ES2949828T3 - Virus AAV/XBP1S-HA, método de terapia génica y uso de este en la optimización y mejora de las capacidades de aprendizaje, memoria y cognitivas - Google Patents

Abstract

La presente invención presenta una secuencia del virus AAV/XBPls-HA, método y su uso en el mejoramiento de funciones cognitivas, de memoria y del aprendizaje, tal como se presenta en los estudios in vivo en la figura 12/17 panel derecho.

Description

DESCRIPCIÓN

Virus AAV/XBP1S-HA, método de terapia génica y uso de este en la optimización y mejora de las capacidades de aprendizaje, memoria y cognitivas

Campo técnico de esta invención

Esta invención se refiere al campo de la medicina, específicamente al el proceso de aprendizaje y formación de la memoria, mediante el uso de virus adenoasociados (AAV) que sobreexpresan el factor de transcripción XBP1 en neuronas del sistema nervioso central (SNC), preferiblemente en el hipocampo, recuperando y mejorando el rendimiento de la memoria y el aprendizaje.

Antecedentes y descripción del estado de la técnica

La investigación científica acerca de las enfermedades del SNC ha sido de gran interés en los últimos años, sobre todo las enfermedades relacionadas con alteraciones cognitivas. El tratamiento de enfermedades relacionadas con la memoria o el aprendizaje no tienen un enfoque terapéutico para reducir los síntomas.

En la búsqueda del tratamiento de estas enfermedades cognitivas se ha identificado el factor de transcripción conocido como XBP1 cuya función está implicada en los mecanismos biológicos y moleculares de los procesos de memoria y aprendizaje.

Las terapias farmacológicas que existen en la actualidad están dirigidas principalmente a la disminución endógena de XBP1 mediante el control de un sensor corriente arriba, IRE1, como se presenta en la patente US2013197023. La activación de IRE1 cataliza la escisión no convencional de un intrón de 26 nucleótidos expresado en el ARNm de xbpl, de una manera mecánica similar a un corte y empalme del pre-ARNt. La eliminación de este intrón provoca un cambio de marco de lectura en la secuencia de codificación de XBP1 lo que da como resultado la traducción de una proteína de mayor tamaño de 376 residuos, de 54 kDa, denominada XBP1 s. En ausencia de la escisión, se traduce la proteína de 261 residuos, de 33 kDa, denominada XBPlu del inglés, sin corte y empalme. Se ha descrito que la proporción XBP1s/XBPlu se correlaciona con el nivel de expresión del gen regulado por XBP1s aumentando la capacidad de plegamiento del retículo endoplásmico (RE) necesaria para mantener la homeostasis celular. La regulación negativa de la expresión XBP1 se ha visto implicada en la generación de neuroprotección en la enfermedad de Huntington y en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), como se presenta en la patente WO2010/008860.

Otra patente relevante en cuanto a la medida del estrés en el RE, donde está implicado el factor de transcripción XBP1, es la patente japonesa JP2007129970. Valuenza y cols. (Cell Death and disease, 2012, 3, e272) describen que la expresión local de XBP1s en la médula espinal que usa virus adenoasociados mejoró la recuperación locomotora después de una lesión de la médula espinal. Zuleta y cols. (Biochemical and Biophysical Research Communications, 2012, 42, 558-563) describe que la distribución mediada por AAV de XBP1s en el cuerpo estriado reduce la agregación de la huntingtina mutante en un modelo de ratón de la enfermedad de Huntington. Valdés y cols. (PNAS, 2014, 111, 6804-6809) describe que la distribución de XBP1 mediada por AAV proporciona supervivencia de neuronas dopaminérgicas en un modelo de enfermedad de Parkinson basado en neurotoxinas

En general, este desarrollo se refiere al proceso de memoria, a la consolidación y almacenamiento de nueva información en el cerebro. Se define la memoria a corto plazo como la retención de información durante cortos períodos de tiempo sin generar conexiones neuronales ni síntesis de proteínas. Por otro lado, se define la memoria a largo plazo cuando se producen nuevas sinapsis neuronales y la información recopilada se almacena durante semanas, meses o incluso años con la dependencia de la producción de nuevos ARNm y proteínas (1).

Uno de los muchos componentes implicados en el desarrollo neuronal es el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), que es una neurotrofina que regula el desarrollo neuronal, la neuroplasticidad y la sinaptogénesis en el SNC (2). Diferentes estudios han asociado el BNDF con mecanismos de aprendizaje y de formación de la memoria (3, 4, 5, 6, 7 y 8). Los niveles de expresión de BDNF están controlados dinámicamente por el comportamiento; sin embargo, su regulación transcripcional es compleja. Se han descrito diversos factores de transcripción asociados a la regulación del BDNF, como el factor de respuesta a la transcripción del calcio (CaRF) y la proteína de unión al elemento de respuesta de AMPc (CREB; 9 y 10). Aunque por el momento los mecanismos de control fino de la expresión de BDNF han sido poco estudiados.

Compendio de la invención

La formación de la memoria y el aprendizaje se basan en la inducción de la expresión de nuevos genes en diferentes regiones del cerebro, aunque principalmente en el hipocampo donde se ha señalado al BDNF como uno de los principales factores mediadores de esta función dentro de un gran número de otros factores involucrados. En la búsqueda de diferentes reguladores de la expresión de BDNF, en su región promotora proximal, se identificó un sitio de unión funcional para el factor de transcripción XBP1, componente clave de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR). El análisis del perfil de expresión génica que regula el factor XBP1 reveló que también regula un grupo de genes entre los que se pueden mencionar: GLIA3 (receptor ionotrópico de glutamato, AMPA 3 (alfa3)); BDNF (factor derivado de la neurotrofina cerebral); y KliF17 (familia de las quinesinas 17); por lo tanto, XBP1 regula genes implicados en el aprendizaje y la memoria. El análisis del comportamiento de ratones deficientes para el factor de transcripción XBP1 en sus neuronas, reveló una reducción en la formación de la memoria contextual y el deterioro del empoderamiento a largo plazo (17).

Sorprendentemente, el aumento de la expresión de XBP1s ya sea por la sobreexpresión en el SNC de XBPIs en ratones transgénicos o bien por la administración a través de un virus directamente en el hipocampo, consigue mejorar el rendimiento de las tareas de memoria. Este resultado revela una nueva función no prevista para XBP1 en los procesos cognitivos. Lo anterior, avalado por el reciente descubrimiento de polimorfismos en el promotor de XBP1, como un factor de riesgo de la enfermedad de Alzheimer y del trastorno bipolar, han hecho que las estrategias para mejorar la actividad de las XBP1 s en el cerebro se traduzcan en efectos beneficiosos para el tratamiento de trastornos de la memoria, cognitivos y del aprendizaje.

Un dato relevante en esta invención es el nivel de homología en las secuencias de XBP1 en ratones y humanos, que es superior al 75%, preferiblemente del 83%. Las secuencias de XBP1s y XBPlu humanas se pueden observar en las tablas número VIII y IX respectivamente.

La invención se establece en el conjunto de reivindicaciones adjuntas.

Un primer aspecto de esta invención es un vector adenoasociado (AAV) para usar en el tratamiento de un trastorno de la memoria o un trastorno del aprendizaje en un sujeto que lo necesite, en donde

- el AAV induce la sobreexpresión neuronal de XBP1s en el cerebro, preferiblemente en el hipocampo; y

- el AAV comprende un genoma viral recombinante que comprende un casete de expresión, que comprende una región reguladora de la transcripción específica para tejido neuronal unida operativamente a un polinucleótido que codifica XBP1s.

