KR101461538B1

KR101461538B1 - 생물학적 관심대상의 펩티드 및 단백질의 측정을 위한 고감도 면역검정법 및 키트

Info

Publication number: KR101461538B1
Application number: KR1020107002425A
Authority: KR
Inventors: 제이 마뉴엘 사라사 바리오
Original assignee: 아라클론 바이오테크, 에스.엘.
Priority date: 2007-08-02
Filing date: 2007-12-05
Publication date: 2014-11-14
Also published as: RS52124B; JP2010535328A; CN101861521B; HRP20120020T1; KR20100046168A; AU2007357025B2; EP2183599B1; US20090035790A1; CA2689024A1; PT2183599E; PL2183599T3; EP2020602A1; IL202598A; CL2007003513A1; CA2689024C; IL202598A0; WO2009015696A1; DK2183599T3; ES2377151T3; CN101861521A

Abstract

본 발명은 당업계의 현재 검정법보다 더 높은 감도를 가진, 시료 중의 폴리펩티드 탐지를 가능케 하는 면역검정법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 면역검정법을 수행하기 위해 필요한 구성요소를 제공하는 키트에 관한 것이다.

Description

생물학적 관심대상의 펩티드 및 단백질의 측정을 위한 고감도 면역검정법 및 키트 {HIGHLY SENSITIVE IMMUNOASSAYS AND KITS FOR THE DETERMINATION OF PEPTIDES AND PROTEINS OF BIOLOGICAL INTEREST}

본 발명은 시료 중의 펩티드 및 단백질의 탐지를 가능케 하며, 당업계의 현재 검정법보다 더 높은 감도를 제공하는 면역검정법의 분야에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 면역검정법의 수행에 필요한 구성요소들을 제공하는 키트에 관한 것이다.

알츠하이머병 (AD) 은 기억력 감소의 진행 및 증가에 이어 사지 및 몸의 기능 제어 상실 및 최후에는 사망을 특징으로 하는 중추신경계의 진행성 퇴행성 질환이다. 이는 분명히 65 세 이상 인구의 1 내지 6% 및 80 세 이상 인구의 10 내지 20% 에 영향을 주는 치매의 가장 일반적인 원인이다.

AD 는, 환자의 뇌에서 신경세포들 사이의 세포외 공간에서의 노인성 플라크의 점진적인 출현을 포함하는 몇가지 병리학적 특징에 의해 기타 유형의 치매와는 구분된다. 플라크는 변질된 신경 및 신경교 세포로 둘러싸인, 아밀로이드 β 펩티드 (Aβ) 로 지칭되는 40 내지 42 개의 아미노산 펩티드의 피브릴로 주로 형성된 아밀로이드 침전물의 중심 코어를 갖고 있다. 상기 펩티드는 β아밀로이드 전구체 단백질 (βAPP) 로 지칭되는 전구체 단백질의 단백질가수분해 과정으로 인한 것이다. βAPP 는 유기체 내에서 βAPP 를 코딩하는 유전자의 1 차적인 전사물의 대안적인 스플라이싱으로 인해 유도되는 상이한 이소형 (isoform) 으로서 발견된다. 상기 이소형은 주로 βAPP-695, βAPP-751 및 βAPP-770 이며, 여기서 숫자들은 아미노산의 갯수를 가리킨다. βAPP 유전자는 인간에서 21 번 염색체에서 발견되며, 그의 3 배수체는 (다운증후군) 단백질의 과발현 및 환자 뇌에서의 아밀로이드 플라크의 조기 출현을 초래한다 (Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741-766). βAPP 는 상이한 생성물을 제공하는 상이한 단백질가수분해 효소 (세크리타아제) 에 의해 가공될 수 있는 막통과 단백질이다. 일반적으로, βAPP 는 그의 세포외 영역에서 알파 세크리타아제에 의한 절단을 겪게 되어, 길이가 긴 가용성 분비 절편 및 길이가 더 짧은, C83 으로 지칭되는 멤브레인에 고정되어 있는 절편을 생성하며, 이는 γ-세크리타아제에 의해 더 절단되어 p3 펩티드 (p3₄₀ 또는 p3₄₂) 및, 기타 프로테아제에 의해 더 분해되는 57 또는 59 펩티드를 제공한다. βAPP 가 β-세크리타아제에 의해 절단되는 경우, 가용성의 분비 절편 (sβAPP-β) 및 γ-세크리타아제에 의해 절단되어 아밀로이드 펩티드 Aβ 및 멤브레인에 고정되어 있는 57 또는 59 아미노산 펩티드를 제공할 수 있는 C99 절편을 제공한다 (Selkoe D.J. (2001) Physiol. Rev. 81, 741-766).

AD 는 발병 연령에 따라서는 조기 발병형 (60 세 이하의 연령) 및 늦은 발병형 (60 세 초과의 연령) 으로, 상염색체성 우성 유전의 존재에 따라서는 가족성 AD 또는 산발성 AD 로 분류될 수 있다. AD 의 조기 발병 가족성 형태는 βAPP, 프레세닐린 1 및 프레세닐린 2 (각각 21 번, 14 번 및 1 번 염색체에 위치함) 을 코딩하는 유전자에서의 공지된 돌연변이와 연관되어 있을 수 있다. 상기 분류는 상호 배타적이지 않다. 가장 빈번한 형은 산발성의 늦은 발병형이다.

임상적인 실습에서, AD 의 진단은 전형적인 임상적 특징의 존재성을 근거로 하는 임상적인 기준 및 뇌영상 기법 및 혈액 분석을 이용한 기타 유형의 치매의 배제를 이용하여 수행한다. 뇌 부검을 이용하여 수행한 연구에 따라 AD 가 있는 것으로 진단된 환자들의 10 내지 20% 가 상이한 질환을 앓고 있음에도 불구하고, 상기 기준을 이용하는 진단의 신뢰성은 받아들여지고 있다. 더욱이, 현재의 진단 방법은 신경퇴행 과정이 상당히 진행되어 환자가 심각한 치매를 앓고 뇌 손상이 상당히 심각하여 치료법이 제한될 때에만 수행될 수 있다. 결정적인 진단은 사후 뇌 조직의 병리학적 검사를 필요로 한다.

따라서, 감도가 높고 특이적이며, 진행 조기의 징후와 연관된 것들을 고령으로 인한 인지 장애와 구분해 내고, AD 로 인한 변화와 기타 퇴행 상태로 인한 변화를 구분해 내는, AD 의 조기 진단을 위한 바이오마커를 동정해 낼 필요가 있다. Growdon 등 (Neurobiol. Aging, 1998, 19:109-116) 에 따르면, AD 에 대한 이상적인 마커는 하기의 필요조건을 충족시켜야 한다:

- 신경병리학의 기본적인 특징을 간파해야 한다

- 신경병리학적으로 확인된 경우의 질환에서 입증되어야 한다

- AD 탐지에 있어서 80% 이상의 감도를 보여야 한다

- AD 를 기타 유형의 치매와 구분해 내는 80% 이상의 특이성을 보여야 한다

- 수행함에 있어서 신뢰성, 재현성, 비-침습성 및 단순성이 있어야 하며, 비용이 많이 들지 않아야 한다.

환자의 뇌 또는 CSF 에 존재하는 바이오마커의 수준을 탐지함으로써 AD 를 진단하는 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 상이한 바이오마커들은 그의 측정이 CSF 에서 수행되는 것을 특징으로 한다. CSF 는 중추신경계의 세포외 공간의 조성을 직접적으로 반영하므로, 그에 따라 바이오마커로서 더 높은 농도를 제공한다. 그러나, CSF 는 치매가 있는 환자가 쉽게 받아들일 수 없는 비일상적인 진단법이며 기억 장애가 있는 환자를 혼자 두는 요추 천자를 수단으로 하여서만 구해낼 수 있다. 따라서, 신체에서 비침습적으로 구해낼 수 있는 시료에서 탐지될 수 있는 AD 바이오마커가 필요하다.

선행 기술에 기재되어 있고 혈장에서 탐지될 수 있는 적합한 AD 바이오마커에는 하기의 것이 포함된다: (i) 아밀로이드 플라크로부터 유도되는 마커, (ii) Aβ 또는 βAPP 에 대한 자가항체, (iii) 염증 마커, 예컨대 IL-6, 그의 수용체 또는 gp130, C-반응성 단백질 또는 산화 스트레스 (이소프로스탄), (iv) 지질 대사의 마커 (apoE, 옥시스테롤) 및 (v) 혈관 질환 마커 (호모시스테인, 지질단백질 b C1q) (Scheuner D 등. (1996) Nature Med 2, 864-870).

그러나, Aβ 가 AD 환자의 뇌에 축적되며, AD 의 발병기전에서 중심적인 구성요소라는 사실의 관점에서, 상기 단백질은 AD 바이오마커로서 가장 적합한 후보물질로서 간주된다. 그러나, AD 에 대한 혈장 바이오마커로서의 Aβ 의 이용은 혈청 내 Aβ펩티드 (Aβ(1-40) 및 Aβ(1-42)) 의 농도가 극히 낮다는 문제에 직면하게 되며, 이에 따라 상기 펩티드 종들을 신뢰성있게 탐지하기에 충분한 감도가 있는 검정법이 없다.

Scheuner 등 (Nature Med., 1996, 2:864-870) 은 프레세닐린 1, 프레세닐린 2 또는 βAPP 의 세포외 농도가, 가족성 AD 와 연관되어 있는 돌연변이를 보유한 가족들 중의 환자에서 증가하는지 여부를 검사하기 위한 1 차적인 연구를 수행했다. 상승된 수준의 Aβ 1-42(43) 가 FAD-연계 PS1 (P < 0.0001), PS2_N141I (P = 0.009), APP_{K670N, M671L} (P < 0.0001), 및 APP_V7171 (한 대상체) 돌연변이가 있는 대상체들로부터의 혈장에서 관찰되긴 했지만, 상기 연구는, 혈청 중 Aβ 펩티드의 농도가 훨씬 더 낮은 산발성 AD 의 분석에 대해서는 입증되지 않았다. 상기 문헌에서 사용된 검정 키트는, Suzuki, N. 등. (Science, 1994, 264:1336-1340) 에 의해 선행기술에서 기재된 ELISA 샌드위치 검정법으로, 이는 포획 항체 및 퍼옥시다아제-콘쥬게이션된 탐지 항체를 이용한다.

Aβ 수준과 산발성 AD 사이에는 상관성이 없는 것으로 제안되어 왔다. 따라서, Tamaoka A 등. (J Neurol Sci., 1996, 141, 65-68) 은 산발성 AD 가 있는 28 명의 환자, 치매와 함께 상이한 신경학적 진행과정에 있는 40 명의 환자 및 40 명의 건강한 대조군에서의 혈장 중 Aβ 수준을 측정했다. 저자들은 대조군 대상체와 산발성 AD 를 앓는 환자에서 Aβ40 및 Aβ42 의 혈장 수준이 비슷하다는 결론을 내렸다. 유사한 결과가 Kosaka 등에 의해 수득되었다 (Neurology, (1997) 48, 741-745). Tamaoka 및 그의 동료들이 이용한 검정법에 있어서, 혈장 중 Aβ1-40 의 측정에 대해서는 WO200722015 에서 추가로 특징이 기재되어 있다. 그 검정법은 ELISA 샌드위치 검정법으로, Aβ40 및 Aβ42 펩티드를 1A10 모노클로날 항체 (mAb) 를 이용하여 고체 지지체 상에 포획하고, 퍼옥시다아제-콘쥬게이션된 14F1 mAb 를 이용하여 탐지하는 것이다. 상기 검정법은 한자릿수 pg/ml 의 범위에서의 감도 수준을 제공한다.

