ES2666840T3 - Anticuerpos, kit y método in vitro para detectar beta-oligómeros amiloides - Google Patents

Abstract

Un kit para detectar oligómeros de beta-amiloides, que comprende: (a) un anticuerpo de captura que tiene una región variable de cadena ligera con una CDR1 que tiene la secuencia Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Glu (SEQ ID NO:14), una CDR2 que tiene la secuencia Lys-Ala-Ser-Asn-Arg-Phe-Ser (SEQ ID NO:15), y una CDR3 que tiene la secuencia Phe-Gln-Gly-Ser-Arg- Leu-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO:16); y una región variable de cadena pesada con una CDR1 que tiene la secuencia Gly-Phe-Thr-Phe-Ser-Ser-Phe-Gly-Met-His (SEQ ID NO:4), una CDR2 que tiene la secuencia Tyr-Ile-Ser-Arg-Gly- Ser-Ser-Thr-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Gly (SEQ ID NO:5), y una CDR3 que tiene la secuencia Gly-Ile-Thr-Thr- Ala-Leu-Asp-Tyr (SEQ ID NO:6); y (b) un anticuerpo de detección que reconoce un epitopo lineal N-terminal del péptido beta-amiloide 1-42 que es 82E1.

Description

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos, kit y método in vitro para detectar β-oligómeros amiloides

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer ("Alzheimer's disease", AD) es una enfermedad neurodegenerativa devastadora que se

5 caracteriza por la acumulación de placas de β-amiloides (Aβ) en regiones cerebrales implicadas en el aprendizaje y la memoria. Aunque se ha creído que estas grandes placas provocan la AD, en la actualidad las pruebas indican que unos pequeños oligómeros difundibles de Aβ pueden ser los responsables. Los ligandos difundibles derivados de amiloides ("amyloid-derived diffusible ligands", ADDL) son una especie de oligómeros de Aβ que pueden generarse in vitro con propiedades similares a los oligómeros de Aβ endógenos (patentes de EE. UU. n.º 6.218.506; Klein, et

10 al. (2004), Neurobiol. Aging, 25:569-580; Lambert, et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:6448-6453). Los oligómeros de Aβ están presentes en el cerebro de pacientes con AD, se unen a las neuronas e inducen déficits en la morfología neuronal y en la memoria. Estudios realizados con anticuerpos que se unen a oligómeros de Aβ han demostrado una mejora en la morfología neuronal y en la memoria.

Se conocen ensayos para medir los monómeros de Aβ. Por ejemplo, se ha desarrollado un ELISA de "sandwich"

15 compuesto por un anticuerpo específico del extremo N-terminal (Aβ1) (clon 82E1) y anticuerpos específicos de los extremos C-terminales para Aβ1-40 (clon 1A10) y Aβ1-42 (clon 1C3) para detectar Aβ1-40 y Aβ1-42 de longitud completa con una sensibilidad en el intervalo menor de un dígito de fmol/ml (equivalente a un único dígito de pg/ml) sin reactividad cruzada con APP (Horiskoshi, et al. (2004), Biochem. Biophys. Res. Commun., 319:733-737, y publicación de patente de EE. UU. n.º 2011/0008339). Otros ensayos han empleado la actividad de las enzimas β-y

20 γ-secretasa sobre la proteína precursora de amiloides ("amyloid precursor protein", APP) para detectar monómeros; sin embargo, pocos ensayos han detectado de modo específico y fiable los oligómeros de Aβ en una muestra de fluido humana, tal como fluido cerebroespinal (CSF) en controles normales y en AD (Georganopoulou, et al. (2005), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:2273-2276; Fukumoto, et al. (2010), FASEB J., 24:2716-2726; Gao, et al. (2010), PLoS One, 5(12):e15725). Los ensayos de oligómeros Aβ indicados han empleado una serie de estrategias que

25 incluyen anticuerpos específicos de ADDL acoplados con una plataforma de amplificación de PCR de biocódigo de barras (Georganopoulou, et al. (2005), supra), ELISA de solapamiento de epitopos (Gandy, et al. (2010), Ann. Neurol., 68:220-230; Xia, et al. (2009), Arch. Neurol., 66:190-199), también junto con una primera cromatografía de exclusión molecular (Fukomoto, et al. (2010), supra), y métodos de matrices de afinidad por amiloides (Gao, et al. (2010), supra; Tanghe, et al. (2010), Int. J. Alz. Dis., 2010:417314), seguido por la disociación de los oligómeros y la

30 medición con anticuerpos contra monómeros de Aβ.

El documento WO2006055178 se refiere a anticuerpos que reconocen diferencialmente conformaciones multidimensionales de ligandos difundibles derivados de Aβ, también conocidos como ADDL. Los anticuerpos de la invención pueden distinguir entre extractos de cerebro humano con enfermedad de Alzheimer y cerebro humano control y son útiles en los métodos para detectar los ADDL y para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer. Los 35 presentes anticuerpos también bloquean la unión de ADDL a neuronas, el ensamblaje de los ADDL, y la taufosforilación y, por tanto, son útiles en métodos para prevenir y tratar enfermedades asociadas con oligómeros solubles de β-amiloides 1-42. El documento WO2007050359 se refiere a anticuerpos que reconocen diferencialmente conformaciones multidimensionales de ligandos difundibles derivados de Aβ, también conocidos como ADDL. Los anticuerpos de la invención pueden distinguir entre extractos de cerebro humano con enfermedad

40 de Alzheimer y cerebro humano control y son útiles en los métodos para detectar los ADDL y para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer. Los presentes anticuerpos también bloquean la unión de ADDL a neuronas, el ensamblaje de los ADDL, y la taufosforilación y, por tanto, son útiles en métodos para prevenir y tratar enfermedades asociadas con oligómeros solubles de β-amiloides 1-42.

También se han detectado oligómeros de Aβ en CSF (fluido cerebroespinal) o cerebro empleando una electroforesis

45 en gel, seguida de un análisis de la transferencia Western (Klyubin, et al. (2008), J. Neurosci., 28:4231-4237; Hillen, et al. (2010), J. Neurosci., 30:10369-10379), o después de una cromatografía de exclusión molecular (Shankar, et al. (2011), Methods Mol. Biol., 670:33-44), que se basa en el peso molecular de los oligómeros que se mantienen después del procedimiento de electroforesis. Sin embargo, las técnicas electroforéticas y de transferencia no proporcionan la sensibilidad necesaria para observar estas especies en el CSF control normal (Klyubin, et al. (2008),

50 supra), que muestra un registro en 1000 veces de concentraciones de oligómeros de Aβ (Georganopoulou, et al. (2005), supra). Las especies de oligómero de Aβ representan un amplio intervalo de pesos moleculares y, así, la asignación a una molaridad precisa resulta problemática. Aunque se ha demostrado un límite inferior de detección de 100 aM (Georganopoulou, et al. (2005), supra), la mayoría de los métodos indicados (Georganopoulou, et al. (2005), supra; Gao, et al. (2010), supra; Fukumoto, et al. (2010), supra; Gandy, et al. (2010), supra) no evalúan la

55 selectividad entre las señales de los oligómeros de Aβ, comparadas con los monómeros de Aβ, de modo que las concentraciones indicadas deben considerarse con precaución. Un ensayo (Xia, et al. (2009), Arch. Neurol., 66:190199), comercializado por Immunobiological Laboratories, Inc. (Minneapolis, MN) afirma conseguir una selectividad en 320 veces por los dímeros de Aβ1-16, comparados con el monómero Aβ40, pero carece de la sensibilidad necesaria para evitar la reactividad cruzada con el monómero de Aβ en el CSF. Puesto que la hipótesis es que los oligómeros

60 de Aβ en el CSF están presentes a niveles de fM y que los monómeros de Aβ en el CSF están presentes a 1,5-2 nM, un ensayo que mida selectivamente los oligómeros de Aβ en una muestra de CSF debe tener una selectividad

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en la presente se indican en la tabla 1. Tabla 1

Anticuerpo

Epitopo central Secuencia del epitopo dentro de Aβ1-42 SEQ ID NO:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

7

6E10

5-11 RHDSGYE 8

BAM-10

3-8 EFRHDS 9

4G8

xx-21 EVHHQKLVFFA 10

WO-2

3-8 EFRHDS 9

26D6

3-8 EFRHDS 9

2A10a

3-8 EFRHDS 9

2B4b

3-8 EFRHDS 9

4C2a

3-8 EFRHDS 9

4E2a

3-8 EFRHDS 9

2H4c

1-8 DAEFRHDS 11

20C2a

3-8 EFRHDS 9

2D6a

3-8 EFRHDS 9

5F10c

3-8 EFRHDS 9

1F4a

* imagen5 imagen6

1F6a

* imagen7 imagen8

2E12a

3-10 EFRHDSGY 12

3B3a

* imagen9 imagen10

82E1

1-5 DAEFR 13

La posición del epitopo central es con respecto a Aβ1-42. aIgG1, bIgG2b, cIgG2a. *Se calcula que los epitopos están localizados en el N-terminal de Aβ1-42, puesto que pueden unirse al péptido Aβ1-20.