La administración del virus puede ser intravenosa y/o intraperitoneal y/o intracraneal y/o intramedular y/o intranasal y/o intraneural y/o cualquier medio que introduzca el virus en el cerebro atravesando la barrera hematoencefálica de un paciente o sujeto. El virus induce la sobreexpresión neuronal de XBP1s en un intervalo de dosis de 16 a 130 unidades virales por individuo.

Depósito de microorganismos

El plásmido pAAV-XBP1s-1-1A fue depositado el 5 de noviembre de 2014 en la agencia internacional de depósitos biológicos, American Type Culture Collection (ATCC), con el número de depósito PTA-121708.

Descripción detallada de la invención

Se debe entender que esta descripción no se limita a la metodología, los compuestos, los materiales, las técnicas de fabricación, los usos y las aplicaciones particulares aquí descritos, ya que estos pueden variar. También se debe entender que la terminología empleada aquí se usa con el único propósito de describir una representación particular y no intenta limitar la perspectiva y el potencial de esta descripción.

Hay que señalar que el uso y método aquí, en la lista de reivindicaciones y en todo el texto, que el singular no excluye el plural, excepto cuando el contexto claramente lo implica. Entonces, por ejemplo, la referencia a un "uso o método" es una referencia a uno o más usos o métodos e incluye equivalentes conocidos por los expertos en la materia (la técnica). De manera similar, como otro ejemplo, la referencia a "una etapa", "un paso" o "un modo" es una referencia a uno o más etapas, pasos o modos y puede incluir sub-etapas, pasos o modos, implícitos y/o sobrevenidos.

Todas las conjunciones usadas se deben entender en su sentido menos restrictivo y más inclusivo posible. Así, por ejemplo, la conjunción "o" se debe entender en su sentido ortodoxo lógico, y no como un "o excluyente", a menos que el contexto o el texto lo requiera o lo indique específicamente. Las estructuras, materiales y/o elementos descritos se deben entender referidos también funcionalmente a esos equivalentes y así evitar interminables enumeraciones exhaustivas.

Las expresiones usadas para indicar aproximaciones o conceptualizaciones se deben entender así, a menos que el contexto exija una interpretación diferente.

Todos los nombres y términos técnicos y/o científicos empleados aquí tienen el significado común que les da una persona común, cualificada en estas materias, a menos que específicamente se indique lo contrario.

Se describen los métodos, técnicas, elementos, compuestos y composiciones, aunque en la práctica y/o en los ensayos de esta invención se pueden usar o preferir métodos, técnicas, compuestos y composiciones similares y/o equivalentes a los descritos.

En este sentido, nada se debe considerar como una admisión o aceptación, rechazo o exclusión, que los autores y/o inventores no estén facultados para hacerlo, o que estas publicaciones sean anteriores en virtud de otras anteriores, o por cualquier otra razón.

En la presente memoria se describen vectores basados en los serotipos AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y virus adenoasociados capaces de mediar eficazmente las transferencias de genes al cerebro, preferiblemente al hipocampo, cuando se administran localmente (Figura 12/17, panel izquierdo).

La administración sistémica de estos vectores también da lugar a un suministro eficaz de genes tanto al cerebro como al hipocampo. Aunque la distribución de genes mediada por el vector AAV6 es más eficaz, en el caso de la administración sistémica, la distribución no se limita únicamente al cerebro o al hipocampo. Esta invención presenta que el vector de AAV6 con regiones proximales del promotor del factor de transcripción XBP1, permite generar una respuesta en un agrupamiento de factores de interés inespecífico en el cerebro y específicamente en el hipocampo. En particular, la administración local del vector de AAV6 que incluye un casete de expresión en el que un gen heterólogo XBP1 está bajo el control del promotor PGK logra una mejora en la memoria y en la capacidad cognitiva en individuos sanos in vivo. (Figura 12/17 panel derecho y figura 13/17).

I. Definición de términos y expresiones generales

Los términos "virus adenoasociado", "virus AAV", "virión AAV", "partícula viral AAV" y "partícula de AAV", como se usan en este documento, son intercambiables, se refieren a una partícula viral compuesta de al menos al menos una proteína de la cápside de AAV (preferiblemente por todas las proteínas de la cápside de un serotipo de AAV en particular) y un polinucleótido del genoma encapsulado en una cápside de AAV. Si la partícula incluye un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido diferente de un genoma de tipo nativo de AAV como un transgén para ser distribuido a una célula de mamífero) flanqueado por las repeticiones terminales invertidas del AAV, eso se conoce típicamente como un "vector de partículas de AAV" o "vector de AAV". AAV se refiere a un virus que pertenece a los Dependovirus de la familia de Parvoviridae. El genoma de AAV tiene una longitud de aproximadamente 4,7 kilobases y está formado por ácido desoxirribonucleico de cadena simple (ssADN) que se puede registrar como positivo o negativo. El genoma incluye repeticiones terminales invertidas (ITRs) en ambos extremos de la cadena de ADN y dos marcos de lectura abiertos (ORFs): REP y CAP (Replicasa y Cápside). El marco Rep está formado por cuatro genes superpuestos que codifican proteínas REP (REP 78, REP 68, REP 52 y REP 40) necesarias para el ciclo de vida del AAV. El marco CAP contiene nucleótidos superpuestos de 20 secuencias de proteínas de la cápside: VP1, VP2 y VP3, que interaccionan entre sí para formar una cápside con una simetría icosaédrica (11), como se muestra en la figura 15/17.

El término "ITR de virus adenoasociado" o “ITR de AAV”, como se usa aquí, se refiere a la secuencia terminal invertida que se repite y está presente en ambos extremos de la cadena de ADN del genoma en un virus adenoasociado. Las secuencias ITR se necesitan para la multiplicación eficaz del genoma de AAV. Otra característica de estas secuencias es su capacidad para formar una horquilla. Esta característica contribuye a su autocopia que permite la síntesis primaria independiente de la segunda cadena de ADN. Las ITRs también demostraron ser necesarias tanto para la integración del ADN del AAV de tipo nativo en el genoma de la célula huésped y su rescate, como también para la encapsidación eficaz del ADN del AAV combinado con la generación de su ensamblaje completo (16)

El término "AAV6", como se usa en esta invención, se refiere al serotipo 6 del virus adenoasociado con una secuencia del genoma como se define en el número de acceso de GenBank AF028704.1, que se encuentra en la página web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF028704.1

El término "vector de AAV", como se usa en esta invención, también se refiere a un vector que incluye uno o más polinucleótidos de interés (o transgenes) que están flanqueados por secuencias de repetición terminales de AAV (ITRs). Estos vectores de AAV se pueden replicar y empaquetar en partículas virales infecciosas cuando están presentes en una célula huésped que ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa los genes REP y CAP (es decir, las proteínas de AAV REP y CAP), y donde la célula huésped ha sido transfectada con un vector que codifica y expresa una proteína del marco de lectura del adenovirus E4orf6. Cuando un vector de AAV se incorpora en un polinucleótido más grande (por ejemplo, en un cromosoma o en otro vector como un plásmido usado para la clonación o transfección), entonces el vector de AAV se designa típicamente como un "pro-vector". El pro-vector puede ser "rescatado" por replicación y encapsidación en presencia de las funciones de empaquetamiento del AAV y las funciones auxiliares necesarias proporcionadas por E4orf6.

