Los sobrenadantes de fago (aproximadamente 100 µ?) se usaron directamente para análisis en el ELISA de unión diferencial del monómero ?ß, oligómero ?ß, y fibrilo ?ß descrito antes.

El anticuerpo anti-oligómero ?ß 19.3, generado de la biblioteca de maduración de afinidad de cadena ligera de 3B3, ha sido descrito y caracterizado en la solicitud co-pendiente PCT/US2011/XXXXXXX, reclamando prioridad de 61/364,210, presentada el 14 de julio, y como se usa en la presente es anticuerpo aislado que comprende: una región variable de cadena ligera que tiene la secuencia (SEQ ID NO:1) Ala Ser Arg Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser He Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu lie Tyr Lys Ala Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Me Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe GIn Gly Ser Arg Leu Gly Pro Ser Phe Gly GIn Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys; una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia (SEQ ID NO: 2) Glu Val GIn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val GIn Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg GIn Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Tyr lie Ser Arg Gly Ser Ser Thr lie Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu GIn Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Me Thr Thr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly GIn Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser; y una región constante de caena pesada que tiene la secuencia (SEQ ID NO: 3) Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu GIn Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr GIn Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Me Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys.

Selectividad del oligómero A3 del anticuerpo anti-oligómero A3 19.3 Para confirmar la potencia de unión de 19.3 para los oligómeros ?ß, en comparación al monómero ?ß40, se completaron ELISA de un lado usando oligómeros ?ß separados o placas revestidas con monómero ?ß40 con una curva de titulación común del anticuerpo (Figura 1B). El EC50, una medida de la unión máxima total media al oligómero ?ß, de 19.3 fue 1.6 nM y 4.3 nM para los oligómeros ?ß y ?ß40, respectivamente. En este formato el anticuerpo 19.3 demostró aproximadamente tres veces mayor unión máxima para los oligómeros ?ß en comparación al monómero ?ß40, mientras que la potencia fue aproximadamente 3.7 veces mayor. Como se muestra en la Figura 1 B, 19.3 tuvo una mayor afinidad para los oligómeros ?ß contra el monómero ?ß40 cuando ambos son inmovilizados independientemente en una superficie de placa de ensayo. Entonces, aunque el anticuerpo anti-oligómero ?ß 19.3 identificado en la presente se une selectivamente a los oligómeros ?ß sobre el monómero ?ß40 cuando cada uno está independientmente unido a una placa de ensayo, los Solicitantes pensaron comparar además las propiedades de unión relativa de 19.3 cuando ambas especies de oligómeros ?ß y monómero ?ß estuvieran concurrentemente presentes, tal como esa que podría ocurrir en un fluido corporal o muestra de tejido, ya sea en solución o inmovilizado en una placa de ensayo.

Para representar de manera más precisa una muestra de CSF ¡n vivo, donde ambos oligómeros ?ß y monómeros ?ß puedan estar presentes, la afinidad de 19.3 para los oligómeros ?ß en la presencia de monómero ?ß40 fue probada en un formato de ELISA competitivo (Figura 1C). La placa de ELISA fue preparada primero revistiendo con una preparación de los oligómeros ?ß a 50 pmoles por pozo y luego agregando el anticuerpo 19.3 a una concentración final de 2 nM a cada pozo. Esta concentración de 19.3, es decir 2 nM, representa la concentración de EC50 para la unión de los oligómeros ?ß determinada en el ELISA de un lado (Figura 1 B). Agregar monómero ?ß40 en una curva de titulación para remover competitivamente el 19.3 de la superficie revestida con oligómero ?ß resultó en un EC50 de 5.5 µ?. Cuando 100 pmoles por pozo de monómero ?ß40 fue usado para revestir la placa de ELISA y los oligómeros ?ß fueron usados para competir para la unión al anticuerpo, el EC50 fue 8.7 nM. Esto indicó que el 19.3 tuvo mayor afinidad para los oligómeros ?ß, tanto en solución como en una fase sólida, en comparación al monómero ?ß40. En consecuencia, la concentración de ?ß40 requerida para desplazar 50% de 19.3 de los oligómeros ?ß fue aproximadamente 600 veces mayor que la concentración de oligómeros ?ß requerida para desplazar la unión de 19.3 al ?ß40. Concentraciones hasta de 0.200 pM de oligómeros ?ß han sido reportadas en CSF de pacientes con AD (Georganopoulou, et al., 2005, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 102:2273-2276) en comparación a 1500 pM de monómero ?ß. Entonces, el anticuerpo 19.3 pareció tener el grado de selectividad que pudiera requerirse para detectar los oligómeros ?ß sobre los niveles de los fondos del monómero ?ß. El anticuerpo 19.3 fue acoplado con un anticuerpo de detección, 82E1, previamente reportado en los formatos de ELISA para detectar los oligómeros ?ß en cerebro de AD (Xia, et al., 2009, Arch. Neurol., 66:190-199) para desarrollo de ensayo posterior. Cuando el 82E1 (Immunobiological Laboratories (IBL), Inc., Minneapolis, MN) fue usado como tanto el anticuerpo de captura como de detección, el ELISA 82E1/82E1 , este anticuerpo tuvo selectividad inferior al nivel requerido para uso con CDF humano (datos no mostrados).

Anticuerpos que prefieren el oligómero A3 en ELISA sándwich de oligómero A3 En una investigación de pares de anticuerpos de captura y detección en un formato de ELISA sándwich (Cuadro 1), la combinación de 19.3 como el anticuerpo de captura con cualquiera de 7305, un anticuerpo anti-oligómero ?ß (20C2, Pat. de EEUU No. 7,780,963, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad) o 82E1 (Immunobiological Laboratories (IBL), Inc., Minneapolis, MN) se desempeñaron de forma comparativa en búfer de bloqueo de Caseína en una curva estándar de oligómero ?ß, cada uno dando un límite de detección (LoD) bajo 4 pg/mL (Figura 2A). Uso de un anticuerpo anti-monómero ?ß tanto como anticuerpo de captura como de detección ha sido reportado como un ensayo de oligómero ?ß, sin embargo, los niveles absolutos de sensibilidad o selectividad ya sea no fueron reportados (6E10/6E10; Gandy, et al., 2010, Ann. Neurol., 68:220-230), o la selectividad fue menor (82E1/82E1 ; Xia, et al., 2009, Arch. Neurol., 66:190-199) de lo deseado para un ensayo para medir oligómeros ?ß en CSF humano.