Se evaluó el anticuerpo 19.3 como reactivo de captura potencial para oligómeros de Aβ en combinación con tres 5 anticuerpos diferentes como anticuerpos de detección, 19.3, 7305 (es decir, 20C2, patente de EE. UU. n.º 7.780.963), y 82E1, tras su biotinilación, en un ensayo ELISA de "sandwich". El 19.3 biotinilado se estudió como anticuerpo de detección y se emparejó con 19.3 como anticuerpo de captura en un ensayo de epitopos solapantes. La presencia de epitopos solapantes sería indicativa de una construcción de Aβ con múltiples epitopos, lo cual sugiere la presencia de un dímero o de oligómeros de Aβ de orden superior. El ELISA de epitopo solapante de 19.3 10 x 19.3 tiene un límite de detección ("limit of detection", LoD) para oligómeros de Aβ de 98 pg/ml. Los ELISA de "sandwich" para la pareja de anticuerpos 19.3 y 82E1 tienen un LoD de 1,3 pg/ml y un límite inferior de cuantificación fiable (LLoRQ) de 4,2 pg/ml para oligómeros de Aβ, y la proporción de señal de oligómeros de Aβ/monómeros de Aβ

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la región variable de cadena ligera ha sido mutada (concretamente, 19.3 N33S, 19.3 N33T, 19.3 N33A, 19.3 N33E,

19.3 N33D, 19.3 N33S-N35Q, 19.3 N33S-N35S, 19.3 N33S-N35T, 19.3 N33S-N35A). El anticuerpo de captura puede presentar una región variable de cadena ligera con una CDR1 de SEQ ID NO:1, una CDR2 de SEQ ID NO:15, y una CDR3 que tiene la secuencia Phe-Gln-Gly-Ser-Arg-Leu-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO:16); y una región variable de cadena pesada con una CDR1 de SEQ ID NO:4, una CDR2 de SEQ ID NO:5, y una CDR3 de SEQ ID NO:6.

El anticuerpo de captura del kit y el método in vitro puede ser un variante del anticuerpo 19.3, en el que la CDR2 de la región variable de cadena ligera ha sido mutada (concretamente, 19.3 N58Q, 19.3 N58S, 19.3 N58T, 19.3N35A). El anticuerpo de captura puede presentar una región variable de cadena ligera con una CDR1 de SEQ ID NO:14, una CDR2 de SEQ ID NO:2, una CDR3 de SEQ ID NO:16; y una región variable de cadena pesada con una CDR1 de SEQ ID NO:4, una CDR2 de SEQ ID NO:5, y una CDR3 de SEQ ID NO:6.

La CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo de captura puede tener la secuencia Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val-His-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Thr-Tyr-Leu-Glu (SEQ ID NO:1), en la que Xaa1 es Thr, Ala, Asp o Glu, y Xaa2 es Asn, His, Gln, Ser, Thr, Ala, o Asp; o en la que Xaa1 es Asn, Ser, Thr, Ala, Asp o Glu, y Xaa2 es Thr. La CDR1 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo de captura puede tener la secuencia Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Ile-Val-His-Ser-Xaa1-Gly-Xaa2-Thr-Tyr-Leu-Glu (SEQ ID NO:1), en la que Xaa1 es Thr, Ala, Asp o Glu, y Xaa2 es Thr. La CDR2 de la región variable de cadena ligera del anticuerpo de captura puede tener la secuencia Lys-Ala-Ser-Xaa1-Arg-Phe-Ser (SEQ ID NO:2), en la que Xaa1 es Thr.

Para facilitar la producción y potenciar la conservación y el uso del anticuerpo de captura en el kit y el método in vitro de esta descripción, ciertas realizaciones incluyen el uso de un anticuerpo de captura que muestra menos de una disminución en 10 número de veces en la CE50, en un ensayo basado en ELISA con oligómeros de Aβ, cuando se conservan a 40 °C durante 1 mes. Más preferiblemente, el anticuerpo de captura muestra una disminución en menos de 6 veces, 5 veces, 4 veces, 3 veces, o 2 veces en la CE50 cuando se conserva a 40 °C durante 1 mes. La estabilidad del anticuerpo puede evaluarse como se describe en los ejemplos de la presente. En los ejemplos 7 y 9 se proporcionan anticuerpos que tienen dicha estabilidad a temperaturas elevadas.

Aunque el anticuerpo de detección reconoce un epitopo lineal localizado en el N-terminal de Aβ1-42, dicho anticuerpo puede o no unirse también a un epitopo conformacional. A este respecto, se han descrito una serie de anticuerpos que pueden emplearse como anticuerpo de detección en el kit y el método in vitro. Tal como se indica en la tabla 1, uno cualquiera de los anticuerpos 6E10, BAM-10, WO-2, 26D6, 2A10, 2B4, 4C2, 4E2, 2H4, 2D6, 5F10, 1F4, 1F6, 2E12 o 3B3 reconoce un epitopo lineal localizado en el N-terminal de Aβ1-42 y, por tanto, puede utilizarse en el kit y el método in vitro. Los anticuerpos 20C2 y 82E1 pueden utilizarse en el kit y el método in vitro. En ciertas realizaciones, el anticuerpo de detección se une a un epitopo N-terminal de 5 a 10 restos aminoácidos de Aβ1-42 que tiene la secuencia DAEFR (SEQ ID NO:13). El anticuerpo de detección, empleado en el kit y el método in vitro de la invención, es 82E1.

Para facilitar la detección de un complejo de anticuerpo de captura/oligómero de Aβ/anticuerpo de detección, ciertas realizaciones incluyen el uso de un anticuerpo de detección marcado. En la técnica se conoce una diversidad de marcadores y estos pueden adaptarse a la práctica de esta invención. Por ejemplo, se han descrito marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes y marcadores dispersores de luz (por ejemplo, partículas de oro coloidal). Véase, por ejemplo, Csaki et al. (2002), Expert. Rev. Mol. Diagn., 2:187-93.

Los marcadores fluorescentes para su uso en esta invención incluyen, pero no se limitan a fluoróforos hidrófobos (por ejemplo, ficoeritrina, rodamina, ALEXA FLUOR™ 488, ALEXA FLUOR™ 546 y fluoresceína), proteína fluorescente verde ("green fluorescent protein", GFP) y sus variantes (por ejemplo, proteína fluorescente cian y proteína fluorescente amarilla), y puntos cuánticos. Véase, por ejemplo, Haughland (2003), Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, novena edición o edición en web, de Molecular Probes, Inc., o The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, décima edición o edición en web (2006), de Invitrogen, para descripciones de fluoróforos que emiten a diversas longitudes de onda diferentes. Para el uso de puntos cuánticos como marcadores para biomoléculas, véase, por ejemplo, Dubertret, et al. (2002), Science, 298:1759; Nature Biotech. (2003),21:41-51. En realizaciones concretas, el marcador es un fluoróforo hidrófobo tal como ALEXA FLUOR™.

Pueden introducirse marcadores en el anticuerpo de detección por medio de técnicas establecidas en la técnica. Por ejemplo, están disponibles kits para marcar de modo fluorescente anticuerpos con diversos fluoróforos en Invitrogen Corp. De modo similar, las señales de estos marcadores (por ejemplo, la absorción y/o la emisión fluorescente de un marcador fluorescente) pueden detectarse mediante las técnicas ejemplificadas en la presente (concretamente, los sistemas ENVISION™ o ERENNA™, en los que el anticuerpo detector marcado fluorescente no se desacopla del complejo de ELISA de "sandwich" y posteriormente se detecta) o mediante fundamentalmente cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, la detección de múltiples colores, la detección de FRET, la polarización de fluorescencia y similares, son muy conocidas en la técnica. Por ejemplo, están disponibles citómetros de flujo, por ejemplo, en Becton-Dickinson y Beckman Coulter, y los sistemas LUMINEX 100 y LUMINEX HTS™ están disponibles en Luminex Corporation.

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y el kit se emplean para confirmar un diagnóstico o para diagnosticar la AD o la gravedad de la AD. Además, el kit y el método in vitro de esta invención pueden emplearse para identificar pacientes en un estadio temprano de la enfermedad (es decir, un ensayo de prognóstico).