El término "sitio de unión específico para la región reguladora de la transcripción de XBP1", como se usa en esta invención, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que sirve como un promotor (es decir, regula la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada, unida operativamente al promotor) y que afecta a la expresión de una secuencia de ácido nucleico seleccionada en células de tejidos específicos, como las células nerviosas. El sitio de unión específico para la región reguladora de la transcripción del tejido neuronal puede ser constitutivo o inducible.

El término "gen CAP" o "gen CAP de AAV", como se usa en esta invención, se refiere a un gen que codifica una proteína CAP. El término "proteína CAP", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene una actividad de al menos una actividad funcional de la proteína CAP de un AAV nativo (VP1, VP2, VP3). Ejemplos de actividades funcionales de las proteínas VP1, VP2 y VP3 incluyen la capacidad de inducir la formación de una cápside, de facilitar la acumulación de ADN monocatenario, de facilitar el empaquetamiento del ADN de AAV en la cápside (es decir, la encapsidación), de unirse a los receptores celulares y facilitar la entrada del virión a un huésped.

El término "cápside", como se usa en esta invención, se refiere a la estructura en la que se empaqueta el genoma viral. Una cápside consiste en una estructura oligomérica con subunidades estructurales de proteínas CAP.

Por ejemplo, el AAV tiene una cápside icosaédrica formada por la interacción de tres proteínas de la cápside: VP1, VP2 y VP3.

El término "composición de células", como se usa en este documento, se refiere a un material de tipo compuesto que consiste en las revelaciones de la invención y al menos otro componente. La composición se puede formular como una única formulación o se puede presentar como formulaciones separadas de cada uno de los componentes, que se pueden combinar para uso conjunto como una preparación combinada. La composición puede ser un kit de partes, donde cada uno de los componentes se formula y envasa individualmente.

El término "promotor constitutivo", como se usa en esta invención, se refiere a un promotor cuya actividad se mantiene a un nivel relativamente constante en un organismo completo, o durante la mayoría de las etapas experimentales, con escasa o ninguna consideración de las condiciones ambientales y externas de la célula.

El término "potenciador", como se usa aquí, se refiere a un elemento de la secuencia de ADN al que se unen los factores de transcripción para aumentar la transcripción de los genes.

El término "casete de expresión", como se usa aquí, se refiere a una construcción de ácidos nucleicos, generados por recombinación o de manera sintética, con una serie de elementos específicos de los ácidos nucleicos, que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula diana.

El término "genes que proporcionan funciones de ayuda", como se usa aquí, se refiere a genes que codifican polipéptidos, que llevan a cabo funciones de las que depende el AAV para la replicación (es decir, "funciones de ayuda"). Las funciones auxiliares incluyen las funciones necesarias para la replicación de AAV, incluyendo aquellos fragmentos implicados en la activación de la transcripción de genes de AAV, las etapas específicas del corte y empalme del ARNm de AAV, la replicación del ADN de AAV, la síntesis de los productos de CAP y el ensamblaje de la cápside de AAV. Las funciones virales accesorias se pueden derivar de cualquiera de los virus auxiliares conocidos como adenovirus, virus del herpes, lentivirus y virus vaccinia. Las funciones auxiliares incluyen, sin limitación, lentivirus WHV.

El término "ligado operativamente", como se describe en este documento, se refiere a la relación funcional y la localización de una secuencia promotora con respecto a un polinucleótido de interés (por ejemplo, un promotor o potenciador está ligado operativamente a una secuencia codificante que afecta a la transcripción de esta secuencia). Generalmente, un promotor ligado operativamente es contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene que ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión.

El término "administrado localmente", como se usa aquí, significa que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos y/o composiciones farmacéuticas de la invención se administran al sujeto en o cerca de un sitio específico.

Los términos "transportadores farmacéuticamente aceptables", "disolventes farmacéuticamente aceptables", "excipientes farmacéuticamente aceptables" o "vehículos farmacéuticamente aceptables" son intercambiables en este documento, se refieren a un sólido, semisólido o líquido de relleno, disolvente o material de encapsulación o una formulación auxiliar para cualquier tipo convencional no tóxico. Un transportador farmacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxico para los envases empleados en las dosis y concentraciones y es compatible con otros ingredientes de la formulación. El número y naturaleza de los vehículos farmacéuticamente aceptables depende de la forma de administración deseada. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son conocidos y se pueden preparar mediante métodos bien conocidos en la técnica (12).

El término "promotor", como se usa aquí, se refiere a un ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más polinucleótidos, situado corriente arriba de la secuencia del(los) polinucleótido(s), y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para el ADN dependiente de la ARN polimerasa, los sitios de iniciación de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, que incluye, pero no se limita a, los sitios de unión de factores de transcripción, represor y sitios de unión a la proteína activadora, y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida en la técnica para actuar directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción en función del promotor. Un promotor "específico de tejido" solo se activa en tipos específicos de células o tejidos diferenciados.

El término "polinucleótido", como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, que contiene desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, respectivamente. El ácido nucleico puede ser de doble cadena, de cadena simple o contener partes de cadena doble o simple. El término "polinucleótido" incluye, pero no se limita a, secuencias de ácidos nucleicos con capacidad para codificar un polipéptido y secuencias de ácidos nucleicos parcial o totalmente complementarios a un polinucleótido endógeno de la célula o del sujeto tratado del mismo modo para, después de la transcripción de este, se genere una molécula de ARN (por ejemplo, microARN, shARN, siARN) capaz de hibridar e inhibir la expresión del polinucleótido endógeno.

En este documento, el término "cadena" se refiere a una secuencia de nucleótidos continuos (que incluyen o no incluyen nucleótidos naturales modificados o no naturales). Las dos o más hebras pueden ser, o cada una formar parte de moléculas separadas, o pueden estar interconectadas covalentemente, por ejemplo, mediante una conexión, por ejemplo, un conector como polietilenglicol para formar una molécula. Al menos una de las cadenas puede incluir una región que sea suficientemente complementaria a un ARN diana.

Una segunda cadena del agente de dsARN, que incluye una región complementaria a la cadena antisentido, se denomina "cadena sentido". Sin embargo, también se puede formar un agente de siARN en función de una sola molécula de ARN que es al menos parcialmente autocomplementaria, formando, por ejemplo, una estructura de horquilla o de ojal que incluye una región dúplex. En el futuro, estos últimos se denominarán ARN de horquilla corta o shARN. En este caso, el término "cadena" se refiere a una de las regiones de la molécula de ARN que es complementaria a otra región de la misma molécula de ARN.

El término "región reguladora postranscripcional", como se usa aquí, se refiere a cualquier polinucleótido que facilite la expresión, estabilización o localización de las secuencias contenidas en el casete o el producto génico resultante.

El término "genoma viral recombinante", como se usa aquí, se refiere a un genoma de AAV en el que se inserta al menos un casete de polinucleótido no relacionado con la expresión en el genoma de AAV nativo.

El término "gen rep" o "gen rep de AAV", como se usa aquí, se refiere a un gen que codifica una proteína Rep. El término "proteína Rep", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que tiene al menos una actividad funcional de una proteína rep nativa de AAV (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78). Una "actividad funcional" de una proteína Rep (por ejemplo, Rep 40, 52, 68, 78) es cualquier actividad asociada a la función fisiológica de la proteína, incluida la facilitación de la replicación del ADN mediante el reconocimiento, la unión y el corte del origen de la replicación del ADN de AAV, así como de la actividad ADN helicasa. Las funciones adicionales incluyen la modulación de la transcripción de promotores de AAV (u otros heterólogos) y la integración específica de sitio del ADN de AAV en un cromosoma del huésped.

