ES2874704T3

ES2874704T3 - Procedimiento para monitorizar la eficacia de un tratamiento de la enfermedad de Alzheimer con una isoforma de ApoE

Info

Publication number: ES2874704T3
Application number: ES14863892T
Authority: ES
Inventors: Beverly L Davidson; Bradley T Hyman; Eloise Hudry
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; General Hospital Corp
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF; General Hospital Corp
Priority date: 2013-11-20
Filing date: 2014-11-20
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2034-11-20
Also published as: EP3071240B1; CA2931220A1; IL245703B; MX2016006584A; KR20160079891A; BR112016011258A2; EP3071240A4; WO2015077473A1; JP6592435B2; IL245703A0; EP3071240A1; AU2014352944A1; JP2016540977A; US20170336395A1

Abstract

Procedimiento in vitro para determinar A-beta 40 en un mamífero antes y después del tratamiento de un trastorno amiloide, que comprende: (a) proporcionar una primera muestra de sangre obtenida del mamífero antes del tratamiento de un trastorno amiloide; (b) proporcionar una segunda muestra de sangre obtenida del mamífero después del tratamiento del trastorno amiloide; (c) cuantificar un nivel de A-beta 40 en la primera muestra de sangre y en la segunda muestra de sangre; y (d) determinar el nivel de A-beta 40 antes y después del tratamiento del trastorno amiloide; en el que el procedimiento in vitro comprende, además, comparar el nivel de A-beta 40 en la primera muestra con el nivel de A-beta 40 en la segunda muestra, en el que un nivel aumentado de A-beta 40 en la segunda muestra de sangre en comparación con la primera muestra de sangre está asociado con o es indicativo de una disminución o reducción de las placas o agregados amiloides presentes en el cerebro del mamífero y/o está asociado con o es indicativo de un tratamiento eficaz del trastorno amiloide, y en el que el tratamiento comprende un nivel aumentado de una proteína isoforma de ApoE protectora en el cerebro del mamífero, en el que la isoforma de ApoE protectora es la ApoE ε2, y en el que el trastorno amiloide es la enfermedad de Alzheimer.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para monitorizar la eficacia de un tratamiento de la enfermedad de Alzheimer con una isoforma de ApoE

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La transferencia génica está ahora ampliamente reconocida como una poderosa herramienta para el análisis de eventos biológicos y procesos patológicos tanto a nivel celular como molecular. Más recientemente, la aplicación de la terapia génica para el tratamiento de enfermedades humanas, ya sean hereditarias (por ejemplo, deficiencia de ADA) o adquiridas (por ejemplo, cáncer o enfermedad infecciosa), ha recibido considerable atención. Con la aparición de técnicas mejoradas de transferencia génica y la identificación de una biblioteca en constante expansión de enfermedades relacionadas con genes defectuosos, la terapia génica ha evolucionado rápidamente de una teoría de tratamiento a una realidad práctica.

Tradicionalmente, la terapia génica se ha definido como un procedimiento en el que se introduce un gen exógeno en las células de un paciente para corregir un error genético innato. Más recientemente, la terapia génica se ha definido de manera amplia como la corrección del fenotipo de una enfermedad mediante la introducción de nueva información genética en el organismo afectado. En la terapia génica in vivo, se introduce un gen transferido en las células del organismo receptor in situ, es decir, dentro del receptor. La terapia génica in vivo se ha examinado en modelos animales. Se ha informado de la viabilidad de la transferencia génica directa in situ a órganos y tejidos, tales como el músculo, a células madre hematopoyéticas, a la pared arterial, al sistema nervioso y a los pulmones. También se ha informado que la inyección directa de ADN en el músculo esquelético, el músculo cardíaco y la inyección de complejos de ADN-lípido en la vasculatura producen un nivel de expresión detectable del producto o productos génicos insertados in vivo.

El tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central (SNC), por ejemplo, enfermedades genéticas del cerebro, tales como la enfermedad de Alzheimer, sigue siendo un problema insoluble. Un problema importante en el tratamiento de enfermedades cerebrales es que las proteínas terapéuticas, cuando se administran por vía intravenosa, no atraviesan la barrera hematoencefálica, o cuando se administran directamente al cerebro, no se distribuyen ampliamente. De este modo, es necesario desarrollar terapias para tratar la enfermedad de Alzheimer. Dodart et al., PNAS, vol. 102, no. 4, 2005, páginas 1211-1216 dan a conocer la medición de los niveles cerebrales de proteínas Ap antes y después de la expresión de diferentes isoformas de la ApoE en el hipocampo, mediadas por la administración intracerebral de genes, en la enfermedad de Alzheimer. Dodart et al. dan a conocer que la expresión de la ApoE2 reduce el nivel hipocámpico de AP42 y puede prevenir o reducir la formación de placas.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para determinar A-beta 40 en un mamífero antes y después del tratamiento de un trastorno amiloide, que comprende:

(a) proporcionar una primera muestra de sangre obtenida del mamífero antes del tratamiento de un trastorno amiloide;

(b) proporcionar una segunda muestra de sangre obtenida del mamífero después del tratamiento del trastorno amiloide;

(c) cuantificar un nivel de A-beta 40 en la primera muestra de sangre y en la segunda muestra de sangre; y (d) determinar el nivel de A-beta 40 antes y después del tratamiento del trastorno amiloide;

en el que el procedimiento in vitro comprende, además, comparar el nivel de A-beta 40 en la primera muestra con el nivel de A-beta 40 en la segunda muestra, en la que un nivel aumentado de A-beta 40 en la segunda muestra de sangre en comparación con la primera muestra de sangre está asociado con o es indicativo de una disminución o reducción de las placas o agregados amiloides presentes en el cerebro del mamífero y/o está asociado con o es indicativo de un tratamiento eficaz del trastorno amiloide, y

en el que el tratamiento comprende un nivel aumentado de una proteína isoforma de ApoE protectora en el cerebro del mamífero,

en el que la isoforma de ApoE protectora es la ApoE e2, y

en el que el trastorno amiloide es la enfermedad de Alzheimer.

En una realización preferente, el procedimiento in vitro comprende, además, calcular una proporción entre el nivel de A-beta 40 en la primera muestra y el nivel de A-beta 40 en la segunda muestra.

En una realización preferente, el nivel de A-beta 40 en la primera muestra de sangre o en la segunda muestra de sangre se cuantifica mediante un inmunoensayo.

En una realización preferente, la muestra de sangre es sangre completa, plasma o suero.

En una realización preferente, el mamífero es un primate, preferentemente, un ser humano.

ASPECTOS DE LA INVENCIÓN

Se da a conocer un procedimiento para determinar A-beta en un mamífero antes y después del tratamiento de un trastorno amiloide, que comprende:

(a) obtener una primera muestra de sangre del mamífero;

(b) administrar al mamífero un tratamiento de un trastorno amiloide;

(c) obtener una segunda muestra de sangre del mamífero;

(d) cuantificar un nivel de A-beta en la primera muestra de sangre y en la segunda muestra de sangre; y (e) determinar el nivel de A-beta en el mamífero antes y después del tratamiento del trastorno amiloide.

En determinados aspectos, el procedimiento comprende, además, calcular una proporción entre el nivel de A-beta en la primera muestra y el nivel de A-beta en la segunda muestra.

En determinados aspectos, el procedimiento comprende, además, comparar el nivel de A-beta en la primera muestra con el nivel de A-beta en la segunda muestra, en el que un nivel aumentado de A-beta en la segunda muestra de sangre en comparación con la primera muestra de sangre está asociado con o es indicativo de una disminución o reducción de las placas o agregados amiloides presentes en el cerebro del mamífero.

En determinados aspectos, el procedimiento comprende, además, comparar el nivel de A-beta en la primera muestra con el nivel de A-beta en la segunda muestra, en el que un nivel aumentado de A-beta en la segunda muestra de sangre en comparación con la primera muestra de sangre está asociado con o es indicativo de un tratamiento eficaz del trastorno amiloide.

En determinados aspectos, el tratamiento comprende administrar al líquido cefalorraquídeo (LCR) del mamífero una partícula de rAAV que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína isoforma de ApoE protectora insertada entre un par de repeticiones terminales invertidas (ITR, del inglés inverted terminal repeats) de AAV o adyacente a una o más ITR de AAV. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión “isoforma de ApoE protectora” se utiliza para distinguir las isoformas de la ApoE que disminuyen el riesgo de enfermedad de Alzheimer en, como mínimo, un 5 %, tal como un 10 %, un 20 %, un 30 %, un 40 %, un 50 %, un 60 %, un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 100 % o más. En determinados aspectos, la partícula de rAAV es una partícula de rAAV2 que infecta a la célula ependimaria no de roedor a una tasa superior al 20 % de la tasa de infectividad de AAV4, tal como a una tasa superior al 50 % o al 100 %, al 1000 % o al 2000 % de la tasa de infectividad de AAV4.

En determinados aspectos, el tratamiento comprende administrar un ácido nucleico que codifica una isoforma de ApoE protectora a un mamífero, que comprende administrar a una célula ependimaria del mamífero una partícula de rAAV que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV o adyacente a una o más ITR de AAV, y devolver la célula ependimaria al mamífero, administrando de este modo el ácido nucleico al mamífero.

En determinados aspectos, el tratamiento comprende administrar un ácido nucleico que codifica una isoforma de ApoE protectora a una célula ependimaria en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una partícula de rAAV que comprende una proteína de la cápside de AAV y un vector que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV o adyacente a una o más ITR de AAV, administrando de este modo el ácido nucleico a una célula ependimaria en el mamífero.

En determinados aspectos, la partícula de rAAV transduce o transfecta una célula ependimaria en el mamífero, en la que la célula ependimaria transducida o transfectada secreta la proteína isoforma de ApoE. En determinados aspectos, la partícula de rAAV comprende una cápside de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, a Av 9, AAV10, AAV11, Rh74 o Rh10 o una cápside variante de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 o Rh10. En determinados aspectos, la partícula de rAAV comprende una repetición terminal invertida (ITR) de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rli74 o Rh10 o una repetición terminal invertida (ITR) variante de AAV1, AAV2, AAV3, A^aV4, A^aV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, Rh74 o Rh10. En determinados aspectos, la partícula de AAV es una partícula de rAAV4. En determinados aspectos, la partícula de AAV es una partícula de rAAV2. En determinados aspectos, la cápside de rAAV2 tiene, como mínimo, un 80 % de homología con la proteína de la cápside de AAV2 VP1, VP2 y/o VP3. En determinados aspectos, la cápside de rAAV2 tiene una homología del 100 % con la cápside de AAV2 ^vP1 , VP2 y/o VP3.

En determinados aspectos, el ácido nucleico codifica una proteína isoforma de ApoE de mamífero. En determinados aspectos, el ácido nucleico codifica una proteína isoforma de ApoE humana. En determinados aspectos, la partícula de rAAV comprende una composición farmacéutica.

En determinados aspectos, el nivel de A-beta en la primera muestra de sangre o en la segunda muestra de sangre se cuantifica mediante un inmunoensayo.

En determinados aspectos, el mamífero es un mamífero no roedor. En determinados aspectos, el mamífero no roedor es un primate, un caballo, un oveja, un cabra, un cerdo o un perro. En determinados aspectos, el primate es un ser humano.

En determinados aspectos, el tratamiento comprende un nivel aumentado de la proteína isoforma de ApoE protectora en el cerebro del mamífero. En determinados aspectos, la isoforma de ApoE protectora tiene un 80 % de homología con la ApoE e2. En determinados aspectos, la isoforma de ApoE protectora tiene una homología del 100 % con la ApoE e2.

En determinados aspectos, el trastorno amiloide comprende la enfermedad de Alzheimer.

En determinados aspectos, la muestra de sangre es sangre completa, plasma o suero.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS

Figuras 1A-1B. La inyección intraventricular de AAV4-ApoE conduce a una expresión estable de huAPOE y una detección sostenida de proteína huApoE recombinante en el cerebro.

Figura 2. La sobreexpresión de cada isoforma de ApoE afecta de manera diferencial a la progresión de la amiloidosis.

Figura 3. Los tamaños de las placas amiloides varían según cada isoforma de ApoE.

Figuras 4A-4B. La evaluación post-mortem de la carga de amiloide confirma los efectos de la ApoE2 y la ApoE4 sobre la deposición de amiloide.

Figura 5A-5D. Cada isoforma de ApoE afecta de manera diferencial a la densidad sináptica alrededor de los depósitos de amiloide.

La figura 6A es una alineación de las proteínas AAV2 (SEQ ID NO: 1) y AAV4 (SEQ ID NO: 2) y la figura 6B es una alineación de los nucleótidos de AAV2 (SEQ ID NO: 3) y AAV4 (S^eQ ID NO: 4) basada en la secuencia de AAV2 (NC 001401) y AAV4 (NC_001829).

La figura 7 muestra una actividad elevada de TPP1 en diversas regiones del cerebro.

La figura 8 muestra los resultados del comportamiento en el laberinto en T de los perros de control y tratados. Los círculos claros son para perros afectados; los cuadrados oscuros son para perros normales y los círculos oscuros son para un perro TPP-/- tratado con AAV2-CLN2.

Figuras 9A-9B. Figura 9A-9B. Validación del enfoque de transferencia génica de APOE mediante inyección intraventricular de un serotipo 4 de AAV. El marcaje inmunohistológico de GFP o ApoE reveló la presencia de GFP o la proteína ApoE humana en el epéndimo y en el plexo coroideo. (A) Utilización de un ensayo ELISA específico de especie para cuantificar las concentraciones de proteína ApoE humana recombinante dentro de los homogeneizados de cerebro de ratones inyectados. (B) Evaluación del porcentaje de proteína ApoE humana en comparación con la ApoE endógena por ratón. Se calculó la proporción de la ApoE humana y la ApoE endógena murina para cada animal. Utilizando el anticuerpo específico anti-ApoE humano 3H1, se pudo detectar la presencia de proteína recombinante alrededor de algunos depósitos de amiloide en los que tiende a acumularse, dentro del parénquima cortical de ratones inyectados con APP/PS1. Detección de la ApoE mediante transferencia de tipo Western en la muestra de ISF de ratones apoE KO inyectados con un vector AAV4-APOE4. Se utilizó el anticuerpo anti-ApoE de cabra altamente sensible (pero no específico de especie) de Millipore (AB947) como anticuerpo de detección. Se utilizó albúmina como control. n=4-6 animales por grupo. *p<0,05.

Figuras 10A-10D. Los niveles de péptidos A|3 y la densidad de los depósitos de amiloide están modulados por la sobreexpresión de diferentes alelos de APOE. (A) Análisis de la densidad de los depósitos de amiloide en la corteza (panel izquierdo) y el hipocampo (panel derecho) de ratones transgénicos inyectados. Se pudo observar una tendencia similar entre ambas áreas cerebrales, pero los datos solo alcanzaron significación estadística en la corteza. (B) Determinación mediante ELISA de las concentraciones de péptidos AP40 y AP42 en la fracción de ácido fórmico (AF). (C) Cuantificación mediante ELISA de los niveles de péptidos AP40 y AP42 en la fracción soluble de TBS, 5 meses después de la inyección intraventricular de cada AAV. (D) Cuantificación de los niveles plasmáticos de péptidos AP40, 5 meses después de la inyección intraventricular de ratones APP/PS1 con vectores AAV-GFP y Aa V-ApOE2/3/4. n= 4-7 animales por grupo. *p<0,05

Figuras 11A-11B. La sobreexpresión de cada variante de APOE modula de manera diferencial la progresión de la amiloidosis in vivo . Se obtuvieron imágenes bifotónicas in vivo de la deposición de amiloide en ratones APP/PS1 una semana (T0), un mes (T1) y dos meses (T2) después de la inyección intracerebroventricular con los vectores AAV-GFP, AAV-APOE2, AAV-APOE3 o AAV-APOE4. Se realizó una inyección intravenosa de dextrano, rojo de Texas (70.000 Da) antes de la obtención de imágenes para poder seguir los mismos campos de visión a lo largo del tiempo. En un período de tiempo de dos meses, se pudieron detectar pocas placas amiloides nuevas, mientras que los depósitos ocasionales inicialmente visibles ya no eran detectables después de uno o dos meses. (A) Evaluación de la densidad cortical volumétrica de los depósitos de amiloide durante un período de tiempo de dos meses después de la inyección intraventricular de AAV-GFP, AAV-APOE2, AAV-APOE3 o AAV-APOE4 en ratones APP/PS1 de 7 meses de edad. Se obtuvieron imágenes de seis a ocho campos de visión longitudinalmente para cada animal y se calculó la densidad de placas por volumen de corteza y se referenció al valor inicial para cada animal en el nivel inicial (T0). Se observó una progresión general de 0,23 de la densidad de los depósitos de amiloide a lo largo del tiempo (T2/T1, p<0,011). Además, la ApoE2 reduce significativamente la densidad relación con GFP en 0,66 (ee=0,21, p=0,002), en relación con la ApoE3 en 0,67 (ee=0,17, p<0,0001) y en relación con la ApoE4 en 0,74 (ee=0,17, p<0,0001). (B) El ajuste de regresión lineal de la progresión de la amiloidosis durante 2 meses después de la transferencia génica en ratones APP/PS1 muestra que solo AAV-APOE4 induce una pendiente positiva significativa durante este período de tiempo. n=4-6 animales por grupo. *p<0,05.

Figura 12. Evolución del tamaño de los depósitos de amiloide uno y dos meses después de la infusión con la ApoE2, ApoE3 y ApoE4. Los gráficos de dispersión de puntos que representan la proporción de tamaños de placa entre T1 y T0 mostraron que la ApoE4 se asoció con un crecimiento de placas aumentado en comparación con la ApoE2 y la ApoE3 después de un mes. Este efecto no se mantiene después de 2 meses. n>50 placas medidas por grupo en de 3 a 4 animales. *p<0,05.

Figuras 13A-13C. Los cambios neuropatológicos asociados con los depósitos de amiloide se ven afectados de manera diferencial por cada variante de APOE. Se prepararon imágenes de secciones de tomografía de matriz inmunoteñidas para PSD95 (elemento postsináptico) y depósitos de amiloide en ratones APP/PS1, 2 meses después de la inyección intraventricular de AAV-Gf P, AAV-APOE2, AAV-APOE3 y AAV-APOE4. Los depósitos de amiloide se marcaron con el anticuerpo NAB61 que anteriormente se había demostrado que marcaba, preferentemente, especies oligoméricas de Ap tóxicas. (A) Se observó una pérdida significativamente mayor del marcador de sinapsina-1 en la vecindad de las placas amiloides cuando se expresaron tanto APOE3 como APOE4 en comparación con GFP o APOE2. (B) Se observó un efecto similar cuando se cuantificaron los elementos postsinápticos, de modo que la densidad de PSD95 alrededor de los depósitos disminuyó 2 meses después de una inyección intraventricular de AAV4-APOE4. Como parámetro adicional del cambio neuropatológico, se evaluó el número de distrofias neuríticas por placa amiloide en el cerebro de ratones APP/PS1 inyectados, después de inmunotinción para ThioS y el marcador axonal SMI312. (C) Se observó un cambio significativo hacia un mayor número de distrofias cuando los ratones fueron infundidos con la ApoE4 expresada en comparación con los grupos de la ApoE3 y la ApoE2, lo que sugiere que, de este modo, la ApoE4 puede tener efectos perjudiciales más allá de la formación de placas amiloides y puede modular el potencial neurotóxico de agregados amiloides oligoméricos más pequeños. n=4-6 animales por grupo. *p<0,05.

Figura 14. Se observan cambios tempranos en el contenido de especies de Ap oligoméricas en el ISF después de la inyección intracerebroventricular de AAV4-APOE2, AAV4-APOE3, AAV4-APOE4 en ratones Tg2576. La cuantificación del contenido de ISF en oAp utilizando el ensayo ELISA 82E1/82E1 muestra que hay una mayor concentración de especies de amiloide p oligoméricas después de la inyección de AAV4-APOE4 en comparación con AAV4-APOE2 y AAV4-GFP, mientras que los ratones inyectados con AAV4-APOE3 alcanzaron un nivel intermedio. n=3-6 animales por grupo. *p<0,05.

Figuras 15A-15B. Detección de ARNm y proteína de APOE murina endógena y humana después de la inyección intraventricular de AAV4 en ratones APP/PS1. (A) Diagramas de caja que representan las cantidades de proteína ApoE murina endógena en los cerebros de ratones inyectados. (B) Comparación de los niveles de proteína ApoE, 2 y 5 meses después de la inyección intracerebroventricular de AAV4 en ratones APP/PS1 (las muestras de todos los ratones inyectados con la ApoE se agruparon a los 2 y 5 meses, sin discriminación para la variante de APOE). n=4-6 animales por grupo. *p<0,05.

Figuras 16A-16C. Los efectos sobre Ap están asociados con cada isoforma de ApoE después de una exposición corta (2 meses). Se prepararon imágenes de la deposición de amiloide en ratones APP/PS1, 2 meses después de la inyección. Se utilizó la inmunotinción tanto con el anticuerpo Bam10 como con ThioS para teñir todos los depósitos de amiloide o placas de núcleo denso, respectivamente. (A) El análisis estereológico de la densidad de los depósitos de amiloide en la corteza reveló que la sobreexpresión de APOE4 condujo a un número de placas aumentado tan pronto como a los 2 meses después de la inyección, mientras que no se pudo observar ninguna diferencia entre los otros grupos experimentales. (B) La proporción entre la tinción con Bam10 y ThioS, por otro lado, permanece sin cambios entre todos los diferentes grupos. (C) Determinación de las concentraciones de péptidos AP40 (paneles de la izquierda) y AP42 (paneles de la derecha) en los extractos insolubles en ácido fórmico después de una exposición corta con las diferentes variantes de la ApoE. n=3-5 animales por grupo. *p<0,05.

Figuras 17A-17B. Los cambios en las especies de Ap solubles e insolubles se detectaron 3 meses después de la inyección en ratones Tg2576. (A) La cuantificación mediante ELISA del contenido en el ISF de AP40 y AP42 (B) muestra que existe una tendencia hacia una mayor concentración de péptidos amiloides p solubles después de la inyección de AAV4-APOE4 en comparación con AAV4-APOE2, AAV4-APOE3 y AAV4-GFP. (B) Tal como se había observado anteriormente en ratones APP/PS1, el efecto más intenso se observó con la ApoE4, que provoca cantidades significativamente mayores de AP42 en la fracción de ácido fórmico de ratones Tg2576. n=3-5 animales por grupo. *p<0,05.

Figuras 18A-18B. Transferencia génica de AAV4-APOE mediante inyección intracerebroventricular de ratones APP/PS1. (A) Se utilizó un ensayo ELISA específico de especie para cuantificar las concentraciones de proteína APOE humana en homogeneizados de cerebro de ratón después de 2 y 5 meses. (B) Porcentaje de APOE humana en comparación con la ApoE endógena de ratón después de 2 o 5 meses. Se calculó la proporción entre APOE humana y murina para cada animal.

Figuras 19A-19D. Los péptidos Ap y los depósitos de amiloide están modulados por diferentes alelos de APOE. (A) Análisis de la densidad de los depósitos de amiloide en la corteza (panel izquierdo) y el hipocampo (panel derecho) de ratones transgénicos APP/PS1 inyectados con AAV4-GFP o AAV4-APOE2/3/4. (B) Determinación mediante ensayo ELISA de las concentraciones de AP40 y AP42 en la fracción de ácido fórmico (AF) del cerebro de ratón. (C) Cuantificación mediante ensayo ELISA de las concentraciones de péptidos AP40 y AP42 en la fracción soluble en TBS del cerebro de ratón. (A, B, C, D) n=4 ratones inyectados con A^aV4-GFP, n=5 ratones inyectados con AAV4-APOE2, n=6 ratones inyectados con AAV4-APOE3 y n=5 ratones inyectados con AAV4-APOE4. *p<0,05.

Figuras 20A-20B. Las variantes de APOE humana modulan de manera diferencial la progresión de la amiloidosis. (A) Evaluación de la densidad cortical volumétrica de los depósitos de amiloide durante un período de dos meses después de la inyección intraventricular de AAV4-GFP, AAV4-APOE2, AAV4-APOE3 o AAV4-APOE4. Se obtuvieron imágenes de seis a ocho campos de visión longitudinalmente para cada animal. La densidad de placas se calculó por volumen de corteza y se normalizó al valor inicial para cada animal en el nivel inicial (T0). (B) El ajuste de regresión lineal de la progresión de la amiloidosis durante 2 meses después de la transferencia génica muestra que solo AAV4-APOE4 indujo una pendiente positiva significativa durante este período de tiempo. n=4 ratones inyectados con AAV4-GFP, n=4 ratones inyectados con AAV4-APOE2, n=6 ratones inyectados con AAV4-APOE3 y n=5 ratones inyectados con AAV4-APOE4. *p<0,05.

Figura 21. Cambio en el tamaño de los depósitos de amiloide uno o dos meses después de la infusión con APOE2, APOE3 o APOE4.

Gráficos de dispersión de puntos que representan la proporción de tamaños de placa entre T1 y T0 y (C) entre T2 y T1. n>50 placas medidas por grupo de 3 a 4 animales. *p<0,05.

Figuras 22A-22C. Los cambios neuropatológicos asociados con los depósitos de amiloide se ven afectados de manera diferencial por las variantes de APOE. (A) Porcentaje de pérdida presináptica (sinapsina I) y (B) postsináptica (PSD95) en la vecindad de las placas amiloides. (C) Gráfico de barras que representa el número promedio de distrofias por superficie de las placas amiloides. n=4 ratones inyectados con AAV4-GFP, n=4 ratones inyectados con AAV4-APOE2, n=6 ratones inyectados con AAV4-APOE3 y n=5 ratones inyectados con AAV4-APOE4. *p<0,05.

Figura 23. Cambios en las especies de Ap oligoméricas en el ISF después de la inyección de ratones Tg2576. Cuantificación del contenido en el ISF de Ap oligomérica (oAp, como % de ratones inyectados con GFP) utilizando el ensayo ELISA 82E1/82E1 después de la inyección de AAV4-GFP, AAV4-APOE2, AAV4-APOE3 y AAV4-APOE4. n=3 ratones inyectados con AAV4-GFP, n=3 ratones inyectados con AAV4-APOE2, n=5 ratones inyectados con AAV4-APOE3 y n=5 ratones inyectados con AAV4-APOE4. *p<0,05.