Por tanto, esta invención también proporciona un método in vitro para detectar oligómeros de Aβ. Según este método in vitro, se obtiene una muestra biológica que contiene oligómeros de Aβ de un animal, preferiblemente un ser humano; la muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo de captura, tal como se describe en la presente, bajo condiciones suficientes para formar un complejo de anticuerpo de captura/oligómero de Aβ; el complejo de anticuerpo de captura/oligómero de Aβ después se detecta empleando un anticuerpo de detección, tal como se describe en la presente. En otras realizaciones de este método in vitro, una muestra biológica procedente de un animal, preferiblemente de un ser humano, se pone en contacto con un anticuerpo de captura, tal como se describe en la presente, bajo condiciones suficientes para formar un complejo de anticuerpo de captura/oligómero de Aβ; el complejo de anticuerpo de captura/oligómero de Aβ después se detecta empleando un anticuerpo de detección, tal como se describe en la presente. Los términos "muestra biológica" o "muestra de fluido", tal como se emplean en la presente, se refieren a cualquier tipo de fluido, comparado con un tejido o un vertebrado. Los ejemplos típicos que pueden emplearse en los ensayos de la presente son sangre, orina, lágrimas, saliva y fluido cerebroespinal, que se emplea en una realización de la invención. También puede utilizarse el resto de tipos de fluidos corporales, si están presentes oligómeros de Aβ. Sin embargo, en realizaciones concretas, la muestra biológica es CSF.

Este método in vitro es un ensayo de unión competitiva sensible y selectivo, tal como un ensayo ELISA de "sandwich", que detecta y cuantifica los oligómeros de Aβ endógenos en muestras biológicas, tales como muestras de CSF procedentes de individuos con AD e individuos control humanos. Aunque la enfermedad de Alzheimer o AD se describe en concreto en la presente como un trastorno que puede diagnosticarse empleando el kit y el método in vitro según las reivindicaciones, el espectro de demencias o el deterioro cognitivo que resulta de la degradación neuronal asociada con la formación de oligómeros de Aβ o la formación o el depósito de placas o madejas nuerofibrilares de Aβ incluye, pero no se limita a síndrome de Down, demencia de cuerpos de Lewy, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer preclínica, deterioro cognitivo suave debido a la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Alzheimer de aparición temprana (EOD), enfermedad de Alzheimer familiar (FAD), deterioro cognitivo avanzado de la demencia debido a la enfermedad de Alzheimer (Jack, et al. (2011), Alzheimer's Dement., 7(3):257-262), y enfermedades asociadas con la presencia del alelo ApoE4. Por tanto, el kit y el método in vitro pueden utilizarse en el diagnóstico de una cualquiera de estas enfermedades o trastornos.

La invención se describirá con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Preparación de Aβ

Aβ1-40 y Aβ1-42 (péptido 1-40 de β-amiloide, péptido 1-42 de β-amiloide) se obtuvieron en American Peptide Co. (Sunnyvale, CA).

Preparación de los monómeros. Para generar preparaciones de monómeros, Aβ1-40 o Aβ1-42 se disolvieron en 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) para eliminar cualquier estructura secundaria preexistente que pudiera actuar como "semilla" para la agregación. El HFIP se retiró mediante evaporación para formar una película de péptido Aβ1-40 o Aβ1-42. La película de péptido Aβ1-40 o Aβ1-42 a temperatura ambiente se disolvió en 2 ml de tampón borato 25 mM (pH 8,5) por mg de péptido, se dividió en partes alícuotas y se congeló a 70 °C hasta su uso.

Preparación de ADDL. La película de péptido Aβ42 film (1 mg de Aβ42 secado desde 100% de disolvente HFIP) se disolvió en 44 µl de DMSO, a los cuales se le añadieron 1956 µl de medio F12 frío (GIBCO®, Invitrogen, Carlsbad, CA) con mezclado suave. La mezcla se incubó a la temperatura ambiente durante 18 a 24 horas. Las muestras se centrifugaron a 14.200 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se trasladó a un tubo nuevo y se filtró a través de una columna de 0,5 ml de tubos de filtro YM-50 (Millipore, Bedford MA; 0,5 ml) mediante centrifugación a 4.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C. El retenido se recogió invirtiendo el inserto del filtro, se introdujo en un nuevo tubo de recolección y se centrifugó a 4.000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. La concentración de proteínas se midió antes de la filtración mediante un ensayo Bradford (BioRad, Hércules, CA) y se indica como µM (calculado basándose en el peso molecular del monómero de Aβ (P.m. 4513)). Todas las muestras se conservaron a -80 °C hasta su uso.

Preparación de ADDL biotinilados (bADDL). Se prepararon bADDL empleando el mismo método descrito para los ADDL, con péptido 1-42 de Aβ biotinilado en el N-terminal (American Peptide, Sunnyvale, CA) como material de partida.

Preparación de fibrillas. Las preparaciones de fibrillas se realizaron añadiendo 2 ml de ácido clorhídrico 10 mM por mg de película de péptido Aβ1-42. La disolución se mezcló en un mezclador de vórtice a la velocidad más baja durante cinco a diez minutos, y la preparación resultante se conservó a 37 °C durante 18 a 24 horas antes del uso.

Ejemplo 2: Preparación de anticuerpos 3B3 madurados por afinidad

Inmunoadsorción de un banco de anticuerpos humanizados. Se construyó un banco madurado por afinidad del anticuerpo anti-ADDL humanizado h3B3, (véanse las patentes de EE. UU. n.os 7.811.563 y 7.780.963), en el que parte de la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena ligera se sometió a una mutagénesis aleatoria. Para

5 cubrir la región CDR3 completa, se construyeron dos sub-bancos. Un banco estaba compuesto de la región variable de cadena pesada de origen y aminoácidos mutados en la mitad izquierda de la CDR3 de cadena ligera, y el otro en la mitad derecha de la CDR3 de cadena ligera. Se empleó una estrategia similar para la mutagénesis aleatoria de las CDR de cadena pesada con tres sub-bancos.

El 3B3 humanizado se sometió a una maduración por afinidad empleando métodos conocidos en la técnica. Las

10 regiones variables de h3B3 se clonaron en un vector de presentación de Fab (pFab3D). En este vector, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera se insertaron dentro de marco para que se correspondieran con el dominio CH1 de la región constante y la región constante kappa, respectivamente. En Fab3D, el epitopo myc y seis restos aminoácidos de histidina consecutivos siguen a la secuencia CH1, que después se une a la proteína de fago pIII para su presentación. Todas las posiciones en las CDR3 de cadena pesada y ligera se mutagenizaron

15 aleatoriamente empleando secuencias de oligonucleótidos degenerados incorporadas en los cebadores de PCR. Para adaptarse al tamaño físico se construyeron los sub-bancos, y cada uno de ellos se centra en 5-6 restos aminoácidos. Se empleó el vector de ADN de h3B3 como ADN molde para amplificar las cadenas pesada y ligera con los cebadores de PCR mutados (tabla 2). Después de la amplificación con PCR, los fragmentos de ADN sintetizados se separaron en un gel de agarosa al 1,3%, los cebadores se retiraron y los fragmentos variables se

20 digirieron con enzimas de restricción: sitios de clonación BsiWI y XbaI para la clonación de la región variable de cadena ligera, XhoI y ApaI para la clonación de la región variable de cadena pesada.

Tabla 2

Banco de maduración por afinidad 3B3

Cebador Secuencia del cebador SEQ ID NO:

Bancos de cadena ligera

Directo tatggcttctagagatgtggtgatg 17

Inverso

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19

Bancos de cadena pesada

Directo aggcggccctcgaggaggtgcagc 20

Inverso

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M = A/C, N = A/C/G/T.

Para construir un banco de maduración por afinidad en el vector de presentación de fagos pFab3D, el ADN de

25 pFab3D-3B3 se digirió con la misma pareja de enzimas de restricción, se purificó, y los fragmentos de PCR para las regiones variables de cadena pesada o ligera se acoplaron con ligasa T4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) durante la noche a 16 °C. Los productos del acoplamiento después se transfectaron en células competentes para la electroporación TG1 de E. coli (Stratagene, Agilent Technologies, Santa Clara, CA), y partes alícuotas del cultivo

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bacteriano se cultivaron en placas de agar LB-carbenicilina (50 µg/ml) para titular el tamaño del banco. Los cultivos remanentes se cultivaron en una placa grande con carbenicilina y se incubaron a 30 °C durante la noche para obtener una disolución madre del banco de E. coli o se infectaron con el fago auxiliar M13K07 (Invitrogen, Carlsbad, CA; 1011 pfu/ml) mediante una incubación a temperatura ambiente y 37 °C durante diez minutos. Después se añadió medio 2TY con carbenicilina (50 µg/ml) y el cultivo se incubó a 37 °C durante una hora con agitación. Después se añadió kanamicina (70 µg/ml) y los cultivos se dejaron crecer durante la noche a 30 °C con agitación. El sobrenadante del cultivo de fagos se tituló y se concentró mediante precipitación con PEG (polietilenglicol) al 20% (en v/v)/NaCl, se resuspendió en PBS, se esterilizó con un filtro de 0,22 µm, y se formaron partes alícuotas para la inmunoadsorción del banco de fagos.