El término "sujeto", como se usa aquí, se refiere a un individuo, planta, mamífero o animal, como un ser humano, un primate no humano (por ejemplo, un chimpancé u otro simio y especie de monos), un animal (por ejemplo, pájaros, peces, vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos), un mamífero (por ejemplo, perros y gatos) o un animal de laboratorio (por ejemplo, roedores, como ratones, ratas, ratones con genes silenciados (ratones knockout), ratones que sobreexpresan un gen (ratones transgénicos) y cobayas). El término no denota una edad o sexo en particular. El término "sujeto" incluye un feto.

El término "administrado sistémicamente" y "administración sistémica", como se usa en este documento, significa que los polinucleótidos, vectores, polipéptidos o composiciones farmacéuticas de esta invención se administran a un sujeto de manera no localizada. La administración sistémica de los polinucleótidos, vectores, polipéptidos o composiciones farmacéuticas de la invención puede llegar a varios órganos o tejidos de todo el cuerpo del sujeto, o puede llegar a nuevos órganos o tejidos específicos del sujeto. Por ejemplo, la administración intravenosa de una composición farmacéutica de la invención podría dar lugar a la transducción en más de un tejido u órgano en un sujeto.

El término "región transcripcional reguladora", como se usa aquí, se refiere a un fragmento de ácido nucleico capaz de regular la expresión de uno o más genes. Las regiones reguladoras de los polinucleótidos de la invención incluyen un promotor y, opcionalmente, un potenciador.

El término "transducción", como se usa aquí, se refiere al proceso mediante el cual se introduce una secuencia de nucleótidos extraña dentro de la célula en un vector viral.

El término "transfección", como se usa en este documento, se refiere a la introducción de ADN en las células eucarióticas diana.

El término "vector", como se usa aquí, se refiere a un constructo capaz de distribuir, y opcionalmente expresar, uno o más polinucleótidos de interés en una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o ARN desnudo, vectores de cósmidos o fagos, vectores de expresión de ARN o ADN asociados con agentes de condensación catiónica, vectores de expresión de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, como células productoras. Los vectores pueden ser estables y pueden ser autorreplicantes. No hay limitaciones en cuanto al tipo de vector que se puede usar. El vector puede ser un vector de clonación, adecuado para la propagación y para la obtención de polinucleótidos, construcciones génicas o vectores de expresión incorporados en diversos organismos heterólogos. Los vectores adecuados incluyen vectores de expresión en procariotas, fagos y vectores lanzadera y vectores de expresión en eucariotas basados en vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados como retrovirus y lentivirus), como vectores no virales como pSilencer 4,1-CMV.

El término "BDNF", como se usa aquí, es una neurotrofina que regula el desarrollo cerebral, la neuroplasticidad y la sinaptogénesis en el SNC (2).

El término "reguladores de la expresión de BDNF" incluye también a los miembros de la familia ATHCREB que se unen a las secuencias CRE, además del descrito en esta patente denominado UPRE's (elementos de respuesta a proteínas mal plegadas).

Los métodos descritos en la presente memoria, por ejemplo, los métodos del virus AAV con el inserto XRP1s-HA, se pueden usar con cualquier dosificación y/o formulación descrita en esta invención, así como con cualquier ruta de administración descrita en esta invención.

Los “agentes siARN o siARN” son un término usado para describir fragmentos dúplex de ARN de entre 15 y 25 pares de bases, preferiblemente de 19 a 21 pares de bases de longitud.

Por el término "optimización y mejora de la memoria, capacidades cognitivas y aprendizaje", nos referimos a las pruebas cognitivas llevadas a cabo en diferentes especies y/o sujetos como se definen en esta invención.

El término "ADNc" o "ADN complementario" se refiere a una secuencia de ADN que es totalmente complementaria a un ARN, a partir del cual se sintetiza por RT-PCR.

Las palabras "silenciamiento de un gen diana" se refieren al proceso mediante el cual una célula que contiene y/o expresa un producto específico del gen diana cuando no está en contacto con el agente, contendrá y/o expresará al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o menos de ese producto del gen cuando entra en contacto con el agente, en comparación con una célula similar que no ha estado en contacto con el agente. Ese producto del gen diana puede ser, por ejemplo, un ARN mensajero (ARNm), una proteína o un elemento regulador.

El término "complementario", tal como se usa en este documento, se usa para indicar un grado de complementariedad suficiente para que tenga lugar una unión estable y específica entre un compuesto y una molécula de ARN diana, la unión específica requiere un grado de complementariedad suficiente para evitar la unión inespecífica del compuesto oligomérico a secuencias no diana en condiciones en las que se desea la unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de pruebas in vivo o de tratamiento terapéutico, o en el caso de pruebas in vitro en condiciones en las que se han realizado las pruebas.

Ligandos

Las características de un virus, incluidas sus características farmacológicas, se pueden ver influenciadas y adaptar, por ejemplo, mediante la introducción de ligandos. Además, las características farmacológicas de un agente viral se pueden mejorar mediante la incorporación de un ligando en una formulación del agente y un virus.

Los ligandos se pueden unir a una amplia variedad de entidades, por ejemplo, ligandos que se unen a un agente viral, o se pueden usar como un conjugado o aditivo de formulación, por ejemplo, con el vehículo de una subunidad monomérica conjugada con el ligando Los ejemplos se describen más adelante en el contexto de una subunidad monomérica conjugada con un ligando, pero eso es solo lo preferido, y las entidades se pueden unir en otros puntos con un virus.

Un ligando altera la distribución, la dirección o el tiempo de vida de un agente viral en el que se incorpora. En las modalidades preferidas, un ligando proporciona una mejor afinidad por una diana seleccionada, por ejemplo, una molécula, célula o tipo de célula, un compartimento, por ejemplo, un compartimento celular u órgano, un tejido o región del cuerpo, por ejemplo, en comparación con una especie en la que este ligando está ausente.

Los ligandos pueden mejorar las características de transporte, hibridación y especificidad de la molécula diana del virus para esta invención.

En general, los ligandos pueden incluir modificadores terapéuticos, por ejemplo, para mejorar la absorción de la molécula en el individuo; compuestos de diagnóstico o grupos indicadores, por ejemplo, para controlar la distribución; agentes de entrecruzamiento; fracciones que confieren resistencia a reacciones inmunes; y bases nitrogenadas naturales o inusuales.

Los ejemplos generales incluyen moléculas lipofílicas, lípidos, lectinas (por ejemplo, hecogenina, diosgenina), terpenos (por ejemplo, triterpenos, por ejemplo, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivado del epifriedelanol), vitaminas, carbohidratos (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, polímeros sintéticos (por ejemplo, oligo-lactato 15-mer) y polímeros naturales (por ejemplo, de peso molecular bajo y medio), inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico), proteínas, agentes de unión a proteínas, moléculas dirigidas a integrinas, policationes, péptidos, poliaminas y miméticos de péptidos. Otros ejemplos incluyen los ligandos que aceptan células epiteliales o células de ácido fólico, como la transferrina.