Vanderstichele H 등. (Amyloid, 2000, 7, 245-258) 은 12 명의 건강한 대조군, 39 명의 AD 환자 및 레비 소체 치매 (Lewy body dementia) 를 앓는 6 명의 환자, 기타 유형의 치매가 있는 10 명의 환자 및 치매는 나타내지 않지만 기타 신경학적 병리가 있는 9 명의 환자에서의 CSF, 혈장 및 소변 중의 Aβ(1-42) 의 수준을 측정하였으나, Aβ(1-42) 의 수준과 진단, 성별 또는 MMSE 결과와는 아무런 상관관계를 발견할 수 없었다. 상기 연구를 위해서, INNOTEST β-아밀로이드(1-42) 시험을 ELISA 샌드위치 검정법을 기반으로 하여 이용했는데, 여기서 Aβ(1-42) 는 Aβ(1-42) 의 N-말단 영역을 인식하는 21F12 mAb 를 이용하여 고체 지지체에 포획하고, Aβ(42) 의 C-말단 영역 및 HRP 에 커플링된 스트렙타비딘을 인식하는 바이오틴화된 3D6 mAb 를 이용하여 탐지한다.

Fukomoto y col. (Arch. Neurol. 2003, 60, 958-964) 은 146 명의 AD 환자, 경증 인지 장애가 있는 37 명의 환자 및 파킨슨병이 있는 96 명의 환자에서 상이한 임상적, 인구통계학적 및 유전학적 변수에 대한 혈장 Aβ40 및 Aβ42 수준의 상관관계를 연구했다. 결과는 연령과 함께 상당한 증가가 있으나, 진단, 가족력, ApoE 유전자형 또는 상이한 약물, 예컨대 아세틸 콜린스테라아제 저해제 또는 스타틴을 이용한 치료에 대해서는 차이점이 없음을 나타냈다. 측정은 Aβ 의 아미노산 11 내지 28 을 인식하는 mAB (BNT77) 및 Aβ40 및 Aβ42 를 특이적으로 인식하는 HRP-커플링된 mAb (BA27 및 BC05 mAb) 를 이용하는 ELISA 샌드위치 검정법을 이용하여 했다.

Mehta 등 (Arch. Neurol. 57, 2000, 100-105) 은 78 명의 AD 환자 및 61 명의 건강한 대조군에서 혈장 및 CSF Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정하고, Aβ40 혈장 수준은 ApoE4 대립유전자를 가진 AD 환자에서 상기 대립유전자를 갖지 않는 대조군에서보다 더 높으며, Aβ42 수준은 AD 환자와 대조군 사이에서 유사하고, 성별, 간이 정신상태 탐지 (MMSE) 스코어에 대해서는 차이점이 없음을 관찰했다. 측정은 포획 항체로서의 항-Aβ mAb 6E10 및, Aβ42 및 Aβ40 에 특이적인 펩티드에 대한 바이오틴화 항혈청을 이용하는 ELISA 샌드위치 검정법을 이용하여 했다.

Mayeux, R. 등 (Ann Neurol. 1999, 46, 412-416) 은 Mehta 등 (Arch. Neurol. 57, 2000, 100-105) 과 동일한 ELISA 검정법을 이용하여 코호트 대상체 (530 명) 에서 혈장 Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정한 후, 18 개월 후 (307 명의 대상체) 측정했다. 이들은 연구기간동안 AD 가 발생한 대상체가 AD 가 발생하지 않은 군에서보다 더 높은 Aβ42 수준을 갖는다는 점을 관찰했다. Aβ42 수준은 확정된 AD 진단의 3 년 후 감소했다. AD 표현형과 관련해서는 차이점이 관찰되지 않았다.

Lanz, T.A 및 Schacthter, J.B. (J. Neuroscience Methods, 2006, 157:71-81) 는 Aβ펩티드의 총량 또는 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 개별적인 양을 탐지하기 위한 비색 및 형광측정 ELISA 샌드위치 검정법을 기재한다. Aβ펩티드의 총량을 탐지하기 위해, 6E10 mAb 를 Aβ펩티드 포획에 이용하고, 바이오틴화 4G8 및 유로퓸-콘쥬게이션된 스트렙타비딘 또는 HRP-스트렙타비딘을 이용하여 탐지했다. Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 양을 탐지하기 위해, 6E10 mAb 를 포획 항체로서 이용하고, 각각의 절편에 대해 특이적인 바이오틴화 토끼 폴리클로날 항체에 이어 유로퓸-콘쥬게이션된 스트렙타비딘 또는 HRP-스트렙타비딘을 이용했다. 그러나, 상기 방법은 10 pg/ml 의 최저 탐지 한계를 제공하며, 뇌 추출물에서의 Aβ 측정에만 이용할 수 있었다.

WO200750359 는 Aβ42 의 다량체 형태에 특이적인 폴리클로날 항체를 이용하여 Aβ42 유도성 펩티드를 포획하고 mAb 및 HRP-콘쥬게이션된 항-마우스 IgG 를 이용하여 결합된 펩티드의 양을 탐지하는 것을 수반하는 Aβ42 의 다량체 형태 탐지를 위한 면역 검정법을 기재한다. 그러나, 상기 검정법은 4000 pg/ml 에 해당하는 1000-3000 pM 의 탐지 한계를 제공한다.

WO0162801 는 코팅 항체로서의 3D6 mAb 항-N-말단 및 탐지용으로 성숙 Aβ의 아미노산 15 내지 24 를 인식하는 mAb 를 이용하는, Aβ의 측정을 위한 ELISA 샌드위치 검정법을 기재하나, 100 내지 200 pg/mL 범위의 Aβ농도값 측정에 이용될 뿐이다.

WO0315617 는 성숙 Aβ펩티드의 아미노산 13 내지 28 을 인식하는 항체를 이용하는, 혈장 내 Aβ40 및 Aβ42 측정을 위한 ELISA 검정법을 기재하나, 250-400 pg/ml 범위의 상기 펩티드 농도만을 탐지할 수 있고, 이에 따라 가족성 AD 가 있는 혈장에서의 Aβ측정에만 적합하다.

WO0246237 는 포획 항체로서의 Aβ42 의 아미노산 13 내지 28 에 특이적인 mAb 및, Aβ42 펩티드의 N-말단 영역에 특이적인 바이오틴화된 3D6 mAb 에 이어 퍼옥시다아제에 콘쥬게이션된 스트렙타비딘을 이용하는, 뇌 균질화물 내의 전체 Aβ 종 (Aβ40 및 Aβ42) 의 측정을 위한 ELISA 샌드위치 검정법을 기재한다. 상기 문헌은 또한 포획 항체로서의 Aβ42 의 아미노산 33 내지 42 에 특이적인 mAb 21F12 및 탐지 항체로서의 바이오틴화된 3D6 mAb 를 이용하는 Aβ42 특이적 ELISA 샌드위치 검정법을 기재한다. 그러나, 상기 검정법은 전체 Aβ검정에 대해서는 50 ng/ml, Aβ42-특이적 검정에 대해서는 125 mg/ml 의 낮은 감도 수준을 갖고 있어, 혈장 또는 혈청 중의 전체 Aβ 또는 Aβ42 측정에는 부적합하다.

WO0413172 는 탐지 항체로서의 mAb 3D6 및 포획 항체로서의 성숙 Aβ 펩티드의 상이한 영역에 대해 특이적인 폴리클로날 항체를 이용하는, 포름산 뇌 추출물 및 CSF 에서의 β-아밀로이드 (1-42) 의 측정을 위한 ELISA 샌드위치 검정법을 기재한다.

그러나, 현재까지 공지되어 있는 모든 ELISA-기반 검정법은 기껏해야 한자릿수 pg/mL 범위인 낮은 탐지 한계를 갖고 있어, 가족성 AD 를 앓는 환자에서의 CSF 중의 Aβ40 및 Aβ42 탐지 뿐만 아니라 혈장 중의 상기 종들의 탐지에는 충분하지만, Aβ42 혈장 농도가 훨씬 더 낮은 산발성 AD 를 앓는 환자의 혈장 중의 Aβ42 탐지에는 적합하지 않다. 특히, INNOTEST β 아밀로이드 (1-42) 시험은 20 pg/ml 의 낮은 탐지 한계를 갖고 있어, 가족성 AD 를 앓고 있는 환자에서의 CSF 중의 Aβ42 의 탐지 뿐만 아니라 혈장 측정도 가능케 하지만, 혈장 중 훨씬 더 낮은 Aβ42 수준을 나타내는 산발성 AD 를 앓는 환자에서의 Aβ42 탐지에 충분한 감도는 없다. 상기 키트는 오직 CSF 중의 Aβ 펩티드 수준 측정에만 권장된다. 상기 권장사항은 INNOTEST β아밀로이드(1-42) 를 이용한 최근의 연구에 의해 추가로 입증되었는데, CSF 에서의 펩티드 수준이 혈장에서보다 100 내지 1000 배 더 높다고 나타났다 (Lewczuk, P 등. (2004) Neurobiol. Aging 25, 273-281).

또다른 시판 키트는 Biosource β 아밀로이드 (1-40) 및 β 아밀로이드 (1-42) 키트이다. 상기 키트들은 성숙 펩티드의 아미노 말단에 대한 mAb 를 이용하여 펩티드를 지지체 상에 포획하고, 성숙 β 펩티드의 C-말단 영역과 반응하는 토끼 폴리클로날 항체 및 항-토끼 IgG 퍼옥시다아제를 이용하여 탐지하는 ELISA 샌드위치 검정법을 제공한다. 상기 키트는, 제조사에 따르면 10 pg/mL 미만의 감도를 가졌으나, 15.6 내지 1000 pg/mL 의 Aβ 농도 탐지에 이용한다. 제조사에 따르면 Biosource 키트는 혈청, CSF 및 세포 배양물 중의 Aβ 탐지에 권장된다. 그러나, 산발성 AD 환자의 혈청 중의 평균 Aβ40 및 Aβ42 수준은 상기 검정법의 최저 감도 한계 미만이어서, 이들을 혈청 중의 측정에 이용하는 것은 가능하지 않은 것으로 보인다.