Figuras 24A-24D. Detección de ARNm y proteína de APOE murina endógena y humana después de la inyección intracerebroventricular de AAV4-APOE en ratones APP/PS1. (A) Análisis de transferencia de tipo Western de proteínas ApoE endógenas y recombinantes humanas en ratones inyectados con AAV4-APOE o AAV4-GFP. (B) Diagramas de caja que representan las cantidades de proteína ApoE murina endógena en los cerebros de ratones inyectados. No se detectaron cambios 2 o 5 meses después de la infusión de AAV4-APOE (C) Diagramas de caja que representan los niveles de expresión de ARNm de APOE murino endógeno, normalizados a la cantidad de transcritos de GAPDH. (D) Comparación de los niveles de proteína ApoE, 2 y 5 meses después de la inyección intracerebroventricular de AAV4 en ratones APP/PS1 (las muestras de todos los ratones inyectados con la ApoE se agruparon a los 2 y 5 meses, sin discriminación para la variante de APOE). n=4-6 animales por grupo (consúltese Materiales y procedimientos para obtener más detalles). *p<0,05

Figuras 25A-25C. Efectos sobre la patología de Ap asociada con cada isoforma de ApoE después de una exposición corta (2 meses). (A) El análisis estereológico de la densidad de los depósitos de amiloide en la corteza reveló que la sobreexpresión de APOE4 condujo a un número de placas aumentado tan pronto como 2 meses después de la inyección, mientras que no se pudo observar ninguna diferencia entre los otros grupos experimentales. (B) La proporción entre la tinción con Bam10 y ThioS, por otro lado, permanece sin cambios entre todos los diferentes grupos. (C) Determinación de las concentraciones de péptidos AP40 (paneles de la izquierda) y AP42 (paneles de la derecha) en los extractos insolubles en ácido fórmico después de una exposición corta con las diferentes variantes de la ApoE. n=4 ratones inyectados con AAV4-GFP, n=4 ratones inyectados con AAV4-APOE2, n=6 ratones inyectados con AAV4-APOE3 y n=5 ratones inyectados con AAV4-APOE4. *p<0,05

Figuras 26A-26B. Los cambios en las especies de Ap solubles e insolubles se detectaron 3 meses después de la inyección en ratones Tg2576. (A) La cuantificación mediante ELISA del contenido en el ISF de AP40 y AP42 muestra que existe una tendencia hacia una mayor concentración de péptidos amiloides P solubles después de la inyección de AAV4-APOE4 en comparación con AAV4-APOE2, AAV4-APOE3 y AAV4-GFP. (B) Tal como se había observado anteriormente en ratones APP/PS1, el efecto más intenso se observó con la ApoE4, que provoca cantidades significativamente mayores de AP42 en la fracción de ácido fórmico de los ratones Tg2576. n=3 ratones inyectados con AAV4-GFP, n=3 ratones inyectados con AAV4-APOE2, n=5 ratones inyectados con AAV4-APOE3 y n=5 ratones inyectados con AAV4-APOE4. *p<0,05.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

en el que el procedimiento in vitro comprende, además, comparar el nivel de A-beta 40 en la primera muestra con el nivel de A-beta 40 en la segunda muestra, en el que un nivel aumentado de A-beta 40 en la segunda muestra de sangre en comparación con la primera muestra de sangre está asociado con o es indicativo de una disminución o reducción de las placas o agregados amiloides presentes en el cerebro del mamífero y/o está asociado con o es indicativo de un tratamiento eficaz del trastorno amiloide, y en el que el tratamiento comprende un nivel aumentado de una proteína isoforma de ApoE protectora en el cerebro del mamífero,

en el que la isoforma de ApoE protectora es la ApoE e2, y

en el que el trastorno amiloide es la enfermedad de Alzheimer.

Existen diversas isoformas de la apolipoproteína E humana (ApoE), la presencia de algunas de estas isoformas en el cerebro aumenta el riesgo de enfermedad de Alzheimer (EA), mientras que la presencia de otras isoformas disminuye el riesgo de EA. La presencia de la isoforma de ApoE e4 es un factor de riesgo genético importante para la EA esporádica de aparición tardía. (Casellano et al., Sci Transl Med, 3 (89): 89ra57 (29 de junio de 2011)). El alelo de ApoE e4 aumenta considerablemente el riesgo de EA y disminuye la edad de aparición. Por otro lado, la presencia del alelo de ApoE e2 parece disminuir el riesgo de EA. Se sugiere que las isoformas de la ApoE humana afectan de manera diferencial a la depuración o a la síntesis de amiloide-p (Ap) in vivo.

El virus adenoasociado (AAV, del inglés adenoassociated virus) es un pequeño virus no patógeno de la familia Parvoviridae. El AAV se diferencia de los otros miembros de esta familia por su dependencia de un virus auxiliar para la replicación. En ausencia de un virus auxiliar, el AAV se puede integrar de una manera específica de locus en el brazo q del cromosoma 19. El genoma de, aproximadamente, 5 kb del AAV consiste en un segmento de ADN monocatenario de polaridad positiva o negativa. Los extremos del genoma son repeticiones terminales invertidas cortas que se pueden plegar para dar estructuras de horquilla y servir como origen de la replicación del ADN viral. Físicamente, el virión del parvovirus no está envuelto y su cápside icosaédrica tiene, aproximadamente, 20 nm de diámetro.

Hasta la fecha, se han identificado ocho AAV serológicamente distintos y cinco se han aislado de seres humanos o primates y se denominan AAV de tipo 1-5. Govindasamy et al., “Structurally Mapping the Diverse Phenotype of Adeno-Associated Virus Serotype 4”, J. Vir., 80 (23): 11556-11570 (2006). El genoma de AAV2 tiene una longitud de 4680 nucleótidos y contiene dos marcos de lectura abiertos (ORF, del inglés open reading frame). El ORF izquierdo codifica las proteínas Rep no estructurales, Rep 40, Rep 52, Rep 68 y Rep 78, que participan en la regulación de la replicación y la transcripción además de en la producción de genomas de progenie monocatenarios. Además, dos de las proteínas Rep se han asociado con la integración preferencial de genomas de AAV en una región del brazo q del cromosoma 19 humano. También se ha demostrado que Rep68/78 posee actividad de unión a NTP, así como actividades de helicasa de ADN y ARN. Las proteínas Rep poseen una señal de localización nuclear, así como diversos sitios de fosforilación potenciales. La mutación de uno de estos sitios de quinasa dio como resultado una pérdida de actividad de replicación.

Los extremos del genoma son repeticiones terminales invertidas (ITR) cortas que tienen el potencial de plegarse para dar estructuras de horquilla en forma de T que sirven como origen de la replicación del ADN viral. Dentro de la región de ITR se han dado a conocer dos elementos que son fundamentales para la función de las ITR, un motivo de repetición GAGC y el sitio de resolución terminal (trs, del inglés terminal resolution site). Se ha demostrado que el motivo de repetición se une a Rep cuando la ITR está en una conformación lineal o de horquilla. Esta unión sirve para posicionar Rep68/78 para la escisión en el trs que se produce de una manera específica de sitio y cadena. Además de su papel en la replicación, estos dos elementos parecen ser fundamentales para la integración viral. Dentro del locus de integración del cromosoma 19 hay un sitio de unión a Rep con un trs adyacente. Se ha demostrado que estos elementos son funcionales y necesarios para la integración específica del locus.

El virión de AAV2 es una partícula icosaédrica sin envoltura de, aproximadamente, 25 nm de diámetro, que consiste en tres proteínas relacionadas denominadas VP1, VP2 y VP3. El ORF derecho codifica las proteínas de la cápside VP1, v P2 y VP3. Estas proteínas se encuentran en una proporción de 1:1:10, respectivamente, y todas se derivan del ORF derecho. Las proteínas de la cápside se diferencian entre sí por la utilización de un corte y empalme alternativo y un codón de inicio inusual. El análisis de deleción ha demostrado que la eliminación o alteración de VP1, que se traduce a partir de un mensaje sometido a corte y empalme alternativo, da como resultado un rendimiento reducido de partículas infecciosas. Las mutaciones dentro de la región codificante de VP3 dan como resultado la imposibilidad de producir ADN de progenie monocatenario o partículas infecciosas. Una partícula de AAV2 es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de AAV2. Un polipéptido de la cápside de AAV2 puede codificar todo el polipéptido VP1, VP2 y VP3. La partícula puede ser una partícula que comprende AAV2 y otras proteínas de la cápside de AAV (es decir, una proteína quimérica, tal como AAV4 y AAV2). En la presente memoria descriptiva se contemplan variaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de AAV2, siempre que la partícula viral resultante que comprende la cápside de AAV2 permanezca antigénica o inmunológicamente distinta de AAV4, tal como se puede determinar de forma rutinaria mediante procedimientos convencionales. Específicamente, por ejemplo, se pueden utilizar ELISA y transferencias de tipo Western para determinar si una partícula viral es antigénica o inmunológicamente distinta de AAV4. Además, la partícula viral de AAV2 retiene, preferentemente, un tropismo tisular distinto de AAV4.

Una partícula de AAV2 es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de AAV2. Un polipéptido de la cápside de AAV2 que codifica todo el polipéptido VP1, VP2 y VP3 puede tener, en general, como mínimo, aproximadamente, un 63 % de homología (o identidad) con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos expuestos en la SEQ ID NO: 1 (proteína de la cápside de AAV2). La proteína de la cápside puede tener, aproximadamente, un 70 % de homología, aproximadamente, un 75 % de homología, un 80 % de homología, un 85 % de homología, un 90 % de homología, un 95 % de homología, un 98 % de homología, un 99 % de homología o incluso un 100 % de homología con la proteína expuesta en la SEQ ID NO: 1. La proteína de la cápside puede tener, aproximadamente, un 70 % de identidad, aproximadamente, un 75 % de identidad, un 80 % de identidad, un 85 % de identidad, un 90 % de identidad, un 95 % de identidad, un 98 % de identidad, un 99 % de identidad o incluso un 100 % de identidad con la proteína mostrada en la SEQ ID NO: 1. La partícula puede ser una partícula que comprende tanto la proteína de la cápside de AAV4 como la de AAV2, es decir, una proteína quimérica. En la presente memoria descriptiva se contemplan variaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de AAV2, siempre que la partícula viral resultante que comprende la cápside de AAV2 permanezca antigénica o inmunológicamente distinta de la AAV4, tal como se puede determinar de forma rutinaria mediante procedimientos convencionales. Específicamente, por ejemplo, se pueden utilizar ELISA y transferencias de tipo Western para determinar si una partícula viral es antigénica o inmunológicamente distinta de AAV4. Además, la partícula viral de AAV2 retiene, preferentemente, un tropismo tisular distinto de AAV4, tal como se ejemplifica en los ejemplos de la presente memoria descriptiva, aunque una partícula de AAV2 quimérica que comprende, como mínimo, una proteína de la cubierta de AAV2 puede tener un tropismo tisular diferente al de una partícula de AAV2 que consiste solo en proteínas de la cubierta de AAV2.

Tal como se indica en las figuras 6A y 6B, la secuencia de la cápside de AAV2 y la secuencia de la cápside de AAV4 son, aproximadamente, un 60 % homólogas. En determinados aspectos, la cápside de AAV2 comprende (o consiste en) una secuencia que es, como mínimo, un 65 % homóloga a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1.

Se da a conocer una partícula de AAV2 que contiene, es decir, que encapsida, un vector que comprende un par de repeticiones terminales invertidas de AAV2. La secuencia de nucleótidos de las ITR de AAV2 es conocida en la técnica. Además, la partícula puede ser una partícula que comprende tanto la proteína de la cápside de AAV4 como la de AAV2, es decir, una proteína quimérica. Además, la partícula puede ser una partícula que encapsida un vector que comprende un par de repeticiones terminales invertidas de a Av de otros a Av (por ejemplo, AAV1-AAV8). El vector encapsidado en la partícula puede comprender, además, un ácido nucleico exógeno insertado entre las repeticiones terminales invertidas.

Las siguientes características de AAV lo han convertido en un vector atractivo para la transferencia génica. Se ha demostrado in vitro que los vectores de AAV se integran de forma estable en el genoma celular; poseen una amplia gama de huéspedes; se transducen in vitro e in vivo en células en división y no en división y mantienen niveles de expresión elevados de los genes transducidos. Las partículas virales son termoestables, resistentes a disolventes, detergentes, cambios de pH, temperatura y se pueden concentrar en gradientes de CsCl. La integración del provirus de AAV no está asociada con ningún efecto negativo a largo plazo sobre el crecimiento o la diferenciación celular. Se ha demostrado que las ITR son los únicos elementos en cis necesarios para la replicación, el empaquetamiento y la integración y pueden contener algunas actividades promotoras.

Se dan a conocer procedimientos para administrar partículas de AAV, vectores de AAV recombinantes y viriones de AAV recombinantes. Por ejemplo, una partícula de AAV2 es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de AAV2, o una partícula de AAV4 es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de a AV4. Un vector de AAV2 recombinante es una construcción de ácido nucleico que comprende, como mínimo, un ácido nucleico único de AAV2. Un virión de AAV2 recombinante es una partícula que contiene un vector de AAV2 recombinante. Para estar considerado dentro de la expresión “ITR de AAV2”, la secuencia de nucleótidos debe conservar una o ambas características descritas en la presente memoria descriptiva que distinguen a la ITR de AAV2 de la ITR de AAV4: (1) tres (en lugar de cuatro como en AAV4) repeticiones “GAGC” y (2) en el sitio de unión a Rep de AAV2 ITR, el cuarto nucleótido en las dos primeras repeticiones “GAGC” es una C en lugar de una T.

El promotor puede ser cualquier promotor deseado, seleccionado mediante consideraciones conocidas, tales como el nivel de expresión de un ácido nucleico unido funcionalmente al promotor y el tipo de célula en la que se va a utilizar el vector. Los promotores pueden ser un promotor exógeno o endógeno. Entre los promotores se pueden incluir, por ejemplo, promotores fuertes conocidos, tales como SV40 o el promotor de la metalotioneína inducible, o un promotor de AAV, tal como un promotor p5 de AAV. Entre los ejemplos adicionales de promotores se incluyen promotores derivados de genes de actina, genes de inmunoglobulina, citomegalovirus (CMV), adenovirus, virus del papiloma bovino, promotores adenovirales, tales como el promotor tardío principal adenoviral, un promotor de choque térmico inducible, virus sincitial respiratorio, virus del sarcoma de Rous (RSV, del inglés Rous sarcoma virus), etc. Específicamente, el promotor puede ser un promotor p5 de AAV2 o un promotor p5 de AAV4. Además, los fragmentos más pequeños del promotor p5 que conservan la actividad del promotor se pueden determinar fácilmente mediante procedimientos convencionales, entre los que se incluyen, por ejemplo, construir una serie de deleciones en el promotor p5, vincular la deleción a un gen indicador y determinar si el gen indicador se expresa, es decir, se transcribe y/o traduce.

El vector de AAV puede comprender, además, un ácido nucleico exógeno (heterólogo) unido funcionalmente al promotor. Por “ácido nucleico heterólogo” se entiende que cualquier ácido nucleico heterólogo o exógeno se puede insertar en el vector para transferirlo a una célula, un tejido u organismo. Por ejemplo, en determinados aspectos, el ácido nucleico heterólogo codifica una isoforma de ApoE protectora. Por “unido funcionalmente” se entiende que el promotor puede fomentar la expresión del ácido nucleico heterólogo, tal como se conoce en la técnica, tal como la orientación apropiada del promotor con respecto al ácido nucleico heterólogo. Además, el ácido nucleico heterólogo tiene, preferentemente, todas las secuencias apropiadas para la expresión del ácido nucleico, tal como se conoce en la técnica, para codificar funcionalmente, es decir, permitir que se exprese el ácido nucleico. El ácido nucleico puede incluir, por ejemplo, secuencias de control de expresión, tales como un potenciador, y sitios de procesamiento de información necesarios, tales como sitios de unión al ribosoma, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras de la transcripción. El ácido nucleico puede codificar más de un producto génico, limitado únicamente por el tamaño del ácido nucleico que se puede empaquetar.

Una partícula de AAV2 es una partícula viral que comprende una proteína de la cápside de AAV2. En la presente memoria descriptiva se contemplan variaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápside de AAV2, siempre que la partícula viral resultante que comprende la cápside de AAV2 permanezca antigénica o inmunológicamente distinta de AAV4, tal como se puede determinar de forma rutinaria mediante procedimientos convencionales. Específicamente, por ejemplo, se pueden utilizar ELISA y transferencias de tipo Western para determinar si una partícula viral es antigénica o inmunológicamente distinta de otros serotipos de a Av .

AAV4 es un miembro único de la familia de AAV. Se da a conocer una discusión de AAV4 en la Patente US6,468,524. Los datos de hibridación de ADN indicaron un nivel similar de homología para AAV1-4. Sin embargo, a diferencia de los otros AAV, solo se identificó un ORF correspondiente a las proteínas de la cápside en AAV4 y no se detectó ORF para las proteínas Rep. Se da a conocer un vector que comprende el virus AAV4 así como partículas virales AAV4. Si bien AAV4 es similar a AAV2, se descubre en la presente memoria descriptiva que los dos virus son física y genéticamente distintos. Estas diferencias dotan al AAV4 de algunas ventajas únicas que lo adaptan mejor como vector para la terapia génica. Por ejemplo, el genoma de AAV4 de tipo salvaje es más grande que AAV2, lo que permite la encapsidación eficiente de un genoma recombinante más grande. Además, las partículas de AAV4 de tipo salvaje tienen una densidad de flotación mayor que las partículas de AAV2 y, por lo tanto, se separan más fácilmente del virus auxiliar contaminante y las partículas de AAV vacías que las partículas basadas en ^aAV2. Además, a diferencia de AAV1, AAV2 y AAV3, AAV4 es capaz de hemaglutinar eritrocitos humanos, de cobaya y de oveja.

Se da a conocer un vector que comprende el virus AAV5 o un vector que comprende subpartes del virus, así como partículas virales de AAV5. Se proporciona una discusión de AAV5 en la Patente US6,855,314. Si bien AAV5 es similar a AAV2, se descubre en la presente memoria descriptiva que los dos virus son física y genéticamente distintos. Estas diferencias dotan al AAV5 de algunas propiedades y ventajas únicas que lo adaptan mejor como vector para la terapia génica. Por ejemplo, una de las características limitantes de la utilización de AAV2 como vector para la terapia génica es la producción de grandes cantidades de virus. Utilizando técnicas de producción convencionales, ^aAV5 se produce a un nivel de 10 a 50 veces más elevado en comparación con AAV2. Debido a su sitio TRS y proteínas Rep únicos, AAV5 también debería tener un locus de integración distinto en comparación con AAV2.

Además, la proteína de la cápside de AAV5, de nuevo sorprendentemente, es distinta de la proteína de la cápside de AAV2 y muestra un tropismo tisular diferente, lo que hace que las partículas que contienen la cápside de AAV5 sean adecuadas para transducir tipos de células para los que AAV2 no es adecuado o es menos adecuado. Se ha demostrado que AAV2 y AAV5 son serológicamente distintos y, por lo tanto, en una aplicación de terapia génica, AAV5, y los vectores de derivados de AAV5, permitirían la transducción de un paciente que ya posee anticuerpos neutralizantes contra AAV2 como resultado de una defensa inmunológica natural o por exposición previa a vectores de AAV2. Otra ventaja de AAV5 es que AAV5 no puede ser rescatado por otros serotipos. Solo AAV5 puede rescatar el genoma de AAV5 integrado y efectuar la replicación, evitando de este modo la replicación no intencionada de AAV5 provocada por otros serotipos de AAV.

El término “polipéptido”, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se refiere a un polímero de aminoácidos e incluye proteínas de longitud completa y fragmentos de las mismas. De este modo, “proteína”, “polipéptido” y “péptido” se utilizan a menudo de forma intercambiable en la presente memoria descriptiva. Las sustituciones se pueden seleccionar mediante parámetros conocidos para que sean neutras. Tal como apreciarán los expertos en la materia, la presente invención también incluye aquellos polipéptidos que tienen ligeras variaciones en las secuencias de aminoácidos u otras propiedades. Estas variaciones pueden surgir naturalmente como variaciones alélicas (por ejemplo, debido a polimorfismo genético) o se pueden producir por intervención humana (por ejemplo, por mutagénesis de secuencias de ADN clonadas), tales como mutantes puntuales, de deleción, inserción y sustitución inducidos. En general, son preferentes cambios menores en la secuencia de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos, pequeñas deleciones o inserciones internas y adiciones o deleciones en los extremos de las moléculas. Estas modificaciones pueden dar como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, proporcionar mutaciones silenciosas, modificar un sitio de restricción o proporcionar otras mutaciones específicas.

Se da a conocer un procedimiento para administrar un ácido nucleico a una célula, que comprende administrar a la célula una partícula de AAV que contiene un vector que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV o adyacente a una o más ITR de AAV, administrando de este modo el ácido nucleico a la célula. La administración a la célula se puede realizar mediante cualquier medio, incluido simplemente poniendo en contacto la partícula, opcionalmente contenida en un líquido deseado, tal como medio de cultivo de tejidos, o una solución salina tamponada, con las células. Se puede permitir que la partícula permanezca en contacto con las células durante cualquier período de tiempo deseado y, normalmente, la partícula se administra y se deja que permanezca indefinidamente. Para estos procedimientos in vitro, el virus se puede administrar a la célula mediante procedimientos convencionales de transducción viral, tal como se conoce en la técnica y tal como se ejemplifica en la presente memoria descriptiva. Los títulos de virus a administrar pueden variar, particularmente dependiendo del tipo de célula, pero normalmente serán los utilizados para la transducción de AAV en general. Además, se pueden utilizar los títulos utilizados para transducir las células particulares en los presentes ejemplos. Entre las células se pueden incluir cualquier célula deseada en seres humanos, así como en otros mamíferos grandes (no roedores), tales como primates, caballos, ovejas, cabras, cerdos y perros.

Más específicamente, se da a conocer un procedimiento para administrar un ácido nucleico a una célula ependimaria, que comprende administrar a la célula ependimaria una partícula de AAV que contiene un vector que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV o adyacente a una o más ITR de AAV, administrando de este modo el ácido nucleico a la célula ependimaria.

También se da a conocer un procedimiento para administrar un ácido nucleico a un individuo, que comprende administrar a una célula del individuo una partícula de AAV que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV o adyacente a una o más ITR de AAV, y devolver la célula al individuo, administrando de este modo el ácido nucleico al individuo. En determinados aspectos, las ITR de AAV pueden ser ITR de AAV2. Para esta administración ex vivo, las células se aíslan de un individuo por medios convencionales, según el tipo de célula, y se colocan en un medio de cultivo apropiado, de nuevo según el tipo de célula. A continuación, las partículas virales se ponen en contacto con las células, tal como se ha descrito anteriormente, y se deja que el virus transfecte las células. A continuación, las células se pueden trasplantar de nuevo al cuerpo del individuo, de nuevo por medios convencionales para el tipo de célula y tejido. Si se desea, antes del trasplante, las células se pueden estudiar para determinar el grado de transfección por el virus, mediante medios de detección conocidos y tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

Se da a conocer además un procedimiento para administrar un ácido nucleico a una célula en un individuo, que comprende administrar al individuo una partícula de AAV que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV o adyacente a una o más ITR de AAV, administrando de este modo el ácido nucleico a una célula del individuo. La administración puede ser una administración ex vivo directamente a una célula extraída de un individuo, tal como cualquiera de las células enumeradas anteriormente, seguida de la sustitución de la célula de nuevo al individuo, o la administración puede ser una administración in vivo a una célula del individuo. Para la administración ex vivo, las células se aíslan de un individuo por medios convencionales, según el tipo de célula, y se colocan en un medio de cultivo apropiado, de nuevo según el tipo de célula. A continuación, las partículas virales se ponen en contacto con las células, tal como se ha descrito anteriormente, y se deja que el virus transfecte las células. A continuación, las células se pueden trasplantar de nuevo al cuerpo del individuo, de nuevo por medios convencionales para el tipo de célula y tejido. Si se desea, antes del trasplante, las células se pueden estudiar para determinar el grado de transfección por el virus, mediante medios de detección conocidos y tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

También se da a conocer un procedimiento para administrar un ácido nucleico a una célula ependimaria en un individuo, que comprende administrar al individuo una partícula de AAV que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV o adyacente a una o más ITR de AAV, administrando de este modo el ácido nucleico a una célula ependimaria del individuo.

En determinados aspectos, la secuencia de aminoácidos que se dirige al endotelio vascular cerebral se dirige al endotelio vascular cerebral en un individuo que tiene una enfermedad, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer. En determinados aspectos, la secuencia de aminoácidos que se dirige al endotelio vascular cerebral se dirige al endotelio vascular cerebral en un individuo que no tiene la enfermedad de Alzheimer.

En determinados aspectos, el vector viral comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un agente terapéutico. En determinados aspectos, el agente terapéutico es una isoforma de ApoE protectora.

Se da a conocer una célula que comprende un vector viral tal como se describe en la presente memoria descriptiva. En determinados aspectos, la célula es una célula de mamífero de un mamífero no roedor. En determinados aspectos, la célula es una célula de primate. En determinados aspectos, la célula es una célula humana. En determinados aspectos, la célula es una célula no humana. En determinados aspectos, la célula está in vitro. En determinados aspectos, la célula está in vivo. En determinados aspectos, la célula es una célula ependimaria.

Se da a conocer un procedimiento para tratar una enfermedad en un mamífero, que comprende administrar un vector viral o la célula al mamífero tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

En determinados aspectos, el mamífero es un ser humano.

Se da a conocer un procedimiento para administrar un agente al sistema nervioso central de un individuo, que comprende administrar al LCR con un vector viral descrito en la presente memoria descriptiva de modo que las células ependimarias transducidas expresen el agente terapéutico y lo administren al sistema nervioso central del individuo. En determinados aspectos, el vector viral transduce células ependimarias.

Se da a conocer un vector o una célula viral, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, para su utilización en tratamientos médicos.

Se da a conocer una utilización de un vector o célula viral, tal como se describe en la presente memoria descriptiva, para preparar un medicamento útil para tratar una enfermedad, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, en un mamífero.

El vector puede comprender, además, una proteína isoforma de ApoE protectora. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión “proteína secretada” incluye cualquier proteína secretada, ya sea secretada naturalmente o modificada para contener una secuencia señal de modo que se pueda secretar.

El ácido nucleico está “unido operativamente” cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. En general, “unido operativamente” significa que las secuencias de ADN que se unen son contiguas. Sin embargo, los potenciadores no tienen por qué ser contiguos. La unión se consigue mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, se utilizan los adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos, según la práctica convencional. Además, múltiples copias del ácido nucleico que codifica enzimas se pueden unir conjuntamente en el vector de expresión. Estos ácidos nucleicos múltiples pueden estar separados por ligadores.

También se da a conocer una célula de mamífero que contiene un vector descrito en la presente memoria descriptiva. La célula puede ser humana y puede ser del cerebro. El tipo de célula puede ser una población de células madre o progenitoras.