El ligando puede ser una molécula que esté presente de forma natural o recombinante o sintética, como un polímero sintético, por ejemplo, un poli-aminoácido sintético. Los ejemplos de poli-aminoácidos incluyen polilisina (PLL), poliácido L-aspártico, poli-ácido L-glutámico, copolímero de estireno-anhídrido de ácido maleico, copolímero de poli-(láctico-co-glicólico), copolímero de N-(2-hidroxi-propil) metacril-amida (HMPA), polietilenglicol (PEG), alcohol polivinilvinílico (PVA), poliuretano, poli-(ácido 2-etil-acrílico), polímeros de N-isopropil-acril-amida o polifosfazina. Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, poliamina pseudopeptídica, peptidomimético, dendrímero de poliamina, arginina, amidina, protamina, fracciones catiónicas, por ejemplo, lípido catiónico, profirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina o un péptido alfa-helicoidal.

Los ligandos también pueden incluir grupos de direccionamiento, por ejemplo, un agente de direccionamiento a una célula o tejido, por ejemplo, tirotropina, melanotropina, proteína surfactante A, carbohidrato de mucina un poliaminoácido glicosilado, bisfosfonato, poli-glutamato, poli-aspartato o un péptido de Arg-Gly-Asp (RGD) o un mimético de péptido de RGD.

Los ligandos pueden ser proteínas, por ejemplo, glicoproteínas, lipoproteínas, por ejemplo, lipoproteína de baja densidad (LDL) o albúminas, por ejemplo, albúmina sérica, o péptidos, por ejemplo, moléculas que tienen una afinidad específica por un co-ligando, o anticuerpos, por ejemplo, un anticuerpo que se une con un tipo de célula específica. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas como cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, manosa multivalente o fucosa multivalente.

El ligando puede ser una sustancia, por ejemplo, un producto farmacéutico que puede aumentar la absorción del agente viral en la célula, por ejemplo, alterando el citoesqueleto de la célula, por ejemplo, alterando los microtúbulos, microfilamentos y/o filamentos intermedios de la célula.

En un aspecto, el ligando es un lípido o una molécula basada en un lípido. Este lípido o esta molécula basada en un lípido, preferiblemente se une a una proteína sérica, por ejemplo, albúmina sérica.

En una modalidad alternativa, se empaquetarán los virus.

Para la preparación de las soluciones inyectables del virus, se preparan diluyendo la concentración necesaria de virus en PBS (solución salina tamponada con fosfato) que tiene la siguiente fórmula

PBS 1 x

1. Disolver la dosis viral en 800 ml de agua destilada con:

- 8 g de NaCl

- 0,2 g de KCl

- 1,44 g de Na₂HPO₄

- 0,24 g de KH²PO⁴

2. Ajustar el pH a 7,4 con HCl.

3. Ajustar el volumen a 1L con agua destilada adicional H²O.

4. Esterilizar y poner en autoclave.

Diseño y Selección

El control de la síntesis de proteínas y la inducción de la expresión del gen es la clave para la formación y mantenimiento de la memoria a largo plazo.

Además de requerir la modulación de la síntesis local de proteínas, la formación de la memoria implica otros aspectos en la vía secretora que incluye la síntesis y el tráfico de diversos receptores de membrana y canales iónicos, el aumento de la señalización del calcio, la síntesis de membranas y el ensamblaje de complejos proteicos. Sin embargo, se descubrió una función singular de XBP1 específicamente en el hipocampo, independiente del control de los genes canónicos asociados a la UPR. Usando las pérdidas y ganancias de la función, se demostró que se requiere XBP1 para el óptimo establecimiento de la memoria a largo plazo. Esta función inesperada podría tener un origen evolutivo ya que XBP1 es miembro de la superfamilia de CREB. Este factor de transcripción es conocido por su importancia en el almacenamiento de la memoria a largo plazo. El ejemplo de la solicitud, descrito aquí, proporcionó la prueba de que XBP1 modula la expresión de un grupo de genes con actividad comprobada en el aprendizaje y la memoria.

Al analizar el alcance biomédico de la utilización como una terapia, se proporcionó un método eficaz e innovador para mejorar la memoria y el aprendizaje, en el que el uso de esta tecnología genera resultados sorprendentes en su aplicación.

Para explorar la participación de XBP1, en concreto de XBP1 s, en las funciones cognitivas, sensoriales o motoras del SNC, se realizó una revisión del comportamiento en animales knockout para XBP1 específico de neuronas (XBP1Nes-1-) y no se observó ninguna anomalía motora espontánea, obvia o de comportamiento en estos animales ni se detectaron alteraciones histológicas en el cerebro de estos animales. Sin embargo, los animales mutantes mostraron un deterioro específico en la prueba de condicionamiento del miedo contextual (Figura 5/17).

Por otro lado, se evaluó la producción de ARNm para un grupo de genes asociados a procesos de memoria y aprendizaje; se determinó que los genes Kif 17, Ampa3 y Bdnf disminuyen en la deficiencia de XBP1 (Tabla 1), en el hipocampo y no en la amígdala, regiones cerebrales involucradas en esta tarea (Figura 1/17 y 2/17 respectivamente).

También se midió la capacidad de aprendizaje de los animales XBP1Nes'A usando el paradigma de la flexibilidad de la memoria, una prueba dependiente del hipocampo relacionada con la memoria episódica. Los animales XBP1Nes-/' requieren más pruebas que los animales de control para llevar a cabo la tarea a lo largo del tiempo, lo que indica un deterioro significativo de la memoria (Figura 6/17). Este fenotipo se produjo en ausencia de alteraciones en la memoria del cerebro dependiente de la corteza, en las tareas de motricidad, en la ansiedad o en el control reflejo, de acuerdo con la evaluación de estos animales en la placa caliente, en la prueba de reconocimiento de nuevos objetos, el rotarod y en la prueba de respuesta al sobresalto. Para una exploración más profunda de los efectos de XBP1 sobre la plasticidad sináptica y la memoria, se midió la transmisión glutamatérgica evocada por la estimulación de la colateral de Schaffer en cortes de hipocampo y se registró el potencial postsináptico excitatorio de campo (fEPSP) en la región CAl para evaluar la potenciación a largo plazo (LTP) con una estimulación de alta frecuencia. La deficiencia de XBP1 en el SNC reduce la inducción y el mantenimiento de la LTP evaluada por la amplitud del fEPSP en el tiempo (Figura 7/17).

En la respuesta al estrés del RE, se ha señalado XBP E como un componente importante de las células secretoras, ya que regula transcripcionalmente un grupo de genes relacionados con el plegamiento y control de calidad de las proteínas (13, 14). Para identificar los efectos de la deficiencia de XBP1 sobre la expresión génica en el hipocampo de animales, estos fueron sacrificados después del entrenamiento al condicionamiento al miedo contextual y se evaluaron los niveles de ARNm de genes dependientes de XBP1 (por ejemplo: Wfsly Edeml) y genes independientes de XBP1 (gen Bip). Sorprendentemente, no se observaron cambios en la expresión de genes relacionados con la UPR en el hipocampo de animales XBP1Nes+ en comparación con los animales de control (XBP1ef) (Figura 4/17)). En función de los defectos cognitivos identificados en animales XBP1Nes-/', se evaluó la expresión de un grupo de genes conocidos relacionados con el aprendizaje y la memoria (Tabla I).