Aunque ni Gandy ni Xia han reportado la detección de oligómeros ?ß en CSF humano, el trabajo interno con los Solicitantes con 6E10 y reportes publicados por IBL con 82E1 sugieren que su sensibilidad puede estar en el intervalo necesario para la detección de oligómero ?ß en CSF humano. Los Solicitantes compararon en la presente el uso de anticuerpos idénticos tanto para anticuerpos de captura como de anticuerpo de detección, tal como 6E10/6E10 (Figura 2B) y 19.3/19.3 (Figura 2C), así como pares de ensayo de ELISA sandwich usando 19.3 como un anticuerpo de captura únicamente (Figura 2A, con detección de 82E1). Como se muestra en el Cuadro 1, ambos de 6E10/6E10 y 19.3/19.3 demostraron aproximadamente cien veces de reducción de sensibilidad en comparación a cualquiera de 19.3/7305 o 19.3/82E1. El ELISA de 19.3/82E1 utilizando tecnología de detección de luminiscencia (lector de placa EnVision® Multilabel, PerkinElmer, Waltham, A) (Figura 2A), generó un LoD de aproximadamente 1.3 pg/mL. En este formato de ensayo, el LLoRQ del oligómero ?ß fue 4.2 pg/mL (con coeficientes de varianza menores que 20% en este medición más baja) y el ensayo fue aproximadamente 1000 veces selectivo para la señal de oligómero ?ß en comparación al monómero ?ß4?5. Aunque este ensayo fue usado para evaluar la preparaciones de oligómero ?ß, no fue suficientemente sensible para detectar de manera confiable los niveles de oligómero ?ß en CSF humano a niveles consistentes con estimados previos (Georganopoulou, et al., 2005, Proc,. Nati. Acad. Sci. U.S.A.. 102:2273-2276). El ELISA sándwich de 19.3 x 82E1 avanzó en una plataforma de inmunoensayo de detección de microparticulas paramagnéticas que según lo reportado tiene mayor sensibilidad para detectar analitos en los fluidos corporales humanos (Erenna®, Singulex®, Alameda, CA).

CUADRO 1 1 sensibilidad reducida en comparación a 19.3 x 82E1 1 Fondos inaceptables en CSF humano (reactividad cruzada de fibrinógeno) ' selectividad reducida en comparación a 19.3 x 82E1 ELIS sándwich selectivo de oligómero A3 con sensibilidad mejorada Ambos de los pares de anticuerpos de 19.3 y 7305 (19.3 x 7305) y el 19.3 y 82E1 (19.3 x 82E1) (Cuadro 1) fueron evaluados en un ELISA sándwich usando un sistema de inmunoensayo de detección de micropartículas paramagnéticas, Sistema de Inmunoensayo Erenna® (Singulex®, Almeda, CA) para determinar si la sensibilidad del ensayo puede mejorar más para la medición de los oligómeros ?ß en muestras de fluido de primate humano y no humano. En una modalidad de la invención, el immunoensayo fue realizado usando muestras de CSF humano.

Aunque los inmunoensayos de micropartículas paramagnéticas, tal como el Sistema de Inmunoensayo Erenna®, ha sido usado para biomarcadores presentes en una muestra biológica en el intervalo nanomolar (nM), tal como ?ß40 y ?ß42, no ha sido demostrado antes del trabajo de los Solicitantes en la presente que tal sistema de inmunoensayo puede específicamente y confiablemente detectar un biomarcador presente en una muestra de CSF en el intervalo femtomolar (fM), tal como los oligómeros ?ß en la presente. Sin desear limitarse por ninguna teoría, los Solicitantes creen, y han demostrado, que la especificidad y la sensibilidad de los ensayos reclamados es atribuíble a la especificidad y sensibilidad del par de anticuerpos anti-ADDL seleccionados y usados en el ELISA sándwich. De manera similar, aunque los Solicitantes han usado el Sistema de Inmunoensayo Erenna® para ilustrar el ensayo reclamado, es posible que puedan emplearse otros sistemas de detección que tienen sensibilidades comparativas en los métodos inventivos.

El ELISA sándwich 19.3 x 7305 fue realizado usando el Sistema de Inmunoensayo Erenna® (Singulex®, Almeda, CA), acoplando covalentemente el anticuerpo 19.3 a las perlas de micropartículas Erenna® (MP) (en lo siguiente "perlas de 19.3/MP"). Las perlas de 19.3/MP entonces fueron mezcladas con búfer conteniendo la curva estándar de cualquiera de oligómero ?ß o ?ß40 monomérico. El complejo resultante de perla de 9.3/ P/oligómero ?ß o ?ß40 (en lo siguiente "complejo de oligómero ?ß") fue lavado y ya sea marcado fluorescentemente 7305 o el anticuerpo de detección 82E1 fue unido al complejo de oligómero ?ß. El instrumento Erenna®, usando una tecnología de detección propia capaz de contar moléculas sencillas (vea la Pat. de EEUU No. 7,572,640), midió el anticuerpo de detección marcado fluorescentemente después de su liberación del ELISA sándwich. Como se muestra en el Cuadro 2 los datos del ensayo 19.3 x 7305, usando una dilución de dos veces del oligómero ?ß estándar en búfer, se alinearon con una dilución lineal de dos veces de la señal fluorescente (media de los eventos detectados). Las señales generadas por el CSF de macaco puro, o CSF al que se introdujo una curva estándar de los oligómeros ?ß, demostró que la señal fluorescente atribuible a la unión del anticuerpo 7305 marcado fue equivalente en ambos casos, mientras que el ensayo sandwich de 19.3 x 82E1 pudo detectar los oligómeros ?ß salpicados a través de la curva estándar completa. En el formato de ensayo usando 7305 como el anticuerpo de detección, esto fue indicativo de que no hubo fondos específicos (de algo presente en el CSF de macaco) saturando sobre el intervalo de las series de dilución de los oligómeros ?ß que fue suficiente para detectar los oligómeros ?ß en búfer solo. Subiguientemente, se encontró que la señal fluorescente era idéntica a esa para una microparticula desnuda, incluso en la ausencia del acoplamiento de anticuerpo 19.3 (datos no mostrados), lo que también fue consistente con una señal no específica debido a la reactividad cruzada del anticuerpo 7305.

CUADRO 2 Una segunda modalidad del ELISA sándwich de oligómero ?ß selectivo desarrollado usando el Sistema de Inmunoensayo Erenna® reemplazó el anticuerpo de detección 7305 con 82E1 , también acoplado a una etiqueta fluorescente. Como se muestra en el Cuadro 3, esta modalidad del ensayo eliminó la señal no específica tanto en la muestra de macaco pura de CSF como en la agotada de oligómero ?ß, además apoyando la creencia de que el anticuerpo 7305 fue la fuente de la señal no específica. Sin desear limitarse por ninguna teoría, se cree que la señal alta de los fondos observada para el par de anticuerpo 19.3/7305 se debió a la unión de fibrinógeno de la CSF a las perlas de MP, lo cual no fue observado para el par de anticuerpos 19.3/82E1. Esta modalidad del ELISA sándwich selectivo de oligómero ?ß generó un LoD de los estándares de oligómero ?ß a 0.04 pg/mL, un LLoRQ a 0.42 pg/mL y 5,000 veces de selectividad del ensayo para los oligómeros ?ß sobre monómero de ?ß 40 (Figura 3). Con base en estos hallazgos, los Solicitantes seleccionaron este formato de ensayo para optimización posterior.