Se da a conocer un procedimiento para tratar una enfermedad, tal como una enfermedad genética o cáncer, en un mamífero mediante la administración de un polinucleótido, polipéptido, vector de expresión o célula descritos en la presente memoria descriptiva. La enfermedad genética puede ser una enfermedad neurodegenerativa, tal como la enfermedad de Alzheimer.

Determinados aspectos de la presente invención se refieren a polinucleótidos, polipéptidos, vectores y células manipuladas genéticamente (modificadas in vivo) y a la utilización de los mismos. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para la terapia génica o proteica que es capaz de la administración sistémica de una dosis terapéuticamente eficaz del agente terapéutico.

Según un aspecto, se da a conocer un sistema de expresión celular para expresar un agente terapéutico en un receptor mamífero. El sistema de expresión (también denominado en la presente memoria descriptiva “célula modificada genéticamente”) comprende una célula y un vector de expresión para expresar el agente terapéutico. Entre los vectores de expresión se incluyen, sin constituir limitación, virus, plásmidos y otros vehículos para administrar material genético heterólogo a las células. Por consiguiente, la expresión “vector de expresión”, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se refiere a un vehículo para administrar material genético heterólogo a una célula. En particular, el vector de expresión es un vector adenoviral recombinante, de virus adenoasociado o lentivirus o retrovirus.

El vector de expresión incluye, además, un promotor para controlar la transcripción del gen heterólogo. El promotor puede ser un promotor inducible (descrito a continuación). El sistema de expresión es adecuado para la administración al receptor mamífero. El sistema de expresión puede comprender una pluralidad de células modificadas genéticamente no inmortalizadas, conteniendo cada célula, como mínimo, un gen recombinante que codifica, como mínimo, un agente terapéutico.

El sistema de expresión celular se puede formar in vivo. Según otro aspecto adicional, se da a conocer un procedimiento para tratar a un receptor mamífero in vivo. El procedimiento incluye la introducción de un vector de expresión para expresar un producto génico heterólogo en una célula del paciente in situ, por ejemplo, mediante administración intravenosa. Para formar el sistema de expresión in vivo, se introduce un vector de expresión para expresar el agente terapéutico in vivo en el receptor mamífero por vía i.v., en el que el vector migra a través de la vasculatura al cerebro.

Según otro aspecto adicional, se da a conocer un procedimiento para tratar a un receptor mamífero in vivo. El procedimiento incluye la introducción de la proteína diana en el paciente in vivo.

El vector de expresión para expresar el gen heterólogo puede incluir un promotor inducible para controlar la transcripción del producto génico heterólogo. Por consiguiente, la administración del agente terapéutico in situ se controla exponiendo la célula in situ a condiciones que inducen la transcripción del gen heterólogo.

El mamífero receptor puede tener una afección que sea susceptible de terapia de sustitución génica. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la “terapia de sustitución génica” se refiere a la administración al receptor de material genético exógeno que codifica un agente terapéutico y la expresión posterior del material genético administrado in situ. De este modo, la expresión “afección susceptible de terapia de sustitución génica” abarca afecciones tales como enfermedades genéticas (es decir, una afección patológica que es atribuible a uno o más defectos genéticos), patologías adquiridas (es decir, una afección patológica que no es atribuible a un defecto congénito), cánceres y procesos profilácticos (es decir, prevención de una enfermedad o de una afección médica no deseada). Por consiguiente, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente o material que tenga un efecto beneficioso sobre el receptor mamífero. De este modo, “agente terapéutico” abarca tanto moléculas terapéuticas como profilácticas que tienen componentes de ácidos nucleicos o proteicos.

Según un aspecto, el mamífero receptor tiene una enfermedad genética y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente terapéuti

receptor mamífero tiene una patología adquirida y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente terapéuti

genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente antineoplásico. En otro aspecto adicional, el paciente tiene una afección médica no deseada y el material genético exógeno comprende un gen heterólogo que codifica un agente terapéuti

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión “una isoforma de ApoE protectora” incluye variantes o fragmentos biológicamente activos o inactivos de este polipéptido. Una “variante” de uno de los polipéptidos es un polipéptido que no es completamente idéntico a una proteína nativa. Esta proteína variante se puede obtener alterando la secuencia de aminoácidos por inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos. La secuencia de aminoácidos de la proteína se modifica, por ejemplo, mediante sustitución, para crear un polipéptido que tiene sustancialmente las mismas o mejores cualidades en comparación con el polipéptido nativo. La sustitución puede ser una sustitución conservadora. Una “sustitución conservadora” es una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Una sustitución conservadora sería una sustitución por un aminoácido que produce el menor cambio posible en la carga del aminoácido o el tamaño de la cadena lateral del aminoácido (alternativamente, en el tamaño, la carga o el tipo de grupo químico dentro de la cadena lateral), de manera que el péptido global conserva su conformación espacial, pero tiene una actividad biológica alterada. Por ejemplo, los cambios conservadores comunes pueden ser Asp por Glu, Asn o Gln; His por Lys, Arg o Phe; Asn por Gln, Asp o Glu y Ser por Cys, Thr o Gly. La alanina se utiliza comúnmente para sustituir otros aminoácidos. Los 20 aminoácidos esenciales se pueden agrupar de la siguiente manera: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina, que tienen cadenas laterales apolares; glicina, serina, treonina, cistina, tirosina, asparagina y glutamina, que tienen cadenas laterales polares no cargadas; aspartato y glutamato, que tienen cadenas laterales ácidas; y lisina, arginina e histidina, que tienen cadenas laterales básicas. Los cambios de aminoácidos se consiguen cambiando los codones de la secuencia de ácido nucleico correspondiente. Se sabe que estos polipéptidos se pueden obtener en base a la sustitución de determinados aminoácidos por otros aminoácidos en la estructura del polipéptido con el fin de modificar o mejorar la actividad biológica. Por ejemplo, mediante la sustitución de aminoácidos alternativos, se pueden conferir pequeños cambios conformacionales a un polipéptido que da como resultado una actividad aumentada. Alternativamente, se pueden utilizar sustituciones de aminoácidos en determinados polipéptidos para proporcionar residuos que posteriormente se pueden unir a otras moléculas para proporcionar conjugados de péptido-molécula que conservan suficientes propiedades del polipéptido de partida para ser útiles para otros fines.

Se puede utilizar el índice hidropático de aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a un polipéptido, en el que se descubre que determinados aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen índices hidropáticos similares y aún conservan una actividad biológica similar. Alternativamente, la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar en base a la hidrofilicidad, particularmente cuando la función biológica en el polipéptido que se desea generar está destinada a su utilización en aspectos inmunológicos. El mayor promedio de hidrofilicidad local de una “proteína”, tal como está gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad. Por consiguiente, se observa que se pueden realizar sustituciones basándose en la hidrofilicidad asignada a cada aminoácido.

Al utilizar el índice de hidrofilicidad o el índice hidropático, que asigna valores a cada aminoácido, es preferente realizar sustituciones de aminoácidos en las que estos valores sean ± 2, siendo ± 1 particularmente preferente, y siendo aquellos con ± 0,5 las sustituciones más preferentes.

La proteína variante tiene, como mínimo, un 50 %, como mínimo, aproximadamente, un 80 %, o incluso, como mínimo, aproximadamente, un 90 % pero menos del 100 %, de homología o identidad de secuencia de aminoácidos contiguos con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa correspondiente.

La secuencia de aminoácidos del polipéptido variante corresponde esencialmente a la secuencia de aminoácidos del polipéptido nativo. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “corresponde esencialmente a” se refiere a una secuencia polipeptídica que provocará una respuesta biológica sustancialmente igual a la respuesta generada por la proteína nativa. Esta respuesta puede ser, como mínimo, el 60 % del nivel generado por la proteína nativa, e incluso puede ser, como mínimo, el 80 % del nivel generado por la proteína nativa.

Una variante puede incluir residuos de aminoácidos no presentes en la proteína nativa correspondiente o deleciones con respecto a la proteína nativa correspondiente. Una variante también puede ser un “fragmento” truncado en comparación con la proteína nativa correspondiente, es decir, solo una parte de una proteína de longitud completa. Las variantes de proteínas también incluyen péptidos que tienen, como mínimo, un D-aminoácido.

La proteína variante se puede expresar a partir de una secuencia de ADN aislada que codifica la proteína variante. “Recombinante” se define como un péptido o ácido nucleico producido por los procesos de ingeniería genética. Cabe señalar que es bien conocido en la técnica que, debido a la redundancia en el código genético, los nucleótidos individuales se pueden intercambiar fácilmente en un codón y aun así dar como resultado una secuencia de aminoácidos idéntica. Los términos “proteína”, “péptido” y “polipéptido” se utilizan de manera intercambiable en la presente memoria descriptiva.

Se dan a conocer procedimientos para tratar una enfermedad en un mamífero mediante la administración de un vector de expresión a una célula o a un paciente. Para los procedimientos de terapia génica, un experto en la materia de la biología molecular y terapia génica podría determinar, sin experimentación indebida, las dosis y vías de administración apropiadas del vector de expresión utilizado en los procedimientos novedosos de la presente invención.

Según un aspecto, las células se transforman o se modifican genéticamente de otro modo in vivo. Las células del receptor mamífero se transforman (es decir, se transducen o transfectan) in vivo con un vector que contiene material genético exógeno para expresar un gen heterólogo (por ejemplo, recombinante) que codifica un agente terapéutico y el agente terapéutico se administra in situ.

Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “material genético exógeno” se refiere a un ácido nucleico o a un oligonucleótido, ya sea natural o sintético, que no se encuentra naturalmente en las células; o si se encuentra naturalmente en las células, las células no lo transcriben ni lo expresan a niveles biológicamente significativos. De este modo, “material genético exógeno” incluye, por ejemplo, un ácido nucleico no natural que se puede transcribir en ARN antisentido, así como un “gen heterólogo” (es decir, un gen que codifica una proteína que no se expresa o se expresa a niveles biológicamente insignificantes en una célula natural del mismo tipo).

En determinados aspectos, el receptor mamífero tiene una afección que es susceptible de terapia de sustitución génica. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “terapia de sustitución génica” se refiere a la administración al receptor de material genético exógeno que codifica un agente terapéutico y la expresión posterior del material genético administrado in situ. Por lo tanto, la expresión “afección susceptible de terapia de sustitución génica” abarca afecciones tales como enfermedades genéticas (es decir, una afección patológica que es atribuible a uno o más defectos genéticos), patologías adquiridas (es decir, una afección patológica que no es atribuible a un defecto congénito), cánceres y procesos profilácticos (es decir, prevención de una enfermedad o de una afección médica no deseada). Por consiguiente, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión “agente terapéutico” se refiere a cualquier agente o material que tenga un efecto beneficioso sobre el receptor mamífero. De este modo, “agente terapéutico” abarca moléculas tanto terapéuticas como profilácticas que tienen componentes de ácidos nucleicos (por ejemplo, ARN antisentido) y/o proteicos.

Alternativamente, la afección susceptible de terapia de sustitución génica es un proceso profiláctico, es decir, un proceso para prevenir una enfermedad o una afección médica no deseada. De este modo, la presente invención abarca un sistema de expresión celular para administrar un agente terapéutico que tiene una función profiláctica (es decir, un agente profiláctico) al receptor mamífero.

En resumen, la expresión “agente terapéutico” incluye, sin constituir limitación, agentes asociados con las afecciones enumeradas anteriormente, así como sus equivalentes funcionales. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, la expresión “equivalente funcional” se refiere a una molécula (por ejemplo, un péptido o una proteína) que tiene el mismo efecto beneficioso o mejorado sobre el receptor mamífero que el agente terapéutico del cual se considera un equivalente funcional.

Los agentes terapéuticos y las afecciones susceptibles de terapia de sustitución génica descritos anteriormente son meramente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención. Se considera que la selección de un agente terapéutico adecuado para tratar una afección conocida está dentro del alcance de un experto en la materia sin experimentación indebida.

Vectores de AAV

En un aspecto, un vector viral de la presente invención es un vector de AAV. Un vector de “AAV” se refiere a un virus adenoasociado, y se puede utilizar para referirse al virus natural de tipo salvaje en sí mismo o sus derivados. El término cubre todos los subtipos, serotipos y pseudotipos, y formas tanto naturales como recombinantes, excepto cuando se requiera lo contrario. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término “serotipo” se refiere a un AAV que se identifica y se distingue de otros AAV basándose en la reactividad de la proteína de la cápside con antisueros definidos, por ejemplo, hay ocho serotipos conocidos de AAV de primate, ^aA^v-1 a AAV-8. Por ejemplo, el serotipo AAV2 se utiliza para referirse a un AAV que contiene proteínas de la cápside codificadas por el gen cap de AAV2 y un genoma que contiene secuencias de ITR en 5’ y 3’ del mismo serotipo de AAV2. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, por ejemplo, rAAV se puede utilizar para referirse a un AAV que tiene tanto proteínas de la cápside como ITR en 5’-3’ del mismo serotipo, o se puede referir a un AAV que tiene proteínas de la cápside de un serotipo e ITR en 5’-3’ de un serotipo de ^aA^vdiferente, por ejemplo, cápside del serotipo 2 de AAV e ⁱT^rdel serotipo 5 de AAV. Para cada ejemplo ilustrado en la presente memoria descriptiva, la descripción del diseño y la producción del vector describe el serotipo de la cápside y las secuencias de ITR en 5’-3’. La abreviatura “rAAV” se refiere a un virus adenoasociado recombinante, también denominado vector de AAV recombinante (o “vector de rAAV”).

Un “virus AAV” o “partícula viral de AAV” se refiere a una partícula viral compuesta por, como mínimo, una proteína de la cápside de AAV (preferentemente, por todas las proteínas de la cápside de un AAV de tipo salvaje) y un polinucleótido encapsidado. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma de AAV de tipo salvaje, tal como un transgén para ser administrado a una célula de mamífero), normalmente se denomina “rAAV”.

En un aspecto, los vectores de expresión de AAV se construyen utilizando técnicas conocidas para proporcionar, como mínimo, como componentes unidos operativamente en la dirección de la transcripción, elementos de control que incluyen una región de inicio de la transcripción, el ADN de interés y una región de terminación de la transcripción. Los elementos de control se seleccionan para que sean funcionales en una célula de mamífero. La construcción resultante que contiene los componentes unidos operativamente está flanqueada (5’ y 3’) con secuencias de ITR de AAV funcionales.

Por “repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociado” o “ITR de AAV” se entiende las regiones reconocidas en la técnica que se encuentran en cada extremo del genoma de AAV que funcionan juntas en cis como orígenes de la replicación del ADN y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITR de AAV, junto con la región codificante de rep de AAV, proporcionan la escisión y el rescate eficaces, y la integración de una secuencia de nucleótidos interpuesta entre dos ⁱT^rflanqueantes en un genoma de células de mamífero.

Se conocen las secuencias de nucleótidos de las regiones de ITR de AAV. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, una “ITR de AAV” no necesita tener la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje representada, pero se puede alterar, por ejemplo, mediante la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos. Además, las ITR de AAV se pueden derivar de cualquiera de diversos serotipos de AAV, entre los que se incluyen, sin constituir limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, etc. Además, las It R en 5’ y 3’ que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de AAV no necesitan ser necesariamente idénticas o derivadas del mismo serotipo o aislado de AAV, siempre que funcionen según lo previsto, es decir, que permitan la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un vector o genoma de la célula huésped, y que permitan la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la célula receptora cuando los productos del gen Rep de AAV están presentes en la célula.

En un aspecto, las ITR de AAV se pueden derivar de cualquiera de los diversos serotipos de AAV, entre los que se incluyen, sin constituir limitación, Aa V1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, etc. Además, las ITR en 5’ y 3’ que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de expresión de AAV no necesitan ser necesariamente idénticas o derivadas del mismo serotipo o aislado de AAV, siempre que funcionen según lo previsto, es decir, que permitan la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un genoma o vector de la célula huésped, y que permitan la integración de la molécula de ADN en el genoma de la célula receptora cuando los productos del gen Rep de AAV están presentes en la célula.

En un aspecto, las cápsides de AAV se pueden derivar de AAV2. Las moléculas de ADN adecuadas para su utilización en vectores de AAV tendrán un tamaño de menos de, aproximadamente, 5 kilobases (kb), menos de, aproximadamente, 4,5 kb, menos de, aproximadamente, 4 kb, menos de, aproximadamente, 3,5 kb, menos de, aproximadamente, 3 kb, menos de, aproximadamente, 2,5 kb y son conocidas en la técnica.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos seleccionada está unida operativamente a elementos de control que dirigen la transcripción o expresión de la misma en el individuo in vivo. Estos elementos de control pueden comprender secuencias de control asociadas normalmente con el gen seleccionado. Alternativamente, se pueden utilizar secuencias de control heterólogas. Entre las secuencias de control heterólogas útiles se incluyen, en general, aquellas derivadas de secuencias que codifican genes de mamíferos o virales. Entre los ejemplos se incluyen, sin constituir limitación, el promotor temprano de SV40, el promotor de LTR del virus del tumor mamario de ratón; el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP, del inglés adenovirus major late promote/); un promotor del virus del herpes simple (HSV, del inglés herpes simplex virus), un promotor del citomegalovirus (CMV), tal como la región del promotor temprano inmediato del CMV (CMVIE, del inglés citomegalovirus immediate early), un promotor del virus del sarcoma Rous (RSV, del inglés rous sarcoma virus), promotores pol II, promotores pol III, promotores sintéticos, promotores híbridos y similares. Además, las secuencias derivadas de genes no virales, tales como el gen de la metalotioneína murina, también encontrarán utilización en la presente memoria descriptiva. Estas secuencias promotoras están disponibles en el mercado en, por ejemplo, Stratagene (San Diego, California).

En un aspecto, serán de utilización particular tanto los promotores heterólogos como otros elementos de control, tales como los promotores, potenciadores y similares inducibles y específicos del SNC. Entre los ejemplos de promotores heterólogos se incluye el promotor del CMV. Entre los ejemplos de promotores específicos del SNC se incluyen los aislados de los genes de la proteína básica de mielina (M^bP), la proteína del ácido fibrilar glial (GFAP) y la enolasa específica de neuronas (NSE). Entre los ejemplos de promotores inducibles se incluyen elementos sensibles al ADN para ecdisona, tetraciclina, hipoxia y aufin.

En un aspecto, el vector de expresión de AAV que alberga la molécula de ADN de interés unida por las ITR de AAV se puede construir insertando directamente la secuencia o secuencias seleccionadas en un genoma de AAV del que se han escindido los marcos de lectura abiertos (“ORF”) principales de AAV . También se pueden eliminar otras partes del genoma de AAV, siempre que quede una parte suficiente de las ITR para permitir las funciones de replicación y empaquetamiento. Estas construcciones se pueden diseñar utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.

Alternativamente, las ITR de AAV se pueden escindir del genoma viral o de un vector de AAV que contiene el mismo y fusionarse en 5’ y 3’ de una construcción de ácido nucleico seleccionada que está presente en otro vector utilizando técnicas de ligación convencionales. Por ejemplo, las ligaciones se pueden realizar en Tris-Cl 20 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, BSA 33 |xg/ml, NaCl 10 mM-50 mM y ATP 40 pMI, 0,01-0,02 unidades (Weiss) de ADN ligasa T4 a 0 °C (para ligación de “extremos cohesivos”) o ATP 1 mM, 0,3-0,6 unidades (Weiss) de ADN ligasa T4 a 14 °C (para ligación de “extremos romos”). Las ligaciones intermoleculares de “extremos cohesivos” se realizan habitualmente a concentraciones de ADN total de 30-100 |xg/ml (concentración final total de 5-100 nM). Vectores de AAV que contienen ITR.

Además, se pueden producir genes quiméricos sintéticamente para incluir secuencias de ITR de AAV dispuestas en 5’ y 3’ de una o más secuencias de ácido nucleico seleccionadas. Se pueden utilizar codones preferentes para la expresión de la secuencia del gen quimérico en células del SNC de mamíferos. La secuencia quimérica completa se ensambla a partir de oligonucleótidos superpuestos preparados mediante procedimientos convencionales.

A efectos de producir viriones de rAAV, se introduce un vector de expresión de AAV en una célula huésped adecuada utilizando técnicas conocidas, tal como por transfección. En general, se conocen en la técnica diversas técnicas de transfección. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York. Entre los procedimientos de transfección particularmente adecuados se incluyen coprecipitación con fosfato cálcico, microinyección directa en células cultivadas, electroporación, transferencia génica mediada por liposomas, transducción mediada por lípidos y administración de ácidos nucleicos utilizando microproyectiles de alta velocidad.

En un aspecto, entre las células huésped adecuadas para producir viriones de rAAV se incluyen microorganismos, células de levadura, células de insectos y células de mamíferos, que se pueden utilizar, o se han utilizado, como receptores de una molécula de ADN heteróloga. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. De este modo, una “célula huésped”, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, se refiere, en general, a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógena. Las células de la línea celular humana estable, 293 (disponibles fácilmente a través de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo con el número de registro ATCC CRL1573) se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. En particular, la línea celular humana 293 es una línea celular de riñón embrionario humano que se ha transformado con fragmentos de ADN de adenovirus tipo 5 y expresa los genes adenovirales E1a y Elb. La línea celular 293 se transfecta fácilmente y proporciona una plataforma particularmente conveniente en la que producir viriones de rAAV. Por “región codificante de rep de AAV” se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de replicación Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40. Se ha demostrado que estos productos de expresión de Rep poseen muchas funciones, incluido el reconocimiento, la unión y el corte del origen de la replicación del ADN del AAV, la actividad de la helicasa del ADN y la modulación de la transcripción de los promotores del AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión de Rep se requieren colectivamente para replicar el genoma de AAV. Entre los homólogos adecuados de la región codificante de rep de AAV se incluyen el gen rep del virus del herpes humano 6 (HHV-6, del inglés human herpes virus 6), que también se sabe que media la replicación del ADN de AAV2.

Por “región codificante de cap de AAV” se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de la cápside VP1, VP2 y VP3, u homólogos funcionales de las mismas. Estos productos de expresión de Cap proporcionan las funciones de empaquetamiento que se requieren colectivamente para empaquetar el genoma viral.

En un aspecto, las funciones auxiliares de AAV se introducen en la célula huésped transfectando la célula huésped con una construcción auxiliar de AAV antes de la transfección del vector de expresión de AAV o al mismo tiempo que la misma. De este modo, las construcciones auxiliares de AAV se utilizan para proporcionar, como mínimo, una expresión transitoria de los genes rep y/o cap de AAV para complementar las funciones de AAV faltantes que son necesarias para la infección productiva de ^aA^v. Las construcciones auxiliares de AAV carecen de ITR de ^aA^vy no se pueden replicar ni empaquetar por sí mismas. Estas construcciones pueden estar en forma de plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se han dado a conocer diversas construcciones auxiliares de AAV, tales como los plásmidos de utilización común pAAV/Ad y pIM29+45 que codifican productos de expresión tanto de Rep como de Cap. Se han dado a conocer diversos otros vectores que codifican productos de expresión de Rep y/o de Cap. Entre los procedimientos de administración de vectores virales se incluyen inyectar el AAV en el LCR. En general, los viriones de rAAV se pueden introducir en células del SNC utilizando técnicas de transducción in vivo o in vitro. Si se transduce in vitro, la célula receptora deseada se retirará del individuo, se transducirá con viriones de rAAV y se introducirá de nuevo en el individuo. Alternativamente, se pueden utilizar células singénicas o xenogénicas cuando estas células no generen una respuesta inmunitaria inapropiada en el individuo.

Se han descrito procedimientos adecuados para la administración e introducción de células transducidas en un individuo. Por ejemplo, las células se pueden transducir in vitro combinando viriones de AAV recombinantes con células del SNC, por ejemplo, en un medio apropiado, y cribando aquellas células que albergan el ADN de interés que se puede cribar utilizando técnicas convencionales, tales como transferencias de tipo Southern y/o PCR, o utilizando marcadores seleccionables. A continuación, las células transducidas se pueden formular en composiciones farmacéuticas, que se describen con más detalle a continuación, y la composición se puede introducir en el individuo mediante diversas técnicas, tales como injerto, inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea e intraperitoneal.

En un aspecto, las composiciones farmacéuticas comprenderán suficiente material genético para producir una cantidad terapéuticamente eficaz del ácido nucleico de interés, es decir, una cantidad suficiente para reducir o mejorar los síntomas del estado patológico en cuestión o una cantidad suficiente para conferir el beneficio deseado. Las composiciones farmacéuticas también contendrán un excipiente farmacéuticamente aceptable. Entre estos excipientes se incluyen cualquier agente farmacéutico que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición y que se puedan administrar sin una toxicidad indebida. Entre los excipientes farmacéuticamente aceptables se incluyen, sin constituir limitación, sorbitol, Tween80 y líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Se pueden incluir en las mismas sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Además, pueden estar presentes en estos vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras del pH y similares. Una discusión detallada de los excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Nueva Jersey, 1991).

Tal como resultará evidente para los expertos en la materia a la vista de las enseñanzas de esta memoria descriptiva, se puede determinar empíricamente una cantidad eficaz de vector viral que debe añadirse. La administración se puede efectuar en una dosis, de forma continua o intermitente a lo largo del transcurso del tratamiento. Los procedimientos para determinar los medios y las dosis de administración más eficaces son bien conocidos por los expertos en la materia y variarán según el vector viral, la composición de la terapia, las células diana y el individuo que se esté tratando. Se pueden realizar administraciones únicas y múltiples con el nivel y la pauta de dosis seleccionados por el médico tratante.

Se debe entender que el vector viral administrado podría expresar más de un transgén. Alternativamente, también se pueden administrar al SNC vectores separados, cada uno de los cuales expresa uno o más transgenes diferentes, tal como se describe en la presente memoria descriptiva. Además, también se pretende que los vectores virales administrados mediante los procedimientos de la presente invención se combinen con otras composiciones y terapias adecuadas.

Procedimientos para introducir material genético en las células

El material genético exógeno (por ejemplo, un ADNc que codifica una o más proteínas terapéuticas) se introduce en la célula ex vivo o in vivo mediante procedimientos de transferencia génica, tales como transfección o transducción, para proporcionar una célula modificada genéticamente. Los expertos en la materia conocen diversos vectores de expresión (es decir, vehículos para facilitar la administración de material genético exógeno a una célula diana). Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, “transfección de células” se refiere a la adquisición por parte de una célula de material genético nuevo mediante la incorporación de ADN añadido. De este modo, la transfección se refiere a la inserción de ácido nucleico en una célula utilizando procedimientos físicos o químicos. Los expertos en la materia conocen diversas técnicas de transfección, entre las que se incluyen: coprecipitación de ADN con fosfato cálcico; DEAE-dextrano; electroporación; transfección mediada por liposomas catiónicos; y bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de wolframio. La coprecipitación del ADN con fosfato de estroncio es otro posible procedimiento de transfección.