Después se realizó la inmunoadsorción del banco de fagos como se resume en la tabla 3.

Tabla 3

Rondas de inmunoadsorción

Ronda 1 Ronda 2 Ronda 3 Ronda 4

Concentración de antígeno

180 nM 60 nM 20 nM 10 nM

La entrada de fagos desde los bancos de fagos de presentación de Fab (100 µl, aproximadamente 1011-12 pfu) se bloqueó con 900 µl de disolución de bloqueo (leche desnatada en polvo al 3% en PBS) para reducir la unión no específica a la superficie del fago. Se prepararon esferas revestidas con estreptavidina recogiendo 200 µl de la suspensión de esferas en un separador magnético y eliminando los sobrenadantes. Las esferas después se suspendieron en 1 ml de disolución de bloqueo y se introdujeron en un mezclador rotatorio durante 30 minutos. Para eliminar el fago de unión a estreptavidina no específico, el banco de fagos bloqueado se mezcló con las esferas revestidas de estreptavidina bloqueadas y se colocaron en un mezclador rotatorio durante treinta minutos. Las suspensiones de fagos del proceso de deselección se trasladaron a un nuevo tubo y se añadieron 200 µl de antígeno, bADDL al 10%, y se incubó durante dos horas para la unión del antígeno y el anticuerpo. Después de la incubación, la mezcla se añadió a las esferas revestidas con estreptavidina bloqueadas y se incubó en un mezclador rotatorio durante una hora para capturar el complejo de antígeno/anticuerpo sobre las esferas de estreptavidina. Las esferas con los complejos de bADDL al 10%/fago capturado se lavaron cinco veces con PBS/TWEEN 20 al 0,05% y después dos veces solo con PBS. Los fagos unidos se eluyeron de bADDL con 200 µl de TEA 100 mM y se incubaron durante veinte minutos. El fago eluido después se trasladó a un tubo de 50 ml, se neutralizó con 100 µl de Tris-HCl 1 M, pH 7,5, y se añadió a 10 ml de células E. coli TG1 con una DO600 nm de entre 0,6-0,8. Después de una incubación a 37 °C con agitación durante una hora, partes alícuotas del cultivo se cultivaron en placas de agar LB-carbenicilina (50 µg/ml) para titular el número de fagos de salida, y el resto de las bacterias se centrifugaron y se suspendieron en 500 µl de medio 2xYT (Teknova, Hollister, CA), se cultivaron en placas de bioensayo de agar YT (Teknova, Hollister, CA) que contenían ampicilina 100 µg/ml y glucosa al 1%. Las placas de bioensayo se cultivaron durante la noche a 30 °C.

Después de cada ronda de inmunoadsorción se escogieron aleatoriamente colonias individuales para producir fagos en placas de 96 pocillos. El procedimiento para la preparación de los fagos en placas de 96 pocillos es similar al descrito anteriormente, excepto que no se empleó la etapa de precipitación de fagos. Las placas de cultivo que contienen las colonias cultivadas en 120 µl de medio 2xYT (16 g de BACTO-triptona, 10 g de BACTO-extracto de levadura, 5 g de NaCl (todos de BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), ddH2O hasta 1 l) con ampicilina 100 µg/ml y glucosa al 0,1% se cultivaron durante la noche en un agitador HIGRO (Genomic Solutions, Ann Arbor, MI) a 30 °C con agitación a 450 rpm. Los sobrenadantes de fagos (aproximadamente 100 µl) se emplearon directamente para el análisis en el ELISA de unión de ADDL. La unión del fago a los ADDL se detectó con un anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano ("horseradish peroxidase", HRP) (Amersham Bioscience, GE Healthcare, Waukesha, WI).

Ejemplo 3: Selección de anticuerpos 3B3 madurados por afinidad

A partir de la maduración por afinidad de la cadena ligera, un panel de siete clones (11.4, 17.1, 14.2, 13.1, 19.3, 7.2 y 9.2) mostraron unas potentes actividades de unión a ADDL cuando se comparan con h3B3 en un ELISA de fagos/Fab. La tabla 4 muestra la similitud de aminoácidos de los clones seleccionados a partir del banco de maduración por afinidad de la cadena ligera con relación al anticuerpo de origen, h3B3.

imagen17

Tabla 6

Ab

Secuencia de LCVR SEQ ID NO:

h3B3

imagen18 30

19.3

imagen19 31

17.1

imagen20 32

14.2

imagen21 33

13.1

imagen22 34

7.2

imagen23 35

9.2

imagen24 36

11.4

imagen25 37

Ejemplo 4: Conversión de IgG de anticuerpos 3B3 madurados por afinidad

Los siete clones de Fab principales (11.4, 17.1, 14.2, 13.1, 19.3, 7.2 y 9.2) se seleccionaron para la conversión de

5 IgG. Las IgG convertidas se expresaron empleando vectores con una base de plásmido. Los vectores de expresión se construyeron de modo que todos contenían los componentes necesarios, excepto las regiones variables. En los vectores básicos, la expresión de las cadenas ligera y pesada es dirigida por el promotor de CMV humano y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Para los siete clones seleccionados para la conversión de IgG, la región variable de cadena pesada se condensó dentro de marco con una región constante de cadena pesada

10 de IgG2 humana (SEQ ID NO:38 y 39), mientras que la región variable de cadena ligera se condensó dentro de marco con la región constante de cadena ligera kappa (SEQ ID NO:40 y 41). Las secuencias conductoras de cadena pesada (SEQ ID NO:42 y 43) y ligera (SEQ ID NO:44 y 45), que median en la secreción de los anticuerpos hacia el medio de cultivo, también se condensaron dentro de marco con las consiguientes regiones variables. Para los vectores de expresión de cadena pesada, la región constante puede seleccionarse a partir de una subclase de

15 isotipo diferente, por ejemplo, IgG1 o IgG2. Entre la secuencia conductora y la región constante, se introducen las secuencias intergénicas que contienen las secuencias de clonación para una fusión dentro de marco perfectamente integrada de la región variable que se va introducir con la secuencia conductora en su extremo 5' y la región constante en su extremo 3' empleando una estrategia de clonación IN-FUSION (Clontech, Mountain View, CA). Se empleó el kit de clonación de PCR IN-FUSION Dry-Down (Clontech, Mountain View, CA) para la amplificación con

20 PCR de las regiones variables. El kit de clonación Dry-Down contiene todos los componentes necesarios para la reacción de PCR. Se añadieron los cebadores de PCR y los ADN molde. Los vectores de expresión portan oriP del genoma vírico de EBV. La pareja oriP/EBNA1 se emplea a menudo para prolongar la presencia del vector de expresión dentro de las células transfectadas y se utiliza mucho para la extensión de la duración de la expresión

10

15

20

25

30

35

40

45

50

(Lindner, et al. (2007), Plasmid, 58:1-12) para la expresión prolongada en células 293EBNA, secuencias bacterianas para un marcador de selección de kanamicina, y un origen de la replicación en E. coli. Cuando se insertan las regiones variables, las IgG son directamente expresadas en células de mamífero. Todas las regiones variables de cadena pesada de la presente se clonaron en un vector de expresión de IgGl (pVl JNSA-BF-HCG1) y las regiones variables de cadena ligera se clonaron en un correspondiente vector de expresión de kappa o lambda (pVl JNSA-GS-FB-LCK).

Ejemplo 5: Clonación y expresión del anticuerpo 3B3 madurado por afinidad

Los siete clones principales (11.4, 17.1, 14.2, 13.1, 19.3, 7.2 y 9.2) se produjeron como anticuerpos monoclonales y se purificaron para su posterior caracterización. El procedimiento de clonación para los vectores de expresión de anticuerpos resultantes fue el siguiente. Las regiones variables se amplificaron con PCR, en la que las reacciones de PCR se realizaron en un volumen de 25 µl que contenía una mezcla maestra de PCR de alta fidelidad, el molde (1 µl), y los cebadores directos e inversos (1 µl de cada uno). Condiciones de la PCR: 1 ciclo de 94 °C, 2 minutos; 25 ciclos de 94 °C, 1,5 minutos; 60 °C, 1,5 minutos; 72 °C, 1,5 minutos, y 72 °C, 7 minutos; 4 °C hasta la retirada. Los productos de la PCR después se digirieron con DpnI y se purificaron con el kit de placa QIAQUICK (Qiagen, Venlo, Países Bajos). Se reasociaron cien nanogramos de los correspondientes vectores de cadena pesada o de cadena ligera previamente linealizados con 10 ng del fragmento de PCR con una reacción IN-FUSION (kit de clonación IN-FUSION Dry-Down, Clontech, Mountain View, CA). La mezcla de reacción se transformó en células XL2 Blue MRF' competentes y se cultivaron durante la noche en placas de agar que contenían kanamicina 50 µg/ml. Las construcciones de cadena ligera se digirieron con HindIII + NotI y las construcciones de cadena pesada se digirieron con AspI + HindIII para comprobar la estructura mediante análisis de restricción. Las secuencias de ADN de todos los clones se confirmaron mediante análisis de secuencia.