CUADRO 3 Ensayo farmacodinámico (PD) Usando los hallazgos anteriores, los Solicitantes han desarrollado un ELISA sándwich de oligómero ?ß selectivo, usando el par de anticuerpos 19.3 y 82E1, para detectar y medir los niveles de oligómeros ?ß en una muestra de CSF. Este ensayo será denominado en adelante el ensayo farmacodinámico (PD) ensayo para su uso para evaluar los cambios en el analito, es decir los niveles del oligómero ?ß, (Figura 9A) después de tratamiento para inhibir la producción, aumentar la eliminación, o en contrario para modificar los niveles de oligómero ?ß.

El ensayo PD también puede ser usado para diferenciar los pacientes con AD de los sin AD, es decir diagnosticar, para vigilar la progresión de la enfermedad, es decir prognóstico, o para vigilar el potencial terapéutico de un tratamiento que modifica la enfermedad para cambiar las concentraciones del oligómero ?ß.

El ensayo PD, como se describe en el Ejemplo 7, colocó el anticuerpo 19.3 acoplado a una perla de micropartícula paramagnética (MP) (perla de MP/19.3) dentro de un pozo en una placa de ELISA. Al pozo se agregó ya sea CSF humano o un estándar de oligómero ?ß (en una serie de dilución añadida a un búfer de Tris y albúmina de suero bovino). Cualquier oligómero ?ß presente en el pozo fue unido por la perla de 19.3/MP y la solución en exceso fue eliminada. El 82E1 marcado fluorescente, como el anticuerpo de detección, sin un búfer de ensayo (búfer Tris con 1% de tritón X-100, d-destiobiotina, BSA), se agregó al complejo lavado de perla de MP/19.3/oligómero ?ß y se incubó, para unir el complejo de oligómero ?ß. El complejo resultante de perla de MP bead/19.3/oligómero ?ß/82?1 se lavó con un búfer de elución y el anticuerpo 82E1 marcado fluorescente es eluído con cualquier anticuerpo sin unir. La detección con el detector de micropartículas paramagnéticas detector, tal como el instrumento Erenna®, en el que la solución fluye y es excitada por un láser, permite la detección de moléculas sencillas (la etiqueta fluorescente emite fotones de una longitud de onda de luz específica) para generar y medir una señal fluorescente, equivalente a las moléculas detectadas, es decir al oligómero ?ß. Una curva estándar de oligómeros ?ß, medida con el instrumento Erenna®, en comparación a los monómeros ?ß es mostrada en la Figura 3.

Oligómeros ?ß en CSF humano El ELISA sándwich selectivo de oligómero ?ß de 19.3 x 82E1 del Ejemplo 6 fue usado para medir los niveles endógenos de los oligómeros ?ß en muestras de CSF humano (Figuras 4A y 4B). En dos cohortes de muestras separadas, la señal fluorescente, generada por la presencia de oligómeros ?ß, se elevó significativamente en CSF de AD (clínicamente diagnosticado usando una puntuación de MMSE inferior a 25 como AD probable) el CSF en comparación cualquiera de los controles jóvenes o sanos de edad coincidente. Los niveles absolutos de oligómeros ?ß observados fueron 2.1 +/- 0.61 pg/mL en AD (N =20) y 0.53 +/ -0.26 pg/mL en control de edad coincidente (N = 10) en las muestras de CSF de Precisión Medicine (Solana Beach, CA) con una puntuación de prueba t, dos vías Mann-Whítney de p<0.0004 (Figura 4A). Los niveles absolutos de oligómeros ?ß observados fueron 1.66 +/- 0.5 pg/mL en AD (N = 10) y 0.24 +/-0.05 pg/mL en control (N = 10) en las muestras de CSF de Bioreclamation (Hicksville, NY), con una puntuación de prueba t, dos vías Mann-Whitney de p<0.0021 (Figura 4B). Combinando las dos cohortes, 90% de las muestras de CSF de AD diagnosticadas fueron superiores al LLoRQ de 0.42 pg/mL, mientras que solo 20% del control de edad coincidente o 10% de los controles jóvenes estuvieron sobre este límite. Todos los calores estuvieron arriba del LoD de 0.04 pg/mL Los niveles de monómero de ?ß40 y ?ß42 fueron medidos en las muestras de CSF obtenidas de Bioreclamación (Figuras 5A y 5B, respectivamente) y fueron comparables entre las de CSF de AD y control CSF para ?ß40 (Figura 5A), mientras que fueron reducidas significativamente en las muestras de AD para ?ß42 (Figura 5B). Esto ha sido previamente reportado como una característica (De Meyer, et al., 2010, Arch. Neurol. 67:949-956; Jack, et al., 2010, Lancet Neurol. 9.119-128) de CSF de AD y confirmó el diagnóstico correcto de estas muestras. Sin desear limitarse por ninguna teoría, los Solicitantes creen que los niveles inferiores de ?ß42 en las muestras de CSF de AD se debe a la retención de ?ß42 en los depósitos amiloides del cerebro de AD. La capacidad de detectar y cuantificar específicamente estas diferencias observadas sugiere que esos biomarcadores pueden usarse como una medida de diagnósitco y prognósitco para AD.

Para un ensayo de diagnóstico, la señal, es decir el nivel de oligómeros ?ß, detectado del ensayo inventivo en la presente sería típicamente mayor a tres veces más alto para un paciente con AD (a un nivel > 0.5 pg./mL) en comparación a la señal observada para pacientes sin AD. Esto es consistente con los datos mostrados en ambas de la Figura 4A, en la que los niveles de oligómeros ?ß en el CSF de AD en comparación con los controles de edad coincidente fue cuatro veces más alto y en Figura 4B, en la que los niveles de oligómeros ?ß en CSF de AD fue ocho veces más alto. Estos datos también apoyan el uso del ensayo de oligómero ?ß inventivo para identificar pacientes en etapas tempranas de la enfermedad (es decir, un ensayo de prognóstico). La edad es el factor de riesgo más grande para el desarrollo del AD y las diferencias observadas entre AD y los controles de edad coincidente fueron menores entre AD y los controles jóvenes. De manera similar, para un ensayo de oligómero ?ß de prognóstico, los pacientes que tienen un MMSE inferior a 25 podrían tener una señal de oligómero ?ß detectada de >0.5 pg/mL (cuatro a ocho veces más alta que los pacientes con MMSE por arriba de 25/normal) en comparación a la señal detectada para monómero de ?ß42, que es aproximadamente dos veces menor en el CSF de AD en comparación a los controles. La Figura 6 sugiere que si una puntuación de MMSE de < 25 es usada como un corte (Mungas, D., 1991, Geriatrics 46 (7): 54-58), arriba del cual un paciente es considerado 'sano normal' y por debajo del cual un paciente es considerado ya sea con deterioro cognoscitivo suave, o como teniendo AD, se esperaría que por arriba del nivel de oligómero ?ß de 0.5 pg/mL, el paciente probablemente tendría una puntuación de MMSE inferior a 25.

Ensayo de acoplamiento a objetivo (TE) De manera similar, usando los hallazgos anteriores, los Solicitantes han desarrollado un ELISA sándwich selectivo, usando un par de anticuerpos anti-lgG2 humano x 82E1, para detectar y cuantificar los niveles de oligómeros ?ß unidos en una muestra de CSF de un paciente tratado con el anticuerpo lgG2, 19.3 anti-oligómero ?ß, es decir un anticuerpo terapéutico.