Tabla I

Esta tabla I muestra el perfil de la expresión génica en el hipocampo de animales XBP1Nes'/' en comparación con el animal control. Se muestran los niveles de ARNm de genes asociados a procesos de aprendizaje y memoria, evaluados en disecciones de hipocampo de ratones macho mediante PCR en tiempo real (XBP1Nes-/- n=4, XBP 1 uf n=de 5 a 6), se indica la media y el error estándar y se llevó a cabo el análisis estadístico de t de Student para obtener el valor de p. Los genes que presentan un valor significativo de p se representan con letras más oscuras.

La deficiencia de XBP1 ha dado lugar a reducciones notables en los niveles de ARNm de un subconjunto de genes (Figura 1/17). Estas alteraciones en la expresión génica eran específicas del hipocampo ya que no se detectaron en la amígdala diseccionada de los mismos animales XBP1 Nes-/-(Figura 3/17).

Para comprobar si el aumento de XBP1 s en el SNC altera la capacidad de aprendizaje y memoria de los animales, se generó un modelo de ratón transgénico que sobreexpresaba la forma activa de XBP1s en las neuronas que usa el promotor priónico para realizar su expresión (TgxBP1s). Estos animales son viables, nacen de acuerdo con los coeficientes mendelianos y no desarrollan ningún fenotipo visible. La expresión restringida del transgén en el SNC se confirmó mediante transferencia de Western (Western Blot) y análisis de PCR en tiempo real (Figura 8/17, panel izquierdo). En particular, la expresión sostenida de XBP1s en el SNC mejora el rendimiento de los animales en las pruebas de flexibilidad de la memoria (Figura 8/17, panel derecho). De acuerdo con estos resultados, los cortes de hipocampo derivados de los animales TgxBP1s mostraron una amplitud sostenida y superior de la LTP inducida por la estimulación theta-burst (Figura 9/17), en comparación con los animales de control de la misma camada.

Después de ver el efecto de la manipulación de XBP1s en ratones transgénicos e investigar la función específica en el hipocampo, se desarrolló un virus adenoasociado (AAV) capaz de introducir el gen XBP1 en diferentes individuos.

Con respecto al desarrollo del virus adenoasociado (AAV), este incluye el genoma viral recombinante que consiste en un casete de expresión que incluye una región reguladora transcripcional específica del tejido del hipocampo ligada operativamente al polinucleótido de interés. De acuerdo con esta invención, los virus adenoasociados (AAV) incluyen cualquier serotipo conocido de los 42 tipos y se derivan del parvovirus. En general, los diferentes serotipos de AAV son secuencias genómicas con una importante homología a nivel de aminoácidos y de ácidos nucleicos, que proporcionan funciones genéticas idénticas, proporcionan vibriones esencialmente idénticos en términos funcionales y físicos, y su replicación, ensamblaje usa prácticamente los mismos mecanismos.

En esta invención en particular se usó AAV del serotipo 6 (al igual que los mencionados, por ejemplo, en el número de acceso de GenBank AF028704.I (AAV6), NC006260 (AAV7), NC006261 (AAV8) y AX753250.1 (AAV9)), tal como se presenta en la Tabla II. El genoma del AAV, para usar en los métodos de acuerdo con esta descripción, normalmente incluye un activador en cis 5' y una secuencia de repetición terminal invertida en 3' y un casete de expresión. Las secuencias ITR o LTR tienen 141 pares de longitud. Preferiblemente, se usa la secuencia completa de las LTRs en la molécula y solo se permite una ligera modificación de las secuencias. En una forma preferida de esta descripción, el genoma recombinante del AAV comprende los LTRs 5' y 3' del AAV. En otra forma preferida de esta descripción, los LTRs de AAV en 5' y 3' derivan del AAV de serotipo 6. En otra forma más preferida de esta descripción, el genoma recombinante del AAV carece del marco de lectura abierto Rep y Cap.

Por otro lado, las ITRs pueden tener su origen en otros serotipos de AAV.

El AAV para usar en los métodos de esta invención comprende una cápside de cualquier serotipo. En particular, para esta invención, se prefiere la cápside derivada de los serotipos 6, 7, 8 y 9. Aunque, preferiblemente, se desea la cápside del AAV del serotipo 6.

Se puede generar una caperuza del AAV para usar en el método de la descripción mediante mutagénesis (es decir, inserciones, supresiones o sustituciones) de una de las caperuzas del AAV o de sus ácidos nucleicos codificantes. En algunas realizaciones, la caperuza del Aa V es al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% o más similar a una o más de las caperuzas de AAV mencionadas.

La caperuza del AAV puede ser quimérica, incluir los dominios de dos, tres, cuatro o más de las caperuzas del AAV mencionadas. La caperuza del a Av puede ser un mosaico de los monómeros VP1, VP2, VP3 y proceder de dos o tres AAV diferentes o de un AAV recombinante (rAAV).

Una composición de rAAV para usar en el método de la descripción puede incluir más de una de las caperuzas (CAPs) mencionadas.

Una CAP del AAV para usar en el método de la descripción está diseñada para que contenga una secuencia heteróloga u otra modificación. Por ejemplo, puede ser una secuencia peptídica o proteica que confiera focalización selectiva o la evasión inmune a través de ingeniería genética en una proteína Cap. Alternativamente, o además, la Cap puede modificarse químicamente para que la superficie del rAAV presente modificaciones químicas específicas, por ejemplo, polietilénglicol, que puede facilitar la evasión inmune. La proteína Cap también se puede generar mutagenizada (por ejemplo, para eliminar su receptor de unión natural o para enmascarar un epítopo inmunogénico).

El vector de AAV puede contener un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de al menos una secuencia de XBP1 que se puede seleccionar en las siguientes tablas: Tabla IV (Xbpls) y Tabla V (Xpb 1u) (secuencia de referencia NCB1 NM_001271730.1 y NM_013842.3, respectivamente). Las referencias de secuencias se obtuvieron de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/4111474450?report=genbank&logS=nucltop&blast rank= 1&RID=7TM54X2201R (Xbpls) y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/411147449?report=genbank&log$=nucltop&blast rank=2&RID=7TM54X220IR (Xbplu).

El vector de AAV puede contener un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de Xbpls que se puede seleccionar de la tabla IV, quedando como se presenta en la Tabla III.

El vector de AAV puede contener un promotor con la adición de al menos una secuencia diana de Xbplu que se puede seleccionar en la tabla V.

El vector AAV puede contener un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que tenga una homología del 85% con una secuencia diana seleccionada de la lista mencionada anteriormente, tabla IV y tabla V.

El vector AAV puede contener un promotor con la adición de al menos una segunda secuencia diana que tenga una homología del 70% con una secuencia diana seleccionada de las tablas mencionadas anteriormente.

El vector AAV puede contener un promotor con la adición de al menos una secuencia diana que sea un equivalente funcional con una secuencia diana seleccionada de las tablas mencionadas.

La región reguladora de la transcripción puede incluir un promotor y, opcionalmente, una región potenciadora. Preferiblemente, el promotor se selecciona de este listado: PGK1, CAMKII, THY 1, entre otros. El potenciador no necesita ser específico para el tejido neuronal.

En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, el de la calcio calmodulina quinasa 2, también conocida como CAMKII.

En una realización, el promotor es específico, por ejemplo, también conocido como Thyl.

En otra realización, el casete de expresión que forma parte del AAV de la descripción también incluye un elemento regulador postranscripcional. En una realización preferida, el elemento regulador postranscripcional es el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE) o variantes funcionales y fragmentos de este y el PPT-CTS o variantes funcionales y fragmentos de este. En una realización particular, el elemento regulador postranscripcional es WPRE.