Por el contrario, la “transducción de células” se refiere al proceso de transferir ácido nucleico a una célula utilizando un virus de ADN o ARN. En la presente memoria descriptiva, un virus de ARN (es decir, un retrovirus) para transferir un ácido nucleico a una célula se denomina retrovirus quimérico transductor. El material genético exógeno contenido en el retrovirus se incorpora al genoma de la célula transducida. Una célula que ha sido transducida con un virus de ADN quimérico (por ejemplo, un adenovirus que porta un ADNc que codifica un agente terapéutico) no tendrá el material genético exógeno incorporado en su genoma, pero será capaz de expresar el material genético exógeno que se retiene de manera extracromosómica dentro de la célula.

Normalmente, el material genético exógeno incluye el gen heterólogo (normalmente en forma de ADNc que comprende los exones que codifican la proteína terapéutica) junto con un promotor para controlar la transcripción del nuevo gen. El promotor tiene, de manera característica, una secuencia de nucleótidos específica necesaria para iniciar la transcripción. Opcionalmente, el material genético exógeno incluye, además, secuencias adicionales (es decir, potenciadores) necesarias para obtener la actividad de transcripción génica deseada. Para los propósitos de la presente discusión, un “potenciador” es simplemente cualquier secuencia de ADN no traducida que trabaja contigua a la secuencia codificante (en cis) para cambiar el nivel de transcripción basal dictado por el promotor. El material genético exógeno se puede introducir en el genoma celular inmediatamente aguas abajo del promotor, de modo que el promotor y la secuencia codificante estén unidos operativamente para permitir la transcripción de la secuencia codificante. Un vector de expresión retroviral puede incluir un elemento promotor exógeno para controlar la transcripción del gen exógeno insertado. Estos promotores exógenos incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles.

Los promotores constitutivos naturales controlan la expresión de funciones celulares esenciales. Como resultado, un gen bajo el control de un promotor constitutivo se expresa en todas las condiciones de crecimiento celular. Entre los promotores constitutivos a modo de ejemplo se incluyen los promotores de los siguientes genes que codifican determinadas funciones constitutivas o “de mantenimiento”: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), dihidrofolato reductasa (DHFR), adenosina desaminasa, fosfoglicerol quinasa (PGK), piruvato quinasa, fosfoglicerol mutasa, el promotor de actina y otros promotores constitutivos conocidos por los expertos en la materia. Además, muchos promotores virales funcionan de forma constitutiva en las células eucariotas. Entre estos se incluyen: los promotores temprano y tardío de SV40; las repeticiones terminales largas (LTR, del inglés long terminal repeats) del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus; y el promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple, entre muchos otros. Por consiguiente, cualquiera de los promotores constitutivos mencionados anteriormente se puede utilizar para controlar la transcripción de un inserto de gen heterólogo.

Los genes que están bajo el control de promotores inducibles se expresan solo en presencia de un agente inductor o en mayor grado en presencia del mismo (por ejemplo, la transcripción bajo el control del promotor de la metalotioneína aumenta mucho en presencia de determinados iones metálicos). Entre los promotores inducibles se incluyen elementos sensibles (RE, del inglés responsive elements) que estimulan la transcripción cuando se unen sus factores inductores. Por ejemplo, existen RE para factores séricos, hormonas esteroides, ácido retinoico y AMP cíclico. Los promotores que contienen un RE particular se pueden elegir para obtener una respuesta inducible y, en algunos casos, el propio RE se puede unir a un promotor diferente, confiriendo de este modo inducibilidad al gen recombinante. De este modo, seleccionando el promotor apropiado (constitutivo frente a inducible; fuerte frente a débil), es posible controlar tanto la existencia como el nivel de expresión de un agente terapéutico en la célula modificada genéticamente. Si el gen que codifica el agente terapéutico está bajo el control de un promotor inducible, la administración del agente terapéutico in situ se desencadena exponiendo la célula modificada genéticamente in situ a condiciones que permitan la transcripción del agente terapéutico, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal de inductores específicos de los promotores inducibles que controlan la transcripción del agente. Por ejemplo, la expresión in situ mediante células modificadas genéticamente de un agente terapéutico codificado por un gen bajo el control del promotor de la metalotioneína se potencia poniendo en contacto in situ las células modificadas genéticamente con una solución que contiene los iones metálicos apropiados (es decir, inductores).

En consecuencia, la cantidad de agente terapéutico que se administra in situ se regula controlando factores tales como: (1) la naturaleza del promotor utilizado para dirigir la transcripción del gen insertado, (es decir, si el promotor es constitutivo o inducible, fuerte o débil); (2) el número de copias del gen exógeno que se insertan en la célula; (3) el número de células transducidas/transfectadas que se administran (por ejemplo, se implantan) al paciente; (4) el tamaño del implante (por ejemplo, injerto o sistema de expresión encapsulado); (5) el número de implantes; (6) la cantidad de tiempo que las células transducidas/transfectadas o los implantes se dejan en su lugar; y (7) la tasa de producción del agente terapéutico por la célula modificada genéticamente. La selección y optimización de estos factores para la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico particular se considera que está dentro del alcance de un experto en la materia sin experimentación indebida, teniendo en cuenta los factores descritos anteriormente y el perfil clínico del paciente.

Además del, como mínimo, un promotor y el, como mínimo, un ácido nucleico heterólogo que codifica el agente terapéutico, el vector de expresión puede incluir un gen de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, para facilitar la selección de células que han sido transfectadas o transducidas con el vector de expresión. Alternativamente, las células se transfectan con dos o más vectores de expresión, conteniendo un vector, como mínimo, el gen o genes que codifican el agente o agentes terapéuticos, y conteniendo el otro vector un gen de selección. Se considera que la selección de un promotor, potenciador, gen de selección y/o secuencia señal adecuados (descritos a continuación) está dentro del alcance de un experto en la materia sin experimentación indebida.

El agente terapéutico se puede dirigir para su administración a una ubicación extracelular, intracelular o de membrana. Si es deseable que el producto génico sea secretado por las células, el vector de expresión se diseña para incluir una secuencia “señal” de secreción apropiada para secretar el producto génico terapéutico desde la célula al medio extracelular. Si es deseable que el producto génico se retenga dentro de la célula, se omite esta secuencia señal de secreción. De manera similar, el vector de expresión se puede construir para incluir secuencias señal de “retención” para anclar el agente terapéutico dentro de la membrana plasmática celular. Por ejemplo, todas las proteínas de membrana tienen regiones transmembrana hidrófobas, que detienen la translocación de la proteína en la membrana y no permiten que la proteína sea secretada. Se considera que la construcción de un vector de expresión que incluye secuencias señal para dirigir un producto génico a una ubicación particular está dentro del alcance de un experto en la materia sin la necesidad de experimentación indebida.

Ensayos de detección

Se contempla una variedad de procedimientos de inmunodetección para este aspecto. Entre estos procedimientos de inmunodetección se incluyen ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunorradiométrico, fluoroinmunoensayo, ensayo quimioluminiscente, ensayo bioluminiscente y transferencia de tipo Western, aunque diversos otros son bien conocidos por los expertos en la materia. Las etapas de los diversos procedimientos de inmunodetección útiles se han descrito en la bibliografía científica.

En general, los procedimientos de inmunounión incluyen obtener una muestra sospechosa de contener proteína Ap y poner en contacto la muestra con un primer anticuerpo, monoclonal o policlonal específico para Ap, según la presente invención, según sea el caso, en condiciones eficaces para permitir la formación de inmunocomplejos.

Los procedimientos de inmunounión incluyen procedimientos para detectar y cuantificar la cantidad de proteína Ap en una muestra y la detección y cuantificación de cualquier inmunocomplejo formado durante el proceso de unión. En la presente memoria descriptiva, se obtendría una muestra sospechosa de contener proteína Ap y se pondría en contacto la muestra con un fragmento de anticuerpo de la presente invención y, posteriormente, se detectaría y cuantificaría la cantidad de inmunocomplejos formados en las condiciones específicas.

Poner en contacto la muestra biológica elegida con el anticuerpo en condiciones eficaces y durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de inmunocomplejos (inmunocomplejos primarios) es, en general, una cuestión de simplemente añadir la composición del anticuerpo a la muestra e incubar la mezcla durante un período de tiempo suficiente para que los anticuerpos formen inmunocomplejos con cualquier antígeno presente, es decir, se unan a los mismos. Después de este tiempo, la composición de muestra-anticuerpo, tal como una sección de tejido, placa ELISA, transferencia por puntos o transferencia de tipo Western, se lavará, en general, para eliminar cualquier especie de anticuerpo unida de manera no específica, permitiendo que se detecten solo aquellas moléculas de scFv unidas específicamente dentro de los inmunocomplejos primarios.

En general, la detección de la formación de inmunocomplejos es bien conocida en la técnica y se puede conseguir mediante la aplicación de numerosos enfoques. Estos procedimientos se basan, en general, en la detección de una etiqueta o un marcador, tal como cualquiera de los marcadores radiactivos, fluorescentes, biológicos y enzimáticos. Entre las patentes de EE. UU. relativas a la utilización de tales marcadores se incluyen las Patentes US3,817,837; US3,850,752; US3,939,350; US3,996,345; US4,277,437; US4,275,149 y US4,366,241. Por supuesto, se pueden encontrar ventajas adicionales mediante la utilización de un ligando de unión secundario, tal como un segundo anticuerpo y/o una disposición de unión a ligando de biotina/avidina, tal como se conoce en la técnica.

Tal como se ha señalado anteriormente, una molécula de detección de proteínas (es decir, un ligando de unión, tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo) se puede unir por sí mismo a un marcador detectable, en el que simplemente se detectaría este marcador, permitiendo de este modo que se determine la cantidad de inmunocomplejos primarios en la composición que se va a determinar. Alternativamente, el primer anticuerpo que se une dentro de los inmunocomplejos primarios se puede detectar por medio de un segundo ligando de unión que tiene afinidad de unión por el anticuerpo. En estos casos, el segundo ligando de unión se puede unir a un marcador detectable. El segundo ligando de unión es, a menudo, un anticuerpo en sí mismo, que de este modo se puede denominar anticuerpo “secundario”. Los inmunocomplejos primarios se ponen en contacto con el ligando de unión secundario o el anticuerpo marcado en condiciones eficaces y durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de inmunocomplejos secundarios. A continuación, los inmunocomplejos secundarios se lavan, en general, para eliminar cualquier anticuerpo o ligando secundario marcado unido no específicamente y, posteriormente, se detecta el marcador restante en los inmunocomplejos secundarios.

Procedimientos adicionales incluyen la detección de inmunocomplejos primarios mediante un enfoque de dos etapas. Se utiliza un segundo ligando de unión, tal como un anticuerpo, que tiene afinidad de unión por el primer ligando de unión para formar inmunocomplejos secundarios, tal como se ha descrito anteriormente. Después del lavado, los inmunocomplejos secundarios se ponen en contacto con un tercer ligando de unión o anticuerpo que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, de nuevo en condiciones eficaces y durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de inmunocomplejos (inmunocomplejos terciarios). El tercer ligando o anticuerpo está unido a un marcador detectable, lo que permite la detección de los inmunocomplejos terciarios formados de este modo. Este sistema puede proporcionar, si se desea, la amplificación de la señal.

Tal como se ha detallado anteriormente, los inmunoensayos, en su sentido más simple y/o directo, son ensayos de unión. Determinados inmunoensayos preferentes son los diversos tipos de ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA) y/o radioinmunoensayos (RIA) conocidos en la técnica. La detección inmunohistoquímica que utiliza secciones de tejido también es particularmente útil. Sin embargo, se apreciará fácilmente que la detección no se limita a estas técnicas, y/o también se pueden utilizar transferencia de tipo Western, transferencia por puntos, análisis mediante FACS y/o similares.

En un ELISA a modo de ejemplo, los anticuerpos se inmovilizan sobre una superficie seleccionada que muestra afinidad proteica, tal como un pocillo en una placa de microtitulación de poliestireno. Posteriormente, se añade a los pocillos una composición de ensayo sospechosa de contener proteína Ap, tal como una muestra clínica (por ejemplo, una muestra biológica obtenida del individuo). Después de la unión y/o el lavado para eliminar los inmunocomplejos unidos de forma no específica, se puede detectar el antígeno unido. La detección se consigue, en general, mediante la adición de otro anticuerpo que está unido a un marcador detectable. Este tipo de ELISA es un “ELISA tipo sándwich” sencillo. La detección también se puede conseguir mediante la adición de un segundo anticuerpo, seguido de la adición de un tercer anticuerpo que tiene afinidad de unión por el segundo anticuerpo, estando el tercer anticuerpo unido a un marcador detectable.

En otro ELISA a modo de ejemplo, las muestras sospechosas de contener el antígeno se inmovilizan sobre la superficie del pocillo y/o posteriormente se ponen en contacto con agentes de unión. Después de la unión y/o el lavado para eliminar los inmunocomplejos unidos de forma no específica, se detectan los agentes anti-unión unidos. Cuando los agentes de unión iniciales están unidos a un marcador detectable, los inmunocomplejos se pueden detectar directamente. De nuevo, los inmunocomplejos se pueden detectar utilizando un segundo anticuerpo que tiene afinidad de unión por los primeros agentes de unión, estando el segundo anticuerpo unido a un marcador detectable.

Otro ELISA en el que se inmovilizan los antígenos implica la utilización de competencia de anticuerpos en la detección. En este ELISA, los anticuerpos marcados contra un antígeno se añaden a los pocillos, se dejan que se unan y/o se detectan mediante su marcador. A continuación, la cantidad de un antígeno en una muestra desconocida se determina mezclando la muestra con los anticuerpos marcados contra el antígeno durante la incubación con los pocillos recubiertos. La presencia de un antígeno en la muestra actúa reduciendo la cantidad de anticuerpo contra el antígeno disponible para unirse al pocillo y, por lo tanto, reduce la señal final. Esto también es apropiado para detectar anticuerpos contra un antígeno en una muestra desconocida, en la que los anticuerpos no marcados se unen a los pocillos recubiertos de antígeno, y también reduce la cantidad de antígeno disponible para unirse con los anticuerpos marcados.

Independientemente del formato utilizado, los ELISA tienen determinadas características en común, tales como el recubrimiento, la incubación y la unión, el lavado para eliminar especies unidas de forma no específica y la detección de los inmunocomplejos unidos.

En los ELISA, probablemente sea más habitual utilizar un medio de detección secundario o terciario en lugar de un procedimiento directo. De este modo, después de unir una proteína o un anticuerpo al pocillo, recubrir con un material no reactivo para reducir la señal de fondo y lavar para eliminar el material no unido, la superficie inmovilizadora se pone en contacto con la muestra biológica que se va a analizar en condiciones eficaces para permitir la formación del inmunocomplejo (antígeno/anticuerpo). La detección del inmunocomplejo requiere, a continuación, un anticuerpo o ligando de unión secundario marcado, y un anticuerpo o ligando de unión secundario junto con un anticuerpo terciario o un tercer ligando de unión marcado.

“En condiciones eficaces para permitir la formación de inmunocomplejos (antígeno/anticuerpo)” significa que las condiciones incluyen, preferentemente, diluir los oligómeros de tau y/o la composición de scFv con soluciones, tales como BSA, gammaglobulina bovina (BGG, del inglés bovine gammaglobuline) o solución salina tamponada con fosfato (PBS, del inglés phosphate buffered saline)/Tween. Estos agentes añadidos también tienden a ayudar a reducir la señal de fondo inespecífica.

Las condiciones “adecuadas” también significan que la incubación se realiza a una temperatura o durante un período de tiempo suficiente para permitir una unión eficaz. Las etapas de incubación son normalmente de, aproximadamente, 1 a 2 a 4 horas, más o menos, a temperaturas, preferentemente, del orden de 25 °C a 27 °C., o pueden ser durante la noche a, aproximadamente, 4 °C, más o menos.

Después de todas las etapas de incubación en un ELISA, la superficie en contacto se lava para eliminar el material no complejado. Un ejemplo de un procedimiento de lavado incluye el lavado con una solución tal como PBS/Tween o tampón borato. Después de la formación de inmunocomplejos específicos entre la muestra de ensayo y el material unido originalmente, y el lavado posterior, se puede determinar la aparición de cantidades incluso diminutas de inmunocomplejos.

Para proporcionar un medio de detección, el segundo o tercer anticuerpo tendrá un marcador asociado para permitir la detección. Este puede ser una enzima que generará desarrollo de color al incubar con un sustrato cromógeno apropiado. De este modo, por ejemplo, se deseará poner en contacto o incubar el primer y segundo inmunocomplejo con un anticuerpo conjugado con ureasa, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa de hidrógeno durante un período de tiempo y en condiciones que favorezcan el desarrollo de una mayor formación de inmunocomplejos (por ejemplo, incubación durante 2 horas a temperatura ambiente en una solución que contiene PBS, tal como PBS-Tween).

Después de la incubación con el anticuerpo marcado y el lavado posterior para eliminar el material no unido, se cuantifica la cantidad de marcador, por ejemplo, mediante incubación con un sustrato cromógeno, tal como urea, o púrpura de bromocresol, o ácido 2,2’-azino-di-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), o H2O2, en el caso de la peroxidasa como marcador enzimático. La cuantificación se consigue posteriormente midiendo el grado de color generado, por ejemplo, utilizando un espectrofotómetro de espectro visible.

Ejemplo 1

Cambios en la progresión de la deposición de amiloide

Este ejemplo estudió los cambios en la progresión de la deposición de amiloide en ratones APP/PS después de la sobreexpresión de diferentes isoformas de la ApoE mediante inyección intraventricular de un virus adenoasociado de serotipo 4 (AAV4).

El alelo épsilon 4 de la ApoE (ApoE e4) es el primer factor de riesgo genético para la enfermedad de Alzheimer (EA), mientras que la herencia del raro alelo épsilon 2 de la ApoE (ApoE e2) reduce este riesgo aproximadamente a la mitad. Sin embargo, a pesar del descubrimiento de estas fuertes evidencias genéticas hace casi 17 años, los mecanismos por los que la ApoE confiere riesgo siguen siendo inciertos.

Para descifrar cómo las diferentes isoformas de la ApoE (ApoE e2, e3 y e4) impactan en la formación y estabilidad de las placas amiloides fibrilares, se inyectaron vectores de ^aAV4 que codifican cada isoforma de ApoE en el ventrículo de ratones APP/PS de 7 meses de edad. Utilizando imágenes multifotónicas in vivo, se rastrearon las poblaciones de depósitos de amiloide en el nivel inicial y después de la exposición a la ApoE durante un intervalo de dos meses, permitiendo de este modo una vista dinámica de la progresión de la amiloidosis en un animal vivo.

Se observó que la cinética de la deposición de placas amiloides era variable según cada isoforma, de modo que los ratones inyectados con ApoE e4 tuvieron un aumento del 38 % de las placas seniles mientras que los ratones tratados con ApoE e2 presentaron una disminución del 15 % del número de depósitos de amiloide en comparación con la ApoE e3 después de 2 meses. El análisis post-mortem confirmó estos resultados y reveló la presencia de proteínas ApoE humanas que decoran placas en la corteza, lo que refleja una gran difusión de la proteína por todo el parénquima y su acumulación focal donde se depositan los péptidos Ap. Es importante señalar que este contenido aumentado de la proteína ApoE e4 también se asoció con una pérdida de sinapsis más grave alrededor de los depósitos de amiloide.

En general, los presentes datos demostraron que la sobreproducción de diferentes isoformas de la ApoE pudo influir en la progresión de la enfermedad y podría modular el grado de pérdida de sinapsis, uno de los parámetros que mejor se correlaciona con el deterioro cognitivo en pacientes con eA.

1. La inyección intraventrícuiar de AAV4-ApoE condujo a una expresión estable de huApoE y una detección sostenida de la proteína ApoE humana (huApoE) recombinante en el cerebro.

Brevemente, se inmunodetectaron GFP y huApoE en ratones APP/PS inyectados con vectores de AAV4. La señal de GFP se pudo observar en toda el área del ventrículo (panel superior) y en las células que recubren el ventrículo, así como la APOE humana.

Para evaluar el presente enfoque, se inyectaron AAV4-Venus (control), AAV4-ApoE2, AAV4-ApoE3 y AAV4-ApoE4 en el ventrículo de ratones de tipo salvaje. Dos meses después de la inyección, se pudieron detectar proteínas ApoE humanas en el parénquima cortical alrededor de los depósitos de amiloide (nótese el anticuerpo 3H1; solo se observó una señal de fondo inespecífica en los ratones inyectados con AAV4-GFP). De este modo, se detectó mediante ELISA un nivel significativo de ApoE humana en el cerebro, y las tinciones inmunohistológicas para Venus y ApoE confirmaron la expresión de los diferentes transgenes por las células que recubren el ventrículo.

Se realizaron experimentos de qRT-PCR para evaluar los niveles de ARNm del transgén. Una curva de calibración permitió determinar las concentraciones de ARNm de huApoE según el nivel de GAPDH endógena. Se incluyeron muestras de ratones que estuvieron expuestos durante 2 o 5 meses. Se realizó un ensayo ELISA diseñado para detectar específicamente APOE humana en homogeneizados de cerebro (figura 1A). Se pudieron detectar niveles bajos de proteínas recombinantes en ratones inyectados con AAV4-APOE en comparación con animales tratados con AAV4-GFP, según se cuantificó mediante ELISA específico para APOE humana (figura 1B) y se confirmó mediante transferencia de tipo Western.

2. La sobreexpresión de cada isoforma de APOE afecta de manera diferencial a la progresión de la amiloidosis. Se utilizaron imágenes bifotónicas in vivo para seguir la deposición de amiloide a lo largo del tiempo en un animal vivo. Brevemente, se inyectaron estereotácticamente ratones APP/PS (7 meses de edad) con vectores de AAV4 que codifican ApoE2, ApoE3, ApoE4 y Venus. Después de 1 semana, se implantó una ventana craneal y se obtuvieron imágenes de los depósitos de amiloide a lo largo del tiempo después de la craneotomía. Después de 2 meses, los animales se sacrificaron y se realizaron análisis post-mortem.

Se prepararon imágenes bifotónicas de ratones APP/PS inyectados con AAV4-ApoE2, AAV4-ApoE3 o AAV4-ApoE4. Se pudieron detectar placas amiloides después de la inyección intraperitoneal de metoxi-XO4 (5 mg/kg) y se inyectó dextrano-rojo de Texas (70.000 Da de peso molecular; 12,5 mg/ml en PBS estéril) en una vena lateral de la cola para proporcionar un angiograma fluorescente. Las imágenes se tomaron una semana (=T0), un mes y dos meses después de la inyección. Los mismos campos se capturaron a lo largo del tiempo para seguir la progresión de las lesiones. Aparecieron pocos depósitos nuevos de amiloide, mientras que algunos de ellos ya no se pudieron detectar durante un período de tiempo de dos meses.

Un análisis completo de las imágenes in vivo muestra que el número de depósitos de amiloide aumenta de manera significativamente más rápida en ratones APP/PS inyectados con AAV4-ApoE4 en comparación con los animales tratados con AAV4-ApoE3 y AAV4-Venus. Por el contrario, se mide una pequeña, pero significativa, disminución de la densidad de placas cuando se utilizó AAV4-ApoE2 (figura 2). Se observa una tendencia hacia placas más grandes en ratones APP/PS inyectados con AAV4-ApoE4 (p<0,06), pero en general el tamaño de las placas permanece constante. Los datos resumidos de la formación de imágenes in vivo muestran que la sobreexpresión de cada isoforma de APOE afecta de manera diferencial a la progresión de la deposición de amiloide in vivo. La inyección de AAV4-ApoE2 conduce a una ligera disminución de la densidad de amiloide a lo largo del tiempo, mientras que la inyección de AAV4-ApoE4 agrava la amiloidosis.

3. El tamaño de las placas amiloides varía según cada isoforma de ApoE.

Las imágenes bifotónicas in vivo permitieron el seguimiento de los cambios del tamaño de cada depósito de amiloide durante un período de 2 meses. El tamaño de las placas puede permanecer estable, aumentar o disminuir con el tiempo. Las distribuciones de las proporciones de tamaño entre T1/T0 y T2/T1 muestran que hay un cambio hacia placas amiloides más grandes en ratones inyectados con AAV4-ApoE4 en comparación con los otros grupos (figura 3).

4. La evaluación post-mortem de la carga de amiloide confirma los efectos de la ApoE2 y la ApoE4 sobre la deposición de amiloide.

Dos meses después de la inyección de AAV4, la evaluación estereológica post-mortem reveló que los animales inyectados con AAV4-ApoE4 tienen una mayor densidad de placas amiloides en la corteza, mientras que no se pudo detectar ninguna diferencia entre los otros grupos (figura 4A). Este número aumentado de depósitos de amiloide se observa cuando las placas se marcaron con ThioS o Bam10. Sin embargo, no se detectó ningún cambio en la proporción entre Bam10 y ThioS. Cinco meses después de la inyección, los efectos de cada isoforma de ApoE son más pronunciados en comparación con dos meses (figura 4B). Se observó un aumento significativo de la densidad de los depósitos cuando se inyectó AAV4-ApoE4 a los ratones, mientras que se detectó un efecto inverso con ApoE2. De nuevo, no se detectaron cambios en la proporción entre Bam10 y ThioS.

5. Cada forma de ApoE afecta de manera diferencial a la densidad sináptica alrededor de los depósitos de amiloide. Se utilizó tomografía de matriz para determinar con precisión la densidad de elementos presinápticos y postsinápticos alrededor de los depósitos de amiloide. Este nuevo procedimiento de obtención de imágenes ofrece capacidades para la obtención de imágenes de alta resolución de la arquitectura molecular del tejido. La tomografía de matriz se basa en un corte ultrafino de la muestra (70 nm), inmunotinción y reconstrucción 3D. Imágenes representativas de muestras de tomografía de matriz teñidas para placa amiloide y el marcador postsináptico PSD95. Las imágenes de tomografía de matriz muestran que se observa una disminución del número de marcadores postsinápticos PSD95 alrededor de los depósitos de amiloide, pero este efecto desaparece lejos de las placas. La cuantificación de marcadores presinápticos (sinapsina-1) y postsinápticos en la vecindad o lejos de las placas se determinó en cada grupo de ratones inyectados con un AAV4 (figuras 5A-D). La cuantificación extensa de elementos presinápticos y postsinápticos confirmó que una densidad disminuida de sinapsina 1 y PSD95 se asoció con placas amiloides, amplificándose este efecto drásticamente cuando la ApoE4 se sobreexpresó en el cerebro de ratones APP/PS1 (figura 5C, figura 5D). La sobreexpresión de la ApoE4 se asocia con una mayor pérdida espinal en comparación con los otros grupos en la vecindad de los depósitos de amiloide. Por el contrario, la densidad de puntos de sinapsina es mayor en los animales tratados con la ApoE2 alrededor de las placas.