Este ensayo en lo siguiente será denominado el ensayo de acoplamiento a objetivo (ensayo TE) para su uso para medir los oligómeros ?ß unidos ¡n vivo a un anticuerpo terapéutico (captura). Como tal, el ensayo TE puede usarse para medir niveles de oligómeros ?ß unido a un anticuerpo terapéutico para confirmar el acoplamiento del oligómero ?ß por el agente terapéutico. Sin desear limitarse por ninguna teoría, los Solicitantes creen que el nivel de oligómeros ?ß unido a un anticuerpo terapéutico anti-oligómero ?ß será menor en muestras de CSF de sujetos que han sido tratados con el tiempo con dicho agente terapéutico. Los niveles de los oligómeros ?ß unidos que aumentan o que no cambian después de la administración sugerirían que el agente terapéutico no es adecuado para el tratamiento de AD. Alternativamente, puede ser el caso de que meramente al secuestrar los oligómeros ?ß y uniéndolos al anticuerpo terapéutico, puede obtenerse un beneficio en un desempeño preciso, debido a una reducción en la interacción con las neuronas en el cerebro. Son embargo, este beneficio puede no estar asociado con un cambio en los oligómeros ?ß per se. El ensayo de acoplamiento de objetivo evaluará, a un mínimo, la capacidad de un anticuerpo terapéutico de acoplarse a los oligómeros ?ß dentro del CSF.

Para demostrar la capacidad de los anticuerpos específicos de oligómero ?ß de acoplarse a los oligómeros ?ß en una matriz de CSF humano, los Solicitantes generaron los complejos de 19.3/oligómeros ?ß dentro del CSF humano salpicando en el anticuerpo anti-oligómero ?ß 9.3 a niveles que se creen presentes a las 24 horas en macacos dosificados IV con 20 m/k (100 ng/mL, Figura 8). A esta muestra de CSF humano salpicada con 19.3 se agregó una cantidad escalada de estándares de oligómero ?ß, tanto igualando las concentraciones de oligómero ?ß endógeno (0.1-5.0 pg/mL) (Figuras 4A y 4B) asi como elevándolas significativamente por arriba de los intervalos normales. Los complejos de 19.3 x oligómero ?ß formados en el CSF humano fueron capturados en placas de ELISA de 96 pozos revestidas con cualquiera de anticuerpo a la cadena ligera kapa humana o anticuerpo a lgG2 humano, luego detectado con 82E1 biotinilado (b82E1) como fue realizado para el ensayo de PD (Figura 3A). El anticuerpo anti-oligómero ?ß 19.3 fue suficientemente reconocido por ambos del kapa anti-humano e lgG2 anti-humano en búfer (A , Figuras 7A y 7B), ya que el anticuerpo contiene ambos de estos aspectos. Como se muestra en la Figura 7A (·, CSF), el ensayo usando lgG2 anti-humano como el anticuerpo de captura y 82E1 como el anticuerpo de detección, para detectar y medir el complejo de 19.3/oligómero ?ß, resultó en una sensibilidad significativamente mejor en CSF humano en comparación al ensayo usando kapa anti-humano como el anticuerpo de captura (·, CSF, Figura 7B). Ambos ensayos tuvieron sensibilidad equivalente en un búfer de Caseína. El uso de kapa anti-humano para capturar el complejo de 19.3/oligómero ?ß resuló en una menor sensibilidad, a un LoD de 42 pg/mL de oligómero ?ß unido a 100 ng/mL de 19.3, quizá debido a mayores niveles de fondos de las especies de IgG con una cadena ligera kapa en el CSF humano en comparación a la especie lgG2, lo que resultó en una mayor sensibilidad para el formato de ensayo usando un anti-lgG2. Después de la dosificación de cualquiera de humanos o animales experimentales con 19.3 o un anticuerpo relacionado lgG2 anti-oligómero ?ß como un anticuerpo terapéutico, se podría esperar que el anticuerpo terapéutico a ser representado en el CSF a 0.1-0.2% del nivel dosificado (Thompson, 2005, Proteins de the Cerebrospinal Fluid, Elsevier Academic Press, NewYork, NY). El anticuerpo terapéutico presente en el CSF podría unirse a oligómeros ?ß disponibles, los complejos de 19.3 (lgG2)/oligómero ?ß podrían ser capturados con el anticuerpo de captura anti-lgG2 a través del anticuerpo anti-humano 19.3, lgG2, y los complejos de oligómero ?ß entonces serían detectados con 82E1. La sensibilidad de esta platforma probablemente mejoraría usando un sistema de detección de micropartículas paramagnéticas, tal como el sistema de inmunoensayo Erenna® (Singulex®, Alameda, CA), utilizado en el ensayo de PD anterior.

Con el tiempo, después de tratamiento terapéutico con un anticuerpo anti-oligómero ?ß, se espera que la señal detectada para los complejos de 19.3/?ß-?? |???ß > se reduciría (en comparación a los niveles pre-tratamiento). La cantidad de oligómero ?ß unido, ya sea medido para estos complejos de manera precisa o después de un periodo de tratamiento terapéutico, representa la proporción del anticuerpo terapéutico acoplado con el objetivo, es decir los oligómeros ?ß, y puede servir como un subrogado para la eficacia del anticuerpo terapéutico.

EJEMPLOS Las siguientes abreviaturas se usan en la presente: Ab: anticuerpo; ?ß: proteína beta amiloide; AD: enfermedad de Alzheimer; ADDLs: ligandos difundibles derivados de ß amiloide; aM: atomolar; CSF: fluido cerebroespinal; DE media: media de eventos detectados; DMSO: dimetilsulfóxido; HFIP: 1 ,1,1 ,3,3,3 hexafluoro-2-propanol; HMW: alto peso molecular; LMW: bajo peso molecular; LoD: límite de detección;; LLoRQ: limite inferior de cuantificación confiable.

EJEMPLO 1 Preparaciones de ADDL y ?ß ?ß40 y ?ß42 (péptido amiloide ß 1-40, péptido amiloide ß 1-42) fueron obtenidos de la American Peptide Co., Sunnyvale, CA. ?ß42 fue disuelto en 1 ,1 ,1 ,3,3,3 hexafluoro-2-propanol (HFIP), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, para eliminar cualquier estructura secundaria pre-existente que pudiera actuar como una "semilla" de agregación. El HFIP fue removido por evaporación para formar una película de ?ß42. La película de péptido ?ß42 (1 mg ?ß42 secado de 100% de solvente HFIP) fue disuelta en 44 L de DMSO, al cual 1 ,956 µ? de medio frío F12 (GIBCO®, Invitrogen, Carisbad, CA, Cat # ME100014L1) fue agregado con agitación suave y se incubó a temperatura ambiente por 18 a24 horas. Las muestras fueron centrifugadas a 14,200 g por 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante fue transferido a un tubo fresco y se filtró a través de un tubo de filtro de columna de 0.5 mi YM-50 (Millipore, Bedford MA; Cat# UFC505096, 0.5 mi) vía rotación a 4,000 rpm por 15 minutos a 4°C. El retenido fue recolectado al revertir el inserto de filtro, reemplazado dentro de un nuevo tubo de recolección, y centrifugado a 4,000 rpm por 5 minutos a 4°C. La concentración de proteína fue medida pre-filtración por un Ensayo de Bradford (BioRad, Hercules, CA, Cat#_23236) y reportado como µ? (calculado con base en el peso molecular de monómero ?ß (MW 4513)). Todas las muestras fueron almacenadas a -80°C hasta su uso.