El casete de expresión que forma parte del AAV de acuerdo con la descripción comprende un "polinucleótido de interés" que codifica la proteína XBP1 s que actúa dentro de una neurona incluidas cualquiera de sus isoenzimas que varían en localizaciones subcelulares.

El límite de tamaño de los contenedores del vector AAV está limitado al tamaño del genoma de tipo salvaje del AAV, que varía de tamaño de acuerdo con el serotipo de AAV (es decir, entre 4.087 y 4.767). Por ejemplo, el ^a AV-6 nativo tiene un tamaño de genoma de 4.683. En algunas formas de realización, la capacidad de clonación del vector de ARN recombinante puede ser limitada y una secuencia codificante deseada puede implicar la sustitución completa de 4,8 kilobases del genoma del virus. Por lo tanto, en algunos casos, los genes de gran tamaño pueden no ser adecuados para su uso en un vector estándar de AAV recombinante. El experto común apreciará que las opciones estén disponibles en el estado de la técnica para superar una capacidad de codificación limitada. Por ejemplo, puede hibridarse la IRT de AAV de dos genomas para formar concatémeros de cabeza a cola, casi duplicando la capacidad del vector. La inserción de los sitios de corte y empalme permite la eliminación de la IRT después de la transcripción. Otras opciones para superar una capacidad limitada para clonar serán evidentes para el experto en el tema.

Rutas de administración

Las vías de administración del virus están condicionadas a que el virus pueda atravesar la barrera hematoencefálica para infectar las neuronas diana.

Se han definido dos rutas principales de administración para lograr este propósito en esta descripción. La primera de estas rutas es la nasal (18). Generalmente, los medicamentos administrados por la nariz pueden entrar en la sangre a través de la circulación general, pueden penetrar directamente en el cerebro o, en algunos casos, pueden seguir ambas rutas. Sin embargo, muchos de los factores que controlan el flujo del fármaco a través de cada una de estas rutas no están completamente definidos. En general, hay tres rutas a través de las cuales puede viajar un fármaco administrado en la cavidad nasal. Estas rutas (18) incluyen la entrada en la circulación sistémica directamente desde la mucosa nasal (19), la entrada en el bulbo olfatorio por el transporte axonal a través de las neuronas, y la entrada directa en el cerebro (20). La evidencia que apoya el papel de cada una de estas rutas para una variedad de sustratos modelo se resume a continuación para diferentes tipos de virus.

La naturaleza de esta tabla no pretende ser exhaustiva sino más bien resaltar algunos de los solutos de diferentes clases que han seguido una o más rutas.

Otros medios de administración a las células en el SNC han incluido (19):

La inyección directa en espacios fluidos, como el humor vítreo en el ojo; o en el líquido cefalorraquídeo de la columna vertebral a través de diferentes rutas, intraventricular o intratecal (*”) para su distribución al plexo coroideo, las capas ependimales/meníngeas, y de ahí al cerebro adyacente a través de procesos que se extienden dentro de estas capas; y su paso a través de la barrera hematoencefálica o barreras hemato-tumorales por medio de inyección intraarterial combinada con una interrupción osmótica o farmacológica temporal.

El término (**) Intratecal (intra+ theca, "dentro de una vaina") es un adjetivo que se refiere a algo que ocurre o se introduce en un espacio anatómico o espacio potencial dentro de una vaina, más comúnmente la membrana aracnoides del cerebro o la médula espinal.

Cálculo de la dosis

De acuerdo con Ulusoy y cois. (20), la titulación del vector requiere un intervalo de 109 a 1013 copias de genoma (CG) por ml con una dosis probada de 1010 - 1012 cg/ml. Por otro lado, cualquier tasa de dilución de los vectores a título debe tener un intervalo bajo-medio de 1011 cg/ml, lo que se traduce en la desaparición de la toxicidad.

Dosis en humanos:

El intervalo de dosis en humanos se encuentra en el intervalo de 109 a 1030 unidades virales/kilo de peso, sin restringir este intervalo a la aplicación en diferentes grupos de edad o con volúmenes de distribución modificados por edad o patología.

La concentración o nivel máximo de una sustancia encontrada experimentalmente o por observación, que no causa alteraciones adversas detectables en la morfología, capacidad funcional, crecimiento, desarrollo o duración de la vida de los organismos diana, distinguible de las observadas en organismos normales (control) de la misma especie y cepa, en condiciones definidas de exposición.

Método de aplicación

Los vectores rAAV6 se inyectaron bilateralmente en el SN usando una jeringa Hamilton de 5 gl equipada con un capilar de vidrio con un diámetro en el punto de aproximadamente 60-80 micras. Se inyectaron dos microlitros de tampón que contenían las concentraciones apropiadas de partículas virales a una velocidad de 0,4 gl/minuto. La aguja se retira lentamente 5 minutos después de finalizar la inyección.

Descripción de las Figuras

Figura 1/17._En esta figura se hace una evaluación de los niveles de expresión de varios genes relacionados con la memoria medidos en el hipocampo, como XBP1f/f (n = 4 ratones) y XBP1Nes-/-(n = de 5 a 6 ratones) mediante PCR en tiempo real.

Figura 2/17. Esta figura presenta los niveles de ARNm de los genes relacionados con la memoria, indicados en la figura 3/17, medidos en la amígdala mediante PCR en tiempo real. En c, d y f se muestran los promedios y se llevó a cabo un análisis estadístico mediante la prueba t de Student (*:p<0,05, **:p<0,01, *** p <0,001, ns: no significativo). Todas las muestras se estandarizaron con los niveles de p-actina.

Figura 3/17. Esta figura presenta los niveles de proteína BDNF y KIF17 que fueron analizados por Western blot usando extractos de hipocampo obtenidos de animales de 6 meses de edad para XBP1f/f y XBP1Nes-/-. Los niveles de p-actina o Hsp90 se usaron como control de carga. Se muestran el promedio y el error estándar como los tiempos de cambio en comparación con los animales de control (n = 3). Las bandas se cortaron a partir del mismo gel y sus exposiciones a la película.

Figura 4/17._Esta figura muestra los niveles de ARNm de los genes de la UPR indicados. Estos genes se midieron en el hipocampo disecado de ratones XBP1Nes-/- o de animales XBP1f/f mediante PCR en tiempo real. El análisis se llevó a cabo a los 6 meses de edad (n = 3 por grupo para XbplA y n = 5 por grupo para Wfs1, Edem y Bip).

Figura 5/17. Esta figura muestra las alteraciones en la memoria a largo plazo y la potenciación a largo plazo de XBP1 condicionado en ratones knock-out. Aquí vemos un gráfico de barras donde se presentan los ratones XBP1Nes-/- y el control de la misma camada (XBP1f/f) de ratones macho en los que se probó el condicionamiento al miedo contextual en la prueba. Se calculó el porcentaje de eventos de inmovilidad durante la prueba (XBP1f/f: n = 4 y XBP1Nes-/-: n = 6 por grupo). Se realizó un análisis estadístico mediante la prueba t de Student (*: p<0,05).

Figura 6/17. Aquí se presenta en paralelo, en otro gráfico de barras, el resultado obtenido cuando los animales se entrenaron y evaluaron usando el paradigma de la flexibilidad de la memoria. El análisis muestra el número promedio de pruebas para alcanzar los criterios de cuatro días consecutivos (n = 4 por grupo). Se llevó a cabo un análisis estadístico mediante la prueba t de Student (***: P<0,001).