Conclusión

Las inyecciones intraventriculares del serotipo 4 del virus AAV condujeron a una sobreproducción sostenida y prolongada de proteínas recombinantes solubles en todo el parénquima cerebral. La sobreexpresión de la ApoE2, la ApoE3 y la ApoE4 afectó de manera diferencial al transcurso de la patología en ratones ^aP^p/PS, de modo que la progresión de la carga amiloide aumentó significativamente cuando se inyectó la ApoE4 en comparación con la ApoE3. Por el contrario, la ApoE2 se asoció con efectos protectores y pocos depósitos de amiloide que ya no son detectables dos meses después de la inyección. El análisis inmunohistológico post-mortem confirmó el efecto adverso de la ApoE4. La sobreproducción sostenida de la ApoE4 exacerbó la pérdida de sinapsis observada alrededor de los depósitos de amiloide en comparación con la ApoE3, mientras que la ApoE2 tuvo un efecto leve. El presente estudio demostró una conexión directa entre las isoformas de la ApoE, la progresión de la amiloidosis y la pérdida de sinapsis in vivo.

Ejemplo 2

Tratamiento de los trastornos del sistema nervioso central a través del líquido cefalorraquídeo (LCR) en grandes mamíferos

Para conseguir la terapia génica para los trastornos cerebrales, tales como la enfermedad de Alzheimer, era necesario determinar si en un mamífero se podían conseguir niveles de enzimas terapéuticas en estado estacionario a largo plazo. Se descubrió que las células ependimarias (células que se encuentran en los ventrículos del cerebro) se pueden transducir y secretan una enzima dirigida al líquido cefalorraquídeo (LCR). Se determinó que el virus adenoasociado (AAV4) puede transducir el epéndimo en un modelo de ratón con alta eficacia. (Davidson et al., PNAS, 28: 3428-3432, 2000). En ratones hubo una normalización de los niveles de sustrato almacenado en el cerebro enfermo después del tratamiento con AAV4.

Se investigó si la administración general de un vector se podría realizar de manera eficaz para conseguir niveles de enzima en estado estacionario en el LCR. En primer lugar, era necesario encontrar un vector que pudiera transducir las células ependimarias (células que recubren los ventrículos) en el cerebro de mamíferos más grandes. Los estudios se realizaron en un modelo de perro de LINCL y un modelo de primates no humanos de LINCL. Los perros con LINCL son normales al nacer, pero desarrollan signos neurológicos alrededor de los 7 meses, déficits cognitivos comprobables a los 5-6 meses, convulsiones a los 10-11 meses y pérdida visual progresiva.

Se seleccionó un virus adenoasociado (AAV) como vector debido a su pequeño tamaño (20 nm), la mayor parte de su material genético se puede eliminar (“eviscerar”) para que no haya genes virales presentes y para que sea incompetente en la replicación. Anteriormente se sometió a ensayo si los vectores del virus adenoasociado tipo 4 (AAV4) podrían mediar mejoras funcionales y patológicas generales en un modelo murino de mucopolisacaridosis tipo VII (MPS VII) provocada por deficiencia de beta-glucuronidasa (Liu et al., J. Neuroscience, 25 (41): 9321-9327, 2005). Se inyectaron unilateralmente vectores de AAV4 recombinantes que codifican beta-glucuronidasa en el ventrículo lateral de ratones con MPS VII con la enfermedad establecida. El epéndimo transducido expresaba niveles elevados de enzima recombinante, con enzima secretada que penetraba en las estructuras cerebrales y cerebelosas, así como en el tronco encefálico. Los estudios inmunohistoquímicos revelaron una estrecha asociación de la enzima recombinante y la microvasculatura cerebral, lo que indica que la beta-glucuronidasa alcanzó el parénquima cerebral a través de los espacios perivasculares que recubren los vasos sanguíneos. El aprendizaje asociativo aversivo se evaluó mediante el condicionamiento del miedo al contexto. En comparación con los controles heterocigóticos de la misma edad, los ratones afectados mostraron una respuesta al miedo condicionada deficiente y discriminación de contexto. Este déficit de comportamiento se revirtió 6 semanas después de la transferencia génica en ratones con MPS VII tratados con beta-glucuronidasa inyectados con AAV4. Los datos muestran que las células ependimarias pueden servir como fuente de secreción enzimática en el parénquima cerebral circundante y el LCR. Sorprendentemente, sin embargo, cuando estos estudios se extendieron a grandes mamíferos (es decir, perros y primates no humanos, PNH), los vectores de AAV4 no fueron eficaces para dirigirse al epéndimo en estos animales. En su lugar, era necesario utilizar un vector de AAV2. Brevemente, se generó rAAV2 que codifica TPP1 (AAV2-CLN2) y se inyectó por vía intraventricular para transducir el epéndimo (Liu et al., J. Neuroscience, 25 (41): 9321-9327, 2005). TPP1 es la enzima deficiente en LINCL. Los datos indicaron que la transducción ependimaria en el cerebro de PNH dio como resultado un aumento significativo de la enzima en el LCR. Los resultados indicaron niveles elevados de actividad de TPP1 en diversas regiones del cerebro, en los que el eje vertical muestra el % de control de la actividad (figura 7).

En el primer perro que fue tratado, la administración del vector fue por debajo de la óptima, pero aun así mostró actividad de CLN2 en el cerebro. Los perros posteriores se sometieron a administración ICV con estereotaxia. Se descubrió que las habilidades cognitivas de los perros tratados mejoraron significativamente con respecto a un perro no tratado, según se midió mediante el comportamiento en el laberinto en T (figura 8). Además, los efectos de la administración ICV de AAV2-CLN2 en el modelo de perro de LINCL fueron muy pronunciados. En el animal no tratado (-/-), están presentes ventrículos grandes, mientras que los cerebros del control no tratado y los animales tratados no mostraron ventrículos. Después de la administración de AAV.TPP1 a los ventrículos de perros con LINCL, se observó actividad enzimática detectable en diversas regiones del cerebro, incluido el cerebelo y la médula espinal superior. En dos perros vivos afectados, la atrofia cerebral se atenuó significativamente, se incrementó la longevidad y se mejoró la función cognitiva. Finalmente, en PNH, se demostró que este procedimiento puede conseguir niveles de actividad de TPP1 de 2 a 5 veces por encima del tipo salvaje.

Se generaron y sometieron a ensayo diversos vectores de AAV para determinar la combinación óptima de ITR y cápside. Se produjeron cinco combinaciones diferentes, una vez que se determinó que la ITR de a AV2 era la más eficaz: AAV2/1 (es decir, ITR de AAV2 y cápside de ^aA^v1), AAV2/2, AAV2/4, AAV2/5 y AAV2/8. Se descubrió que AAV2/2 funcionó mucho mejor en los grandes mamíferos (perros y PNH), seguido de AAV2/8, AAV2/5, AAV2/1 y AAV2/4. Esto fue bastante sorprendente porque el orden de eficacia de los vectores virales es el opuesto al observado en ratones.

De este modo, el presente trabajo ha demostrado que las células del revestimiento ventricular pueden ser una fuente de enzima recombinante en el LCR para su distribución por todo el cerebro, y que AAV2/2 es un vehículo eficaz para administrar agentes terapéuticos, tales como el gen que codifica CLN2 (TPP1) en perros y primates no humanos. Ejemplo 3

Las isoformas de la APOE humana administradas mediante transferencia génica modulan de manera diferencial la enfermedad de Alzheimer al afectar a la deposición, la depuración y la neurotoxicidad de amiloide

La enfermedad de Alzheimer (EA) es el trastorno neurodegenerativo relacionado con la edad más frecuente y se ha convertido en un importante problema de salud pública. Entre los genes de susceptibilidad asociados con la forma esporádica de aparición tardía de la EA, el alelo de la apolipoproteína E e4 (gen APOE; proteína ApoE) es, con diferencia, el factor de riesgo genético más importante. La presencia de una copia de APOE e4 aumenta sustancialmente el riesgo de desarrollar la enfermedad en un factor de 3 en comparación con el alelo APOE e3 más común, mientras que las dos copias conducen a un aumento de 12 veces. Curiosamente, APOE e2 tiene un impacto opuesto y es un factor protector, de modo que la herencia de este alelo específico disminuye el riesgo de EA ajustado por edad a aproximadamente la mitad en comparación con APOE3/3. La edad promedio de aparición de la demencia también se corresponde con estos perfiles de riesgo, ya que los portadores de APOE4/4 tienen un inicio a mediados de los 60 y los portadores de APOE2/3 a principios de los 90, un cambio de casi 3 décadas, mientras que los individuos con APOE3/3 tienen una edad de aparición intermedia, a mediados de la década de 1970.

El mecanismo por el cual la ApoE impacta en la EA es controvertido. Se cree que la acumulación de placas seniles que contienen Ap en el hipocampo y la corteza de los pacientes juega un papel central en la EA, porque todos los genes conocidos responsables de las formas autosómicas dominantes raras de la enfermedad participan en la producción de péptidos Ap. Curiosamente, se demostró que el genotipo APOE afecta fuertemente al grado de deposición de amiloide en pacientes con EA, así como la cantidad de Ap oligomérica soluble neurotóxica detectada en muestras de autopsias. Se ha sugerido que las isoformas de la ApoE influyen de manera diferencial en la integridad cerebrovascular y afectan a la salida de péptidos Ap a través de la barrera hematoencefálica, modulando de este modo la acumulación de agregados amiloides alrededor de los vasos sanguíneos (angiopatía amiloide cerebral o AAC). Además, la ApoE también se ha implicado directamente en la neurodegeneración y en la plasticidad neuronal. Los efectos de la ApoE2 se han estudiado relativamente poco en estos contextos.

Los animales modificados genéticamente que expresan APOE2, APOE3 y APOE4 humanos tienen un orden de carga de amiloide similar al de los seres humanos, según la hipótesis de que diferentes isoformas de la ApoE impactan en el inicio y/o el crecimiento de las placas. Sin embargo, se necesitan más estudios para analizar los mecanismos de los efectos mediados por la ApoE sobre los depósitos de amiloide existentes y sobre la neurodegeneración existente. Para superar esta laguna en el conocimiento, se utilizó un enfoque de transferencia génica en el que los vectores de virus adenoasociado que expresan los diversos alelos APOE (o control de GFP) se inyectan en el ventrículo lateral para transducir principalmente el epéndimo, que posteriormente actúa como una fábrica biológica para administrar la ApoE dentro de los fluidos cefalorraquídeo e intersticial. Posteriormente se utilizó microscopía multifotónica intravital para rastrear los efectos de las diversas isoformas de la ApoE sobre la formación y el crecimiento de placas y, en el caso de la ApoE2, la depuración de las mismas, así como enfoques de microdiálisis in vivo para monitorizar las variables bioquímicas de la ApoE y Ap en el ISF, y tomografía de matriz para evaluar cambios en la neurotoxicidad asociada a Ap. Se descubrió que las isoformas de la ApoE impactan en los niveles de Ap oligomérica soluble en el ISF, el ritmo de fibrilación y deposición de Ap, la estabilidad de los depósitos de amiloide una vez formados, su depuración y el alcance de los efectos neurotóxicos peri-placa. De hecho, los ratones con EA tratados con la ApoE4 muestran una mayor cantidad de Ap soluble, una mayor densidad de placas fibrilares, una exacerbación de la pérdida de elementos sinápticos y un mayor número de distrofias neuríticas alrededor de cada depósito, mientras que se observó un efecto protector relativo con la ApoE2. Estos datos respaldan la hipótesis de que los alelos APOE median su efecto sobre la EA principalmente a través de Ap, y destacan a la ApoE como una diana terapéutica.

RESULTADOS

La inyección intraventricular de AAV4-APOE conduce a una expresión estable de APOE y a una producción sostenida de ApoE en el cerebro

La apolipoproteína E es una proteína secretada de manera natural, producida principalmente por astrocitos y microgliocitos y se puede difundir por todo el parénquima cerebral. Se aprovechó esta propiedad inyectando un serotipo 4 de A^aV que codifica GFP (control) o cada alelo APOE en los ventrículos cerebrales laterales de ratones APP/PS1 de 7 meses de edad. Teniendo en cuenta las grandes áreas cerebrales afectadas por las lesiones características de la EA, esta estrategia ofreció una gran ventaja en comparación con múltiples inyecciones intraparenquimatosas.

Dos meses después de la inyección, se detectaron células transducidas en el plexo coroideo y el epéndimo que recubre el ventrículo, confirmando de este modo la funcionalidad de los vectores de AAV4. Utilizando anticuerpos específicos para cada especie, se detectaron también proteínas ApoE tanto humanas como murinas mediante ELISA (figuras 9A, 9B y 15A) y transferencia de tipo Western. Se observó que la concentración de apolipoproteína E humana alcanzó, en promedio, 20 |xg/mg de proteína total (figura 9A), que representa, aproximadamente, el 10 % de la ApoE murina endógena (figura 9B). La presencia de esta modesta cantidad adicional de ApoE humana no alteró de manera detectable los niveles de proteína ApoE murina endógena (figura 15A). Se observó una disminución pequeña, pero estadísticamente significativa, entre 2 y 5 meses después de la inyección de AAV4 (figura 15B). No obstante, los niveles de proteína humana permanecieron detectables en comparación con el grupo de control, lo que sugiere que la transducción mediada por AAV4 proporcionó una plataforma para la producción sostenida de la proteína recombinante secretada en todo el parénquima. De hecho, las proteínas ApoE humanas se pudieron detectar alrededor de los depósitos de amiloide de ratones APP/PS1 en todo el manto cortical, en el que se sabe que se acumula proteína ApoE murina endógena.

A continuación, se evaluó la presencia de la ApoE humana en el líquido intersticial (ISF, del inglés intersticial fluid), un compartimento extracelular que también contiene especies solubles de Ap altamente activas biológicamente. Debido a la cantidad relativamente pequeña de la ApoE detectada en todo el lisado cerebral, se inyectaron a diversos ratones apoE KO con cada vector AAV4-APOE y se rastreó la presencia de la proteína humana utilizando anticuerpos altamente sensibles pero no específicos de especie. Utilizando una técnica de microdiálisis, se confirmó la presencia de la ApoE en el ISF de animales apoE KO inyectados.

En general, estos datos confirman que una sola inyección intracerebroventricular de AAV4 fue suficiente para conducir a la producción sostenida de una proteína de interés en todo el parénquima cerebral y dentro del ISF, y que el epéndimo/plexo coroideo se puede utilizar como una “bomba biológica” para administrar proteínas potencialmente terapéuticas al cerebro.

La infusión de las isoformas de la ApoE afecta de manera diferencial a los péptidos amiloides y a la deposición de placas

Se transdujeron ratones APP/PS1 con vectores que expresan GFP o las diversas isoformas de la ApoE durante 5 meses antes del sacrificio. Un análisis de la carga de placas amiloides reveló que, después de 5 meses, se observó un aumento significativo en la densidad de los depósitos amiloides en la corteza de los animales inyectados con AAV4-APOE4 en comparación con los que expresaban APOE2. La densidad de placas en ratones tratados con AAV4-GFP y AAV4-APOE3 no fue diferente entre sí en un nivel intermedio (figura 16A).

Las concentraciones de péptidos AP40 y AP42 medidas a partir de los extractos de ácido fórmico imitaron los cambios observados en el contenido de las placas amiloides, de modo que se encontró una mayor concentración de péptidos amiloides en ratones que expresaban el alelo APOE4 (figura 16B) y se detectó un efecto contrario con APOE2 después de 5 meses. El contenido de péptidos AP40 y AP42 en la fracción soluble en TBS se vio afectado de manera similar por la inyección de cada AAV-APOE (figura 16C). Además, la proporción entre péptidos Ap agregados y solubles permaneció sin cambios por la exposición a la ApoE, lo que sugiere que la sobreexpresión de cada isoforma de ApoE humana distinta modula de manera simultánea tanto la especie amiloide fibrilar como soluble.

La sobreexpresión de cada isoforma de ApoE durante solo 2 meses produce efectos menores que los observados en el estudio de 5 meses. Sin embargo, se observó un aumento significativo en la densidad de placas amiloides dentro del área cortical de ratones inyectados con AAV4-APOE4 en comparación con los otros grupos experimentales (figura 16A). Esto fue paralelo a la cantidad de Ap contenida en la fracción de ácido fórmico (figura 16C), lo que demuestra un efecto predominante de esta variante específica. Las especies de AP40/42 solubles en TBS solo mostraron una tendencia a ser más bajas o más elevadas cuando AAV4-APOE2 o AAV4-APOE4, respectivamente, se expresaron durante 2 meses (datos no mostrados).

Para determinar si la presencia de isoformas de la ApoE humana podría reflejar un cambio temprano en el grado de fibrilización de Ap, también se midió la proporción entre inmunotinción robusta para Ap utilizando Bam10 (que marca todos los depósitos de amiloide) y Thio-S (que solo tiñe el núcleo denso) 2 meses después de la inyección. No se detectó ningún cambio entre las 3 isoformas, lo que sugiere que no hubo ningún efecto diferencial sobre la distribución de las poblaciones de depósitos de amiloide densos y difusos entre los grupos experimentales en este período de tiempo (figura 16B). Estos datos indican que una exposición más prolongada a las variantes de la ApoE tiene efectos más fuertes sobre la deposición de amiloide que una exposición más corta.

Se ha sugerido que la ApoE desempeña un papel en el transporte de Ap a través de la barrera hematoencefálica. Para someter a ensayo si la exposición a las isoformas de la ApoE podría modular la salida de péptidos Ap a través de la barrera hematoencefálica, se midió la concentración de Ap40 en el plasma de cada animal inyectado. Se observó que el contenido plasmático de Ap humano en ratones inyectados con AAV4-APOE3 y AAV4-APOE4 por vía intracerebroventricular fue menor en comparación con AAV4-APOE2 y AAV4-GFP (figura 10D). Esto sugiere que las variantes E3 y E4 ayudan a retener Ap en el compartimento del sistema nervioso central, de acuerdo con las concentraciones relativamente aumentadas de Ap en el parénquima cerebral observadas y con los datos previos que sugieren una semivida mejorada de Ap debido a la ApoE.

Los portadores de APOE4 son más susceptibles a la disfunción neurovascular y, recientemente, se ha demostrado que la ruptura de la barrera hematoencefálica se favorece en ratones transgénicos APOE4 incluso en ausencia de depósitos de amiloide. Para evaluar si una inyección intraventricular de AAV4-APOE en APP/PS podría comprometer la integridad de la BHE, se realizó una tinción post-mortem con azul de Prusia. A pesar de la presencia de algunas áreas focales positivas para hemosiderina, dispersamente esparcidas por el cerebro en todos los grupos, no se observaron diferencias obvias entre ninguno de los grupos de animales experimentales.

La expresión de isoformas de la ApoE modula la cinética de la progresión de la amiloidosis

La ApoE4 se asoció con una mayor densidad de depósitos de amiloide, mientras que el efecto opuesto se observó con la ApoE2 después de 5 meses. Esto podría reflejar cambios en las velocidades de deposición y depuración de amiloide p, o ambas. Para evaluar cómo las variantes de la ApoE afectan a la progresión dinámica de la amiloidosis, se utilizaron imágenes bifotónicas in vivo y se siguió la cinética de la formación y depuración de la placa amiloide. Los ratones recibieron una inyección intraventricular con vectores de AAV4 a los 7 meses de edad y se implantó una ventana craneal una semana después de la inyección para realizar la primera sesión de obtención de imágenes (T0). Después de 1 mes (T1) y 2 meses (T2), se obtuvieron imágenes de los depósitos de amiloide en los mismos campos de visión. Los ratones fueron sacrificados para el análisis post-mortem después de la segunda sesión de obtención de imágenes.

La gran mayoría de los depósitos de amiloide permanecieron estables, aunque se pudieron detectar nuevas placas ocasionales en el pequeño volumen de visualización durante el período de tiempo de dos meses. Además, en raras ocasiones, no se pudo detectar ninguna placa positiva para metoxi de la que se obtuvieron imágenes al comienzo del experimento después de uno o dos meses, lo que sugiere que algunas placas podrían depurarse. Con el tiempo, se observó un aumento general en la densidad volumétrica de los depósitos de amiloide, siendo la densidad en T2, en promedio, un 23 % mayor que la de T1. La velocidad de progresión de amiloide fue más rápida en ratones APP/PS1 tratados con la ApoE4, mientras que los animales expuestos a la ApoE2 tuvieron una densidad de depósitos de amiloide significativamente reducida en relación con GFP (0,66), ApoE3 (0,67) y ApoE4 (0,74) después de 2 meses (figuras 11A, 11B). Es importante destacar que los cambios de la ApoE2 reflejan una disminución desde el nivel inicial, mostrando directamente, y por primera vez, la depuración activa de placas no mediada por inmunidad. A diferencia de los datos obtenidos de animales transgénicos APOE, estos resultados demuestran que la inducción de un aumento modesto de la cantidad de ApoE puede afectar al proceso amiloidogénico en curso incluso después de que la deposición de amiloide ya haya comenzado.

A continuación, se evaluó el crecimiento de una sola placa amiloide midiendo la proporción del área de sección transversal de los depósitos individuales entre T1/T0 y T2/T1. Se detectaron diferencias entre los grupos en T1 (proporción T1/T0), pero no en T2 (proporción T2/T1, figura 12), lo que sugiere que la presencia de variantes de la ApoE humana afecta principalmente al crecimiento de las placas durante el primer mes después de la exposición, pero este parámetro no difiere posteriormente. En particular, el tamaño de los depósitos de amiloide creció significativamente más en los ratones tratados con la ApoE4 en comparación con la ApoE2 y la ApoE3, lo que sugiere que este alelo no solo exacerbó el número de placas sino también su tamaño. Por lo tanto, la ApoE4 afecta tanto a la siembra de péptidos Ap como al tamaño de las placas preexistentes.

La densidad sináptica alrededor de los depósitos de amiloide empeora con las isoformas ApoE3 y ApoE4 en comparación con ApoE2

La pérdida de sinapsis es el parámetro que se correlaciona mejor con el deterioro cognitivo. Recientemente, se ha demostrado que la presencia de la ApoE4 se asocia con niveles más elevados de Ap oligomérica sináptica en el cerebro de pacientes humanos con EA y conduce a una densidad sináptica significativamente menor alrededor de las placas amiloides en comparación con la ApoE3 (R. M. Koffie et al., Apolipoprotein E4 effects in Alzheimer’s disease are mediated by synaptotoxic oligomeric amyloid-beta. Brain 135, 2155 (julio de 2012); T. Hashimoto et al., Apolipoprotein E, Especially Apolipoprotein E4, Increases the Oligomerization of Amyloid beta Peptide. J Neurosci 32, 15181 (24 de octubre de 2012)). Además, la reciente evidencia in vitro demostró que la ApoE4 no protegía contra la pérdida de sinapsis inducida por Ap (M. Buttini et al., Modulation of Alzheimer-like synaptic and cholinergic deficits in transgenic mice by human apolipoprotein E depends on isoform, aging, and overexpression of amyloid beta peptides but not on plaque formation. J Neurosci 22, 10539 (15 de diciembre de 2002); A. Sen, D. L. Alkon, T. J. Nelson, Apolipoprotein E3 (ApoE3) but not ApoE4 protects against synaptic loss through increased expression of protein kinase C epsilon. J Biol Chem 287, 15947 (4 de mayo de 2012)). Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que una distribución continua y difusa de cada isoforma de ApoE no solo puede afectar de manera diferencial a la cinética de la deposición y depuración de Ap en el cerebro de ratones APP/PS, sino también a la integridad de las sinapsis que rodean los depósitos de amiloide.

Se determinaron las densidades de los elementos presinápticos y postsinápticos (sinapsina-1 y PSD95, respectivamente) mediante tomografía de matriz, una técnica de alta resolución basada en la tinción por inmunofluorescencia de secciones de tejido ultrafinas (K. D. Micheva, S. J. Smith, Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron 55, 25 (5 de julio de 2007); R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 4012 (10 de marzo de 2009)). Dado que se demostró que las especies amiloides oligoméricas están muy concentradas en las proximidades de los depósitos de amiloide, los puntos de sinapsina-1 y PSD95 se cuantificaron lejos (>50 pm) o cerca (<50 pm) de las placas utilizando protocolos anteriormente establecidos (R. M. Koffie et al. Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci USA 106, 4012 (10 de marzo de 2009)). Se observó que la pérdida de elementos presinápticos cerca de las placas se exacerbaba cuando se expresaba APOE3 o APOE4, lo que no era el caso después de la inyección de AAV4-APOE2 o AAV4-GFP (figura 13A). Por el contrario, la densidad de los puntos postsinápticos se mantuvo sin cambios entre los ratones inyectados con GFP, ApoE2 y ApoE3, mientras que los animales tratados con ApoE4 mostraron una pérdida significativa de PSD95 alrededor de los depósitos de amiloide, reforzando de este modo el efecto adverso de la ApoE4 sobre los efectos neurotóxicos de Ap (figura 13C). Cuando se evaluó la densidad de elementos sinápticos en áreas ubicadas lejos de los depósitos de amiloide (>50 pm), no se pudo detectar ninguna diferencia entre los grupos, lo que sugiere que no hay efecto de las variantes de la ApoE humana por sí mismas sobre la densidad sináptica, pero sí un efecto importante de las isoformas de la ApoE sobre la neurotoxicidad inducida por Ap. Por lo tanto, la pérdida sináptica relativa observada con la ApoE3 y la ApoE4 está directamente relacionada con la presencia de péptidos Ap que rodean cada placa (a una distancia <50 pm de su borde).

Como parámetro neuropatológico adicional, también se evaluó el número de distrofias neuríticas asociadas con los depósitos de amiloide en ratones APP/PS1 inyectados con AAV4. Además de una disminución de la densidad espinal a su alrededor, las placas seniles también provocan una alteración más general del neuropilo con un aumento de la curvatura de las neuritas y la aparición de distrofias inflamadas. Estos cambios patológicos son probablemente atribuibles a especies de Ap oligoméricas solubles que están enriquecidas en una región dentro de los 50 |om de la superficie de la placa. Se observó que la sobreexpresión de la ApoE4 exacerba la formación de distrofias neuríticas positivas para SMI312 asociadas con los depósitos de amiloide en comparación con GFP, ApoE2 y ApoE3 (figura 13C). Este resultado confirma la observación de que la isoforma ApoE4 tiene el efecto más fuerte y no solo modula la formación de placas, sino que también afecta a la neurotoxicidad asociada al amiloide.