EJEMPLO 2 Selección de anticuerpos anti-ADDL A. Panorama de biblioteca de anticuerpo humanizado Una biblioteca de afinidad madura de un anticuerpo anti-ADDL humanizado, h3B3, (vea la Pat. de EEUU Nos. 7,811 ,563 y 7,780,963) fue construida en la que parte de las secuencias de aminoácidos de CDR3 de cadena ligera fue sometida a mutagénesis aleatoria. Para cubrir la región CDR3 completar, se construyeron dos sub-bibliotecas. Una biblioteca estuvo compuesta de la región variable de cadena pesada parental y aminoácidos mutados en la mitad izquierda de CDR3 de cadena ligera y la otra en la mitad derecha de CDR3 de cadena ligera. Una estrategia similar fue usada para la mutagénesis aleatoria de las CDR de cadena pesada con tres sub-bibliotecas. 3B3 humanizado (h3B3) fue sometido a mutación de afinidad usando métodos conocidos en la técnica. Las regiones variables de h3B3fueron clonadas en un vector de despliegue de Fab (pFab3D). En este vector, las regiones variables para las cadenas pesada y ligera fueron insertadas en marco para igualar al dominio de CH1 de la región constante y la región constante kapa, respectivamente. En Fab3D, el epítopo myc y seis aminoácidos de histidina consecutivos siguieron la secuencia CH1 , que es luego ligada a la proteína plll de fago para despliegue. Todas las posiciones en las CDR3s de cadena pesada y ligera fueron mutagenizadas aleatoriamente usando secuencias de oligonucleótido degeneradas construidas en los cebadores de PCR. Para adaptarse a las dimensiones físicas, las sub-bibliotecas fueron construidas con cada una de ellas enfocada en 5-6 aminoácidos. El vector de ADN humano 3B3 (H3B3) se utiliza como plantilla de ADN para amplificar tanto las cadenas ligeras y pesadas con los cebadores de PCR mutados (Cuadro 4). Después de la amplificación por PCR, los fragmentos de ADN sintetizados fueron corridos en gel de agarosa al 1.3%, los cebadores se removieron y los fragmentos variables se digirieron en enzimas de restricción: sitios de clonación BsiWI y Xbal para la clonación de la variable de cadena ligera, Xhol y Apal para la clonación de la variable de cadena pesada.

CUADRO 4 Para construir una biblioteca de maduración de afinidad en el vector de despliegue de fago pFab3D, el pFab3D-3B3 ADN fue digerido con el mismo par de enzimas de restricción, purificado por fragmentos de PCR para las variables de cadena pesada o ligera ligados con T4 ligasa (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante la noche a 16°C. Los productos de la ligación entonces fueron transfectados en células competentes para electroporación TG1 de E. coli (Stratagene, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y alícuotas de los cultivos bacterianos se colocaron en placas en agar LB-carbenicilina (50 pg/mL) para titular el tamaño de la biblioteca. Los cultivos restantes fueron ya sea colocados en placas grandes con carbenicilina e incubados a 30°C durante la noche para reserva de biblioteca de E. coli o infectados con auxiliar de fago M13K07 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 1011 pfu/mL) por incubación a temperatura ambiente y 37°C por diez minutos. Luego medio 2?? con carbenicilina (50 pg/mL) se agregó y fue incubado a 37°C por una hora con agitación. Kanamicina (70 pg/ml) fue luego agregada y los cultivos crecieron durante la noche a 30°C con agitación. El sobrenadante del cultivo de fago fue titulado y concentrado por precipitación con 20% (v/v) PEG (polietilenglicol)/NaCI, resuspendido en PBS, esterilizado con un filtro de 0.22 pm, y alícuotas formadas para la adsorción de la biblioteca de fago.

La adsorción de biblioteca de fago luego se realizó como se resume en el Cuadro 5.

CUADRO 5 Los fagos de entrada de las bibliotecas de fago de despliegue de Fab (100 pl, aproximadamente 1011"12 pfu) fueron bloqueadas con 900 pL de solución de bloqueo (3% de leche seca desgrasada en PBS) para reducir la unión no especifica a la superficie del fago. Perlas revestidas con estreptavidina fueron preparadas recolectando 200 pL de la suspensión de la perla en un separador magnético y se removieron los sobrenadantes. Las perlas luego fueron suspendidas en 1 mL de solución de bloqueo y se colocaron en un mezclador rotatorio por 30 minutos. Para remover el fago de unión de estreptavidina no específico, la biblioteca de fago bloqueado fue mezclada con las perlas revestidas con estreptavidina bloqueada y colocado en un mezclador rotatorio por treinta minutos. Las suspensiones de fago del procedimiento de des-selección fueron transferidas a un tubo nuevo y 200 pL de antígeno, 10% de bADDL se agregó y fue incubado por dos horas para la unión de anticuerpo y antígeno. Después de la incubación, la mezcla se agregó en las perlas revestidas con etreptavidina bloqueada y fue incubada en un mezclador rotatorio por una hora para capturar el complejo Ab/Ag en las perlas de estreptavidina. Las perlas con los complejos capturados de 10% bADDL/ fago fueron lavadas cinco veces con PBS/0.05% Tween 20 y luego dos veces con PBS solo. Los fagos unidos fueron eluidos del bADDL con 200 pL de 100mM TEA y fueron incubados por veinte minutos. Los fagos eluidos fueron luego transferidos a un tubo de 50 mL, neutralizado con 100 pL de 1M Tris-HCI, pH7.5, y adgregado a 10 mL de células TG1 de E. coli con un OD 600 nm entre 0.6-0.8. Después de incubación a 37 C con agitación por una hora, alícuotas del cultivo fueron colocadas en placas de agar LB-carbenicilina (50 pg/mL) para titular el número de fagos producidos, y las bacterias restantes centrifugadas y suspendidas con 500 pl de medio 2xYT (Teknova, Hollister, CA), colocadas en placas de bioensayo de agar YT (Teknova, Hollister, CA) conteniendo 100 pg/ml de ampicilina y 1% de glucosa. Las placas de bioensayo fueron cultivadas durante la noche a 30 C.

Después de cada ronda de adsorción, colonias simples fueron tomadas aleatoriamente para producir fagos en placas de 96 pozos. Los procedimientos para la preparación del fago en placas de 96 pozos fueron similares a esos descritos antes excepto que no se uso el paso de precipitación de fago. Las placas de cultivo conteniendo las colonias se cultivaron en 120 pL de medio 2xYT (16g Bacto-tryptone, 10g Bacto-extracto de levadura, 5g NaCI (todos, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), ddH20 a 1 L (autoclave)) con 100 pg/ml de ampicilina y 0.1% de glucosa fueron incubados durante la noche en un agitador HiGro® (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI) a 30°C con agitación a 450 rpm. Los sobrenadantes del fago (aproximadamente 100 pL) se usaron directamente para análisis en el ELISA de unión de A DDL descrito antes. La unión del fago a los ADDLs fue detectado con un anticuerpo anti-M13 conjugado a peroxidasa de rábano (HRP) (Amersham Bioscience, GE Healthcare, Waukesha, Wl).