캐나다 특허 출원 (CA2585148) 은, 국제 특허 출원 WO200646644 에 대응하는 것으로, 0.5 pg/mL 의 최저 탐지 한계를 나타내는, 오직 Aβ 펩티드 검정법을 기재한다. 상기 문헌에서 이용한 검정법은 전자화학발광 (ECL) 샌드위치 검정법으로, mAb 21F12 (Aβ42 의 아미노산 33-42 를 인식함) 가 자석 비드에 커플링되어 있어서, Aβ42 를 포함하는 시료 중의 Aβ42 펩티드를 포획하는데 이용되며, 추가로 루테늄 착물에 커플링되어 있는 3D6 mAb 와 접촉시킨다. 이어서, 결합된 3D6 항체의 양은, 전기 에너지 적용시 루테늄 착물에 의해 방출되는 발광에 의해 탐지된다. 상기 검정법을 이용하여, 발명자들은 0.5 pg/mL 의 낮은 Aβ42 표준을 탐지할 수 있다. 그러나, AD 환자 및 건강한 대조군 유래의 혈장 시료 중의 Aβ42 비교에 상기 검정법을 이용할 때, 두가지 설정의 환자들 사이에서 현저한 차이를 발견할 수 없어서, 발명자들은 혈청 중의 온전한 Aβ42 의 양은 분해로 인해 상당히 낮다는 결론을 내렸으며, ng/mL 범위의 더 낮은 감도 수준을 제공하는, 21F12 mAb 를 이용하는 경쟁적 ELISA 검정법으로 돌아섰다.

따라서, 당업계에 공지된 방법 및 키트의 문제점을 극복하며, 특히 산발성 AD 를 앓는 환자의 혈장에서 신뢰할만한 Aβ 펩티드를 탐지하기에 충분한 감도를 가진, Aβ 로부터 유도된 펩티드를 탐지하는 개선된 면역학적 검정법 및 키트가 필요하다.

발명의 개요

제 1 국면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, Aβ42, Aβ40 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 폴리펩티드의 탐지 또는 측정을 위한 키트에 관한 것이다:

(i) 상기 표적 폴리펩티드를 인식하는, 제 1 항체 또는 항체들의 배합물

(ii) 제 1 항체 또는 항체들의 배합물에 의해 인식되는 영역과는 상이한 표적 폴리펩티드 영역을 인식하는 제 2 항체 또는 항체들의 배합물

(iii) 결합쌍의 제 1 구성원에 커플링되는 제 2 항체에 대해 친화성을 나타내는 시약, 및

(iv) 탐지가능한 태그에 커플링되어 있는 결합쌍의 제 2 구성원.

제 2 국면에서, 본 발명은 시료 중의 표적 폴리펩티드를 측정 또는 탐지할 뿐만 아니라 대상체에서 신경퇴행성 장애 진단을 위한 본 발명의 키트의 용도에 관한 것이다.

제 3 국면에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 시료 중의 Aβ42, Aβ40 및 이들의 혼합물의 군으로부터 선택되는 표적 폴리펩티드의 양을 측정 또는 탐지하는 방법에 관한 것이다:

(i) 상기 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제 1 항체 또는 항체들의 배합물을 이용하여 시료 내에 존재하는 표적 폴리펩티드를 포획하는 단계,

(ii) 단계 (a) 에서 형성된 면역 복합체를, 제 1 항체 또는 항체들의 배합물에 의해 인식되는 영역과 상이한 표적 폴리펩티드의 영역을 인식하는 제 2 항체 또는 항체들의 배합물과 접촉시키는 단계,

(iii) 단계 (ii) 에서 형성된 복합체를, 제 2 항체에 대해 친화성을 나타내며, 결합쌍의 제 1 구성원에 커플링되어 있는 시약과 접촉시키는 단계,

(iv) 단계 (iii) 에서 형성된 복합체를, 탐지가능한 태그에 커플링되어 있는 결합쌍의 제 2 구성원과 접촉시키는 단계, 및

(v) 결합쌍의 제 2 구성원에 결합된 탐지가능한 태그의 활성 또는 양을 탐지 또는 측정하는 단계.

제 4 국면에서, 본 발명은 본 발명의 방법을 이용하여 환자의 시료 중의 Aβ40 또는 Aβ42 의 양을 측정하고, 상기 대상체의 시료 중의 펩티드 중 하나 또는 두가지 모두의 농도의, 퇴행성 장애가 나타난 건강한 개인 유래의 시료 중의 상기 펩티드 또는 펩티드들의 농도에 대한 상관관계를 구하는 것을 포함하는, 대상체에서의 퇴행성 장애의 진단 방법에 관한 것이다.

본 발명의 저자들은 놀랍게도, 제 1 항에서 정의한 구성요소를 가진 키트를 이용하여, 0.1 pg/ml 미만의 최소 탐지 한계로, Aβ40 및 Aβ42 의 수준을 측정할 수 있다는 것을 발견했다. 상기 키트는 임의의 대상체의 임의의 시료에서, 특히 산발성 AD 를 앓는 것으로 의심되는 대상체의 혈장에서 상기 분자 종들의 신뢰성있는 정량을 가능하게 하는데, 상기 혈장 농도는 너무나 낮아서 현재까지는 신뢰성있는 측정이 가능하지 않았다.

도 1 은 ELISA 샌드위치 검정법의 표준 적정 곡선을 나타내는 것으로, 450 nm 에서의 흡광도 값을 Aβ40 의 표준 제제의 공지된 농도 (pg/mL) 에 대해 그래프를 그린 것이다.
도 2 는 ELISA 샌드위치 검정법의 표준 적정 곡선을 나타내는 것으로, 450 nm 에서의 흡광도 값을 Aβ42 의 표준 제제의 공지된 농도 (pg/mL) 에 대해 그래프를 그린 것이다.

따라서, 제 1 국면에서, 본 발명은 하기를 포함하는, Aβ42, Aβ40 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 폴리펩티드의 측정 또는 탐지 키트에 관한 것이다:

(iii) 결합쌍의 제 1 구성원에 커플링되어 있는 제 2 항체에 대해 친화성을 나타내는 시약, 및

임의의 특정 이론에 구애됨이 없이, 증강된 감도는 탐지 항체로부터의 시그널을 증폭시키는 시약 (iii) 의 이용으로 인한 것으로 여겨진다.

본원에 사용된 "Aβ42" 는 아미노산 672 내지 713 에 해당하는 42 개의 아미노산 펩티드 (서열 식별번호: 4) 이며, β 및 γ-세크리타아제에 의한 아밀로이드 전구체 단백질 (서열 식별번호: 6) 의 순차적인 단백질가수분해 절단으로 생성된다.

본원에 사용된 "Aβ40" 는 아미노산 672 내지 711 에 해당하는 40 개의 아미노산 펩티드 (서열 식별번호: 5) 이며, β 및 γ-세크리타아제에 의한 아밀로이드 전구체 단백질 (서열 식별번호: 6) 의 순차적인 단백질가수분해 절단으로 생성된다.

본 발명의 문맥에서, 제 1 항체는 "포획 항체" 로 지칭되는 것으로, 상기 항체가, 시료로부터 상기 항체가 특이적으로 결합하는 모든 분자종들을 찾아내기 위해 사용됨을 의미한다. Aβ40 및/또는 Aβ42 에 특이적인 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 한, 포획 항체로서 사용될 수 있는 항체의 유형에 관해서는 실제적으로 제한이 없다. 따라서, 포획 항체로 이용하기에 적합한 항체 분자에는 하기의 것이 포함된다:

- 항원-결합 가변 영역 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 중쇄 불변 도메인, CH1, CH2 및 CH3 을 포함하는 "온전한" 항체,

- 온전한 항체의 파파인 (papain) 절단으로 인한 "Fab" 절편으로서, 단일 항원-결합 부위 및 CL 및 CH1 영역을 포함하는 것,

- 온전한 항체의 펩신 절단으로 인한 "F(ab')₂" 절편으로서, 2 개의 항원-결합 부위를 포함하는 것,

- "Fab'" 절편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인 (CH1) 을 포함하며, 1 개의 항원-결합 부위만을 갖는다. Fab' 절편은, 항체 힌지 영역으로부터 1 개 이상의 시스테인을 포함하는, 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 여러개의 잔기가 부가되어 Fab 절편과 차이난다.

- "Fv" 는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 절편이다. 상기 영역은 타이트한, 비공유성 결합으로 1 개의 중쇄 및 1 개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진다. 상기 배치에서, 각 가변 도메인의 3 개의 과가변 영역 (CDR) 이 상호작용하여 VH - VL 이량체의 표면 상에 항원 결합 부위를 정하게 된다. 취합하면, 6 개의 과가변 영역은 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 1 개의 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 오직 3 개의 과가변 영역을 포함하는 Fv 의 절반) 이, 온전한 결합 부위보다는 더 낮은 친화성이긴 하지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

- 단일쇄 FV 또는 "scFv" 항원 절편은 VL 및 VH, 항체의 도메인을 포함하며, 여기서 상기 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬에 존재한다. 바람직하게는, VL 및 VH 영역은 scFv 가 항원 결합에 대한 원하는 구조를 형성하도록 하는 폴리펩티드 링커에 의해 연결된다.

- "2 가의 이중특이적 항체 (diabody)" 는 동일 사슬 상의 2 개의 도메인들 사이를 짝지어 주기에는 너무 짧은 펩티드 링커에 의해 연결된 동일 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 상의 경쇄 가변 도메인 (VL) 에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) 을 포함한다. 이는 또다른 사슬의 상보적인 도메인과의 짝짓기를 성사시키며, 2 개의 관능성 항원 결합 부위를 가진 이량체성 분자의 어셈블리를 촉진한다.

- "이중특이적 항체" (BAb) 는 2 개의 상이하게 특이적인 항원 결합 부위를 가진 단일한 2 가의 항체 (또는 그의 면역치료적으로 유효한 절편) 이다. 2 개의 항원 부위는 화학적으로 또는 당업계에 공지된 유전공학적 방법으로 서로 커플링될 수 있다.

모든 상기 항체 절편들은 당업계에 공지된 통상적인 기술, 예를 들어 당업계에 공지되어 있는 아미노산 결실(들), 삽입(들), 치환(들), 부가(들), 및/또는 재조합 (및/또는 임의의 기타 개질(들) (예를 들어, 트랜슬레이션 후 화학적 개질, 예컨대 글리코실화 및 인산화) 를 단독적으로 또는 조합하여 이용하여 추가로 개질될 수 있다. 면역글로불린 사슬의 아미노산 서열의 기초가 되는 DNA 서열에 상기 개질을 도입하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다: 참고문헌은, 예를 들어 Sambrook 등.; Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 제 2 판 1989 및 제 3 판 2001.

포획 항체로서 적합한 항체에는 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 두가지 모두가 포함된다. 폴리클로날 항체의 제조를 위해서는, 염소, 토끼, 래트, 마우스, 쌍봉낙타, 단봉낙타, 리마, 인간, 조류 및 기타를 포함하는 각종 숙주가 면역원성 특성을 가진 Aβ40 또는 Aβ42 의 절편에 해당하는 펩티드를 이용한 주사로 면역화될 수 있다. 숙주 종에 따라서는, 면역학적 응답성을 증가시키기 위해 각종 아쥬반트가 사용될 수 있다. 상기 아쥬반트에는, 이에 한정되지 않으나, 프로인트 (Freund's), 미네랄 겔, 예컨대 알루미늄 수산화물 및 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 다가음이온 (polyanions), 펩티드, 오일 에멀전, KLH 및 디니트로페놀이 포함된다. 인간에 사용되는 아쥬반트들 중, BCG (bacilli Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum) 이 특히 바람직하다. 항원이 펩티드인 경우, 그것을 면역화시킬 종에서 면역원성인 단백질에 콘쥬게이션시키는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 항원은 이관능성 또는 유도화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통해 콘쥬게이션), N-히드록시숙신이미드 (라이신 잔기를 통해), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물 또는 SOCl₂ 를 이용하여, 키홀 림페트 헤모시아닌 (keyhole limpet hemocyanin (KLH)), 블루 캐리어 (Blue Carrier) (콘콜레파스 콘콜레파스 (Concholepas concholepas) 로부터 분리한 헤모시아닌), 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 저해제에 콘쥬게이션될 수 있다.