Las proteínas ApoE humanas modifican la cantidad de especies de Ap oligoméricas contenidas en el líquido intersticial en otro modelo de ratón de EA

A continuación, se abordó la cuestión de si la presencia de diferentes isoformas de la ApoE dentro del ISF puede alterar la cantidad de especies de amiloide solubles en ese mismo compartimento extracelular. Se eligió inyectar a otro modelo de EA, los ratones Tg2576, para validar los hallazgos anteriores de los inventores de la presente invención en una línea diferente de ratones transgénicos. Los ratones Tg2576 sobreexpresan la forma mutada de APP que contiene la mutación sueca y presentan un fenotipo mucho más leve que los ratones APP/PS1 a una edad determinada. Se inyectaron cohortes de animales de 16 a 18 meses de edad, de modo que los depósitos de amiloide ya estaban presentes en el momento de la transducción de AAV4-APOE. Tres meses después de la transferencia génica, se insertó una sonda de microdiálisis en el hipocampo y se recogieron muestras para caracterizar los primeros cambios asociados con cada variante de APOE dentro del ISF.

Se observó que la concentración de especies oligoméricas de Ap medida con el ensayo ELISA específico 82E1/82E1 fue significativamente mayor (en un 42 ± 7 %) después de la inyección de AAV4-APOE4 en comparación con AAV4-APOE2 (figura 14), lo que sugiere que la presencia de la ApoE puede modular la naturaleza de los agregados amiloides en este compartimento extracelular. Además, cuando se evaluaron los AP40 y AP42 totales en el ISF se observaron las mismas tendencias pero no alcanzaron significación (figura 17A), lo que sugiere que la presencia de diferentes isoformas de la ApoE en el ISF influye en el estado de agregación de los péptidos amiloides algo más que la cantidad total.

Tal como era de esperar, los análisis bioquímicos post-mortem de cerebros de ratones Tg2576 expuestos a las diversas isoformas de la ApoE mostraron que la concentración de AP42 en la fracción de ácido fórmico aumentó significativamente en los animales tratados con la ApoE4 (figura 17B), confirmando en un segundo modelo transgénico las observaciones de los inventores de la presente invención en ratones APP/PS1.

En conjunto, estas mediciones bioquímicas sugieren que la expresión de la ApoE en ratones Tg2576 induce cambios similares en la biología amiloide a los observados en ratones APP/PS1. Es importante destacar que se observa un cambio temprano en el contenido de oAp dentro del ISF, en el que estas especies neurotóxicas pueden interactuar directamente con las terminales sinápticas.

DISCUSIÓN

La sorprendente conexión entre la herencia de los alelos APOE4 que aumentan el riesgo y los alelos APOE2 que tienen un efecto opuesto drástico para el desarrollo de la EA ha llevado a múltiples sugerencias sobre cómo se media este riesgo. Se ha implicado a la ApoE como una proteína de unión a Ap implicada en la depuración de Ap. Sin embargo, los estudios en ratones con genes inactivados (knockout, KO) para la ApoE informaron sorprendentemente que los depósitos de Ap eran sustancialmente menores en ausencia de la ApoE. La sustitución por APOE2, APOE3 o APOE4 humanos condujo a un aumento de los depósitos de amiloide en el mismo orden que en los pacientes con EA, lo que se postuló que se producía a través de un efecto sobre el inicio de las placas o la formación de fibrillas. Las hipótesis alternativas se centran en los efectos diferenciales sobre el crecimiento neurítico, o incluso proponen que el efecto del genotipo APOE sobre el fenotipo de la enfermedad de Alzheimer es una consecuencia de otro gen en desequilibrio genético con APOE en el cromosoma 19.

Los datos de los inventores de la presente invención, derivados del estudio de 2 modelos de ratón diferentes utilizando un enfoque anteriormente sometido a ensayo en el contexto de la enfermedad de almacenamiento lisosómico y la enfermedad de Huntington, abordaron directamente estos problemas mediante la utilización de una combinación de obtención de imágenes multifotónicas in vivo, inmunohistopatología cuantitativa convencional, estudios de tomografía de matriz de la estructura sináptica y enfoques de microdiálisis de alto peso molecular novedosos que permiten el examen de la Ap oligomérica. Se demostró que cambiar el microambiente de la ApoE en el ISF en animales con enfermedad establecida tiene efectos específicos de alelos rápidos y sorprendentes en la economía de Ap. El estudio de los inventores de la presente invención demostró que incluso un aumento modesto (~10 %) en los niveles de la ApoE4, administrada al ISF, impacta notablemente sobre el fenotipo de Ap y la cinética de depuración, con una retención de Ap soluble asociada con la ApoE4 aumentada, así como formas fibrilares y extraíbles en ácido fórmico, y aumenta la neurotoxicidad alrededor de las placas marcadas por la pérdida sináptica y el aumento de distrofias neuríticas. Por el contrario, la ApoE2 disminuye Ap y tiene un marcado efecto neuroprotector.

Dado que los cambios modestos en los niveles de la ApoE en el ISF tienen consecuencias tan drásticas, estos resultados pueden llevar a comprender los efectos de una amplia variedad de factores ambientales y genéticos que podrían alterar el riesgo de EA o la progresión de la EA, influyendo en la expresión de APOE. Se pueden producir aumentos en la ApoE de una magnitud sustancialmente superior a la que se ha demostrado después de traumatismos, epilepsia, isquemia y dietas con alto contenido en colesterol, todas las cuales se han asociado con Ap cerebral elevada. Además, los polimorfismos del promotor que se han encontrado anteriormente en desequilibrio genético con el alelo APOE4 impactan en la expresión de A^pO^e.

Otras manipulaciones que afectan a la homeostasis de ApoE o ApoE-lipoproteínas en el SNC cambian claramente la deposición de Ap. Por ejemplo, en experimentos con transferencia génica focal con lentivirus de APOE (principalmente en neuronas del hipocampo), la sobreexpresión de APOE4 ejerce un efecto más intenso sobre el amiloide en relación con APOE3. Estudios anteriores también demostraron que los agonistas de RXR, que tienen múltiples efectos, incluida la potenciación de la síntesis de ApoE endógena, conducen a la eliminación de Ap del cerebro, quizás por un efecto sobre la depuración a través de la barrera hematoencefálica. Además, la transducción cerebral de CYP46A, que metaboliza el colesterol en el SNC y reduce sus niveles, reduce la deposición de Ap al igual que el aumento de LDL-R en el cerebro, que se sabe que reduce los niveles de ApoE. Finalmente, las manipulaciones genéticas sugieren que cambiar la expresión de la ApoE a la mitad puede afectar al fenotipo de Ap. Los resultados de los inventores de la presente invención sugieren que, de manera interesante, cambios más modestos también pueden tener efectos drásticos.

Los datos de los inventores de la presente invención abordan directamente otras cuatro áreas importantes de controversia en la bibliografía de APOE-Alzheimer. 1) Se ha demostrado un efecto claro de la isoforma de ApoE sobre la neurotoxicidad evaluada por la pérdida de sinapsis y distrofias neuríticas, ambas relacionadas probablemente con alteraciones de la función del sistema nervioso. Dado que estos efectos resultaron evidentes en la vecindad inmediata de las placas, pero no en áreas alejadas de las placas, la naturaleza protectora de la sinapsis de la ApoE2 en comparación con la ApoE4 probablemente esté mediada por efectos sobre Ap de la peri-placa más que por un efecto directo de la ApoE sobre la estabilidad sináptica. 2) La observación directa de la cinética de deposición y crecimiento de las placas utilizando obtención de imágenes multifotónicas longitudinales in vivo muestra que la ApoE4 potencia la deposición y el crecimiento de las placas, mientras que la ApoE2 está realmente asociada con la resolución de las placas, argumentando que las isoformas de la ApoE tienen un impacto poderoso en el ritmo y progresión de enfermedad más allá de un efecto inicial sobre la formación de placas fibrilares. Los resultados refuerzan la idea de que la ApoE4 puede acelerar el proceso patológico en términos de deposición de amiloide y neurotoxicidad (y, por lo tanto, conducir a una edad de inicio más temprana) mientras que la ApoE2 hace lo contrario, lo que plantea la posibilidad de que la introducción de la ApoE2 (o un mimético de la ApoE2 ) en el SNC podría tener valor terapéutico incluso después de que la enfermedad esté bien establecida. 3) Se ha sugerido de diversas formas a la ApoE como un mecanismo para depurar Ap del cerebro o como una molécula de retención que aumenta la semivida de depuración; los resultados actuales de los inventores de la presente invención muestran que la introducción de cantidades modestas de la ApoE en el ISF es suficiente para mejorar la retención de Ap en el SNC, a menos que sea la ApoE2. 4) Los mecanismos de la notable acción protectora de APOE2 en la EA no han estado claros durante mucho tiempo, en parte porque la ApoE2 se une a los receptores de la ApoE de manera relativamente escasa. Los datos actuales de los inventores de la presente invención sugieren que la ApoE2 tiene una ganancia de función, capaz de revertir realmente los depósitos de Ap establecidos, así como de respaldar la plasticidad sináptica y neurítica, además de un probable efecto neutro o nulo sobre la depuración de Ap en el plasma. Esto sugiere que las décadas de diferencia en la edad de inicio entre los pacientes que heredan los alelos APOE4 y APOE2 puede reflejar tanto un punto de inicio diferente como diferencias continuas en la cinética de deposición y depuración de Ap, así como diferencias específicas de alelos en el grado de neurotoxicidad asociada con los depósitos. Esta función dual de la ApoE2 puede conducir a enfoques terapéuticos destinados a imitar su capacidad de depuración de placas y de restauración sináptica.

Estos resultados son consistentes con un modelo en el que la ApoE actúa como un armazón para la oligomerización de Ap, con eficiencia de formación y estabilización de la Ap oligomérica ApoE4>ApoE3>ApoE2, y con la reciente observación de los inventores de la presente invención de que la Ap oligomérica está aumentada en el SNC de pacientes humanos con EA ApoE4>ApoE3 (incluso cuando la carga de placas se normaliza en todos los casos). Si la ApoE, especialmente la ApoE4, media la formación de la Ap oligomérica neurotóxica, se predijo que el aumento de ApoE4 conduciría a un aumento de alteraciones sinápticas y neuríticas, tal como parece ser el caso en los datos actuales. Basados en estos resultados, se debe tener precaución con respecto a los agentes que aumentarían los niveles de la ApoE en el cerebro en pacientes con EA que han heredado el alelo APOE4.

Finalmente, los datos de los inventores de la presente invención confirman el poder de la transducción de epéndimo mediada por AAV para administrar proteínas secretadas al cerebro y, desde aquí, a todo el manto cortical. La transferencia génica u otros enfoques que disminuyen la ApoE4 o aumentan la ApoE2 son un medio poderoso para influir en la progresión de la EA.

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Animales . Los experimentos se realizaron utilizando ratones doblemente transgénicos APPswe/PS1dE9 (APP/PS1) (D. R. Borchelt et al., Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron 19, 939 (octubre de 1997)) (obtenidos del Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) y ratones Tg2576 (K. Hsiao et al., Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 274, 99 (4 de octubre de 1996)). Se insertó un gen de proteína precursora de amiloide mutante humana que contenía la doble mutación sueca K594N/M595L en el genoma de estas dos razas de ratón, bajo el control del promotor de la proteína priónica. Además, el modelo de ratón APP/PS1 sobreexpresa una variante del gen de presenilina 1 delecionado para el exón 9 (impulsado por el mismo promotor). La sobreexpresión simultánea de APPswe y PSEN1 en ratones APP/PS1 conduce a un fenotipo más grave, con una deposición sustancial de amiloide visible tan pronto como a los 6 meses de edad. Por otro lado, la raza de ratones Tg2576 es un modelo mucho más leve que solo desarrolla placas amiloides aproximadamente al año de edad. Para determinar si la introducción de diferentes isoformas de la ApoE afectaría a la progresión de la enfermedad, se inyectaron ratones APP/PS1 (entre 4 y 7 animales por afección) y Tg2576 (entre 3 a 5 animales por afección) de 7 meses y 16 meses de edad, respectivamente. También se utilizaron ratones deficientes en APOE (ApoE-KO, del Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine). Los experimentos se realizaron según los NIH y las pautas institucionales.

Construcción y producción de vectores virales

El ADNc de APOE-2, APOE-3 y APOE-4 fue proporcionado generosamente por el Dr. LaDu de la Universidad de Illinois (Chicago). Después de la amplificación mediante PCR, cada uno de ellos se digirió mediante BamHI y se insertó en un esqueleto de AAV2-pCMV-hrGFP. Se produjeron títulos elevados de vectores de serotipo 4 de Aa V (AAV4-APOE2, AAV4-APOE3, AAV4-APOE4 y AAV4-GFP) utilizando el sistema de baculovirus mediante el Gene Transfer Vector Core de la Universidad de Iowa, Iowa City. Los virus se titularon mediante PCR cuantitativa.

Inyecciones intraventriculares estereotácticas . Se realizaron inyecciones intraventriculares estereotácticas de vectores de serotipo 4 de AAV tal como se ha descrito anteriormente (T. L. Spiers et al., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (3 de agosto de 2005); G. Liu, I. H. Martins, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Adeno-associated virus type 4 (AAV4) targets ependyma and astrocytes in the subventricular zone and RMS. Gene Ther 12, 1503 (octubre de 2005)). Los animales se anestesiaron mediante inyección intraperitoneal de ketamina/xilazina (100 mg/kg y 50 mg/kg de peso corporal, respectivamente) y se colocaron sobre un marco estereotáctico (David Kopf Instruments, Tujunga, California). Se realizaron inyecciones de vectores en cada ventrículo lateral con 5 pl de preparación viral (título 2 x 1012 vg/ml) utilizando una micropipeta afilada de calibre 33 unida a una jeringa Hamilton de 10 pl (Hamilton Medical, Reno, Nevada) a una velocidad de 0,25 pl/minuto. Las coordenadas estereotácticas de los sitios de inyección se calcularon a partir del bregma (anteroposterior 0,3 mm, mediolateral ±1 mm y dorsoventral -2 mm).

Implantación de la ventana craneal y obtención de imágenes multifotónicas . Una semana después de la inyección intraventricular, los ratones fueron anestesiados con isoflurano (1,5 %) y se implantó una ventana craneal extrayendo un trozo de cráneo y reemplazándolo con un cubreobjetos de vidrio de 8 mm de diámetro (tal como se ha descrito anteriormente, T. L. Spiers et al., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (3 de agosto de 2005)). Para la obtención de imágenes, se construyó un anillo de cera a lo largo del borde de la ventana para crear un pocillo de agua para el objetivo (objetivo 20x, apertura numérica de 0,95, Olympus). Con el objeto de visualizar los depósitos de amiloide, los animales transgénicos recibieron una inyección intraperitoneal de metoxi-XO4 (5 mg/kg) 24 horas antes de la cirugía, un compuesto fluorescente que atraviesa la barrera hematoencefálica y se une a los depósitos de amiloide (B. J. Bacskai, W. E. Klunk, C. A. Mathis, B. T. Hyman, Imaging amyloid-beta deposits in vivo. J Cereb Blood Flow Metab 22, 1035 (septiembre de 2002)). Antes de la obtención de imágenes, se inyectó dextranorojo de Texas (70.000 Da de peso molecular; 12,5 mg/ml en PBS estéril; Molecular Probes, Eugene, Oregón) en una vena lateral de la cola para proporcionar un angiograma fluorescente, de modo que la forma de la vasculatura fuera utilizada como un punto de referencia para seguir exactamente los mismos campos de visión a lo largo del tiempo. Se obtuvieron imágenes de los ratones una semana después de la inyección de AAV para evaluar el nivel inicial de depósitos de amiloide, posteriormente, uno y dos meses después de la inyección.

Un láser Ti:Sapphire en modo bloqueado (MaiTai, Spectra-Physics, Mountain View, California) montado en un sistema de obtención de imágenes multifotónicas (Bio-Rad 1024ES, Bio-Rad, Hercules, California) generó una luz de excitación de fluorescencia bifotónica de 860 nm. La luz emitida se recogió a través de un detector externo personalizado que contenía tres tubos fotomultiplicadores (Hamamatsu Photonics, Bridgewater, Nueva Jersey), en el intervalo de 380-480, 500-540 y 560-650 nm. Se adquirieron imágenes a 2 colores simultáneamente para placas y angiografía. Se obtuvieron imágenes in vivo de bajo aumento (615 x 615 pm; paso z, 2 pm, profundidad, -200 pm) y de 6 a 8 campos de visión para cubrir una gran área cortical.

Procesamiento y análisis de imágenes . La densidad de placas en cada campo de visión se cuantificó utilizando Image J, informando del número total de depósitos de amiloide por volumen de corteza obtenida por imagen. Se consideró el volumen cortical comenzando desde el primer corte de la pila z en la superficie hasta el último corte en el que se pudo detectar un depósito de amiloide. Se evaluó el tamaño de los depósitos de amiloide a lo largo del tiempo midiendo su área de sección transversal desde la intensidad máxima después de la proyección bidimensional. Para cada placa, se calculó la proporción del área entre el punto de tiempo inicial y el primer mes (T1/T0), o entre los meses segundo y primero (T2/T1).

Los ajustes del microscopio multifotónico (potencia del láser y PMT) se mantuvieron sin cambios a lo largo de las diferentes sesiones de obtención de imágenes durante todo el tiempo del experimento.

Muestreo de microdiálisis in vivo . El muestreo de microdiálisis in vivo de ApoE y Ap intersticial cerebral se realizó en ratones Tg2576, 3 meses después de la inyección intracerebroventricular de cada AAV4 (S. Takeda et al., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse. Neuroscience 186, 110 (14 de julio de 2011)). La sonda de microdiálisis tenía un eje de 4 mm con una membrana de polietileno (PE) de 3,0 mm y 1000 kDa de valor de corte de peso molecular (MWCO, del inglés molecular weight cut off) (PEP-4-03, Eicom, Kyoto, Japón). Antes de su utilización, la sonda se acondicionó sumergiéndola brevemente en etanol y, posteriormente, se lavó con tampón de perfusión de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) (en mM: 122 NaCl, 1,3 CaCl2, 1,2 MgCl2, 3,0 KH2PO4, 25,0 NaHCO3) que se filtró a través de una membrana de tamaño de poro de 0,2 pm. La salida y la entrada de la sonda preacondicionada se conectaron a una bomba peristáltica (ERP-10, Eicom, Kyoto, Japón) y una bomba de microjeringa (ESP-32, Eicom, Kyoto, Japón), respectivamente, utilizando tubos de etileno-propileno fluorado (FEP) (9250 pm d.i.).

La implantación de la sonda se realizó tal como se ha descrito anteriormente (S. Takeda et al., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in freemoving mouse. Neuroscience 186, 110 (14 de julio de 2011; J. R. Cirrito et al., In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. J Neurosci 23, 8844 (1 de octubre de 2003)), con ligeras modificaciones. Brevemente, a los animales anestesiados (isoflurano al 1,5 %) se les implantó estereotácticamente una cánula guía (PEG-4, Eicom, Kyoto, Japón) en el hipocampo (bregma -3,1 mm, -2,5 mm lateral a la línea media, -1,2 mm ventral a la duramadre). A continuación, la guía se fijó al cráneo con cemento dental binario.

Cuatro días después de la implantación de la cánula guía, los ratones se colocaron en una jaula de microdiálisis convencional y se insertó una sonda a través de la guía. Después de la inserción de la sonda, para obtener registros estables, la sonda y los tubos de conexión se perfundieron con LCRa durante 240 min a un caudal de 10 pl/min antes de la recogida de la muestra. Las muestras se recogieron a un caudal de 0,25 (para la cuantificación de Ap) y 0,1 pl/min (para la detección de la ApoE). Las muestras se almacenaron a 4 °C en tubos de polipropileno. Durante la recogida de muestras de microdiálisis, los ratones estaban despiertos y se movían libremente en la jaula de microdiálisis diseñada para permitir el movimiento de los animales sin restricciones sin aplicar presión sobre el conjunto de la sonda (sistema de microdiálisis AtmosLM, Eicom, Kyoto, Japón).

Análisis inmunohistológico . Los ratones APP/PS1 se sacrificaron mediante inhalación de CO2 a los 2 o 5 meses después de la inyección intraventricular (exposición a corto y largo plazo), mientras que los animales Tg2576 se sacrificaron después de 3 meses. Se fijó un hemisferio cerebral completo en paraformaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfato para análisis inmunohistológico y se incrustó en cera de parafina. Se procesó una sección coronal de 1 mm a través de la corteza frontal para el ensayo de tomografía de matriz, mientras que el resto del hemisferio cerebral se ultracongeló para realizar análisis bioquímicos y biomoleculares.

Para detectar depósitos de amiloide, ApoE y GFP, las secciones incluidas en parafina (10 pm) se desparafinaron secuencialmente en xileno, se rehidrataron en etanol, se trataron en tampón citrato (citrato de sodio 10 mM, Tween 20 al 0,05 %, pH 6,0), se permeabilizaron en PBS con Triton al 0,5 % y se bloquearon en PBS con BSA al 3 % durante 2 horas a temperatura ambiente. La incubación con anticuerpos primarios se realizó durante la noche a 4 °C: Bam10 (SIGMA 1:1000) y R1282 (1:500, proporcionado por el Dr. Dennis Selkoe) para placas amiloides, anticuerpo monoclonal de ratón 3H1 (Ottawa Heart Institute) para la ApoE humana, anti-GFP de pollo (1:500, Aves) y SMI-312 (Covance) para distrofias neuríticas. La incubación con el anticuerpo secundario se realizó durante 2 horas a temperatura ambiente al día siguiente. Las placas amiloides de núcleo denso se marcaron incubando las secciones durante 8 minutos en una solución de Thio-S (Sigma, St Louis, Missouri) al 0,05 % en etanol al 50 % antes del montaje.

Preparación de muestras, inmunotinción y análisis de imágenes para tomografía de matriz

Los análisis de tomografía de matriz para los elementos presinápticos y postsinápticos se realizaron tal como se ha descrito anteriormente (R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci USA 106, 4012 (10 de marzo de 2009)). Brevemente, se diseccionó un trozo de tejido cortical (1 mm3) adyacente a la región ventricular y se fijó durante 3 h en paraformaldehído al 4 %, sacarosa al 2,5 % en PBS 0,01 M. Después de la deshidratación en etanol, las muestras se incubaron en resina LR White (Electron Microscopy Sciences) durante toda la noche a 4 °C antes de la polimerización a 53 °C. A continuación, se cortaron cintas de secciones (70 nm) en un micrótomo de ultracorte (Leica) utilizando un cuchillo de diamante Jumbo Histo (Diatome).

Después de la rehidratación en glicina 50 mM en TBS durante 5 minutos, las secciones se bloquearon en Tween al 0,05 % y BSA al 0,1 % en Tris durante 5 minutos, y se aplicaron anticuerpos primarios 1:50 en tampón de bloqueo durante 2 horas (PSD95 Abcam Ab12093, sinapsina I Millipore AB1543 y NAB61 de la Dra. Virginia Lee que tiñe, preferentemente, especies de Ap oligoméricas, E. B. Lee et al., Targeting amyloid-beta peptide (Abeta) oligomers by passive immunization with a conformation-selective monoclonal antibody improves learning and memory in Abeta precursor protein (APP) transgenic mice. J Biol Chem 281, 4292 (17 de febrero de 2006)). Los portaobjetos se lavaron con TBS y se aplicaron anticuerpos secundarios (anticuerpo de cabra anti-Alexa Fluor 488, anticuerpo de ratón anti-Cy3 o anticuerpo de ratón anti-Alexa Fluor 488, Invitrogen). Las imágenes se obtuvieron en 7-30 secciones en serie a través de la corteza frontal y se adquirieron utilizando un microscopio confocal/multifotónico Zeiss Axioplan LSM510 (objetivo de aceite Plan Apochromatic de apertura numérica 63x).

Las imágenes se analizaron tal como se ha descrito anteriormente utilizando Image J (software abierto de los Institutos Nacionales de Salud) y MATLAB (Mathworks) (R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci USA 106, 4012 (10 de marzo de 2009)). Cada conjunto de imágenes se convirtió en pilas y se alineó mediante los complementos MultiStackReg y StackReg de Image J (cortesía de Brad Busse y P. Thevenaz, Universidad de Stanford). Se seleccionaron volúmenes conocidos y se utilizó un programa de detección automatizado basado en umbrales para contar puntos tanto de PSD95 como de sinapsina que aparecieron en más de una sección consecutiva (programa WaterShed, proporcionado por Brad Busse, Stephen Smith y Kristina Micheva, Universidad de Stanford). WaterShed exportó una pila de imágenes con umbral (separada para cada canal) que mostraba puntos que estaban presentes en más de una parte de la matriz. Se tomaron muestras de diversos sitios de la corteza por ratón y se midió su distancia desde el borde de una placa.

Cuantificación de Ap

Las concentraciones de AP40 y AP42 en la fracción soluble en TBS, la fracción de ácido fórmico y en el microdializado se determinaron mediante ELISA tipo sándwich BNT-77/BA-27 (para AP40) y BNT-77/BC-05 (para AP42) (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japón), según las instrucciones del fabricante. La cantidad de oligómero Ap en la muestra se determinó mediante ELISA tipo sándwich 82E1/82E1 (Immuno-Biological Laboratories, Inc, Hamburgo, Alemania), en el que se utilizaron los mismos anticuerpos N-terminales (residuos 1-16) tanto para la captura como para la detección. (W. Xia et al., A specific enzyme linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in human plasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease. Arch Neurol 66, 190 (febrero de 2009)).

Análisis por inmunotransferencia

Se sometieron a electroforesis fracciones solubles en TBS de cerebro y microdializados (20 |xg de proteína) en geles Novex Bis-Tris al 4-12 % (Invitrogen) en tampón de ejecución MOPS para SDS-PAGE (Invitrogen). Los geles se transfirieron a una membrana de PVDF y se bloquearon durante 60 min a t.a. en leche al 5 %/TBS-T. Las membranas se sondaron con anticuerpo de cabra anti-ApoE (1:1000, Millipore, AB947) para detectar una pequeña cantidad de APOE en el ISF de animales sin APOE, a la vez que se detectó albúmina como control. Las transferencias para la ApoE humana y de ratón se sondaron, respectivamente, con anticuerpo EP1373Y (1:1000, Novus Biologicals, NB110-55467) y con anticuerpo policlonal de conejo contra ApoE (1:1000, Abcam, ab20874). La incubación con anticuerpos IgG de cabra conjugados con HRP (Vector) se realizó durante 2 horas. Las proteínas inmunorreactivas se revelaron utilizando el kit ECL (Western Lightning, PerkinElmer) y se detectaron en Hyperfilm ECL (GE healthcare).

qRT-PCR

El ARN total de las muestras de cerebro se extrajo utilizando el reactivo TRIzol® (Life Technologies; 15596-026) y, posteriormente, se sintetizó el ADNc según las instrucciones del fabricante del sistema de RT-PCR de una etapa SuperScript® III (Life technologies; 12574-018). Los cebadores de PCR se diseñaron específicamente para amplificar el ARNm de APOE humano recombinante y los ARNm endógenos de ApoE y Gapdh (ApoE directo: 5'-AGCTCCCAAGTCACACAAGA; la ApoE inverso: 5'-GTTGCGTAGATCCTCCATGT; APOE directo: 5'-CCAGCGACAAT CACTGAAC; APOE inverso: 5'-GCGCGT AAT ACGACT CACT A; Gapdh directo: 5'- ATGACATCAAGAAGGTGGTG y Gapdh inverso: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTG).