EJEMPLO 3 Determinación de 19.3 EC50 para los oligómeros ?ß y AB40.

Las placas de unión de proteína superior fueron revestidas a cualquiera de 100 pmoles/pozo de ?ß40 o 50 pmoles/pozo de oligómeros ?ß en PBS, durante la noche a 4°C. El día siguiente, las placas fueron lacadas cinco veces con PBS + 0.05% Tween-20 y bloqueadas durante la noche con búfer de bloqueo de Caseína (Thermo Scientific, Waltham, MA) y 0.05% de Tween-20. El anticuerpo 19.3, identificado en el Ejemplo 2, fue probado de 0 a 15 pg/ml en una serie de dilución de tres veces de 12 puntos. Después de dos horas a temperatura ambiente de incubación, las placas fueron lavadas e IgG anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina (ThermoScientific, Waltham, MA) se agregó a 0.08 pg/ml. Después de la incubación por 45 minutos a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas y Tropix CDP star (Applied Biosystems, Foster City, CA) se agregó. La luminescencia fue detectada después de 30 minutos en un lector de placa EnVision® (PerkinElmer, Waltham, MA). Se completaron los ajustes de las curvas usando el software GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

EJEMPLO 4 Ensayos de unión competitivos con oligómeros ?ß y monómero A3 Un ensayo de unión competitivo con oligómeros ?ß y monómero ?ß demostró una preferencia para la unión de oligómeros ?ß usando el anticuerpo 19.3. Placas de oligómeros ?ß fueron preparadas como en lo anterior en el Ejemplo 3, a través del paso de bloqueo de búfer de Caseína. Placas revestidas con monómero ?ß40 se prepararon de la misma manera, usando 100 pmoles/pozo. El anticuerpo 19.3, del Ejemplo 2, fue aplicado a 4 nM (EC50 para los oligómeros ?ß determinado en el Ejemplo 3 anterior) a cada pozo en la matriz de búfer de Caseína y se dejó interactuar con los oligómeros ?ß o ?ß40 por 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. Una curva de concentración de tres veces de 12 puntos comenzando a 10 µ?, para cualquiera de los oligómeros ?ß o ?ß40, fue aplicada a los pozos que contenían anticuerpo. Para las placas revestidas con oligómeros ?ß, ?ß40 se agregó a los pozos; para las placas de ?ß40, los oligómeros ?ß se a gregaron a los pozos. Las placas fueron incubadas por una y media horas a temperatura ambiente. Ambos cálculos de detección de unión de anticuerpo residual y la EC50 fueron determinados en el Ejemplo 3 anterior.

EJEMPLO 5 ELISA sándwich en plataforma Envision A. Ensayo de oligómeros ?ß Se aplicaron ELISAs sándwich a la preparación completa de oligómeros ?ß o CSF humano. El anticuerpo 19.3 que prefiere al oligómero A fue revestido a 0.5 pg por pozo en búfer de bicarbonato de sodio (ThermoFisher #28382, Waltham, MA) durante la noche a 4°C. El día siguiente, los pozos fueron lavados con salina amortiguada con fosfato con 0.05% de Tween 20 (PBS-T) y bloquedos durante la noche a 4°C con 200 pL/pozo de búfer de caseína en PBS (ThermoFisher #37528, Waltham, MA), con 0.1% de Tween agregado. Los estándares del oligómero ?ß o fracciones SEC fueron diluidas en búfer de caseína y se agregaron a 100 pUpozo. Las diluciones que proporcionaron la señal en el intervalo lineal de la curva estándar fueron usados para los cálculos. El día siguiente, la placa fue lavada cinco veces con PBS-T y Biotin-82E1 (IBL, No.10326, Toronto, Ontario, Canadá) se agregó a 100 µ?/???? en búfer de caseína por una hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas de nuevo con PBS-T y Neutravidin-AP (ThermoFisher #31002, Waltham, MA) se agregó por 30 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, después de lavados adicionales de PBS-T, sustrato quimioluminiscente Tropix® CDP®-Star (Life Technologies™, Carlsbad, CA) se agregó por 30 minutos. La luminescencia fue cuantificada en un lector de placa EnVision® (Perk'mElmer, Waltham, MA).

B. Ensayo de monómero A3 ?ß40 (American Peptide Co, Sunnyvale, CA) fue disuelto en 1 ,1 ,1 ,3,3,3 hexafluoro-2-propanol (HFIP, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El HFIP fue removido por evaporación, y la película de péptido seca luego fue redisuelta en dimetil sulfóxido (DMSO, Sigma Aldrich, St. Louis, MO). El método estándar para realizar un ELISA y/o biotinilación de reactivos puede encontrarse en Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Harlow E, Lañe D (1988)). Los métodos para la detección de monómeros ?ß usando un protocolo de ELISA sándwich ha sido previamente reportado (Sankaranayaranan et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 328:131-140) usando anticuerpos disponibles comercialmente, tal como 6E10, 12F4 y G210 (Covance, Princeton, NJ).

EJEMPLO 6 Muestras de CSF humano Las muestras de CSF de pacientes con AD confirmados clínicmanete, controles jóvenes, o controles de edad coincidente fueron comprados a BioReclamation (Hicksville, NY) o Precisión Med (Solana Beach, CA). El diagnóstico cognoscitivo fue realizado usando el Examen de Estado Mini-Mental (MMSE) comúnmente aceptado. La naturaleza de las muestras fue confirmada por la medición respectiva de monómero ?ß40 y ?ß42 por ELISA (Ejemplo 5B), que ha sido reportado ya sea sin cambio, o significativamente reducido en CSF de AD.

EJEMPLO 7 Análisis farmacocinético de 19.3 en primates no humanos Para confirmar la presencia de 19.3 en CSF de primate, un estudio fue realizado para el anticuerpo 19.3 anti-oligómero ?ß en un cohorte de macacos con puerto de cisterna magna. Seis animales (tres machos/tres hembras) fueron dosificados con un bolo intravenoso de anticuerpo 19.3 (20 mg/kg). Muestras de CSF fueron recolectadas del puerto de la cisterna magna en varios puntos de tiempo y la concentración del anticuerpo 19.3 en el CSF fue determinada con un ensayo ELISA de IgG anti-human. Los Solicitantes encontraron que el anticuerpo 19.3 fue capaz de cruzar dentro del CSF de primate, donde aumento en concentración durane las primeras 24 horas y tuvo un máximo en aproximadamente 100 ng/mL. Esta concentración guió el nivel de anticuerpo 19.3 anti-oligómero ?ß salpicado dentro del CSF humano para desarrollo del ensayo de acoplamiento de objetivo.