모노클로날 항체의 제조를 위해, 통상적인 기법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 Ausubel, F.M. 등의 문헌 (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc; ring-bound edition, 2003) 의 11.4 내지 11.11 부분에 상세하게 기재되어 있는 과정을 이용하여, Kohler 등의 문헌, Nature, 256:495 (1975) 에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 대안적으로, 모노클로날 항체는 McCafferty 등의 문헌, Nature, 348:552-554 (1990) 에 기재된 기법을 이용하여 생성되는 항체 파지 라이브러리로부터 재조합 DNA 과정으로 분리할 수 있다. Clacksoii 등의 문헌, Nature, 352:624-628 (1991) 및 Marks 등의 문헌, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) 은 각각 파지 라이브러리를 이용한 쥐과동물 및 인간 항체의 분리를 기재한다. 후속 문헌들은 사슬 셔플링 (Marks 등, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), 및 매우 큰 파지 라이브러리 구축을 위한 전략으로서의 조합적 감염 및 생체내 재조합에 의한 고친화성 (nM 범위) 인간 항체의 제조를 기재한다 (Waterhouse 등., Nucl. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). 따라서, 상기 기법들은 모노클로날 항체의 분리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 제조 기법에 대한 실행가능한 대안이다.

폴리클로날 항체는 채혈 및 피브린 응고덩어리의 제거 후 면역화된 숙주로부터 수득되는 항혈청으로서 직접 이용될 수 있다. 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양물의 상청액으로서 또는 적합한 숙주의 복강내에서의 하이브리도마의 이식 후 복수액으로서 직접 이용될 수 있다. 대안적으로, 면역글로불린 분자는, 폴리클로날이든 또는 모노클로날이든, 그의 사용 전에 통상적인 수단, 예컨대 Aβ40 또는 Aβ42 로부터 유도된 펩티드를 이용하는 친화성 정제, 비변성 겔 정제, HPLC 또는 RP-HPLC, 크기 배제, 단백질 A 컬럼 상의 정제, 또는 상기 기법의 임의의 조합으로 정제될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 포획 항체는 Aβ40 및 Aβ42 의 공통 영역을 인식하며, 이로써 단일 항체종을 이용하여 두 종의 동시적인 포획을 가능케 한다. 원칙적으로, Aβ40 및 Aβ42 의 두 서열의 공통 영역에 특이적인 임의의 항체가 포획 항체로서 이용될 수 있다. 포획 항체에 의해 표적화될 수 있는 바람직한 에피토프에는 Aβ40 또는 Aβ42 의 1 내지 16, 1 내지 17, 13 내지 28, 15 내지 24, 1 내지 5 및 1 내지 11 의 아미노산에 위치하는 에피토프가 포함된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 포획 항체는 C-말단 영역이 상이한, Aβ40 및/또는 Aβ42 내의 영역에 대한 것이다. 더욱더 바람직한 구현예에서, 포획 항체는 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 N-말단 영역의 에피토프에 대한 것이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 포획 항체는 모노클로날 항체이다. 더욱더 바람직한 구현예에서, 포획 항체는 Aβ 펩티드의 아미노산 1 내지 16 에 해당하는 영역을 인식한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 포획 항체로서 사용되는 모노클로날 항체는 Kim, K.S. (Neuroscience Res. Comm. 1988, 2:121-130) 에 기재된 적이 있는 6E10 mAb 이다.

본 발명의 키트의 제 2 구성요소는 제 1 항체 또는 항체의 배합물에 의해 인식되는 영역과는 상이한 표적 폴리펩티드의 영역을 인식하는 항체 또는 항체의 배합물에 해당한다. 본 발명의 문맥에서, 제 2 항체는 "탐지 항체" 로 지칭되는데, 이는 상기 항체가 포획 항체에 의해 보유하게 된 항원의 양을 탐지하기 위해 사용될 것이기 때문이다.

포획 항체와 마찬가지로, 탐지 항체로 사용될 수 있는 항체의 유형에 대해서 실제적으로 제한이 없다. 그러나, 당업자는 탐지 항체가 다음과 같아야 한다는 것을 이해할 것이다: (i) 포획 항체에 의해 커버되지 않는 항원의 영역에 결합해야 함, 및 (ii) 항원 결합 부위 뿐만 아니라 상기 항체에 대한 높은 결합 친화성을 나타내는 시약에 의해 특이적으로 탐지될 수 있는 추가적인 영역 또는 영역들을 포함함으로써, 포획 항체에 의해 포획되는 항원에 결합되는 항체의 탐지를 가능케 해야 함. 바람직하게는, 상기 시약에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 상기 추가적인 영역들은 면역글로불린 분자의 불변 영역에 해당한다.

적합한 탐지 항체에는, 온전한 항체, Fab, F(ab')₂, Fab' 및 Fv 절편, 단일쇄 FV 항체, 2 가의 이중특이적 항체 (diabody), 이중특이적 항체 등이 포함되며, 상기 화합물들은 위에서 정의된 바와 같다. 포획 항체의 경우와 마찬가지로, 탐지 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날이며, 자연 그대로이거나 또는 트랜슬레이션 후 개질된 것이며, 순수하거나 또는 포획 항체에 대해 기재된 것과 동일한 과정을 이용하여 항원 결합 분자에서 풍부화된 것일 수 있다. 탐지 항체를 이용하기 위해, 그것을 적합한 작용 농도로 희석해야 하며, 상기 희석은 각 몫의 항체에 대해 일상적으로 결정될 수 있다는 것이 당업자에게 감안될 것이다. 더욱이, 적합한 작용 희석은 항혈청이 사용되거나 또는 정제된 IgG 분획이 사용되는지 여부에 따라 달라질 것임이 명백하다. 전형적인 희석은, 1/1000, 1/2000, 1/3000, 1/4000, 1/5000, 1/6000, 1/7000, 1/8000, 1/9000, 1/10000 등이다.

바람직한 구현예에서, 탐지 항체는 하기의 군으로부터 선택되는 임의의 폴리클로날 항체를 포함한다:

(i) Aβ40 또는 Aβ43 과의 임의의 실질적인 교차반응을 부여하지 않고 Aβ42 에 특이적으로 결합하는 Aβ42 펩티드의 C-말단 영역에 해당하는 펩티드에 대해 제조된 폴리클로날 항체

(ii) Aβ42, Aβ39, Aβ38, Aβ41 또는 Aβ43 과의 임의의 실질적인 교차반응을 부여하지 않고 Aβ40 에 특이적으로 결합하는 Aβ40 펩티드의 C-말단 영역에 해당하는 펩티드에 대해 제조된 폴리클로날 항체,

(iii) Aβ40 및 Aβ42 의 C-말단 영역을 동시에 인식하는 항체, 및

(iv) (i) 및 (ii) 하의 항체의 배합물.

더욱 바람직한 구현예에서, Aβ42-특이적 항체의 제조에 사용되는 Aβ42 펩티드의 C-말단 영역에 해당하는 펩티드는 서열 식별번호: 1 또는 서열 식별번호: 2 에서 정의되는 펩티드이다. 또다른 바람직한 구현예에서, Aβ40-특이적 항체의 제조에 사용되는 Aβ40 펩티드의 C-말단 영역에 해당하는 펩티드는 서열 식별번호: 3 에서 정의되는 펩티드이다. Aβ40 및 Aβ42 에 특이적인 항체 및 그의 제조 방법은 WO2004024770 및 WO2004098631 에 상세하게 기재되어 있으며, 이들 문헌의 내용은 본원에 참고문헌으로 포함된다.

당업자라면, 상기 방법이 상기 방법에 사용되는 포획 및 탐지 항체의 유형에 따라 Aβ40, Aβ42 또는 이들 두가지 종 모두의 동시 탐지에 사용될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Aβ40 를 특이적으로 탐지 또는 측정하기 위해서는, 포획 항체는 Aβ40 의 N-말단 영역 (및 또한 Aβ42 의 것, 그 이유는 두 펩티드가 모두 동일한 N-말단 영역을 갖기 때문이다) 을 인식하는 항체일 수 있으며, 탐지 항체는 Aβ42 와의 임의의 교차 반응을 부여하지 않으면서 Aβ40 의 C-말단 영역을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다. 대안적으로, Aβ40 는 Aβ42 와의 임의의 교차반응을 부여하지 않으면서 Aβ40 의 C-말단 영역을 인식하는 포획 항체 및 Aβ40 및 Aβ42 에 공통적인 Aβ40 의 영역, 바람직하게는 Aβ42/Aβ40 의 N-말단 영역을 인식하는 탐지 항체를 이용하여 특이적으로 탐지될 수 있다.

Aβ42 를 특이적으로 탐지 또는 측정하기 위해서는, 포획 항체는 Aβ42 의 N-말단 영역 (및 또한 Aβ40 의 것, 그 이유는 두 펩티드가 모두 동일한 N-말단 영역을 갖기 때문이다) 을 인식하는 항체일 수 있으며, 탐지 항체는 Aβ40 와의 임의의 교차 반응을 부여하지 않으면서 Aβ42 의 C-말단 영역을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다. 대안적으로, Aβ42 는 Aβ42 의 C-말단 영역을 인식하는 포획 항체 및 Aβ40 및 Aβ42 에 공통적인 Aβ42 의 영역을 인식하는 탐지 항체를 이용하여 특이적으로 탐지될 수 있다.

Aβ42 및 Aβ40 을 동시에 탐지 또는 측정하기 위해서는, 포획 항체는 Aβ42 및 Aβ40 에 공통적인 N-말단 영역을 인식하는 항체일 수 있으며, 탐지 항체는 2 가지 이상의 항체의 배합물로서, 제 1 항체가 Aβ40 와의 임의의 교차 반응을 부여하지 않으면서 Aβ42 의 C-말단 영역을 특이적으로 인식하며, 제 2 항체가 Aβ42 와의 임의의 교차 반응을 부여하지 않으면서 Aβ40 의 C-말단 영역을 특이적으로 인식한다. 대안적으로, 포획 항체는 Aβ42 및 Aβ40 에 공통적인 N-말단 영역을 인식하는 항체일 수 있으며, 탐지 항체는 Aβ40 및 Aβ42 의 두가지 모두의 C-말단 영역을 인식하는 항체일 수 있다. 대안적으로, Aβ42 및 Aβ40 는, Aβ40 와의 임의의 교차 반응을 부여하지 않으면서 Aβ42 의 C-말단 영역을 특이적으로 인식하는 제 1 항체 및 Aβ42 와의 임의의 교차반응을 부여하지 않으면서 Aβ40 의 C-말단 영역을 특이적으로 인식하는 제 2 항체를 포함하는 2 가지 이상의 항체의 혼합물을 포획 항체로서 이용하고, Aβ42 및 Aβ40 의 두가지에 공통적인 N-말단 영역을 인식하는 탐지 항체를 이용하여 동시에 탐지될 수 있다. 대안적으로, Aβ42 및 Aβ40 는 포획 항체로서의 두가지 Aβ40 및 Aβ42 의 C-말단 영역을 인식하는 항체 및 Aβ42 및 Aβ40 의 두가지 모두에 공통적인 N-말단 영역을 인식하는 탐지 항체를 이용하여 동시에 탐지될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 제 1 및/또는 제 2 항체 또는 항체들의 배합물은 그의 제조에 이용되는 폴리펩티드의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이용하여 친화성을 근거로 정제된 것이다.