ELISA de APOE

Se utilizaron ensayos ELISA específicos para detectar proteínas APOE tanto humanas como murinas endógenas. Brevemente, las placas de ELISA se recubrieron durante la noche con 1,5 ug/ml de anticuerpo de cabra anti-APOE (para detectar APOE murina) o 1,5 ug/ml de anticuerpo WUE4 (para detectar APOE humana) y se bloquearon con leche desnatada al 1 % diluida en PBS durante 1,5 h a 37 °C. Se utilizaron proteínas ApoE recombinantes humanas como patrones (para el ensayo específico para humanos, Biovision) o patrones de ratón internos a partir del extracto de cerebro (para el ensayo específico murino) y las muestras se diluyeron en tampón ELISA (BSA al 0,5 % y Tween-20 al 0,025 % en PBS) y se incubó durante toda la noche. Después del lavado, se utilizaron, respectivamente, anticuerpos de detección específicos para humanos (de cabra anti-ApoE, Millipore; 1:10.000) o de ratón (Abcam ab20874; 1:2.000), seguido de una incubación de 1,5 h con un anticuerpo secundario conjugado con HRP apropiado. El revelado de la señal se realizó utilizando el sustrato TMB antes de detener la solución utilizando H3PO4. Los resultados colorimétricos se midieron a 450 nm.

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism. Debido al pequeño tamaño de las muestras, no se pudo suponer la normalidad para la mayoría de los análisis. Para todos los análisis post-mortem, se realizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis seguida de una prueba de comparación múltiple de Dunn para evaluar el efecto de cada vector inyectado. Los datos de imágenes in vivo de la progresión de amiloide se analizaron utilizando un modelo de efectos mixtos, con un efecto aleatorio para el ratón y efectos fijos para el vector, el tiempo y la densidad volumétrica inicial. En este análisis se consideró una interacción entre el tiempo y el vector, pero no fue significativa. Para el análisis del tamaño de las placas a lo largo del tiempo, se ajustaron dos modelos de efectos mixtos para el logaritmo de la proporción de dos puntos de tiempo consecutivos, con efectos aleatorios para el ratón y efectos fijos para el tamaño del registro inicial (t0 en el primer análisis, t1 en el segundo análisis).

Ejemplo 4

La transferencia génica de isoformas de la ApoE humana modula de manera diferencial la deposición de amiloide y la neurotoxicidad en ratones

La herencia del alelo e4 de la apolipoproteína E (APOE) es el factor de riesgo genético más intensamente asociado con la forma esporádica de la enfermedad de Alzheimer (EA), mientras que el alelo raro APOE e2 tiene el efecto opuesto. Sin embargo, los mecanismos por los cuales APOE confiere riesgo y protección siguen siendo inciertos. En la presente memoria descriptiva, se utiliza un enfoque de transferencia génica para bañar la corteza de ratones transgénicos portadores de placas amiloides con APOE humana expresada viralmente. Se monitorizó la amiloide-p (Ap con obtención de imágenes multifotónicas, microdiálisis in vivo y tomografía de matriz post-mortem) para estudiar la cinética de los cambios mediados por APOE humana en la neurotoxicidad relacionada con Ap en ratones transgénicos. Se observó que la APOE4 humana aumentó las concentraciones de Ap oligomérica dentro del líquido intersticial (ISF) y exacerbó la deposición de placas; lo contrario ocurrió después de la exposición a APOE2 humana. La pérdida de sinapsis peri-placa y las distrofias neuríticas también empeoraron con APOE4 o se atenuaron con APOE2. La salida de Ap del sistema nervioso central (SNC) al plasma disminuyó con APOE3 y APOE4 en comparación con APOE2, según la retención específica de isoforma de Ap en el CNS. En general, los datos de los inventores de la presente invención muestran un efecto diferencial de las isoformas de la APOE humana sobre la deposición y depuración de amiloide en ratones transgénicos y, lo que es más importante, sobre la sinaptotoxicidad mediada por Ap. Estos resultados sugieren que el riesgo genético de APOE está mediado por Ap, y que los enfoques terapéuticos dirigidos a disminuir APOE4 o aumentar APOE2 pueden ser beneficiosos en la EA.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es el trastorno neurodegenerativo relacionado con la edad más frecuente y un importante problema de salud pública. Entre los genes de susceptibilidad asociados con la forma esporádica de aparición tardía de la EA, el alelo de la apolipoproteína E e4 (APOE e4) es, con diferencia, el factor de riesgo genético más significativo. La presencia de una copia de APOE e4 aumenta sustancialmente el riesgo de desarrollar la enfermedad en un factor de 3 en comparación con el alelo APOE e3 más común, mientras que las dos copias conducen a un aumento de 12 veces. Curiosamente, APOE e2 tiene un impacto opuesto y reduce el riesgo de EA ajustado por edad aproximadamente a la mitad. La edad promedio de aparición de la demencia corresponde a estos perfiles de riesgo, comenzando los portadores de APOE4/4 a mediados de los 60 y los portadores de APOE2/3 a principios de los 90, un cambio de casi 3 décadas, mientras que los individuos con APOE3/3 tienen una edad de aparición intermedia, a mediados de los 70.

Se cree que la acumulación de placas seniles que contienen Ap en el hipocampo y la corteza de los pacientes desempeña un papel central en la EA, porque todos los genes conocidos responsables de las formas autosómicas dominantes raras de la enfermedad participan en la producción de péptidos Ap. Es controvertido si la APOE afecta a la EA a través de un efecto sobre Ap. El genotipo APOE afecta intensamente al grado de deposición de amiloide en los pacientes, y los animales modificados genéticamente que expresan APOE2, APOE3 y APOE4 humanos tienen un orden de carga de amiloide similar al de los seres humanos, según la hipótesis de que diferentes isoformas de la APOE impactan en el inicio y/o el crecimiento de las placas. También se ha sugerido que las variantes de APOE modifican la cantidad de Ap oligomérica soluble neurotóxica e influyen de manera diferencial en la integridad cerebrovascular y la salida de Ap a través de la barrera hematoencefálica. Finalmente, la APOE se ha implicado directamente en la neurodegeneración y en la integridad sináptica. Se desconoce cómo la APOE2, que protege contra la EA, influye en estos procesos.

Debido a que la mayoría de los estudios anteriores de los efectos de APOE utilizaron la ablación genética de ApoE o la expresión de por vida de APOE en ratones transgénicos, actualmente se desconoce el impacto de la introducción de APOE después de que la deposición de placas ya haya comenzado. Sin embargo, es fundamental abordar este problema teniendo en cuenta que, actualmente, se están evaluando nuevos ensayos terapéuticos destinados a elevar la expresión de APOE y que la deposición de amiloide se puede observar décadas antes de los déficits cognitivos. Para superar esta laguna de conocimiento, se utilizó un enfoque de transferencia génica en el que se inyectaron vectores de virus adenoasociado (AAV) que expresan los diversos alelos APOE humanos (o, como control, proteína verde fluorescente, GFP, del inglés green fluorescent protein) en los ventrículos laterales de un modelo de ratón transgénico de EA para transducir la capa ependimaria, que posteriormente libera proteínas APOE humanas dentro del líquido cefalorraquídeo (LCR) y el líquido intersticial (ISF). Utilizando microscopía multifotónica intravital, microdiálisis in vivo y tomografía de matriz, se descubrió que las isoformas de la APOE humana afectaban a los niveles de Ap oligomérica soluble en el ISF, el ritmo de fibrilación y deposición de Ap y el grado de efectos neurotóxicos peri-placa. De hecho, los ratones con EA expuestos a APOE4 humana mostraron una mayor cantidad de Ap soluble, una mayor densidad de placas fibrilares, una exacerbación de la pérdida sináptica y un mayor número de distrofias neuríticas alrededor de cada depósito, mientras que se observó un efecto protector relativo con APOE2.

Resultados

La inyección intraventricular de AAV4-APOE conduce a ¡a producción sostenida de APOE humana en el cerebro

La APOE es una proteína secretada de manera natural, producida principalmente por astrocitos y microgliocitos, que se puede difundir por todo el parénquima cerebral. Se aprovechó esta propiedad inyectando un vector de serotipo 4 de AAV que porta un gen que codifica GFP o cada alelo APOE humano en los ventrículos cerebrales laterales de ratones transgénicos APP/PS1 de 7 meses de edad. Teniendo en cuenta las grandes áreas cerebrales afectadas por las lesiones características de la EA, esta estrategia podría ofrecer una ventaja en comparación con múltiples inyecciones intraparenquimatosas.

Dos meses después de la inyección, se detectaron células transducidas en el plexo coroideo y el epéndimo que recubre el ventrículo. Utilizando anticuerpos específicos de especie, también se detectaron proteínas APOE humanas y murinas mediante ensayo ELISA (figuras 18A-18B y figura 24B) y transferencia de tipo Western (figura 24A). La concentración de apolipoproteína E humana alcanzó, en promedio, 20 |xg/mg de proteína total (figura 18A), que representa alrededor del 10 % de las de ApoE murina endógena (figura 18BC). Esta modesta cantidad adicional de APOE humana no alteró significativamente los niveles de ARNm o proteína murinos endógenos (figuras 24A-24C). Se observó una disminución pequeña, pero estadísticamente significativa, en los niveles de APOE humana entre 2 y 5 meses después de la inyección de AAV4 (figura 24D). No obstante, las cantidades de proteína humana permanecieron fácilmente detectables, lo que sugiere que la transducción mediada por AAV4 proporcionó una plataforma para la producción sostenida de la proteína secretada en todo el parénquima. De hecho, la proteína APOE humana estaba presente alrededor de los depósitos de amiloide en todo el manto cortical, en el que se sabe que se acumula la proteína APOE.

A continuación, se evaluó la presencia de APOE humana en el ISF, un compartimento extracelular que contiene Ap soluble altamente activo biológicamente. Debido a la cantidad relativamente pequeña de APOE detectada en todo el lisado cerebral, se inyectó ApoE con vectores AAV4-APOE a ratones con genes inactivados y se rastreó la presencia de proteína APOE humana utilizando anticuerpos altamente sensibles pero no específicos de especie. La microdiálisis confirmó la presencia de APOE en el ISF de animales con genes inactivados a los que se había inyectado ApoE.

En general, estos datos confirman que una sola inyección intracerebroventricular de AAV4-APOE2/3/4 conduce a la producción sostenida de una proteína de interés en todo el parénquima cerebral y el ISF, y que el epéndimo/plexo coroideo se puede utilizar para administrar proteínas al cerebro.

La infusión de cada isoforma de APOE afecta de manera diferencial a los péptidos amiloides y a la deposición de placas

A ratones APP/PS1 de siete meses de edad con deposición sustancial de amiloide se les inyectaron vectores que expresaban GFP o cada isoforma de APOE humana durante 5 meses antes del sacrificio. Un análisis de la carga de placas amiloides reveló un aumento significativo en la densidad de los depósitos de amiloide en la corteza de los animales inyectados con AAV4-APOE4 en comparación con los que expresan APOE2 (AAV4-APOE2: 31 ± 4 y AAV4-APOE4: 77 ± 5 placas/mm2 de corteza; p<0,01). Las densidades de placas en ratones expuestos a GFP y APOE3 alcanzaron un nivel intermedio entre APOE4 y APOE2 (AAV4-GFP 54 ± 15; AAV4-APOE3: 47 ± 3 placas/mm2 de corteza; figura 19A) y también eran equivalentes a los de los animales no inyectados.

Las concentraciones de los péptidos AP40 y AP42 medidas a partir de extractos de ácido fórmico de cerebro de ratón imitaron los cambios observados histológicamente, de modo que se descubrió un aumento de péptidos amiloides en ratones que expresaban APOE4 (AP40: 1733 ± 338 pMol/mg de proteína y AP42: 8720 ± 1155 pMol/mg de proteína), y se detectó un efecto opuesto con APOE2 (AP40: 468 ± 105 pMol/mg de proteína y AP42: 5156 ± 1318 pMol/mg de proteína, p<0,05; figura 19B). El contenido de péptidos Ap en la fracción soluble en solución salina tamponada con Tris (TBS) se vio afectado de manera similar y se midieron concentraciones más elevadas de AP40 y AP42 solubles después de la exposición a APOE4 (AP40: 94 ± 18 pMol/mg de proteína y AP42: 12,9 ± 1,5 pMol/mg de proteína) en comparación con APOE2 (AP40: 20 ± 8 pMol/mg de proteína y AP42: 2,3 ± 0,8 pMol/mg de proteína, p<0,05; figura 19C).

La expresión de cada isoforma de APOE durante 2 meses produjo efectos menores que los observados después de 5 meses, lo que implica que el impacto de APOE en la formación o depuración de amiloide tardó varios meses en hacerse evidente cuando se evaluó post-mortem. Sin embargo, se observó un aumento significativo en la densidad de las placas amiloides dentro de la corteza de los ratones inyectados con AAV4-APOE4 en comparación con los otros grupos (AAV4-GFP. 25 ± 4; AAV4-APOE2: 22 ± 6; AAV4-APOE3: 26 ± 5 y AAV4-APOE4: 56 ± 4 placas/mm2 de corteza, p<0,05; figura 25A), en paralelo con la cantidad de AP40 contenida en la fracción de ácido fórmico (AAV4-GFP 725 ± 92; AAV4-APOE2: 492 ± 62; AAV4-APOE3: 681 ± 140 y AAV4-APOE4: 1108 ± 238 pMol/mg de proteína, p<0,05; figura 25C). Las concentraciones de especies de AP40/42 solubles en TBS no cambiaron, y no se detectó ningún cambio en la proporción de placas de núcleo denso con respecto a la inmunorreactividad total de AP (figura 25B). Experimentos de control adicionales no revelaron ningún impacto de la inyección de AAV4-APOE sobre el metabolismo de la proteína precursora amiloide (APP, del inglés Amyloid Precursor Protein), la activación glial o la cantidad de enzima de degradación de la insulina. En general, la comparación de los datos a los 2 y 5 meses de exposición sugiere que las alteraciones en la isoforma de APOE desplazan los depósitos fibrilares y solubles de AP durante meses, en lugar de actuar de forma breve.

La APOE afecta la barrera hematoencefálica (BHE) y altera la salida de péptidos AP. Para examinar cómo la exposición a APOE modula el equilibrio de los péptidos AP a través de la BHE, se midieron las concentraciones plasmáticas de AP40 después de 5 meses. El contenido plasmático de AP en ratones inyectados con AAV4-APOE3 o AAV4-APOE4 fue menor en comparación con AAV4-APOE2 y AAV4-GFP (AAV4-GFP 1167 ± 213; AAV4-APOE2: 1247 ± 160; AAV4-APOE3: 736 ± 78 y AAV4-APOE4: 799 ± 67 pMol/ml de plasma; p<0,05; figura 19D), lo que sugiere que APOE3 y APOE4 ayudaron a retener AP en el SNC, según las concentraciones cerebrales de AP relativamente aumentadas y con datos previos que informan una semivida más larga de AP en el SNC debido a la APOE.

Los portadores de APOE4 son más susceptibles a la disfunción neurovascular, y se demostró que la degradación de la BHE está favorecida en ratones transgénicos con APOE4, incluso en ausencia de deposición de amiloide. Para evaluar si las inyecciones de AAV4-APOE comprometían la integridad de la BHE, se realizó una tinción post-mortem con azul de Prusia. A pesar de la presencia de algunas áreas focales positivas para hemosiderina, no se observó ningún efecto entre ninguno de los grupos experimentales.

La expresión de isoformas APOE modula cinética de la amiloidosis

Para evaluar cómo las variantes de APOE afectan a la progresión dinámica de la amiloidosis, se utilizó obtención de imágenes bifotónicas in vivo y se siguió la cinética de la formación y depuración de placas amiloides. Los ratones recibieron una inyección intraventricular de AAV4 que portaba GFP o cada variante de APOE a los 7 meses de edad y se implantó una ventana craneal una semana después (T0). Después de 1 mes (T1) o 2 meses (T2), se obtuvieron imágenes de los depósitos de amiloide, siguiendo exactamente las mismas áreas corticales en el cerebro a lo largo del tiempo.

La mayoría de los depósitos de amiloide permanecieron estables, aunque ocasionalmente se pudieron detectar nuevas placas en el pequeño volumen de visualización. Sin embargo, en raras ocasiones, una placa positiva para metoxi de la que se obtuvieron imágenes al principio no se pudo detectar después de uno o dos meses, lo que sugiere que algunas placas se podrían depurar. La velocidad de progresión de amiloide fue más rápida en ratones APP/PS1 expuestos a APOE4, pero disminuyó, e incluso se invirtió, en animales expuestos a APOE2. Después de 2 meses, APOE2 redujo significativamente la densidad de depósitos de amiloide en proporción con GFP en 0,66 (p=0,002), en proporción con APOE3 en 0,67 (p<0,0001) y en proporción con APOE4 en 0,74 (p<0,0001) (figuras 20A, 20B)

A continuación, se evaluó el crecimiento de una sola placa amiloide midiendo la proporción del área de sección transversal de los depósitos individuales entre T1/T0 y T2/T1. Se detectaron diferencias entre los grupos en T1 (proporción T1/T0, figura 21), de modo que los depósitos de amiloide expuestos a APOE4 crecieron significativamente más en comparación con los animales expuestos a GFP, APOE2 y APOE3 (proporciones T1/T0: 1,175 ± 0,048 para AAV4-GFP, 0,97 ± 0,043 para AAV4-APOE2; 1,063 ± 0,041 para AAV4-APOE3 y 1,29 ± 0,065 para AAV4-APOE4; p<0,05). Sin embargo, este efecto no se observó después del segundo mes (proporción T1/T2).

Pérdida sináptica y distrofias neuríticas alrededor de los depósitos de amiloide después de la exposición a APOE

Se sabe que la pérdida de sinapsis se correlaciona con el deterioro cognitivo. Recientemente se ha demostrado que la presencia de APOE4 se asocia con concentraciones más elevadas de Ap oligomérica sináptica y una densidad sináptica disminuida alrededor de las placas amiloides en los cerebros de pacientes humanos con EA en comparación con APOE3. Además, ensayos in vitro recientes demostraron que la APOE4 no protegía contra la pérdida de sinapsis inducida por Ap. Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que la APOE puede afectar de manera diferencial no solo a la cinética de la deposición y depuración de Ap, sino también a la integridad de las sinapsis que rodean los depósitos de amiloide.

Se determinaron las densidades de los elementos presinápticos y postsinápticos (sinapsina-1 y PSD95) mediante tomografía de matriz, una técnica de alta resolución basada en la tinción por inmunofluorescencia de secciones de tejido ultrafinas (K. D. Micheva, S. J. Smith, Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron 55, 25 (5 de julio de 2007); R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci USA 106, 4012 (10 de marzo de 2009)). Dado que se demostró que las especies oligoméricas de amiloide están muy concentradas en las proximidades de los depósitos de amiloide, se cuantificaron los puntos de sinapsina-1 y PSD95 lejos (>50 pm) o cerca (<50 pm) de las placas. La pérdida de elementos presinápticos cerca de las placas se exacerbó cuando se expresó APOE3 o APOE4, lo que no sucedió después de la inyección de AAV4-APOE2 o AAV4-GFP (figura 22A). La densidad de los puntos postsinápticos se mantuvo sin cambios entre los ratones inyectados con AAV4-GFP, AAV4-APOE2 y AAV4-APOE3, mientras que los animales tratados con AAV4-APOE4 mostraron una mayor pérdida de PSD95 alrededor de los depósitos de amiloide, reforzando de este modo el efecto perjudicial de la APOE4 sobre la neurotoxicidad de Ap (figura 22B). Cuando se evaluó la densidad de elementos sinápticos en áreas ubicadas lejos de depósitos de amiloide (>50 pm), no se pudo detectar ninguna diferencia entre los grupos, lo que sugiere que la pérdida sináptica relativa observada con APOE3 y APOE4 estaba directamente relacionada con la presencia de péptidos Ap alrededor de cada placa.

También se evaluó el número de neuritas distróficas asociadas con depósitos de amiloide, dado que las placas neuríticas reflejan una alteración más general del neuropilo con un aumento de la curvatura de las neuritas y la aparición de distrofias inflamadas. Estos cambios patológicos son probablemente atribuibles a especies de Ap oligoméricas solubles que están enriquecidas en una región dentro de los 50 pm de la superficie de la placa. La expresión de APOE4 exacerba la formación de neuritas distróficas positivas para SMI312 asociadas con depósitos de amiloide en comparación con GFP, APOE2 y APOE3 (B 22C). Este resultado confirma la observación de que la isoforma APOE4 afecta a la neurotoxicidad de la amiloide.

Las proteínas APOE humanas modifican la cantidad de especies de Ap oligoméricas en el líquido intersticial en ratones Tg2576

A continuación, se abordó la cuestión de si la presencia de diferentes isoformas de la APOE humana dentro del ISF puede alterar la cantidad de especies de amiloide solubles en ese mismo compartimento extracelular. Se inyectaron ratones Tg2576 para validar los hallazgos anteriores de los inventores de la presente invención en un modelo de ratón de EA diferente. Los ratones Tg2576 presentan un fenotipo mucho más leve que los ratones APP/PS1 de la misma edad. Se trataron cohortes de animales de 16 a 18 meses de edad en los que ya había comenzado el depósito de amiloide. Tres meses después de la transferencia génica, se insertó una sonda de microdiálisis en el hipocampo y se recogieron muestras para caracterizar los primeros cambios asociados con cada variante de APOE humana.

Se observó que la concentración de oligómeros Ap medida con el ensayo ELISA específico 82E1/82E1 fue significativamente mayor (en 42 ± 7 %; p<0,05) después de la inyección de AAV4-APOE4 en comparación con AAV4-APOE2 (figura 23), lo que demuestra que la presencia de APOE puede modular la naturaleza de los agregados amiloides en el compartimento extracelular. Cuando se evaluaron los Ap40 y Ap42 totales en el ISF se observaron las mismas tendencias pero no alcanzaron significación (figura 26).

Tal como se esperaba, los análisis bioquímicos post-mortem de cerebros de ratones Tg2576 mostraron que la concentración de Ap42 en la fracción de ácido fórmico aumentó en los animales expuestos a APOE4 (figura 26B), confirmando en un segundo modelo transgénico las observaciones previas de los inventores de la presente invención en ratones APP/PS1.

Discusión

La sorprendente asociación genética entre la herencia de los alelos APOE y la EA ha dado lugar a múltiples sugerencias sobre cómo se media este riesgo. La APOE se une a Ap y se ha implicado en la depuración de Ap, pero los estudios en ratones con genes inactivados para ApoE muestran sorprendentemente que los depósitos de Ap son sustancialmente menores en ausencia de ApoE. La sustitución de ApoE murino endógeno por APOE2, APOE3 o APOE4 humanos modifica los depósitos de amiloide en el mismo orden que en los pacientes con EA, presumiblemente a través de los efectos sobre el inicio de la formación de placas o la formación de fibrillas. Las hipótesis alternativas se centran en los efectos diferenciales sobre el crecimiento neurítico, o la propuesta de que el efecto del genotipo APOE sobre el fenotipo de la EA es una consecuencia de otro gen en desequilibrio genético con APOE en el cromosoma 19.

Utilizando una tecnología de transferencia génica desarrollada recientemente (G. Liu, I. Martins, J. A. Wemmie, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Functional correction of CNS phenotypes in a lysosomal storage disease model using adeno-associated virus type 4 vectors. J Neurosci 25, 9321 (12 de octubre de 2005)) y dos modelos de ratón de EA, los datos de los inventores de la presente invención abordaron estos problemas mediante la utilización de una combinación de obtención de imágenes multifotónicas in vivo, inmunohistopatología cuantitativa convencional, tomografía de matriz y enfoques de microdiálisis de alto peso molecular que permiten el examen de la Ap oligomérica dentro del ISF. El estudio de los inventores de la presente invención demostró que un aumento modesto (~10 %) en los niveles de APOE4 alteró la cinética de agregación y depuración de Ap, lo que condujo a una mayor retención de Ap y exacerbó la pérdida sináptica y las distrofias neuríticas alrededor de las placas. Por el contrario, APOE2 disminuyó la deposición de Ap y tiene un marcado impacto neuroprotector. Los efectos observados no se correlacionaron con cambios en el contenido de productos proteolíticos de APP, lo que sugiere que la producción de Ap en sí misma no se vio afectada. De este modo, estos resultados argumentan que cantidades modestas de APOE4 y APOE2 en el ISF impactan en la depuración, deposición y neurotoxicidad de amiloide en direcciones opuestas. Debido a que se midieron cantidades más bajas de Ap en el plasma de ratones expuestos a APOE3 o APOE4 únicamente en el SNC, se planteó la hipótesis de que los resultados de los inventores de la presente invención se pueden deber a una depuración diferencial de Ap dentro del cerebro. Este efecto puede estar potencialmente relacionado con el estado de lipidación de cada variante de APOE producida por células ependimarias transducidas por AAV. De hecho, estudios previos han demostrado que hay menos APOE4 asociada a lipoproteínas en comparación con APOE2 y APOE3, de modo que el aumento de los niveles de lipoproteínas deslipidadas frente a lipidadas puede ser un mecanismo para los efectos diferenciales de las isoformas de la APOE sobre la acumulación y retención de Ap en el cerebro. Alternativamente, una limitación del estudio de los inventores de la presente invención es la posibilidad de que la expresión de APOE2 humana reduzca o desplace la ApoE murina en un compartimento crítico, produciendo de este modo un efecto análogo al observado en animales sin ApoE en los que se acumula menos Ap. No obstante, debido a que las mediciones directas de los inventores de la presente invención de la proteína ApoE murina y el ARNm no muestran un efecto global de la expresión de APOE humana en la proteína endógena, y debido a que APOE2 y APOE4 tienen impactos opuestos sobre la deposición de amiloide, se está a favor de un efecto directo de las isoformas de la APOE humana sobre la deposición de amiloide.

Dado que los cambios modestos en los niveles de APOE en el ISF tienen consecuencias tan drásticas, estos resultados también pueden llevar a comprender los efectos de una amplia variedad de factores ambientales y genéticos que podrían alterar el riesgo o la progresión de la EA al influir en la expresión de APOE. Los aumentos de APOE mayores que la magnitud que demostraron los inventores de la presente invención en la presente memoria descriptiva pueden tener lugar después de una lesión cerebral traumática, epilepsia, isquemia y una dieta con alto contenido en colesterol, todos los cuales se han asociado con Ap cerebral elevada. Además, los polimorfismos del promotor que se han encontrado en desequilibrio genético con el alelo APOE4 afectan a la expresión de APOE.