EJEMPLO 8 INmunoensavo a base de micropaartículas paramagnéticas de ELISA de oligómeros ?ß El ELISA sandwich de oligómero ?ß fue realizado usando una plataforma de inmunoensato de micropartículas paramagnéticas (Erenna® immunoensayo system, Singulex®, Almeda, CA) para determinar los niveles de oligómero en muestra humanas o estándares de oligómero ?ß. Las micro-partículas (MPs) para captura fueron preparadas uniendo 12.5 pg del reactivo de captura, anticuerpo 19.3 de oligómero ?ß, por mg de MPs (vea el método siguiente). Los MPs unidos a 19.3 fueron diluidos a 100 pg/mL en búfer de ensayo (búfer Tris con 1% Tritón X-100, d-desthiobiotin, 0.1% albúmina de suero bovino) y se agregó a 100 uL a 100 uL de muestra de CSF o estándares (diluidos en búfer de Trisy 3% de albúmina de suero bovino), seguido por incubación por dos horas a 25°C. Las MPs fueron retenidas vía un lecho magnético, y el material sin unir se removió en un paso de un solo lavado usando diluyente de ensayo el lavador de placa THydroflex (Tecan, Mánnedorf, Switzerland). El anticuerpo de detección marcado con alexa-fluorescente, 82E1 (preparado como en el ejemplo siguiente), fue diluido a una concentración final de 500 pg/mL y se filtró a través de un filtro de 0.2 pm (Pall 4187, Fort Washington, NY). Este anticuerpo se agregó a 20 pL/pozo de partículas de muestra individuales. Las placas de ELISA fueron incubadas por una hora a 25°C, con agitación en un Jitterbug (Boekel, Feasterville, PA). Los pozos fueron lavados cuatro veces con búfer de ensayo para remover cualquier reactivo de detección sin unir. Los complejos MP/19.3/oligómero ?ß/82?1 fueron transferidos a una nueva placa, el búfer fue aspirado y 10 pUpozo de búfer de elución se agregó, seguido por una incubación de 5 minutos a 25°C, con agitación en un Jitterbug a velocidad 5. Eluído, el anticuerpo 82E1 de detección marcado con flúor fue transferido a una placa 384 conteniendo 10 pUpozo de búfer de neutralización y se leyó en un detector de micropartículas paramagnéticas (Erenna®, Singulex®, Alameda, CA) a 60 segundo por pozo de tiempo de lectura.

A. Marcado del anticuerpo de captura 1. Unión del anticuerpo de oligómero ?ß (19.3) a Dynabeads (perlas MP): Remover el sobrenadante de 50 µ? Dynabeads usando un imán. Resuspender las Dynabeads en 200 pl de un búfer de unión de anticuerpo y de lavado, tal como búfer RIPA [#9806, Cell Signaling Technologies, Beverly, MA], conteniendo 5 pg de 19.3. Incubar por 10 minutos con rotación a temperatura ambiente. Remover el sobrenadante del complejo de 19.3/perla MP con un imán. Lavar el complejo con 200 µ? del búfer de unión y lavado. 2. Acoplar el anticuerpo de oligómero ?ß (19.3) a las Dynabeads (perlas MP): Justo antes del uso, hacer una solución 5 mM de BS3 (Bis(sulfosuccinimidil)suberato, Cat. # 21580 Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA) en un búfer de conjugación (20 mM de fosfato de sodio, 0.15 M NaCI (pH 7-9)); 250 µ? de esta solución se requiere por muestra (complejo 5 pg 19.3/50 µ? perla P). Lavar las perlas MP acopladas a 19.3 (19.3/perlas de MP) dos veces en 200 µ?_ del búfer de conjugación. Colocar en un imán y desechar el sobrenadante. Resuspender las perlas de 19.3/MP en 250 µ? de 5 mM BS3. Incubar a temperatura ambiente por 30 minutos con inclinación/rotation. Templar la reacción de unión cruzada agregando 12.5 µ? de un búfer de templado (1M Tris HCI (pH 7.5)) e incubar a temperatura ambiente por 15 minutos con inclinación/rotación. Lavar las perlas de MP entrelazadas tres veces con 200 µ? de PBST. Diluir las perlas MP a 100 g/mL en búfer de ensayo para uso como en el protocolo de ensayo anterior.

B. Marcado de anticuerpo de detección Acoplar Alexa Fluor 546 a 82E1: 82E1 fue acoplado a una etiqueta fluorescente comparable a Alexa Fluor 546 (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, 82E1 fue diluido a 1 mg/mL y un décimo del volumen de búfer de bicarbonato de sodio 1M se agregó. Esta solución de 82E1 (100 µ?) se agregó al frasco de tinte Alexa Fluor 546, y el frasco fue tapado, invertido suavemente para disolver el tinte y agitado a temperatura ambiente por 1 hora. Girar las columnas para separar cualquier etiqueta fluorescente sin marcar del anticuerpo de detección, mientras se carga el Componente C (BioGel® P-30, BioRad, Hercules, CA) resina de purificación de exclusión de tamaño fino dentro de la columna. Después de que el búfer en gel se drenó, 100 pL de 19.3/perlas de MP y volumen de reacción de tinte se agregó sobre el centro de la resina en la parte superior de la columna de rotación y se absorbió dentreo del lecho de gel. A la columna se agregó lentamente a temperatura ambiente 100 µ?_ de un búfer de elución (0.01 M fosfato de potasio, 0.15 M NaCI, pH 7.2, con 0.2 mM azida de sodio). Se agregó búfer de elución adicional y a medida que se corría la columna, la columna fue iluminada para visualizar el frente del anticuerpo teñido/marcado. La primera línea de tinte de la columna es el anticuerpo marcado. El tinte libre permanece en el lecho de la columna, desechar la columan de rotación..

Muestra de CSF humano fueron obtenidas de Bioreclamation (Hicksville, NY) y después de descongelación se mantuvieron en hielo. Las muestras de CSF fueron trartadas con 0.05% de Tween-20, (2.5% de reserva de Tween-20 diluido 1 :50 dentro del CSF) antes del muestreo. Las muestras o estándares de oligómero ?ß fueron diluidos en salina amortiguada con Tris (TBS) con 3% de albúmina de suero bovino (BSA). Los MPs acoplados con 19.3 se diluyeron a una concentración final de 100 pg/mL en un búfer de ensayo conteniendo TBS/0.1% BSA/1.0% Tritón X-100. A cada pozo de una placa de 96 pozos se agregó 100 pL de muestra/estándar y 100 pL de 19.3-MPs revestidos. Las muestras fueron incubadas con MPs por 60 minutos a temperatura ambiente (RT) y lavadas una vez usando separación magnética después de la adición de búfer de resuspensión de TBS/ 0.1% BSA/1.0% Tritón X-100 MP. El anticuerpo de detección fluorescentemente marcado, 82E1, se agregó a 20 pL por pozo y fue incubado por 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por cuatro lavados con el búfer de resuspensión de MP usando separación magnética. La etiqueta fluorescente fue eluida del anticuerpo de detección 82E1 y se incubó cinco minutos a temperatura ambiente. El eluido fue transferido a una microplaca conteniendo búfer de neutralización y se transfirió a un dispositivo de detección capaz de leer las micro-partículas magnéticas (MPs), tal como el instrumento Erenna® (Singulex®, Almeda, CA) a 60 segundos por pozo de tiempo de lectura.