키트의 제 3 구성요소는 결합쌍의 제 1 구성원에 커플링되어 있고, 탐지 항체에 대해 친화성을 나타내는 시약에 해당한다. 항체 결합 시약은 특별한 유형(들), 특별한 클래스(들) 및/또는 항체 또는 항체 분절의 특별한 서브클래스(들)에 비공유적으로 결합할 수 있다. 대안적으로, 항체 결합 시약은 특별한 항원에 특이적인 항체에 비공유적으로 결합할 수 있다. 특별한 구현예에서, 항체 결합 시약은 탐지 항체의 Fc 영역 또는 F(ab) 영역에 비공유적으로 결합한다. 바람직한 항체 결합 시약에는, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 V, 단백질 L, 항-Fc 항체 또는 항체 결합 분절 및 Fc 수용체 (FcR) 또는 그의 항체 결합 분절이 포함된다. 탐지 항체에 비공유적으로 결합될 수 있는 항체의 비제한적 예시에는, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 키메라성 항체, 단일 도메인 항체, 단일쇄 Fvs (scFv) 단일쇄 항체, Fab 분절, F(ab') 분절, 디설파이드-연결 Fvs (sdFv), 인트라바디 (intrabodies), 및 항-이디오티픽 (항-Id) 항체 및 임의의 상기한 것의 에피토프 결합 분절이 포함된다. Fc 수용체의 비제한적 예시에는, FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIC, FcγRIIIAα, FcγRIIIB, FcεRIα, FcεRIξ 및 FcγRIIIAξ 이 포함된다.

본 발명의 키트의 제 4 의 구성요소는 탐지가능한 태그에 커플링되어 있는 결합쌍의 제 2 구성원에 해당한다. 적합한 결합쌍에는 하기의 것이 포함된다:

합텐 또는 항원/항체, 예를 들어 디곡신 및 항-디곡신 항체

바이오틴 또는 바이오틴 유사체 (예를 들어, 아미노바이오틴, 이미노바이오틴 또는 데스티오바이오틴)/아비딘 또는 스트렙타비딘,

당/레시틴,

효소 및 보조인자

엽산/엽산염

단백질에 선택적으로 결합하는 이중 나선형 올리고뉴클레오티드/전사 인자

핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산

수용체/리간드, 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용체/스테로이드 호르몬.

결합쌍의 "제 1" 및 "제 2" 구성원이라는 용어는 상대적인 것이며, 상기 구성원 각각은 결합쌍의 제 1 또는 제 2 구성원으로서 나타낼 수 있다는 것이 이해될 것이다. 바람직한 구현예에서, 결합쌍의 제 1 구성원은 바이오틴 또는 기능적으로 동등한 그의 변이체이며, 결합쌍의 제 2 구성원은 아비딘, 스트렙타비딘 또는 기능적으로 동등한 그의 변이체이다.

바람직한 구현예에서, 결합쌍의 제 2 구성원은 스트렙타비딘이다.

적합한 탐지가능한 태그에는, 이에 제한되지 않지만, 형광 부분 (예를 들어, 플루오레신, 로다민, 피코에리트린, 쿠마린, 옥사진, 레소루핀, 시아닌 및 이들의 유도체), 발광 부분 (예를 들어, Quantum Dot Corporation, Palo Alto, CA 에서 공급하는 Qdot^TM 나노입자) 이 포함된다. 탐지가능한 태그가 효소인 경우, 상기 효소는, 예를 들어 활성화제, 기질, 증폭제 등이 첨가되는 경우, 반드시 탐지가능한 시그널을 생성할 수 있어야 한다. 본 발명에 탐지가능한 태그로서 적합한 효소 및 상응하는 기질에는 하기의 것이 포함된다:

알칼리성 포스파타아제:

· 발색성 기질: p-니트로페닐 포스페이트 (p-NPP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트/니트로블루 테트라졸륨 (BCIP/NPT), Fast-Red/나프톨-AS-TS 포스페이트를 기재로 하는 기질

· 형광형성 기질: 4-메틸룸벨리페릴 포스페이트 (4-MUP), 2-(5'-클로로-2'-포스포릴옥시페닐)-6-클로로-4-(3H)-퀴나졸리논 (CPPCQ), 3,6-플루오레신 디포스페이트 (3,6-FDP), Fast Blue BB, Fast Red TR, 또는 Fast Red Violet LB 디아조늄 염

퍼옥시다아제:

· 2,2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) (ABTS), o-페닐렌디아민 (OPT), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB), o-디아니시딘, 5-아미노살리실산, 3-디메틸아미노벤조산 (DMAB) 및 3-메틸-2-벤조티아졸린히드라존 (MBTH), 3-아미노-9-에틸카르바졸 (AEC)- 및 3,3'-디아미노벤지딘 테트라히드로클로라이드 (DAB) 를 기재로 하는 발색성 기질.

· 형광형성 기질: 4-히드록시-3-메톡시페닐아세트산, Amplex

Red 시약, Amplex UltraRed 및 환원된 디히드록사텐을 포함하는 환원된 페녹사진 및 환원된 벤조티아진.

글리코시다아제:

· 발색성 기질: β-D-갈락토시다아제에 대한 o-니트로페닐-β-D-갈락토시드 (o-NPG), p-니트로페닐-β-D-갈락토시드 및 4-메틸룸벨리페닐-β-D-갈락토시드 (MUG).

· 형광형성 기질: 레소루핀 β-갈락토피라노시드, 플루오레신 디갈락토시드 (FDG), 플루오레신 디글루쿠로나이드, 4-메틸룸벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드, 카르복시움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드 및 플루오린화 쿠마린 β-D-갈락토피라노시드

옥시도리덕타아제 (루시퍼라아제):

· 발광성 기질: 루시페린.

바람직한 구현예에서, 탐지가능한 태그는 양고추냉이 퍼옥시다아제이며, 탐지 시약은 TMB 이다.

바람직한 구현예에서, 키트는 추가로 고체 지지체를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "지지체" 또는 "표면" 은 여러가지 형상, 예를 들어 좁고 긴 형태, 간상형, 라텍스 입자, 자석 입자, 미세입자를 포함하는 입자형, 비드, 멤브레인, 마이크로타이터 웰 및 플라스틱 관 중 임의의 한가지를 가질 수 있는 다공성 또는 비다공성 수불용성 재료의 고체상을 지칭한다. 원칙적으로, 충분한 양의 포획 항체와 결합할 수 있다면, 임의의 재료가 고체 지지체로서 적합하다. 따라서, 고체상 재료의 선택은 원하는 검정법 포맷 성능 특징을 근거로 결정된다. 고체 지지체에 적합한 재료에는, 중합체 재료, 특히 셀룰로오스계 재료 및 예컨대 종이, 예를 들어 여과지, 크로마토그래피 용지, 유리섬유지 등을 함유하는 섬유와 같은 셀룰로오스로부터 유도된 재료; 합성 또는 개질된 자연 발생 중합체, 예컨대 니트로세룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 가교결합된 덱스트란, 아가로오스, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리비닐 부티레이트), 등; 자체로 또는 기타 재료와 함께 사용; 예를 들어 바이오글라스로 이용한 유리와 같은 유리, 세라믹, 금속 등이 포함된다. 스티렌 및 카르복실화 스티렌 또는 아미노, 히드록실, 할로 등과 같은 기타 활성 기들로 관능화된 스티렌의 비가교결합 중합체가 바람직하다. 일부의 경우, 부타디엔과 같은 디엔으로 치환된 스티렌의 공중합체가 사용된다.

고체 지지체 및 포획 항체는 키트에서 따로따로 제공될 수 있거나, 또는 대안적으로는 지지체는 포획 항체로 미리 코팅되어 전달될 수 있다. 상기의 경우, 지지체는 포획 항체의 결합 후 블로킹 용액으로 처리될 수 있다. 지지체를 미리 코팅하는 경우, 지지체를 진한 트레할로오스 용액으로 처리하고 건조시키는 것이 바람직하며, 이 경우 건조시킨 트레할로오스는 지지체 상에 할로 (halo) 를 형성한다. 건조시킨 트레할로오스를 포함하는 상기 지지체는 예외적으로 안정하며, 암실에서 4℃ 로 유지되는 경우 2 년까지 저장될 수 있다.

키트의 추가적인 구성요소는 하기를 포함할 수 있다:

환자로부터 분석할 시료를 채취해 내는 수단.

표적 펩티드의 표준 곡선 제작에 필요한 완충액 및 용액.

검정할 동안 고체 지지체를 세척 및 블로킹하기 위한 완충액 및 용액

고체 지지체를 코팅 항체로 코팅하기 위한 완충액 및 용액

탐지가능한 태그로부터의 발색 또는 형광 시그널을 발생시키기 위한 시약.

탐지가능한 태그로부터의 발색 또는 형광 생성물의 형성을 종료시키기 위한 시약 (예를 들어, 1N H₂SO₄)

펩티드를 폴딩되지 않은 상태로 유지시키기 위한 수단 (예를 들어, 진한 구아니디늄 히드로클로라이드).

Aβ40 또는 Aβ42 펩티드 또는 이들의 배합물의 원액 용액을 포함하는 시료.

바람직한 구현예에서, 포획 항체는 고체 지지체에 고정된다. 고정은 탐지할 표적 폴리펩티드의 결합 이전에 또는 일단 펩티드/단백질이 포획 항체에 결합되었을 때 수행될 수 있다. 어느 경우든, 고체 지지체가 사용되면, 측정할 표적 폴리펩티드를 포함하는 시료의 첨가 전에 담체 상의 과다한 단백질 결합 부위를 블로킹하는 것이 편리하다. 바람직하게는, 지지체 상의 펩티드 결합 부위의 블로킹 또는 켄칭(quenching)은, 각각의 결합 반응 후에 복합체를 세척하기 위해 사용되는 것과 동일한 완충액 (예를 들어, 50 mM Tris-HCl, pH 8, PBS 또는 TBS, 임의로는 Tween 20 함유) 에 거대분자 화합물 (예를 들어, 소 혈청 알부민, 전지분유, 웨스턴 블롯 시약, 카세인, 락토알부민, 오보알부민) 이 약 0.05% 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 5%, 더욱 바람직하게는 약 3% 의 농도로 보충된 것을 이용하여 수행된다. 고정된 포획 항체를 포함하는 지지체를 당분간 저장해야 한다면, 지지체를 진한 트레할로오스 용액으로 처리하고 건조시키는 것이 바람직한데, 상기의 경우 건조시킨 트레할로오스는 지지체 상에 할로를 형성한다. 건조시킨 트레할로오스를 포함하는 상기 지지체는 예외적으로 안정하며 암실에서 4℃ 로 유지되는 경우 2 년까지 저장될 수 있다.