Las construcciones de ADN de cadena ligera y de cadena pesada con la secuencia confirmada se transfectaron en células 293 FREESTYLE™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células 293 FREESTYLE™ se transfectaron empleando 293 transfectina (Invitrogen, Carlsbad, CA). La monocapa de células EBNA se transfectó utilizando reactivos de transfección a base de polietilenimina. Las células transfectadas se incubaron a 37 °C/5% de CO2 durante siete días en medio sin suero OPTI-MEM (Invitrogen, Carlsbad, CA). El medio se recogió, se centrifugó, se filtró a través de un sistema de filtración de 0,22 µm (Millipore, Billerica, MA), y después se concentró mediante un filtro de centrífuga CENTRICON™ (Millipore, Billerica, MA). El medio concentrado se mezcló 1:1 con tampón de unión (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL), y después se cargó sobre una columna de proteína A/G preequilibrada (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) o HI-TRAP rProteína A FF (GE Healthcare, Waukesha, WI). La columna cargada se lavó con tampón de unión y se eluyó con tampón de elución (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). El anticuerpo eluido se neutralizó inmediatamente y se dializó contra tampón PBS durante la noche. El anticuerpo dializado se concentró con un filtro de centrífuga AMICON (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) y se determinó la concentración de proteínas a DO280 nm con un coeficiente de extinción de 1,34 mg/ml. El anticuerpo purificado se analizó empleando SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA), o LABCHIP™ de proteínas (Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA). La SDS-PAGE se realizó bajo condiciones no reductoras.

Ejemplo 6: Caracterización de los anticuerpos 3B3 madurados por afinidad

ELISA. Los anticuerpos anti-ADDL seleccionados, es decir, los anticuerpos derivados del anticuerpo de origen h3B3, primero se evaluaron en un ELISA de Aβ de tres enfoques para evaluar la unión del anticuerpo al monómero de Aβ, ADDL, y Aβ fibrilar. La IgG anti-ADDL policlonal (M90/1; Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX) se cultivó en placa a 0,25 mg/pocillo en tiras IMMULON 3 REMOVAWELL™ (Dynatech Labs, Chantilly, VA) durante 2 horas a temperatura ambiente, y los pocillos se bloquearon con BSA al 2% en TBS. Se añadieron las muestras (Aβ monomérico, ADDL, o Aβ fibrilar) diluidas con BSA al 1% en F12 a los pocillos, se dejó que se unieran durante 2 horas a 4 °C, y se lavaron 3X con BSA/TBS a temperatura ambiente. Los anticuerpos monoclonales diluidos en BSA/TBS se incubaron durante 90 minutos a temperatura ambiente y se detectaron con un kit VECTASTAIN® ABC contra IgG de ratón. El marcador de HRP se visualizó con un sustrato de peroxidasa BIO-RAD y se leyó a 405 nm en un lector de microplacas Dynex™ MRX-TC.

Tal como se muestra en la figura 1, con la excepción del anticuerpo 9.2, todos los anticuerpos anti-ADDL mostraron una unión preferente a ADDL con relación a h3B3, los comparadores selectivos (Comp 1 y 3: se unen solo a ADDL) y no selectivos (Comp 2: se une a todas las formas de Aβ evaluadas), y un control (sin anticuerpo). El anticuerpo 9.2 muestra poca unión a todas las formas de Aβ, lo cual sugiere que su afinidad de unión se vio afectada de modo adverso durante la conversión de IgG y/o la producción de anticuerpos. En la tabla 7 se presenta un resumen de la proporción de la unión de los anticuerpos a ADDL:monómero y ADDL:fibrilar en este ensayo.

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 7

Anticuerpo

ADDL:monómero ADDL:fibrilar

h3B3

3,2 2,2

14.2

4,2 2,3

7.2

3,2 2,1

11.4

2,4 2,4

9.2

4,0 0,5

13.1

2,4 2.0

17.1

3,2 2,1

19.3

2,5 2,0

Se generó una curva de titulación total para cada anticuerpo y h3B3 para determinar su afinidad de unión por ADDL, comparado con el monómero de Aβ. Se añadieron ADDL biotinilados (50 pmol/pocillo) o monómero Aβ1-40 (100 pmol/pocillo) a una placa revestida con estreptavidina de alta capacidad (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y se incubó durante dos horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron en PBS con TWEEN al 0,05% (seis veces) y después con PBS solo (tres veces) antes de bloquear los pocillos con leche en polvo desnatada al 5% en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Los pocillos después se lavaron y se añadió una dilución en serie de muestras de anticuerpo a las placas y se dejó que se uniesen durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la incubación y de un lavado, se detectó la unión del anticuerpo con un anticuerpo secundario anti-Fc-IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP) (1:1000; una hora a temperatura ambiente). El marcador de HRP se visualizó con tetrametilbencidina (Virolabs, Chantilly, VA) como sustrato y se leyó a 450 nm en un lector de microplacas. Este análisis confirmó que seis de los siete anticuerpos madurados por afinidad mostraron una unión preferente a ADDL. Véase la figura 2, que compara la unión preferente de h3B3 y 19.3 a ADDL frente a Aβ1-40 monomérico.

Ensayo de unión basado en células. Se ha demostrado que algunos de los anticuerpos anti-ADDL presentan una unión preferente a ADDL, pero no pueden evitar la unión de ADDL a neuronas primarias del hipocampo (Shughrue, et al. (2010), Neurobiol. Aging, 31:189-202). Para demostrar que los anticuerpos anti-ADDL pueden bloquear la unión de ADDL a neuronas, se realizó un ensayo de unión basado en células. Los anticuerpos anti-ADDL se mezclaron con bADDL 500 nM, con unas concentraciones finales del anticuerpo que varían de 1,8 nM a 450 nM. Como control, la misma concentración de anticuerpo desnaturalizado con calor (98 °C durante 30 minutos) se mezcló con bADDL. Las mezclas de anticuerpo-bADDL se incubaron en tubos de microcentrífuga siliconizados (Fischer Scientific, Pittsburgh, PA) a 37 °C durante una hora con rotación constante de extremo a extremo a baja velocidad. Las mezclas después se aplicaron a cultivos corticales y/o de hipocampo primarios y se incubaron a 37 °C durante una hora. La incubación terminó retirando el medio de cultivo. Las células se sometieron a tratamientos de fijación y postfijación. Después las células se incubaron con fosfatasa alcalina (AP) conjugada con estreptavidina a 4 °C durante la noche, se lavaron cinco veces con PBS y se hicieron reaccionar con el sustrato quimioluminiscente TROPIX CDP-Star (Life Technologies, Carlsbad, CA) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se midió la intensidad de unión de bADDL y se registró con un lector de microplacas ENVISION (PerkinElmer, Waltham, MA).

Los resultados de este estudio demuestran que los anticuerpos anti-ADDL de la presente, de modo específico el anticuerpo 19.3, reducen notablemente la unión de ADDL a las neuronas (figura 3). Sin embargo, se observó una marcada reducción en la actividad del anticuerpo en este ensayo cuando los anticuerpos se desnaturalizaron con calor (figura 3).