Otras manipulaciones que impactan en la homeostasis de las lipoproteínas APOE en el SNC cambian claramente la deposición de Ap. Por ejemplo, en experimentos con transferencia génica focal con lentivirus APOE (expresados principalmente en neuronas del hipocampo), la sobreexpresión de APOE4 ejerce un efecto más intenso sobre el amiloide en relación con APOE3. Estudios previos también mostraron que los agonistas del receptor X retinoide que potencian la síntesis de la APOE endógena condujeron a la depuración de Ap del cerebro (P. E. Cramer et al., ApoE-directed therapeutics rapidly clear beta-amyloid and reverse deficits in AD mouse models. Science 335, 1503 (23 de marzo de 2012); C. Bachmeier, D. Beaulieu-Abdelahad, F. Crawford, M. Mullan, D. Paris, Stimulation of the retinoid x receptor facilitates Beta-amyloid clearance across the blood-brain barrier. J Mol Neurosci 49, 270 (febrero de 2012)). Además, la transducción cerebral con CYP46A1, que metaboliza el colesterol en el SNC y reduce sus niveles, reduce la deposición de Ap al igual que el aumento de LDL-R en el cerebro, que se sabe que reduce los niveles de la APOE. Alternativamente, los péptidos que imitan a Ap que bloquean la interacción entre APOE3/4 y Ap o que convierten la estructura de APOE4 en una conformación de tipo APOE2 o APOE3 también mostraron efectos sobre la acumulación de amiloide. Finalmente, las manipulaciones genéticas sugieren que la disminución de la expresión de ApoE endógeno en un 50 % impacta fuertemente en el fenotipo de Ap durante la vida del animal. Los actuales resultados de los inventores de la presente invención, con APOE humano expresada sobre el nivel basal de ApoE murino, pueden ser resultado, en parte, de la competencia entre la APOE humana y la ApoE murina por las interacciones con Ap. Independientemente, estos datos sugieren que los cambios dependientes de isoformas humanas pueden tener efectos drásticos incluso después de que los cambios patológicos estén bien establecidos.

Los datos de los inventores de la presente invención abordan directamente 4 áreas importantes de controversia en la bibliografía de la APOE y la EA. Se demuestra un efecto claro de las isoformas de APOE sobre la neurotoxicidad evaluada por la pérdida de sinapsis y distrofias neuríticas, ambas relacionadas probablemente con el deterioro de la función del sistema nervioso. Como estos efectos resultaron evidentes en la vecindad inmediata de las placas, pero no en áreas alejadas de las placas, la protección de la sinapsis por la APOE2 probablemente esté mediada por efectos sobre Ap de la peri-placa en lugar de deberse a un impacto directo de la APOE sobre la estabilidad sináptica. Las imágenes multifotónicas longitudinales in vivo de la amiloidosis muestran que la APOE4 potencia la deposición y el crecimiento de las placas, mientras que la APOE2 se asocia con la resolución de las placas, argumentando que las isoformas de la APOE tienen un impacto poderoso en el ritmo y la progresión de la enfermedad más allá de un efecto inicial sobre la formación de placas fibrilares. Estos resultados refuerzan la idea de que la APOE4 puede acelerar el proceso patológico en términos de deposición de amiloide y neurotoxicidad (y, por lo tanto, conducir a una edad de inicio más temprana) mientras que la APOE2 hace lo contrario, lo que plantea la posibilidad de que la introducción de APOE2 (o un mimético de APOE2) en el SNC podría tener valor terapéutico. La APOE se ha sugerido de diversas formas como un mecanismo para depurar Ap del cerebro o como una molécula de retención que reduce la semivida de depuración; los actuales resultados de los inventores de la presente invención muestran que la introducción de cantidades modestas de APOE3/4 en el ISF es suficiente para potenciar la retención de Ap en el SNC. El mecanismo de la notable acción protectora de APOE2 en la EA no ha sido claro durante mucho tiempo, en parte porque la APOE2 se une a los receptores de APOE de manera relativamente escasa. Los actuales datos de los inventores de la presente invención sugieren que la APOE2 tiene una ganancia de función y es capaz de revertir los depósitos de Ap establecidos, así como respaldar la plasticidad sináptica y neurítica además de un probable efecto neutro o beneficioso (en comparación con otros alelos) sobre la retención de Ap en el SNC. Esto sugiere que las décadas de diferencia en la edad de inicio entre los pacientes que heredan los alelos APOE4 frente a APOE2 pueden reflejar tanto un punto de inicio diferente como diferencias continuas en la cinética de la deposición y depuración de Ap, así como diferencias específicas de alelos en el grado de neurotoxicidad asociada con los depósitos. Esta función dual de la APOE2 puede conducir a enfoques terapéuticos destinados a imitar su capacidad de depuración de placas y de restauración sináptica.

Estos resultados son consistentes con un modelo en el que la APOE actúa como un armazón para la oligomerización de Ap. Estos resultados también son consistentes con la reciente observación de los inventores de la presente invención de que la Ap oligomérica está elevada en el SNC de pacientes humanos con EA con APOE4>APOE3 (incluso cuando la carga de placas se normaliza en todos los casos). Si la APOE, especialmente la APOE4, media la formación de Ap oligomérica neurotóxica, la predicción sería que la expresión potenciada de la APOE4 conduciría a un aumento de alteraciones sinápticas y neuríticas, tal como parece ser el caso de los actuales datos de los inventores de la presente invención. Basándose en estos resultados, se debe tener precaución con respecto a los agentes que aumentarían las concentraciones de APOE en los cerebros de los portadores de APOE4.

Finalmente, los datos de los inventores de la presente invención destacan la utilidad de la transducción mediada por AAV de la capa ependimaria del cerebro para la administración de genes que codifican proteínas secretadas que posteriormente se difunden a través de todo el manto cortical. Se sugiere que la transferencia génica u otros enfoques que disminuyan APOE4 o aumenten APOE2 pueden ser útiles para impactar en la progresión de la EA.

Materiales y procedimientos

Diseño del estudio

El presente estudio tuvo como objetivo investigar cómo la introducción de cada isoforma de APOE humana influiría en la progresión de amiloide y la neurotoxicidad asociada a Ap, una vez que ha comenzado la deposición de placas. Para abordar esta cuestión, se realizó una única infusión con vectores de AAV que codifican para cada variante de APOE dentro del espacio intracerebroventricular de dos modelos de ratones transgénicos de EA diferentes. Los ratones estuvieron expuestos durante un período de tiempo corto (2-3 meses) o largo (5 meses). Utilizando obtención de imágenes in vivo, microdiálisis in vivo y tomografía de matriz, se evaluó el impacto de las isoformas de la ApoE humana no solo en la deposición y oligomerización de amiloide dentro del ISF, sino también en la neurotoxicidad relacionada con Ap (pérdida espinal y distrofias). Los ratones se asignaron al azar a los grupos de tratamiento. La naturaleza del vector inyectado se mantuvo con enmascaramiento hasta los análisis estadísticos. Todos los animales que se recuperaron con éxito de los procedimientos quirúrgicos se incluyeron en los análisis post-mortem. Los tamaños de las muestras se predeterminaron en función de la experiencia previa. Se llevó a cabo la replicación con una segunda raza transgénica para someter a ensayo adicionalmente las hipótesis.

Animales

Los ratones APPswe/PS1dE9 (APP/PS1) (D. R. Borchelt et al., Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron 19, 939 (octubre de 1997)) (Jackson Laboratory) y ratones Tg2576 (K. Hsiao et al., Correlative memory deficits, Abeta elevation, and amyloid plaques in transgenic mice. Science 274, 99 (4 de octubre de 1996)) expresan un gen de la proteína precursora de amiloide mutante humana que contiene la mutación sueca K594N/M595L, bajo el control del promotor priónico. El modelo APP/PS1 también sobreexpresa el gen de presenilina 1 delecionado para el exón 9, lo que conduce a un fenotipo grave con depósito de amiloide a los 6 meses de edad. La raza Tg2576 es un modelo más leve que desarrolla placas amiloides aproximadamente al año de edad. Se expusieron APP/PS1 de 7 meses de edad a cada vector de AAV durante 2 meses (n=4 animales inyectados con AAV4-GFP, n=4 animales inyectados con AAV4-APOE2, n=6 animales inyectados con AAV4-APOE3 y n=5 animales inyectados con AAV4-APOE4) o 5 meses (n=4 animales inyectados con AAV4-GFP, n=5 animales inyectados con AAV4-APOE2, n=6 animales inyectados con AAV4-APOE3 y n=5 animales inyectados con AAV4-APOE4). Además, se incluyó una cohorte de ratones Tg2576 de 16 meses de edad (n=3 animales inyectados con AAV4-GFP, n=3 animales inyectados con AAV4-APOE2, n=5 animales inyectados con AAV4-APOE3 y n=5 animales inyectados con AAV4-APOE4) para medir los niveles de Ap en el ISF. También se utilizaron ratones deficientes en APOE (Jackson Laboratory). Los experimentos se realizaron según los NIH y las pautas institucionales.

Construcción y producción de vectores virales

El ADNc de APOE-2, APOE-3 y APOE-4, proporcionado generosamente por el Dr. LaDu de la Universidad de Illinois (Chicago), se amplificó mediante PCR, se digirió mediante BamHI y se insertó en un esqueleto de AAV2-pCMV-hrGFP. Se produjeron vectores de serotipo 4 de AAV mediante el Gene Transfer Vector Core de la Universidad de lowa, lowa City. Los 'títulos de los virus de AAV se determinaron mediante PCR cuantitativa.

Inyecciones intracerebroventriculares estereotácticas

Se realizaron inyecciones intraventriculares de AAV tal como se ha descrito anteriormente (G. Liu, I. H. Martins, J. A. Chiorini, B. L. Davidson, Adeno-associated virus type 4 (AAV4) targets ependyma and astrocytes in the subventricular zone and RMS. Gene Ther 12, 1503 (octubre de 2005); T. L. Spiers et al., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (3 de agosto de 2005)). Los animales se anestesiaron (ketamina/xilazina: 100 mg/kg y 50 mg/kg de peso corporal, respectivamente) y se colocaron sobre un marco estereotáctico (David Kopf Instruments). Se realizaron inyecciones en cada ventrículo lateral con 5 |j.l de preparación viral (título 2 x 1012 vg/ml) utilizando una aguja de calibre 33 unida a una jeringa Hamilton de 10 |j.l (Hamilton Medical) a 0,25 ^.l/minuto. Las coordenadas estereotácticas se calcularon a partir del bregma (anteroposterior 0,3 mm, mediolateral ±1 mm y dorsoventral -2 mm).

Implantación de ventana craneal y obtención de imágenes multifotónicas

Se anestesió a los ratones con isoflurano (1,5 %) y se implantó una ventana craneal extrayendo un trozo de cráneo y reemplazándolo con un cubreobjetos de vidrio de 5 mm (T. L. Spiers et al., Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy. J Neurosci 25, 7278 (3 de agosto de 2005)). Para obtener imágenes, se construyó un anillo de cera para crear un pocillo de agua para el objetivo (20x, apertura numérica de 0,95, Olympus). Se visualizaron los depósitos de amiloide después de una inyección intraperitoneal de metoxi-XO4 (5 mg/kg) 24 horas antes de la cirugía, un compuesto fluorescente que atraviesa la BHE y se une a las placas (B. J. Bacskai, W. E. Klunk, C. A. Mathis, B. T. Hyman, Imaging amyloid-beta deposits in vivo. J Cereb Blood Flow Metab 22, 1035 (septiembre de 2002)). Se inyectó dextrano-rojo de Texas (70.000 Da de peso molecular; 12,5 mg/ml en PBS; Molecular Probes) en una vena lateral de la cola para proporcionar un angiograma fluorescente y seguir exactamente los mismos campos de visión a lo largo del tiempo. Se obtuvieron imágenes de los ratones una semana después de la inyección de AAV, y posteriormente, uno y dos meses después.

Un láser Ti:Sapphire en modo bloqueado (MaiTai, Spectra-Physics) montado en un sistema de obtención de imágenes multifotónicas (Bio-Rad 1024ES, Bio-Rad) generó una luz de excitación de fluorescencia bifotónica de 860 nm. La luz emitida se recogió a través de un detector externo que contenía tres tubos fotomultiplicadores (Hamamatsu Photonics), en el intervalo de 380-480, 500-540 y 560-650 nm. Se adquirieron imágenes a 2 colores simultáneamente para placas y angiografía. Se obtuvieron imágenes in vivo de bajo aumento (615 x 615 |om; paso z, 2 |om, profundidad, -200 |om) y de 6 a 8 campos de visión.

Procesamiento y análisis de imágenes

Se cuantificó la densidad de placas utilizando Image J informando del número total de depósitos de amiloide por volumen de corteza obtenida por imagen. Se consideró el volumen cortical comenzando desde el primer corte de la pila z en la superficie hasta el último corte en el que se pudo detectar un depósito de amiloide. Se evaluó el tamaño de los depósitos de amiloide a lo largo del tiempo midiendo su área de sección transversal desde la intensidad máxima después de la proyección bidimensional. Para cada placa, se calculó la proporción del área entre el punto de tiempo inicial y el primer mes (T1/T0), o entre los meses segundo y primero (T2/T1). Los ajustes del microscopio multifotónico (potencia del láser y PmT) se mantuvieron a lo largo de las diferentes sesiones de obtención de imágenes.

Muestreo de microdiálisis in vivo

El muestreo de microdiálisis in vivo de ISF se realizó en ratones Tg2576, 3 meses después de la inyección de AAV (S. Takeda et al., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in free-moving mouse.

Neuroscience 186, 110 (14 de julio de 2011)). La sonda de microdiálisis tenía un eje de 4 mm con una membrana de polietileno (PE) de 3,0 mm y 1000 kDa de valor de corte de peso molecular (MWCO) (PEP-4-03, Eicom). Antes de su utilización, la sonda se lavó con líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa: en mM: 122 NaCl, 1,3 CaCl2, 1,2 MgCl2, 3,0 KH2PO4, 25,0 NaHCO3). La salida y la entrada de la sonda preacondicionada se conectaron a una bomba peristáltica (ERP-10, Eicom) y una bomba de microjeringa (ESP-32, Eicom, Kioto, Japón), respectivamente, utilizando tubos de etileno-propileno fluorado (FEP) (9250 pm d.i.).

La implantación de la sonda se realizó tal como se ha descrito anteriormente (S. Takeda et al., Novel microdialysis method to assess neuropeptides and large molecules in freemoving mouse. Neuroscience 186, 110 (14 de julio de 2011; J. R. Cirrito et al., In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. J Neurosci 23, 8844 (1 de octubre de 2003)). Se les implantó estereotácticamente a los animales anestesiados (isoflurano al 1,5 %) una cánula guía (PeG-4, Eicom) en el hipocampo (bregma -3,1 mm, -2,5 mm lateral a la línea media, -1,2 mm ventral a la duramadre). A continuación, la guía se fijó al cráneo con cemento dental. Cuatro días después de la cirugía, los ratones se colocaron en una jaula de microdiálisis convencional y se insertó una sonda a través de la guía. La sonda se perfundió con LCRa durante 240 min a un caudal de 10 pl/min antes de la recogida de la muestra. Las muestras se recogieron a un caudal de 0,25 (para Ap) y 0,1 pl/min (para la ApoE). Los ratones estaban despiertos y se movían libremente en la jaula de microdiálisis (sistema de microdiálisis AtmosLM, Eicom).

Análisis inmunohistológico

Los ratones APP/PS1 se sacrificaron mediante inhalación de CO2. Se fijó un hemisferio cerebral en paraformaldehído al 4 % en PBS y se incrustó en cera de parafina. Se procesó una pieza de 1 mm3 de corteza para la tomografía de matriz, mientras que el resto se ultracongeló. Secciones incrustadas en parafina (10 pm) se desparafinaron secuencialmente en xileno, se rehidrataron en etanol, se trataron en tampón citrato (citrato de sodio 10 mM, Tween 20 al 0,05 %, pH 6,0), se permeabilizaron en PBS con Triton al 0,5 % y se bloquearon en PBS con BSA al 3 % durante 2 horas. La incubación con anticuerpos primarios se realizó durante la noche a 4 °C: Bam10 (1:1000, SIGMA) y R1282 (1:500, proporcionado por el Dr. Dennis Selkoe) para placas amiloides, anticuerpo monoclonal de ratón 3H1 (1:250, Ottawa Heart Institute) para la ApoE humana, anticuerpo de pollo anti-GFP (1:500, Aves), SMI-312 (1:500, Covance) para distrofias neuríticas, IBA1 (1:500, Wako) y GFAP (1:1000, SIGMA) para microgliocitos y astrocitos, respectivamente. La incubación con el anticuerpo secundario se realizó durante 2 horas. Las placas amiloides de núcleo denso se marcaron mediante Thio-S (Sigma-Aldrich) al 0,05 % en etanol al 50 % antes del montaje.

Preparación de muestras, inmunotinción y obtención de imágenes para tomografía de matriz

Los análisis de tomografía de matriz se realizaron tal como se ha descrito anteriormente (R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci USA 106, 4012 (10 de marzo de 2009)). Se diseccionó un trozo de tejido cortical (1 mm3) adyacente a la región ventricular y se fijó durante 3 h en paraformaldehído al 4 %, sacarosa al 2,5 % en PBS 0,01 M. Después de la deshidratación en etanol, las muestras se incubaron en resina LR White (Electron Microscopy Sciences) durante la noche a 4 °C antes de la polimerización a 53 °C. A continuación, se cortaron cintas de secciones (70 nm) en un micrótomo de ultracorte (Leica) utilizando un cuchillo de diamante Jumbo Histo (Diatome).

Después de la rehidratación en glicina 50 mM en TBS durante 5 minutos, las secciones se bloquearon en Tween al 0,05 % y BSA al 0,1 % en Tris durante 5 minutos, y se aplicaron anticuerpos primarios 1:50 en tampón de bloqueo durante 2 horas (PSD95 Abcam Ab12093, sinapsina I Millipore AB1543 y NAB61 de la Dra. Virginia Lee que tiñe, preferentemente, especies de Ap oligoméricas, E. B. Lee et al., Targeting amyloid-beta peptide (Abeta) oligomers by passive immunization with a conformation-selective monoclonal antibody improves learning and memory in Abeta precursor protein (APP) transgenic mice. J Biol Chem 281, 4292 (17 de febrero de 2006)), seguido de anticuerpos secundarios (Invitrogen). Las imágenes se obtuvieron en 7-30 secciones en serie y se adquirieron utilizando un microscopio confocal/multifotónico Zeiss Axioplan LSM510 (objetivo de aceite Plan Apochromatic de apertura numérica 63x).

Las imágenes se analizaron tal como se ha descrito anteriormente utilizando Image J (Institutos Nacionales de Salud) y MATLAB (Mathworks) (R. M. Koffie et al., Oligomeric amyloid beta associates with postsynaptic densities and correlates with excitatory synapse loss near senile plaques. Proc Natl Acad Sci USA 106, 4012 (10 de marzo de 2009)). Cada conjunto de imágenes se convirtió en pilas y se alineó mediante los complementos MultiStackReg y StackReg de Image J (cortesía de Brad Busse y P. Thevenaz, Universidad de Stanford). Se seleccionaron volúmenes conocidos y se utilizó un programa de detección automatizado basado en umbrales para contar puntos tanto de PSD95 como de sinapsina que aparecieron en más de una sección consecutiva (programa WaterShed, proporcionado por Brad Busse, Stephen Smith y Kristina Micheva, Universidad de Stanford). WaterShed exportó una pila de imágenes con umbral (separada para cada canal) que mostraba puntos que estaban presentes en más de una parte de la matriz. Se tomaron muestras de diversos sitios de la corteza por ratón y se midió su distancia desde el borde de una placa.

Cuantificación de Afi

Se determinaron las concentraciones de AP40 y AP42 mediante ELISA tipo sándwich (Wako) BNT-77/BA-27 (para AP40) y BNT-77/BC-05 (para AP42), según las instrucciones del fabricante. Los oligómeros Afi se cuantificaron mediante ELISA tipo sándwich 82E1/82E1 (Immuno-Biological Laboratories), en el que se utilizaron los mismos anticuerpos N-terminales (residuos 1-16) tanto para la captura como para la detección (W. Xia et al., A specific enzyme linked immunosorbent assay for measuring beta-amyloid protein oligomers in human plasma and brain tissue of patients with Alzheimer disease. Arch Neurol 66, 190 (febrero de 2009)).

Análisis por inmunotransferencia

Se sometieron a electroforesis lisados y microdializados de cerebro (20 |xg de proteína) en geles Novex Bis-Tris al 4-12 % (Invitrogen) en tampón de ejecución MOPS para SDS-PAGE (Invitrogen). Los geles se transfirieron a una membrana de Pv Df y se bloquearon durante 60 min en leche al 5 %/TBS-T. Las membranas se sondaron con anticuerpo de cabra anti-ApoE (1:1000, Millipore) para detectar APOE en el ISF de animales sin ApoE, a la vez que se usó albúmina como control. Las transferencias para la ApoE humana y de ratón se sondaron, respectivamente, con anticuerpo EP1373Y (1:1000, Novus Biologicals) y con anticuerpo policlonal de conejo contra ApoE (1:1000, Abcam). También se analizaron los productos proteolíticos de APP (sAPP: 22C11, 1:4000, Millipore y C83/C99: APP Cter, 1: 4000, Sigma) y la enzima de degradación de la insulina (IDE, 1:1000, Santa Cruz). La incubación con anticuerpos IgG de cabra conjugados con HRP (Vector) se realizó durante 2 horas. Las proteínas inmunorreactivas se revelaron utilizando el kit ECL (Western Lightning, PerkinElmer) y se detectaron en Hyperfilm ECL (GE healthcare).

qRT-PCR

El ARN total de cerebro se extrajo utilizando el reactivo TRIzol® (Life technologies; 15596-026) y posteriormente se sintetizó el ADNc usando el sistema de RT-PCR de una etapa SuperScript® III (Life technologies; 12574-018). Los cebadores de PCR se diseñaron para amplificar el ARNm de APOE humano recombinante y los ARNm endógenos de ApoE y Gapdh (ApoE directo: 5’-AGCTCCCAAGTCACACAAGA; ApoE inverso: 5’-GTTGCGTAGATCCTCCATGT; APOE directo: 5’-CCAGCGACAAT CACTGAAC; APOE inverso: 5’-GCGCGTAATACGACTCACTA, Gapdh directo: 5’-ATGACATCAAGAAGGTGGTG y Gapdh inverso: 5’-CATACCAGGAAATGAGCTTG).

ELISA de APOE

Se extrajeron las muestras en Triton al 2 % en TBS, lo que permitió la movilización y cuantificación de la ApoE unida a la membrana. Las placas de ELISA se recubrieron durante toda la noche con 1,5 ug/ml de anticuerpo de cabra anti-APOE (APOE murina) o 1,5 ug/ml de anticuerpo WUE4 (APOE humana) y se bloquearon con leche al 1 % en PBS durante 1,5 h. Se utilizó la ApoE recombinante humana como patrón (ensayo en seres humanos, Biovision) o patrón interno de ratón a partir del extracto de cerebro (ensayo murino) y las muestras se incubaron durante toda la noche en tampón ELISA (BSA al 0,5 % y Tween-20 al 0,025 % en PBS). Se utilizaron, respectivamente, anticuerpos de detección específicos para humanos (de cabra anti-ApoE Millipore; 1:10.000) o ratón (Abcam; 1:2.000), seguidos de anticuerpos secundarios conjugados con HRP. El revelado de la señal se realizó utilizando el sustrato TMB antes de detener la solución utilizando H3PO4, que se midió a 450 nm.

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Prism. Debido al pequeño tamaño de las muestras, no se pudo suponer la normalidad para la mayoría de los análisis. Para todo el análisis post-mortem, se realizó una prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis seguida de una prueba de comparación múltiple de Dunn. Los datos de imágenes in vivo de la progresión de amiloide se analizaron utilizando un modelo de efectos mixtos, con un efecto aleatorio para el ratón y efectos fijos para el vector, el tiempo y la densidad volumétrica inicial. En este análisis se consideró una interacción entre el tiempo y el vector, pero no fue significativa. Para el análisis del tamaño de la placa a lo largo del tiempo, se ajustaron dos modelos de efectos mixtos para el logaritmo de la proporción de dos puntos de tiempo consecutivos, con efectos aleatorios para el ratón y efectos fijos para el tamaño del registro inicial (t0 en el primer análisis, t1 en el segundo análisis). Las muestras presentaban enmascaramiento para cada análisis.

La utilización de los términos “un” y “uno/a” y “el/la” y referencias similares, en el contexto de la descripción de la presente invención, se debe interpretar que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria descriptiva o que el contexto lo contradiga claramente. Los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” se deben interpretar como términos abiertos (es decir, que significa “que incluye, pero sin limitación a”) a menos que se indique lo contrario. La mención de intervalos de valores en la presente memoria descriptiva está destinada simplemente a servir como un procedimiento abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor por separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en la presente memoria descriptiva, y cada valor por separado se incorpora en la presente memoria descriptiva como si se recitara individualmente en la presente memoria descriptiva. Todos los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en la presente memoria descriptiva o que el contexto lo contradiga claramente de otro modo. La utilización de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionado en la presente memoria descriptiva, pretende iluminar mejor la presente invención. Ningún lenguaje en la presente memoria descriptiva se debe interpretar en el sentido de que indica algún elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la presente invención.

En la presente memoria descriptiva se describen realizaciones de la presente invención, entra las que se incluye el mejor modo conocido por los presentes inventores para llevar a cabo la presente invención. Las variaciones de esas realizaciones pueden resultar evidentes para los expertos en la materia al leer la descripción anterior.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento in vitro para determinar A-beta 40 en un mamífero antes y después del tratamiento de un trastorno amiloide, que comprende:

en el que la isoforma de ApoE protectora es la ApoE e2, y

en el que el trastorno amiloide es la enfermedad de Alzheimer.

2. Procedimiento in vitro, según la reivindicación 1, que comprende, además, calcular una proporción entre el nivel de A-beta 40 en la primera muestra y el nivel de A-beta 40 en la segunda muestra.

3. Procedimiento in vitro, según la reivindicación 1 o 2, en el que el nivel de A-beta 40 en la primera muestra de sangre o en la segunda muestra de sangre se cuantifica mediante un inmunoensayo.

4. Procedimiento in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la muestra de sangre es sangre completa, plasma o suero.

5. Procedimiento in vitro, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el mamífero es un primate, preferentemente, un ser humano.