본 발명의 키트는 키트의 제 1 및 제 2 항체 구성요소에 의해 특이적으로 인식되는 폴리펩티드를 고감도로 탐지 또는 측정할 수 있도록 한다. 따라서, 추가 국면에서, 본 발명은 시료 내의 단백질 또는 단백질들을 탐지하기 위한 본 발명의 키트의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 키트는 시료에서 Aβ40, Aβ42 및 이들의 배합물의 군으로부터 선택되는 펩티드 탐지에 이용된다.

본 발명에서 이해되는 바와 같은 "시료" 는, 조직 배양물, 혈장, 혈청, 타액, 정액, 가래, 뇌척수액 (CSF), 눈물, 점액, 땀, 젖, 뇌 추출물 등 중 임의의 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 시료는 혈장 시료이다.

임의의 시료에서 Aβ40 및 Aβ42 농도의 고감도 측정을 제공하는 본 발명의 키트의 성능의 측면에서, 임의의 세포액 또는 조직 중의 임의의 상기 두가지 펩티드의 농도 변경이 있는 임의의 질환, 특히 퇴행성 질환, 더욱 특별하게는 신경퇴행성 질환의 진단에 이용될 수 있다. Aβ40 및/또는 Aβ42 의 수준 변경의 출현을 근거로 진단될 수 있는 퇴행성 질환의 비제한적 예시에는 하기의 것이 포함된다:

뼈 퇴행성 장애, 예컨대 골감소증, 골연화증, 골다공증, 뼈 골수종 (osteomyeloma), 골형성장애, 파제트병 (Paget's disease), 불완전 골생성증, 뼈 경화증 (bone sclerosis), 재생불량성 뼈 장애 (aplastic bone disorder), 체액성 고칼슘혈증 골수종 (humoral hypercalcemic myeloma), 다발성 골수종 (multiple myeloma) 및 전이에 후속하는 뼈 박화 (bone thinning following metastasis).

연골 퇴행성 장애, 예컨대 고함-스타우트 증후군 (Gorham-Stout syndrome); 관절염성 질환; 골관절염; 류마티스 관절염; 건선 관절염; 류마티스성 질환; 및 파쇄골.

근육 퇴행성 장애, 예컨대 근육 퇴행 위축, 근위축, 충혈성 폐색성 폐질환, 근육 종말 증후군 (muscle wasting syndrome), 사르코페니아 (sarcopenia), 악액질.

허혈로 인한 심근세포 괴사를 포함하는 심장 퇴행성 질환, 이식 거부로 인한 조직 및 장기 괴사, 자가독성으로 인한 청력 소실.

망막 퇴행성 장애, 예컨대 색소성 망막염.

신경계의 퇴행성 질환, 예컨대 알렉산더 병, 알퍼스 병 (Alper's disease), 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 모세혈관확장성조화운동불능, 바텐 병 (Batten disease), 소 해면양뇌증 (Bovine spongiform encephalopathy (BSE)), 카나반 병 (Canavan disease), 코케인 증후군 (Cockayne syndrome), 피질 기저핵 퇴행증 (Corticobasal degeneration), 크로츠펠트-야콥 병 (Creutzfeldt-Jakob disease), 헌팅턴 병, HIV-연관성 치매, 케네디 병 (Kennedy's disease), 크라베 병 (Krabbe disease), 루이 소체 치매 (Lewy body dementia), 운동 실조증 (Machado-Joseph disease (Spinocerebellar ataxia type 3)), 다발성 경화증, 다발계 위축증, 신경보렐리아증 (Neuroborreliosis), 파킨슨 병, 펠리체우스-메르츠바허 병 (Pelizaeus-Merzbacher Disease), 피크 병 (Pick's disease), 원발성 측삭경화증, 프리온 병 (Prion diseases), 렙숨 질환 (Refsum's disease), 샌드호프 병 (Sandhoff disease), 쉴더 병 (Schilder's disease), 정신분열병, 스피엘메이어-보그트-쉬그렌-바텐 병 (Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease (바텐 병으로도 공지되어 있음), 척수소뇌성 실조증, 척수 근육 위축, 진행성 핵상성 안근마비 (Steele-Richardson-Olszewski disease), 척수매독. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키트를 이용하여 진단되는 신경퇴행성 장에는 알츠하이머병이다.

질병이 있을 가능성을 알아내기 위해 필요한 기준은 절대적인 Aβ40 및 Aβ42 농도 뿐만 아니라, 상기 값들의 조합으로 유도되는 기준, 예컨대 비율 Aβ40/Aβ42 또는 Aβ42/Aβ40, 전체 Aβ 펩티드에 대한 Aβ42 및 Aβ40 의 백분율 또는 Aβ42 및 Aβ40 의 농도의 부가일 수 있음을 감안할 수 있다.

바람직한 구현예에서, AD 환자의 시료에서는 건강한 개인으로부터 수득되는 동일한 기원의 생물학적 시료 중의 Aβ40 및/또는 Aβ42 펩티드의 양보다 더 낮은 농도가 나타난다는 것을 근거로 하여 진단될 수 있는 병은 알츠하이머병, 더욱 특별하게는 산발성 AD 이다.

사용시, 본 발명의 키트는 시료 중의 Aβ42, Aβ40 및 이들의 배합물의 군으로부터 선택되는 표적 폴리펩티드의 양을 탐지하기 위한 5 단계 방법을 수행하도록 한다. 상기 방법은 본 발명의 또다른 목적이며, 하기의 단계를 포함한다:

(i) 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제 1 항체 또는 항체들의 배합물을 이용하여 시료 내에 존재하는 표적 폴리펩티드를 포획하는 단계,

(v) 결합쌍의 제 2 구성원에 결합된 화합물의 형광 발현 또는 효소의 활성을 탐지하는 단계.

바람직한 구현예에서, 탐지할 펩티드는 상기 펩티드의 비-올리고머성 형태, 더욱 바람직하게는 Aβ40 및 Aβ42 중 하나의 단량체 형태에 해당한다.

상기 방법의 각각의 단계에 사용되는 시약은 상기에 상세히 기재된 바 있다.

본 발명의 방법의 제 1 단계에서, Aβ40 및/또는 Aβ42 펩티드를 포함하는 시료는 제 1 항체와 접촉시켜 제 1 면역 복합체를 형성하도록 한다.

첫번째 결합 단계를 수행한 후, 복합체는 세척하여 포획 항체에 결합하지 않은, 원래 시료에서 발견되는 임의의 과량의 단백질/펩티드를 제거할 수 있다. 본 발명의 문맥상 사용될 수 있는 바람직한 세척 완충액에는, 임의로는 염 (예를 들어, 150 mM NaCl) 을 포함하며, 임의로는 낮은 농도의 세제 (예를 들어, 0.05% Tween-20) 를 포함하는, 생리학적 값에 근접한 pH 의 임의의 완충액 (예를 들어, 50 mM Tris-HCl) 이 포함된다.

제 2 단계에서, 포획 항체와 시료 내의 Aβ 펩티드 또는 펩티드들 사이에서 형성된 복합체는 제 2 항체와 접촉시켜 "샌드위치-유형" 면역 복합체를 형성한다.

제 2 단계를 수행한 후, 면역 복합체는 이전에 기재된 것과 본질적으로 동일한 완충액 및 과정으로 세척하여 비특이적으로 결합된 항체를 제거할 수 있다.

제 3 단계에서, 본 발명의 방법은 포획 펩티드 또는 펩티드들과 탐지 항체 사이에서 형성된 복합체를, 탐지 항체에 대해 친화성을 나타내며 결합쌍의 제 1 구성원에 커플링되어 있는 시약과 접촉시키는 것을 포함한다.

제 4 단계에서, 본 발명의 방법은 항체 결합 시약과 탐지 항체 사이에서 형성된 복합체를 탐지가능한 태그에 커플링되어 있는 결합쌍의 제 2 구성원과 접촉시키는 것을 수반한다.

본 발명의 방법의 제 5 단계에서, 상기 방법은 탐지가능한 태그의 탐지를 수반한다. 탐지 및/또는 탐지가능한 태그의 정량이 태그의 특징에 좌우되며 당업계에 공지되어 있음을 이해할 것이다. 온전한 기질 또는 탐지가능한 태그가 발광 또는 염료 성분을 포함하는 경우, UV 트랜스일루미네이터 상의 시각적인 관찰에 의해 또는 UV-기반의 전하 결합 소자 (CCD) 카메라 탐지 시스템, 레이저-기반의 겔 스캐너, 크세논-아크-기반의 CCD 카메라 탐지 시스템, UV-트랜스일루미네이터가 조합된 폴라로이드 카메라 뿐만 아니라 냉광의 탐지에 사용되는 각종 기타 기기들을 이용하여 탐지가 가능하다. 탐지가능한 태그가 효소인 경우, 본 발명의 방법의 제 5 단계는 태그로 표지된 면역복합체 (예를 들어, 탐지가능한 태그로 표지된 포획된 펩티드, 탐지 항체 및 시약) 를 탐지가능한 태그로서 사용된 효소의 활성화제, 기질 또는 증폭제에 노출시키는 것을 수반한다. 탐지가능한 시그널을 생성할 수 있는 널리 공지된 탐지가능한 태그에는 효소로 표지된 항체가 포함된다. 상기 목적을 위해 널리 공지된 예시 효소에는, 양고추냉이 퍼옥시다아제, 알칼리성 포스파타아제 및, β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제 및 β-글루쿠로니다아제를 포함하는 글리코시다아제가 포함된다. 예시로서, 탐지 항체에 특이적으로 결합하는 시약은 양고추냉이 퍼옥시다아제로 태그될 수 있다. 포획 부분-탐지 항체-시약 복합체의 형성시, 탐지는 탐지가능한 태그로서 이용되는 효소에 대해 널리 공지된 임의의 광범위한 기질을 이용하여 수행될 수 있다.

또다른 국면에서, 본 발명은 신경퇴행성 질환의 진단 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 질환을 가진 것으로 의심되는 대상체의 시료 중의 Aβ40 및/또는 Aβ42 의 수준을 측정하고, 상기 대상체의 시료 중의 한가지 및/또는 두가지 펩티드의 농도의, 신경퇴행성 장애를 나타내는 건강한 개인 유래의 시료 중의 상기 펩티드 또는 펩티드들의 농도에 대한 상관관계를 구하는 것을 포함한다.

바람직한 구현예에서, 신경퇴행성 질환은 알츠하이머병이며, 상기 시료 중의 펩티드 Aβ40, Aβ42 또는 이들의 배합물의 양이 건강한 개인 유래의 시료 중의 상기 펩티드 또는 펩티드들의 양보다 더 적은 경우, 대상체가 알츠하이머병을 앓고 있음을 나타낸다. 바람직하게는, 측정은 혈장 또는 혈청에서 수행한다.