Unión a FcRn in vitro de anticuerpos anti-ADDL. Para caracterizar la capacidad de los anticuerpos anti-ADDL para unirse y disociar FcRn humana inmovilizada, los siete anticuerpos anti-ADDL variantes de h3B3 se evaluaron en un ensayo de unión de FcRn BIACORE, un sistema sustituto empleado para evaluar la PK de anticuerpo y predecir la semivida terminal (t1/2) de anticuerpos en primates no humanos. Brevemente, la proteína FcRn humana purificada se inmovilizó sobre un chip biodetector BIACORE CM5 y se empleó PBSP (NaPO4 50 mM, NaCl 150 mM y TWEEN 20 al 0,05% (en v/v)), pH 7,3, como tampón de ensayo. Los anticuerpos monoclonales se diluyeron con PBSP, pH 6,0, hasta 100 nM, se dejó que se unieran a FcRn durante 3 minutos hasta alcanzar el equilibrio y se disociaron en

imagen26

imagen27

imagen28

Tabla 11

Anticuerpo

Secuencia CDR1 de LC SEQ ID NO:

19.3 (de origen)

RSSQSIVHSNGNTYLE 14

19.3 N33S

RSSQSIVHSSGNTYLE 46

19.3 N33T

RSSQSIVHSTGNTYLE 47

19.3 N33A

RSSQSIVHSAGNTYLE 48

19.3 N33E

RSSQSIVHSEGNTYLE 49

19.3 N33D

RSSQSIVHSDGNTYLE 50

19.3 N33S-N35Q

RSSQSIVHSSGQTYLE 51

19.3 N33S-N35S

RSSQSIVHSSGSTYLE 52

19.3 N33S-N35T

RSSQSIVHSSGTTYLE 53

19.3 N33S-N35A

RSSQSIVHSSGATYLE 54

La tabla 12 resume la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera de los variantes, comparada con la CDR2 de la cadena ligera del anticuerpo de origen, 19.3. Los variantes de 19.3 cuya CDR2 de cadena ligera se indica en la siguiente tabla 12 y cuyas CDR1 y CDR3 de cadena ligera y todas las cadenas pesadas son como en el propio 19.3 se describen en la presente.

Tabla 12

Anticuerpo

Secuencia CDR2 de LC SEQ ID NO:

19.3 (de origen)

KASNRFS 15

19.3 N58Q

KASQRFS 55

19.3 N58S

KASSRFS 56

19.3 N58T

KASTRFS 57

19.3 N58A

KASARFS 58

Los variantes de 19.3 se evaluaron posteriormente para determinar si las mutaciones tenían algún efecto sobre la 10 estabilidad del anticuerpo. Se incubaron partes alícuotas de anticuerpos variantes purificados, junto con el anticuerpo de origen 19.3, bajo diversas condiciones a 4 °C, 25 °C o 40 °C durante un mes antes de someterse a análisis ELISA. Se revistieron placas de unión para un alto contenido en proteínas (Costar, Corning, Lowell, MA) con el ligando diana en PBS durante la noche a 4 °C. La concentración de la proteína de revestimiento era de 50 pmol/pocillo para los ADDL. Los ADDL se generaron como se describe en el ejemplo 1. Al día siguiente, las placas 15 se lavaron cinco veces con PBS + TWEEN 20 al 0,05% (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) y se bloquearon durante la noche con tampón de bloqueo de caseína (Thermo Scientific, Waltham, MA) y TWEEN 20 al 0,05%. Se ensayaron tres anticuerpos representativos, 19.3, 19.3 N33S, y 19.3 N33T, de 15 µg/ml a 0 µg/ml en una serie de dilución en tres veces de 12 puntos. Después de dos horas de incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron y se añadió anti-IgG humana conjugado con fosfatasa alcalina (ThermoScientific, Waltham, MA) a 0,08 µg/ml. Después 20 de una incubación durante 45 minutos a temperatura ambiente, las placas se lavaron y se añadió el sustrato quimioluminiscente TROPIX CDP-Star (LIFE TECHNOLOGIES, Carlsbad, CA). Se detectó la luminiscencia después

de 30 minutos en un lector de microplacas ENVISION (PerkinElmer, Waltham, MA). Se completaron los ajustes de la curva empleando el programa informático GRAPHPAD PRISM™ (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

Tal como se muestra en las figuras 6B y 6C, los anticuerpos 19.3 N33S y 19.3 N33T presentan una estabilidad de unión potenciada, comparado con el anticuerpo de origen 19.3 (WT, figura 6A) tras una incubación durante un mes a temperaturas variables. En la tabla 13 se proporciona un resumen de las CE50 de estos anticuerpos a diversas temperaturas de incubación.

Tabla 13

Antígeno

Incubación CE50 (nM) del anticuerpo

19,3

19.3 N33T 19.3 N33S

bADDL

momento 0 1,1 15,5 7,8

4°, 1 mes

1,7 11,6 8,6

25°, 1 mes

2,1 15,7 12,8

40°, 1 mes

5,9 23,5 10,1

Aβ1-40

momento 0 10,1 332,1 55,1

4°, 1 mes

16,3 306,8 59,1

25°, 1 mes

22,1 ND 24,3

40°, 1 mes

88,8 96,3 29,9

Se determinó la CE50 de varios de los variantes de 19.3 y se descubrió que los variantes mantenían la especificidad 10 por ADDL en un ensayo ELISA (tabla 14).

Tabla 14

Anticuerpo

CE50 (nM)

ADDL

Aβ1-42

19.3

0,8 18

19.3 N33S

1,7 150

19.3 N33T

3,1 244

19.3 N33D

0,82 28

Todos los anticuerpos eran IgG2.

Ejemplo 10: Anticuerpos que prefieren los oligómeros de Aβ en un ELISA de "sandwich" selectivo para oligómeros de Aβ

15 En una selección de parejas de anticuerpos de captura y detección en formato ELISA de "sandwich", la combinación de 19.3 como anticuerpo de captura con 7305, un anticuerpo antioligómeros de Aβ (20C2, patente de EE. UU. n.º 7.780.963) o 82E1 (Immunobiological Laboratories (IBL), Inc., Minneapolis, MN) actuaron de modo comparable en tampón de bloqueo de caseína en una curva patrón de oligómero de Aβ, y cada uno presenta un límite de detección

imagen29

imagen30

Diluyente patrón

Esperado [ADDL] pM DE promedio DE CV% Interp [ADDL] pM, promedio DE CV% Recuperación

CSF de rhesus mermado

5,00 9097 88 1 imagen31 imagen32

1,67

9112 195 2

0,56

8721 166 2

0,19

8785 269 3

0,06

8744 273 3

0,00

8678 519 6

CSF de rhesus no mermado

5,00 10353 237 2 imagen33 imagen34

1,67

9719 495 5

0,56

9902 546 6

0,19

9971 319 3

0,06

9721 329 3

0,00

10515 282 3

n = 3 para cada experimento.

Como alternativa, el anticuerpo de detección 7305 fue reemplazado por 82E1, también acoplado a un marcador fluorescente, en el ELISA de "sandwich" selectivo de oligómeros de Aβ (figura 9A) revelado empleando el sistema de inmunoensayo ERENNA™. Al igual que 19.3, se ha indicado que el anticuerpo 82E1, en formatos ELISA, detecta 5 oligómeros de Aβ en cerebro AD (Xia, et al. (2009), Arch. Neurol. 66:190-199). Tal como se muestra en la tabla 16, este ensayo elimina la señal no específica en CSF de rhesus puro y mermado en oligómeros de Aβ, lo cual sugiere además que el anticuerpo 7305 era la fuente de la señal no específica. Aunque no se pretenda limitación alguna por la teoría, se cree que la alta señal de fondo observada para la pareja de anticuerpos 19.3/7305 es debida a la unión del fibrinógeno del CSF a las esferas MP, que no había sido observada para la pareja de anticuerpos 19.3/82E1.

10 Este ensayo alternativo generó un LoD de los patrones de oligómeros de Aβ a 0,04 pg/ml, un LLoRQ a 0,42 pg/ml, y una selectividad 5000 veces mayor del ensayo por oligómeros de Aβ frente al monómero Aβ 40 (figura 8). Basándose en estos descubrimientos, se seleccionó este formato de ensayo para la posterior caracterización.

Tabla 16

Parámetro

Pareja de anticuerpos 19.3/7305 Pareja de anticuerpos 19.3/82E1

Pendiente de los acontecimientos detectados (pM)

1.200 4.000

Fondo

70 100

LoD (pM)

0,01 0,01

LLoRQ (pM)

0,16-0,49 0,12

Reactividad cruzada del monómero Aβ40

0,02 % 0,04 %

CSF de rhesus mermado (pM)

80 < 0,12

CSF de rhesus no mermado (pM)

200 0,35

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Ejemplo 12: Ensayo farmacodinámico (PD)

Utilizando los anteriores descubrimientos, se desarrolló un ELISA de "sandwich" selectivo de oligómeros de Aβ, empleando la pareja de anticuerpos 19.3 y 82E1, para detectar y medir los niveles de oligómeros de Aβ en una muestra de CSF. Este ensayo se denominará ensayo farmacodinámico (PD) para su uso para evaluar los cambios en los niveles del analito, es decir, el oligómero de Aβ, después de un tratamiento para inhibir la producción, el aumento en la eliminación, o cualquier otra modificación en los niveles de oligómero de Aβ (figura 9B). El ensayo de PD también puede utilizarse para diferenciar pacientes con AD de pacientes sin AD, es decir, como diagnóstico, para controlar el avance de la enfermedad, es decir, como prognóstico, o para controlar el potencial terapéutico de un tratamiento modificador de la enfermedad para cambiar las concentraciones de oligómeros de Aβ.