EJEMPLO 9 Ensayo de acoplamiento de objetivo (TE) de ELISA sándwich de complejo de oligómero ?ß Un ELISA sándwich de complejo de oligómero ?ß puede realizarse para uso como un ensayo de acoplamiento de objetivo para detectar los complejos de anticuerpo/oligómero ?ß formados in vitro o ¡n vivo, para uso con un anticuerpo terapéutico para mostrar el acoplamiento de objetivo o para demostrar la eficacia de un anticuerpo terapéutico para reducir los complejos 19.3/oligómero ?ß. Cualquiera de lgG2 anti-humano o kapa anti-humano (ambos de Southern Biotech, Birmingnam, AL) fueron revestidos a 0.5 pg por pozo en un búfer de bicarbonato de sodio durante la noche a 4°C (paq. Búfer BupH Carbonato-Bicarbonato, #28382, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham MA . El día siguiente, los pozos fueron lavados con una salina amortiguada con fosfato con 0.05% de Tween 20 (PBS-T; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y bloqueados durante la noche a 4°Celcius con 200 pL/pozo de búfer de caseína en PBS con 0.1 % de Tween agregado. El anticuerpo 19.3 fue salpicado dentro de búfer de Caseína (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham MA) o CSF humano en tubos de microcentrifuga (Axygen, Inc., Union City, CA, MCT-175-L-C) a 0.100 pg/mL. Los oligómeros ?ß fueron salpicados a concentraciones variables para dar una curva estándar, manteniendo constantes los niveles de 19.3. Las muestras fueron agitadas a 4°C por una hora para permitir la formación de los complejos de anticuerpo (19.3)/oligómero ?ß. 100 µ? de muestra/pozo fue aplicada a cualquiera de una placa revestida con lgG2 anti-humano o con kapa anti-humano (n=3) y se incubó durante la noche a 4°C en un agitador de placa. El día siguiente, las placas fueron lavadas cinco veces con PBS-T y Biotin-82E1 (IBL, Minneapolis, MN, No.10326) se agregó a 100 µ?/????, se diluyó 1 :5000 en búfer de bloqueo de Caseína (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO), 0.1 % de Tween 20 por una hora a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas de nuevo con PBS-T, y Neutravidina-AP (ThermoFisher, Waltham, MA, #31002) fue diluido 1 :20,000 en búfer de caseína, luego agregado por 30 minutos a temperatura ambiente. Lavados adicionales de PBS-T siguieron con sustrato luminiscente Tropix CDP star (Applied Biosystems, Foster City, CA, T2214) aplicado por 30 minutos. La luminiscencia fue cuantificada en un lector de placa EnVision (PerkinElmer, Waltham, MA).

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para determinar el nivel de una proteína neuronalmente derivada de interés (NDPOI) en una muestra biológica previamente obtenida de un paciente, que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica previamente obtenida de un mamífero y que tiene un NDPOI con un anticuerpo de captura/perla de microparticulas paramagnéticas (anticuerpo/perla de MP) bajo condiciones suficientes para formar un complejo de NDPOI/anticuerpo de captura/perla de MP; (b) poner en contacto el complejo de NDPOI/anticuerpo de captura/perla de MP del paso (a) con un anticuerpo de detección marcado fluorescentemente bajo condiciones suficientes para formar un complejo de POI/anticuerpo de captura/perla de MP; y (c) detectar la señal fluorescente generada de dicho complejo del paso (b); en donde la señal fluorescente del paso (c) representa la cantidad de NDPOI.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el NDPOI es un oligómero ?ß.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el mamífero es un humano.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo de captura es un anticuerpo anti- oligómero ?ß seleccionado del grupo que consiste en 19.3, 7305, 82E1 , y W02.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo de detección es un anticuerpo anti-oligómero ?ß seleccionado del grupo que consiste en 82E1 , 7305, y 6E10.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el anticuerpo de captura es 19.3 y el anticuerpo de detección es 82E1.

7 - Un método para identificar un paciente que tiene enfermedad de Alzheimer al determinar el nivel de una proteína neuronalmente derivada de interés (NDPOI) en una muestra biológica previamente obtenida de un paciente, en donde el NDPOI es un oligómero ?ß, y en donde se determina que los pacientes que tienen niveles de oligómero ?ß que varían de 0.5 pg/mL a 1 pg/mL tienen la enfermedad de Alzheimer.

8 - Un método para determinar la eficacia terapéutica de un agente terapéutico para tratar la enfermedad de Alzheimer que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica previamente obtenida de un paciente y que tiene una proteína neuronalmente derivada de interés (NDPOI) con un anticuerpo de captura/perla de micropartículas paramagnéticas (perla de anticuerpo/MP) bajo condiciones suficientes para formar un complejo de NDPOI/anticuerpo de captura/perla de MP; (b) poner en contacto el complejo NDPOI/anticuerpo de captura/perla de MP del paso (a) con un anticuerpo de detección marcado fluorescentemente bajo condiciones para formar el complejo de NDPOI/anticuerpo de captura/perla de MP/anticuerpo de detección; y (c) detectar la señal fluorescente generada de dicho complejo del paso (b) y en donde la señal fluorescente representa la cantidad de NDPOI; (d) repetir los pasos (a) a (c) con una segunda muestra biológica previamente obtenida de dicho paciente y que tiene un NDPOI luego de que a dicho paciente se le suministró anteriormente un terapéutico de prueba ; y (e) comparar la señal fluorescente detectada de la segunda muestra biológica a dicha señal de la primera muestra biológica; en donde una disminución de la señal fluorescente detectada representa un agente terapéutico efectivo.

9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el NDPOI es un oligómero ?ß.

10. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el anticuerpo de captura es 19.3 y el anticuerpo de detección es 82E1.

11. - Un método para determinar el acoplamiento a objetivo de un anticuerpo terapéutico unido a una proteina neuronalmente derivada de interés (NDPOI) que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica previamente obtenida de un mamífero y que tiene un NDPOI, luego de que a dicho mamífero se le suministró un anticuerpo terapéutico con un anticuerpo de captura/perla de microparticulas paramagnéticas (anticuerpo/perla de MP) bajo condiciones suficientes para formar un complejo de NDPOI/anticuerpo de captura/perla de MP; (b) poner en contacto el complejo NDPOI/anticuerpo de captura/perla de MP del paso (a) con un anticuerpo de detección marcado fluorescentemente bajo condiciones para formar el complejo de NDPOI/anticuerpo de captura/perla de MP/anticuerpo de detección; y (c) detectar la señal fluorescente generada de dicho complejo del paso (a) y en donde la señal fluorescente representa el acoplamiento de objetivo del NDPOI/anticuerpo terapéutico.

12. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el NDPOI es un oligómero ?ß.

13. - El método de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque el anticuerpo de captura es 19.3 y el anticuerpo de detección es 82E1.