측정한 시료들을 동시에 사용하고, 측정할 화합물의 농도를 증가시켜 알고 있는 여러 개의 시료를 사용하여 상기 방법의 상이한 단계들을 수행하는 것이 바람직하다. Aβ40 및/또는 Aβ42 를 측정하려는 경우, 각각의 펩티드에 대한 표준 곡선은 농도를 증가시키며 제작해야 한다. 표준 곡선에는 하기의 두가지 목적이 있다: (i) 표적 펩티드의 농도와 함께 선형적으로 시그널이 증가하는 농도 범위를 확립함, 및 (ii) 농도값을 수득하기 위해 시험용 시료를 사용하여 수득한 시그널을 곡선에 내삽하여 시험용 시료 중의 펩티드의 농도를 측정함. 본 발명의 검정법의 높은 감도의 측면에서, 시험용 시료의 바람직한 농도는, 예를 들어 3.125; 6.25; 12.5; 25; 50; 100 및 200 pg/mL 이다. 표준 곡선을 수득하기 위해 사용되는 시료의 농도는 각각의 시험 기질에 따라 가변적일 수 있다는 것을 감안할 수 있을 것이다. 그러나, 검정법의 선형 범위의 측정은 당업자에 의해 통상적인 수단으로 쉽게 측정될 수 있다. 산발성 AD 가 있는 환자 유래의 혈청에 비해 가족성 AD 가 있는 환자의 CSF 시료에서 뿐만 아니라 혈청 시료에서 더 많은 양의 Aβ42 및 Aβ40 펩티드가 있음을 감안하면, 가족성 AD 가 있는 환자 유래의 CSF 또는 혈청으로부터의 시료 중의 Aβ 펩티드의 측정에 본 발명의 키트를 사용하는 경우, Aβ40/Aβ42 의 최종 농도가 검정법의 선형 측면에 속하는 범위 내에서 발견되도록 이들을 희석하는 것이 바람직하다.

하기의 실시예는 설명으로서 제공되며, 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

바이오틴-스트렙타비딘 증폭을 이용한 색차 ELISA 샌드위치

감도를 증가시키기 위해, 시그널은 바이오틴-스트렙타비딘을 이용하여 증폭될 수 있다. 아밀로이드 Aβ40 및 아밀로이드 Aβ42 펩티드의 두가지 모두의 아미노산 1 내지 17 을 인식하는 6E10 mAb 포획 항체를 이용하여 플레이트를 코팅했다. 상기 코팅은 pH=9.6 인 100 mM 탄산염/중탄산염 완충액 중에서의 5 ㎍/ml 의 농도에서 밤새 4℃ 에서 수행했다. 실온에서 쉐이킹하면서 3 시간 동안 또는 37℃ 에서 2 시간 동안 300 ㎕ 의 블로킹 용액 (50 mM Tris-HCl, pH 8, 0.2% Tween-20, 0.5% BSA) 을 이용하여 플레이트를 블로킹했다. 필요한 경우, 블로킹 후 플레이트를 20 mg/ml 트레할로오스를 포함하는 100 ㎕ 의 50 mM Tris-HCl pH 8 용액을 이용하여 처리할 수 있다. 트레할로오스의 백색 할로 특징이 나타날 때까지 플레이트를 증발하도록 방치했다. 그렇게 처리한 플레이트는 알루미늄 호일로 덮어 4℃ 에서 보관할 수 있으며, 2 년 동안 안정하다.

표준 곡선의 시료를 6E10 mAb 로 코팅되고 트레할로오스로 처리된 플레이트 상의 펩티드 Aβ40 또는 Aβ42 의 200 pg/ml 원액 용액으로부터 제조했다. 상기 용액으로부터, SDB 중의 일련의 1:2 희석을 하여, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125 pg/ml 의 농도를 제공했다. 100 ㎕ 의 각각의 희석 또는 비희석 시료를 SDB (1/1.000.000) 중의 희석 또는 비희석물에 첨가하고, 4℃ 에서 밤새 (또는 37℃ 에서 2 시간 동안) 인큐베이션했다.

탐지 항체 (Aβ42 또는 Aβ40 이 탐지되는지 여부에 따라, Aβ42 펩티드의 C-말단 영역에 해당하는 펩티드에 대해 제조된 폴리클로날 항체 또는 Aβ40 펩티드의 C-말단 영역에 해당하는 펩티드에 대해 제조된 폴리클로날 항체) 를 SDB 에 첨가하여 희석했다. 100 ㎕ 를 각각의 웰에 첨가하고, 이어서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다.

이어서, 바이오틴-표지 항-토끼 IgG 항체 (SIGMA) 의 SDB 중 1/5000 희석물 100 ㎕ 를 첨가하고, 실온에서 쉐이킹하며 1 시간 동안 인큐베이션했다. 이어서, HRP-커플링된 스트렙타비딘 (SIGMA 제) 의 SDB 중 1/4000 희석물 100 ㎕ 를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다.

플레이트의 현색을 위해, 100 ㎕ 의 발색성 기질 TMB (ZEU Inmunotec) 를 첨가했다. TMB 를 첨가하고, 암실에서 15 내지 30 분 동안 인큐베이션했다. 종료 용액으로서, 50 ㎕ 의 1N H₂SO₄ 를 웰마다 첨가했다. 플레이트 검독기 Synergy HT (BioTek Instruments) 에서 450 nm 에서의 흡광도를 검독했다.

각각의 단계 사이에서, 플레이트는 매 번 5 회의 헹굼을 수행하도록 설정된 자동 플레이트 세척기 (Elx50 Bio Tek Instruments) 를 이용하여 세척했다. 세척 용액은 50 mM 의 Tris-HCl pH 8, 0.05% Tween-20 및 150 mM NaCl (사용 전 여과) 를 함유했다.

실시예 2

형광 ELISA 샌드위치 검정

플레이트를 중탄산염 완충액 (5 ㎍/ml) 에서 6E10 mAb 를 이용하여 밤새 4℃ 에서 코팅했다. 이어서, 플레이트를 쉐이킹하면서 실온에서 3 시간 동안 블로킹했다 (300 ㎕/웰). 이어서, 시험 및 표준 곡선 시료를 플레이트에 첨가하고, 4℃ 에서 밤새 인큐베이션했다. 탐지 항체 (항-Aβ40 또는 항-Aβ42 혈청) 의 1/4000 희석물을 각 웰에 첨가하고 쉐이킹하면서 실온에서 1 시간동안 인큐베이션했다. FITC-커플링된 항-항체의 일련의 희석물 (희석배수 1/1000, 1/5000, 1/10000) 을 첨가하고, 암실 내 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 형광은 485 nm 의 여기 파장 및 528 nm 의 발광 파장을 이용했다.

대안적으로, 검정을 Quanta-Blu (PIERCE) 형광 기질을 이용하여 수행해 ELISA 검정의 감도를 증가시켰다. 최대 여기는 325 nm 이고, 최대 발광은 420 nm 이다. 315-340 nm 의 여기 범위 및 370-470 nm 의 발광 범위에서 탐지될 수 있다. QuantaBlu Working Solution 은 9 부의 QuantaBlu Substrate Solution 를 1 부의 QuantaBlu Stable Peroxidase Solution (실온에서 24 시간동안 안정한 용액) 과 혼합하여 제조한다. 이는 실온에서 1.5 분 내지 90 분 인큐베이션될 수 있으며, 반응을 종료시키거나 또는 종료시키지 않고 검독될 수 있다 (청색이 발색됨).

플레이트를 중탄산염 완충액 (5 ㎍/ml) 에서 밤새 4℃ 에서 6E10 mAb 로 코팅한 후, 쉐이킹하면서 실온에서 3 시간 동안 블로킹했다 (300 ㎕/웰). 하기 농도의 Aβ42 및 Aβ40 펩티드를 이용하여 상이한 표준 곡선을 제작했다:

1000, 500, 250, 125, 62.5, 31, 25 및 15.65 pg/mL

200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25 및 3.125 pg/mL

25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78 및 0.39 pg/mL

10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 및 0.156 pg/mL

5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125, 0.156 및 0.078 pg/mL

1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125 및 0.0156 pg/mL

탐지 항체 (항-Aβ40 또는 항-Aβ42 혈청) 을 쉐이킹하면서 실온에서 1 시간 동안 첨가했다 (1/4000 로 희석). 이어서, HRP-커플링된 항-토끼 IgG 1/1000 를 첨가하고, 쉐이킹하면서 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션했다. 반응을 현색시키기 위해, 100㎕ 의 Quanta-Blue Working Solution 을 첨가한 후, 암실 내 실온에서, 30, 60 및 90 분 동안 인큐베이션했다. 이어서, STOP 용액을 이용하여 반응을 종료시키거나 또는 종료시키지 않고, 30, 60 및 90 분에서 형광을 검독했다 (여기: 360/40 nm; 발광: 460/40 nm).

실시예 3

Aβ40 및 Aβ42 표준 곡선의 제작

Aβ40 표준 곡선의 제작을 위해, 인간 Aβ40 의 동결건조된 시료를 10 ㎍/mL 로 재건했다. 원액 용액으로부터, 하기의 농도 (pg/mL) 를 가진 시료를 제작했다: 25,000 pg/ml, 2,500 pg/ml, 25 pg/ml, 12.5pg/ml, 6.25 pg/ml, 3.125 pg/ml, 1.56 pg/ml, 0.78 pg/ml. 시료는 1 mM 의 프로테아제 저해제 AEBSF 의 존재 하에 제작했다. 이어서, 시료를 이전의 실시예에서 정의된 방법에 따라 가공했다. 결과를 도 1 에 나타낸다.

Aβ42 표준 곡선의 제작을 위해, 인간 Aβ42 의 동결건조된 시료를 10 ㎍/mL 로 재건했다. 원액 용액으로부터, 하기의 농도 (pg/mL) 를 가진 시료를 제작했다: 25,000 pg/ml, 2,500 pg/ml, 25 pg/ml, 12.5pg/ml, 6.25 pg/ml, 3.125 pg/ml, 1.56 pg/ml, 0.78 pg/ml. 시료는 1 mM 의 프로테아제 저해제 AEBSF 의 존재 하에 제작했다. 이어서, 시료를 이전의 실시예에서 정의된 방법에 따라 가공했다. 결과를 도 2 에 나타낸다.

실시예 4

AD 진단 및 Aβ40/Aβ42 수준 사이의 상관관계

대조군 대상체의 코호트, 및 컷오프값이 24 인 간이 정신상태 탐지 (MMSE) 스코어를 이용하여 AD 가 있는 것으로 진단된 환자의 코호트 유래의 혈청 시료에서 이전의 실시예에 기재한 ELISA 샌드위치 검정법을 이용하여 Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정했다. Aβ40 및 Aβ42 의 pg/mL 농도를 표 1 에 제시한다.

평균값을 계산하여, 결과를 표 2 에 제시한다.