El ensayo PD, según se ha descrito en el ejemplo previo con referencia a la figura 9B, coloca el anticuerpo 19.3 acoplado a una esfera de micropartícula (MP) paramagnética (esfera MP/19.3) en un pocillo de una placa de ELISA. Al pocillo se le añadió CSF humano o un patrón de oligómero de Aβ (en una dilución en serie añadida a tampón Tris y albúmina de suero bovina). Cualquier oligómero de Aβ presente en el pocillo se une al complejo de 19.3/esfera MP y el exceso de disolución se lava. Se añade 82E1 marcado con fluorescencia, como anticuerpo de detección, dentro de un tampón de ensayo (tampón Tris con TRITON X-100 al 1%, d-destiobiotina, BSA), al complejo lavado de esfera MP/19.3/oligómero de Aβ y se incuba para unir el complejo de oligómero de Aβ. El complejo de esfera MP/19.3/oligómero de Aβ/82E1 resultante se lava con un tampón de elución, y el anticuerpo marcado con fluorescencia 82E1 se eluye con el anticuerpo no unido. La detección con un detector de micropartículas paramagnéticas, tal como el instrumento ERENNA™, en el que la disolución fluye y es excitada por un láser, permite la detección de moléculas individuales (el marcador fluorescente emite fotones de una longitud de onda lumínica específica) para generar y medir una señal fluorescente, que es equivalente a las moléculas detectadas, concretamente, el oligómero de Aβ. Una curva patrón de oligómeros de Aβ, medidos con el instrumento ERENNA™, comparado con monómeros de Aβ, se muestra en la figura 8.

Ejemplo 13: Oligómeros de Aβ en CSF humano

Se empleó el ELISA de "sandwich" selectivo de oligómeros de Aβ de 19.3 x 82E1 del ejemplo previo para medir los niveles endógenos de oligómeros de Aβ en muestras de CSF humano (figuras 10A y 10B). En dos cohortes de muestras distintas, la señal fluorescente, generada por la presencia de oligómeros de Aβ, aparecía significativamente elevada en CSF de AD (clínicamente diagnosticado empleando una puntuación de MMSE por debajo de 25 como AD probable), comparado con controles sanos de la misma edad o más jóvenes. Los niveles absolutos de oligómeros de Aβ observados fueron 2,1 ± 0,61 pg/ml en AD (n = 20) y 0,53 ± 0,26 pg/ml en el control de la misma edad (n = 10) en muestras de CSF de Precision Medicine (Solana Beach, CA) con una puntuación de ensayo de la t de dos vías de Mann-Whitney de p<0,0004 (figura 10A). Los niveles absolutos de oligómeros de Aβ observados fueron 1,66 ± 0,5 pg/ml en AD (n = 10) y 0,24 ± 0,05 pg/ml en el control (n = 10) en muestras de CSF de Bioreclamation (Hicksville, NY), con una puntuación de ensayo de la t de dos vías de Mann-Whitney de p<0,0021 (figura 10B). Combinando las dos cohortes, 90% de las muestras de CSF con AD diagnosticado estaban por encima de un LLoRQ de 0,42 pg/ml, mientras que solo 20% del control de la misma edad o 10% de los controles más jóvenes se encontraban por encima de este límite. Todos los valores se encontraban por encima de un LoD de 0,04 pg/ml. Los niveles de monómeros Aβ40 y Aβ42 se midieron en las muestras de CSF obtenidas de Bioreclamation (figuras 11A y 11B, respectivamente) y fueron comparables entre AD y CSF control para Aβ1-40 (figura 11A), mientras que se eran significativamente reducidos en las muestras de AD para Aβ1-42 (figura 11B). Esto ha sido previamente descrito como una característica del CSF de AD (De Meyer, et al. (2010), Arch. Neurol., 67:949-956; Jack, et al. (2010), Lancet Neurol., 9:119-128) y confirma el diagnóstico correcto de estas muestras. Aunque no se pretenda limitación alguna por la teoría, se cree que estos niveles menores de Aβ1-42 en las muestras de CSF de AD son debidos a la retención de Aβ1-42 en los depósitos amiloides del cerebro con AD. La capacidad para detectar específicamente y cuantificar estas diferencias observadas sugiere que estos biomarcadores pueden emplearse como una medición de diagnóstico y de prognóstico para la AD.

Para un ensayo de diagnóstico, la señal, es decir, el nivel de oligómeros de Aβ, detectada mediante el ensayo de la presente generalmente sería mayor de tres veces en un paciente con AD (hasta un nivel de >0,5 pg/ml), comparado con la señal observada para pacientes sin AD. Esto resulta coherente con los datos mostrados en la figura 10A, en la que los niveles de los oligómeros de Aβ en el CSF de AD, comparado con los controles de la misma edad, fueron cuatro veces mayores, y en la figura 10B, en la que los niveles de los oligómeros de Aβ en CSF de AD fueron ocho veces mayores. Estos datos también apoyan el uso del ensayo de oligómeros de Aβ de la presente para identificar pacientes en estadios tempranos de la enfermedad (es decir, un ensayo de prognóstico). La edad es el mayor factor de riesgo para el desarrollo de la AD, y las diferencias observadas entre AD y los controles de la misma edad son más pequeñas que entre AD y los controles más jóvenes. De modo similar, para un ensayo de prognóstico de oligómeros de Aβ, los pacientes que muestran un MMSE menor que 25 presentarían una señal de oligómeros de Aβ detectada de >0,5 pg/ml (de cuatro a ocho veces mayor que los pacientes con un MMSE mayor que 25/normal), comparado con la señal detectada para el monómero Aβ1-42, que es aproximadamente dos veces menor en CSF de AD comparado con los controles. Empleando una puntuación de MMSE de 25 como límite de corte (Mungas (1991), Geriatrics, 46(7):4-58), en la que una puntuación de MMSE mayor que 25 se considera "sano normal" y una puntuación menor se considera con deterioro cognitivo leve o con AD, se esperaría que un nivel de oligómeros de Aβ de ≥0,5 pg/ml fuera indicativa de un paciente con una puntuación de MMSE menor que 25 (figura 12).

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Ejemplo 14: Ensayo de unión a la diana (TE)

Empleando los anteriores descubrimientos, se desarrolló un ensayo de TE ("target engagement") para medir los oligómeros de Aβ unidos in vivo a un anticuerpo terapéutico (de captura). Como tal, el ensayo de TE puede emplearse para medir los niveles de oligómeros de Aβ unidos a un anticuerpo terapéutico para confirmar la unión del oligómero de Aβ al anticuerpo terapéutico. Aunque no se pretenda limitación alguna por la teoría, se cree que el nivel de oligómeros de Aβ unidos a un anticuerpo antioligómeros de Aβ terapéutico será menor en las muestras de CSF procedentes de sujetos que han sido tratados a lo largo del tiempo con dicho anticuerpo terapéutico. Unos niveles de oligómeros de Aβ unidos que aumentan o que permanecen sin cambios después de la administración sugieren que el anticuerpo terapéutico no es adecuado para el tratamiento de la AD. Como alternativa, puede darse el caso de que simplemente secuestrando los oligómeros de Aβ y uniéndolos al anticuerpo terapéutico, se obtenga un beneficio en la actuación aguda, debido a una menor interacción con las neuronas en el cerebro. Sin embargo, este beneficio puede no estar asociado con un cambio en los oligómeros de Aβ per se. El ensayo de unión a la diana evalúa, como mínimo, la capacidad de un anticuerpo terapéutico para unirse a oligómeros de Aβ dentro del CSF.