	건강체	AD 환자
Aβ40 (pg/mL)	167.70	30.78
Aβ42 (pg/mL)	169.75	50.53

SEQUENCE LISTING <110> ARACLON BIOTECH S.L. <120> HIGH SENSITIVTY IMMUNOASSAYS AND KITS FOR THE DETERMINATION OF PEPTIDES AND PROTEINS OF BIOLOGICAL INTEREST <130> P3158PC00 <150> EP 07380227.4 <151> 2007-08-02 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide used to prepare the anti-Abeta42-specific polyclonal antibody <400> 1 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide used to prepare the anti-Abeta42-specific polyclonal antibody <400> 2 Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide used to prepare the anti-Abeta40-specific polyclonal antibody <400> 3 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 1 5 <210> 4 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40 <210> 6 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770

Claims

하기를 포함하는, Aβ42, Aβ40 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 표적 폴리펩티드의 탐지 키트:
(i) 상기 표적 폴리펩티드를 인식하는, 제 1 항체 또는 항체들의 배합물
(ii) 제 1 항체 또는 항체들의 배합물에 의해 인식되는 영역과는 상이한 표적 폴리펩티드 영역을 인식하는 제 2 항체 또는 항체들의 배합물
(iii) 제 2 항체에 대해 친화성을 나타내고, 결합쌍의 제 1 구성원에 커플링되는 시약, 및
(iv) 탐지가능한 태그에 커플링되어 있는 결합쌍의 제 2 구성원,
이 중 상기 결합쌍은 합텐 또는 항원/항체, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/레시틴, 효소/보조인자, 엽산/엽산염, 단백질에 선택적으로 결합하는 이중 나선형 올리고뉴클레오티드/전사 인자, 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산, 및 수용체/리간드로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 탐지가능한 태그는 형광 태그, 발광 태그 및 효소 태그로 이루어진 군에서 선택됨.
제 1 항에 있어서, 제 1 항체 또는 항체들의 배합물이, C-말단 영역에서 상이한 Aβ40, Aβ42, 또는 Aβ40 및 Aβ42 중의 영역을 인식하는 키트.
제 1 항에 있어서, 제 1 항체가 Aβ42 및 Aβ40 펩티드의 N-말단 영역을 인식하는 키트.
제 3 항에 있어서, 제 1 항체가 Aβ40 및 Aβ42 의 아미노산 1 내지 16 에 위치하는 에피토프에 대한 것인 키트.
제 1 항에 있어서, 제 1 항체가 모노클로날 항체인 키트.
제 5 항에 있어서, 모노클로날 항체가 6E10 mAb 인 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항체가 하기의 군으로부터 선택되는 항체인 키트:
(i) Aβ40 와의 임의의 실질적인 교차반응을 부여하지 않고 Aβ42 에 특이적으로 결합하는 Aβ42 펩티드의 C-말단 영역에 해당하는 펩티드에 대해 제조된 폴리클로날 항체
(ii) Aβ42 와의 임의의 실질적인 교차반응을 부여하지 않고 Aβ40 에 특이적으로 결합하는 Aβ40 펩티드의 C-말단 영역에 해당하는 펩티드에 대해 제조된 폴리클로날 항체,
(iii) Aβ40 및 Aβ42 의 C-말단 영역을 동시에 인식하는 항체, 및
(iv) (i) 및 (ii) 하의 항체의 배합물.
제 7 항에 있어서, 제 2 항체의 제조에 사용되는 Aβ42 펩티드의 C-말단 영역이 서열 식별번호: 1 또는 서열 식별번호: 2 의 펩티드인 키트.
제 7 항에 있어서, 제 2 항체의 제조에 사용되는 Aβ40 펩티드의 C-말단 영역이 서열 식별번호: 3 의 펩티드인 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항체, 제 2 항체, 또는 제 1 항체 및 제 2 항체가 그의 제조에 사용되는 폴리펩티드의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이용하여 친화성을 기반으로 정제되는 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항체에 대한 친화성을 나타내는 시약이 항-IgG 항체, 단백질 A 또는 단백질 G 또는 기능적으로 동등한 그의 변이체의 군으로부터 선택되는 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합쌍의 상기 제 1 구성원이 바이오틴인 키트.
제 12 항에 있어서, 결합쌍의 제 2 구성원이 아비딘, 스트렙타비딘 또는 기능적으로 동등한 그의 변이체인 키트.
삭제
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 고체 지지체를 포함하는 키트.
제 15 항에 있어서, 항체 또는 항체의 배합물들 중 하나가 고체 지지체에 미리 결합되어 있는 키트.
제 16 항에 있어서, 제 1 항체가 고체 지지체에 미리 결합되어 있는 키트.
제 17 항에 있어서, 트레할로오스의 진한 용액으로 처리하고 건조시킨 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, Aβ40, Aβ42, 또는 Aβ40 및 Aβ42 펩티드를 함유하는 시료를 추가로 포함하는 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 탐지가능한 태그가 효소인 경우, 상기 효소에 의해 탐지가능한 생성물로 변환될 수 있는 기질을 추가로 포함하는 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 측정 또는 탐지할 표적 폴리펩티드가 Aβ40, Aβ42 또는 이들의 혼합물의 군으로부터 선택되는, 시료 중의 폴리펩티드를 측정 또는 탐지하기 위한 키트.
제 21 항에 있어서, 시료가 혈액, 혈장, 혈청 또는 CSF 의 군으로부터 선택되는 키트.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서의 퇴행성 장애의 진단을 위한 키트.
제 23 항에 있어서, 퇴행성 장애가 신경퇴행성 장애인 키트.
제 24 항에 있어서, 신경퇴행성 장애가 알츠하이머병인 키트.
하기의 단계를 포함하는, 시료 중의 Aβ42, Aβ40 및 이들의 혼합물의 군으로부터 선택되는 표적 폴리펩티드의 양을 측정 또는 탐지하는 방법:
(i) 상기 표적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 제 1 항체 또는 항체들의 배합물을 이용하여 시료 내에 존재하는 표적 폴리펩티드를 포획하는 단계,
(ii) 단계 (a) 에서 형성된 면역 복합체를, 제 1 항체 또는 항체들의 배합물에 의해 인식되는 영역과 상이한 표적 폴리펩티드의 영역을 인식하는 제 2 항체 또는 항체들의 배합물과 접촉시키는 단계,
(iii) 단계 (ii) 에서 형성된 복합체를, 제 2 항체에 대해 친화성을 나타내며, 결합쌍의 제 1 구성원에 커플링되어 있는 시약과 접촉시키는 단계,
(iv) 단계 (iii) 에서 형성된 복합체를, 탐지가능한 태그에 커플링되어 있는 결합쌍의 제 2 구성원과 접촉시키는 단계, 및
(v) 결합쌍의 제 2 구성원에 결합된 탐지가능한 태그의 활성 또는 양을 탐지 또는 측정하는 단계,
이 중 상기 결합쌍은 합텐 또는 항원/항체, 바이오틴 또는 바이오틴 유사체/아비딘 또는 스트렙타비딘, 당/레시틴, 효소/보조인자, 엽산/엽산염, 단백질에 선택적으로 결합하는 이중 나선형 올리고뉴클레오티드/전사 인자, 핵산 또는 핵산 유사체/상보적 핵산, 및 수용체/리간드로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 탐지가능한 태그는 형광 태그, 발광 태그 및 효소 태그로 이루어진 군에서 선택됨.
제 26 항에 있어서, C-말단 영역에서 상이한 Aβ40 및 Aβ42 에 공통인 영역을 제 1 항체가 인식하는 방법.
제 27 항에 있어서, 제 1 항체가 Aβ42 및 Aβ40 펩티드의 N-말단 영역을 인식하는 방법.
제 26 항에 있어서, 제 1 항체가 Aβ40 및 Aβ42 의 아미노산 1 내지 16 에 위치하는 에피토프에 대한 것인 방법.
제 26 항에 있어서, 제 1 항체가 모노클로날 항체인 방법.
제 30 항에 있어서, 모노클로날 포획 항체가 6E10 mAb 인 방법.
제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항체가 하기의 군으로부터 선택되는 항체인 방법:
(i) Aβ40 와의 임의의 실질적인 교차반응을 부여하지 않고 Aβ42 에 특이적으로 결합하는 Aβ42 펩티드의 C-말단 영역에 해당하는 펩티드에 대해 제조된 폴리클로날 항체
(ii) Aβ42 와의 임의의 실질적인 교차반응을 부여하지 않고 Aβ40 에 특이적으로 결합하는 Aβ40 펩티드의 C-말단 영역에 해당하는 펩티드에 대해 제조된 폴리클로날 항체, 및
(iii) Aβ40 및 Aβ42 의 C-말단 영역을 동시에 인식하는 항체, 및
(iv) (i) 및 (ii) 하의 항체의 배합물.
제 32 항에 있어서, 제 2 항체의 제조에 사용되는 Aβ42 펩티드의 C-말단 영역이 서열 식별번호: 1, 서열 식별번호: 2 의 군으로부터 선택되는 펩티드인 방법.
제 32 항에 있어서, 제 2 항체의 제조에 사용되는 Aβ40 펩티드의 C-말단 영역이 서열 식별번호: 3 의 펩티드인 방법.
제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항체, 제 2 항체, 또는 제 1 항체 및 제 2 항체가 그의 제조에 사용되는 폴리펩티드의 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이용하여 친화성을 기반으로 정제되는 방법.
제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 항체에 대해 친화성을 나타내는 시약이 항-IgG 항체, 단백질 A 또는 단백질 G 또는 기능적으로 동등한 그의 변이체의 군으로부터 선택되는 방법.
제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합쌍의 상기 제 1 구성원이 바이오틴인 방법.
제 37 항에 있어서, 결합쌍의 제 2 구성원이 아비딘, 스트렙타비딘 또는 기능적으로 동등한 그의 변이체인 방법.
삭제
제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 생물학적 시료가 혈액, 혈청, 혈장 및 CSF 의 군으로부터 선택되는 방법.
제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 항체가 고체 지지체에 미리 고정되어 있는 방법.
대상체에서의 퇴행성 장애의 생체외 (in vitro) 진단 방법으로서, 제 26 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 환자의 시료에서 Aβ40 또는 Aβ42 의 양을 측정하고, 상기 대상체의 시료에서 하나 또는 두 펩티드 모두의 농도의, 퇴행성 장애를 나타내는 건강한 개인 유래의 시료 중의 상기 펩티드 또는 펩티드들의 농도에 대한 상관관계를 구하는 것을 포함하는 방법.
제 42 항에 있어서, 퇴행성 장애가 신경퇴행성 장애인 방법.
제 43 항에 있어서, 신경퇴행성 장애가 알츠하이머병이며, 상기 시료 중의 Aβ40, Aβ42, 또는 Aβ40 및 Aβ42 펩티드의 양이 건강한 개인으로부터 수득되는 동일한 기원 유래의 생물학적 시료 중의 상기 펩티드 또는 펩티드들의 양보다 더 적은 경우, 해당 대상체가 알츠하이머병을 앓고 있음을 표시하는 방법.
제 42 항에 있어서, Aβ40, Aβ42, 또는 Aβ40 및 Aβ42 가 탐지될 시료가 혈장 또는 혈청 시료인 방법.