En este ensayo se emplea una pareja de anticuerpo anti-IgG2 humana x anticuerpo 82E1 para detectar y cuantificar niveles de oligómeros de Aβ unidos en una muestra de CSF procedente de un paciente tratado con el anticuerpo antioligómeros de Aβ 19.3 (IgG2), es decir, un anticuerpo terapéutico (figura 9B). Para demostrar la capacidad de anticuerpos específicos de oligómeros de Aβ para unirse a oligómeros de Aβ en una matriz de CSF humano, se generaron complejos de 19.3/oligómeros de Aβ dentro de CSF humano sembrando el CSF con el anticuerpo antioligómeros de Aβ 19.3 a unos niveles que se cree que están presentes a las 24 horas en mono rhesus dosificado por vía intravenosa con 20 m/k (100 ng/ml, figura 13). A esta muestra de CSF humano sembrado con 19.3 se le añadió una cantidad creciente de patrones de oligómeros de Aβ, que es equivalente a las concentraciones de oligómeros de Aβ endógenas (0,1-5,0 pg/ml) (figuras 10A y 10B) y que también las aumentan significativamente por encima de los intervalos normales. Los complejos de 19.3 x oligómeros de Aβ formados en el CSF humano se capturaron sobre placas de ELISA de 96 pocillos revestidos con anticuerpo contra cadena ligera kappa humana o anticuerpo contra IgG2 humana (ambos de Southern Biotech, Birmingnam, AL) a 0,5 µg por pocillo en tampón bicarbonato de sodio a 4 °C (paquete de tampón carbonato-bicarbonato BupH, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham MA). Al día siguiente, los pocillos se lavaron con PBS-T y se bloquearon durante la noche a 4 °C con 200 µl/pocillo de tampón de caseína en PBS con TWEEN 20 al 0,1% añadido. El anticuerpo 19.3 se sembró en un tampón de caseína (Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham MA) o CSF humano en tubos de microcentrífuga (Axygen, Inc., Union City, CA). Los oligómeros de Aβ se sembraron a concentraciones variables para producir una curva patrón, manteniendo constantes los niveles de 19.3. Las muestras se agitaron a 4 °C durante una hora para permitir la formación de los complejos de anticuerpo (19.3)/oligómero de Aβ. Se aplicaron cien µl de muestra/pocillo a una placa revestida con anti-IgG2 humana o anti-kappa humana (n = 3) y se incubó durante la noche a 4 °C en un agitador de placas. Al día siguiente, las placas se lavaron cinco veces con PBS-T y se añadió biotina-82E1 (IBL, Minneapolis, MN) a 100 µl/pocillo, diluida 1:5000 en tampón de bloqueo de caseína (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), TWEEN 20 al 0,1% durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se volvieron a lavar con PBS-T, y se diluyó neutravidina-AP (ThermoFisher, Waltham, MA) 1:20000 en tampón de caseína y después se añadió durante 30 minutos a temperatura ambiente. A más lavados con PBS-T le siguió la aplicación de un sustrato luminiscente TROPIX CDP Star (Applied Biosystems, Foster City, CA) durante 30 minutos. La luminiscencia se cuantificó en un lector de placas ENVISION (PerkinElmer, Waltham, MA).

El anticuerpo antioligómeros de Aβ 19.3 fue suficientemente reconocido por anti-kappa humana y anti-IgG2 humana en tampón (figuras 14A y 14B, triángulos negros), puesto que el anticuerpo contiene ambas características. Tal como se muestra en la figura 14A (círculos negros, CSF), el ensayo que emplea anti-IgG2 humana como anticuerpo de captura y 82E1 como anticuerpo de detección para detectar y medir el complejo de 19.3/oligómero de Aβ produjo una sensibilidad significativamente menor en CSF humano, comparado con el ensayo que emplea anti-kappa humana como anticuerpo de captura (círculos negros, CSF, figura 14B). Ambos ensayos presentan una sensibilidad equivalente en tampón de caseína. El uso de anti-kappa humana para capturar el complejo de 19.3/oligómero de Aβ produjo menos sensibilidad, hasta un LoD de 42 pg/ml de oligómero de Aβ unido a 100 ng/ml de 19.3, quizás debido a un mayor nivel de fondo de las especies de IgG con una cadena ligera kappa en CSF humano, comparado con las especies de IgG2, que produjeron una mayor sensibilidad en el formato de ensayo que emplea un anti-IgG2. Después de la dosificación de seres humanos o animales experimentales con 19.3 o un anticuerpo antioligómeros de Aβ de IgG2 relacionado como anticuerpo terapéutico, podría esperarse que el anticuerpo terapéutico estuviese representado en el CSF a 0,1-0,2% del nivel dosificado (Thompson (2005), Proteins of the Cerebrospinal Fluid, Elsevier Academic Press, Nueva York, NY). El anticuerpo terapéutico presente en el CSF se unirá a oligómeros de Aβ disponibles, los complejos de 19.3 (IgG2)/oligómero de Aβ serían capturados por el anticuerpo de captura anti-IgG2 a través de anticuerpo anti-IgG2 humana 19.3, y los complejos de oligómeros de Aβ serían detectados con 82E1. La sensibilidad de esta plataforma probablemente puede aumentar empleando un sistema de detección de micropartículas paramagnéticas, tal como el sistema de inmunoensayo ERENNA™ (SINGULEX, Alameda, CA), utilizado en el ensayo de PD de la presente.

A lo largo del tiempo, tras un tratamiento terapéutico con un anticuerpo antioligómeros de Aβ, se esperaría que la señal detectada para los complejos de 19.3/oligómeros de Aβ se redujera (comparado con los niveles de pretratamiento). La cantidad de oligómero de Aβ unido, tanto si se mide agudamente para estos complejos como si se mide a lo largo de un periodo de tratamiento terapéutico, representa la proporción del anticuerpo terapéutico

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unido a la diana, es decir, los oligómeros de Aβ, y puede actuar como sustituto para la eficacia del anticuerpo terapéutico.

Ejemplo 15: Caracterización adicional del anticuerpo

Se empleó un ensayo de unión basado en una disolución para determinar la especificidad y la afinidad de anticuerpos anti-ADDL por diferentes preparaciones de péptidos de beta-amiloides (ADDL, fibrillas, Aβ1-40, Aβ1-20). Se empleó un ELISA cuantitativo que era capaz de capturar el intervalo lineal de dosis-respuesta de anticuerpos monoclonales contra ADDL revestidos sobre placas NUNC. Basándose en esta información, se seleccionó una concentración fija de anticuerpo monoclonal que pueda producir señales de DO constantes en un ELISA justo por encima del ruido del ensayo (lectura de DO450 nm de aproximadamente 0,2 a 0,5). Después el anticuerpo anti-ADDL a esta concentración fija se incubó con diferentes sustratos de péptidos de beta-amiloides (ADDL, fibrillas, Aβ1-40, Aβ1-20) en 20 puntos de titulación en disolución a temperatura ambiente durante la noche para alcanzar el equilibrio. La cantidad de anticuerpo anti-ADDL libre dentro de la mezcla se determinó al día siguiente en un ELISA cuantitativo con una hora de incubación en placas ELISA normales. La fracción de anticuerpo anti-ADDL unido se calculó y se emplearon las correlaciones de anticuerpo anti-ADDL unido a la titulación de ligando libre (sustratos) para obtener la KD, empleando el programa GRAFIT (Erithacus Software, Surrey, UK). Así, la preferencia de sustrato de cada anticuerpo por diferentes preparaciones de péptidos beta-amiloides se presenta como valores de afinidad intrínseca (KD).

Empleando este formato de ensayo, la interacción del anticuerpo y el sustrato se produce en fase de disolución y, por tanto, no existe restricción de ninguna superficie sólida. Además, se dejó que las interacciones alcanzasen el equilibrio. Por tanto, la interacción del anticuerpo anti-ADDL y el sustrato se produce a concentraciones limitantes de ambos componentes sin que existan problemas de precipitación del anticuerpo anti-ADDL o una oligomerización de péptidos de beta-amiloide adicional debido a la alta concentración experimental. Además, la lectura del ensayo es independiente del antígeno en la disolución; así, cualquier heterología del beta-amiloide en diferentes preparaciones de péptidos (por ejemplo, ADDL o fibrillas) no interferiría con la interpretación de los datos y la construcción de modelos matemáticos. La sensibilidad del ensayo se limita a los límites de detección del ensayo ELISA, que permite que este ensayo evalúe anticuerpos monoclonales con unos valores de KD en el intervalo nanomolar.

Se determinaron las cantidades de anticuerpo anti-ADDL libre mediante una curva patrón y se representaron gráficamente frente a titulaciones de diferentes sustratos. Las cantidades de anticuerpo anti-ADDL unido con diferentes sustratos se representaron gráficamente y la información se empleó en GRAFIT para el ajuste de la curva con modelos matemáticos apropiados. El resumen de la KD, expresada en intervalos nM, para el panel de anticuerpos monoclonales anti-ADDL se presenta en la tabla 17.

Tabla 17

Anticuerpo*

ADDL Fibrillas Aβ1-40 Aβ1-20

KD

EE KD EE KD EE KD EE

20C2

0,92 0,09 3,62 0,47 30,48 5,05 71,35 24,41

2A10

2,29 0,25 6,72 0,99 14,69 2,64 22,40 2,43

2B4

2,09 0,24 10,50 1,26 27,57 4,88 1,63 0,26

2D6

5,05 0,52 14,41 2,40 25,66 5,84 30,17 7,07

5F10

11,90 1,63 28,95 5,78 23,54 6,21 6,10 4,39

4E2

4,26 0,42 9,40 1,60 20,24 2,07 28,40 3,23

4C2

8,08 1,03 19,17 3,69 21,89 4,14 28,40 3,23

1F4

9,24 0,84 12,52 1,66 NC NC NC NC

1F6

N/E N/E N/E N/E N/E N/E N/E N/E

2E12

NC NC NC NC NC NC NC NC

Claims (1)

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