Figura H17. Esta figura presenta los registros electrofisiológicos de la LTP llevados a cabo en cortes de hipocampo derivados de ratones XBP1Nes-/- o XBP1f/f de la misma camada de ratones control (n = 7 por grupo). Se muestran los recuentos representativos del fEPSP después de tres adiestramientos de estimulación con 100 Hz en el circuito colateral de Schaffer-CA1. El análisis estadístico se llevó a cabo mediante ANOVA de dos vías (***: p<0,001).

Figura 8/17. Esta figura muestra que la sobreexpresión de XBP1s en las neuronas mejora la memoria a largo plazo. En esta figura se presenta una cepa transgénica neuronal específica de XBP1 s, creada usando el promotor del prion para inducir la expresión en el SNC (TgXBP1s). En el panel izquierdo, se observan los niveles de XBP1 s en el hipocampo analizados por Western blot con los niveles de p-actina como monitor de carga. En el panel derecho se evaluó el nivel de aprendizaje comparando animales TgXBP1s y la camada control, usando la prueba de flexibilidad de la memoria. Se presenta el número de pruebas para alcanzar este criterio (n = 5 por grupo). El análisis estadístico se llevó a cabo mediante un ANOVA de dos vías, seguido de una prueba posterior de Bonferroni (*: p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001).

Figura 9/17. La LTP se midió en cortes de hipocampo en animales TgXBP1s y de control por estimulación theta burst (n = 7 por grupo). Se muestran los recuentos del fEPSP. Se realizó un análisis estadístico mediante un ANOVA de dos vías (***: p<0,001).

Figura 10/17. Esta figura muestra que la expresión local de XBP1s en el hipocampo mejora las pruebas de memoria a largo plazo en ratones de tres meses de edad a los que se les inyectó un virus adenoasociado (AAV) serotipo 6 para administrar XBP1s-HA (AAV/XBPIs-HA) o el vector vacío (AAV/MOCK) en el hipocampo usando estereotaxia bilateral. Catorce días después de la inyección, los animales se adiestraron y evaluaron en la prueba de flexibilidad de la memoria (n = 6 por grupo). El análisis estadístico se llevó a cabo mediante un ANOVA de dos vías seguido de una prueba posterior de Bonferroni (*: p <0,05, **: p <0,01, ***: p <0,001).

Figura 11/17. En este diagrama, Xbpls se presenta en el panel izquierdo y Bdnf en el panel derecho. Los niveles de ARNm se midieron por PCR en tiempo real en el total de ADNc obtenido a partir del hipocampo de ratones de tipo salvaje inyectados con partículas AAV/XBP1s o AAV/MOCK. Los valores de expresión se estandarizaron con los niveles de p-actina (n = 6 por grupo). Se realizó un análisis estadístico mediante la prueba t de Student (*: p<0,05).

Figura 12/17. En estos gráficos se evaluaron ratones a los que se les habían inyectado partículas de AAV, descritas en la Figura 10/17, en el hipocampo mediante dos títulos de virus diferentes (1X:1x106 Tus, 10X: 1x107 TUS) mediante estereotaxia cerebral bilateral. En el panel izquierdo se pueden observar imágenes representativas de la inmunohistoquímica de los animales inyectados, donde se muestran después de la tinción con el anticuerpo anti-HA donde las puntas de flecha indican las neuronas HA positivas. La escala de la barra: 100 gm.

En el panel de la derecha, se adiestró a los ratones para la prueba del laberinto del oasis y se midió el porcentaje de éxito en la tarea a lo largo del tiempo (título 1X: AAV/MOCK n = 9; AAV/XBP1s-HA: n = 10; título 10X: AAV/MOCK n = 5; AAV/XBP1 s-HA: n = 5). Se realizó un análisis estadístico mediante un ANOVA de dos vías seguido de una prueba posterior de Bonferroni (*: p<0,05, ***: p<0,001). Se presentan el promedio y el error estándar en todas las figuras.

Figura 13/17. Esta figura presenta que la sobreexpresión de XBP1 s en el hipocampo de ratones mejora el rendimiento en la prueba de Oasis. Los ratones fueron inyectados mediante estereotaxia bilateral con el serotipo 6 del virus adenoasociado (AAV) para distribuir XBP1s-HA (AAV/XBP1s-HA) o partículas de un vector vacío (AAV/MOCK) en el hipocampo de ratones de tipo salvaje usando los diferentes títulos de virus (IX: 1x106 TUs, 10X: 1x107 TUs). Los ratones se adiestraron en el laberinto del oasis (Figura 12/17, panel derecho), y en la prueba se midió la relación de distancias (observadas frente a esperadas). Se presentaron el promedio y el error estándar en la figura. El análisis estadístico se llevó a cabo usando un ANOVA de dos vías seguido de una prueba posterior de Bonferroni (*: p<0,05, **: p<0,01).

Figura 14/17. Esta figura presenta un modelo de trabajo donde se ve una interacción entre el virus AAV/XBP1s-HA y/o el virus AAV/XBP1u-HA y una célula del hipocampo y cómo el ARNm de Xbpls y Xbplu actúa sobre el grupo de genes (Ryr2, Ampa 3, Bdnf y Kif17) en la regulación del aprendizaje y la memoria. Donde la expresión de XBP1 en las neuronas del hipocampo controla directa o indirectamente (líneas punteadas) la expresión de diferentes genes implicados en el establecimiento de la memoria y otros procesos cognitivos. La regulación directa de los genes del agrupamiento y la expresión que se produce a través de la unión de XBP1 a un sitio de unión UPRE B ubicado en la región promotora proximal de Bdnf.

Figura 15/17. Esta figura muestra un esquema del genoma de AAV.

REP: Genes implicados en el mecanismo de replicación de AAV.

VP: Genes implicados en la formación y ensamblaje de la cápside.

ITR: Es el equivalente de LTR, secuencia invertida terminal repetida.

Figura 16/17. Esta figura presenta el vector del virus AAV con el inserto Xbp1s con la siguiente descripción específica de acuerdo con la tabla VI.

Tabla VI

Figura 17/17._Esta figura presenta la generación del plásmido adenoviral (pAAV) para XBP1s.

(A) Descripción de los separadores usados en la clonación de XBP1s con el marcaje HA en el vector de expresión pAAV-PGKI-MCS. Se diseñaron separadores que delimitan la secuencia de XBP1s murina: la cadena sentido incluye la secuencia del marcaje HA para el extremo 5' (panel izquierdo) y la cadena antisentido incluye la secuencia del marcaje HA para el extremo 3' (panel derecho) indicadas por el cuadro de color gris.

a) cadena sentido-HA

b) cadena antisentido

c) cadena sentido

d) cadena antisentido-HA

B) En la figura inferior se evaluaron los niveles de expresión de HA en función de los extractos totales de proteínas de células HEK después de 48 horas de transfección con los diferentes constructos. Los extractos de proteínas se realizaron en solución RIPA y se analizaron 35 mg de proteínas mediante Western Blot en geles de acrilamida al 8%. La expresión de HA se determinó usando un anticuerpo monoclonal primario dirigido frente a HA (Dilución 1:1.000, Covance, número de catálogo MMS-101R) y el anticuerpo secundario anti IgG de ratón conjugado con peroxidasa (dilución 1:3.000). Como control de carga, se determinó la expresión de la p-Actina usando un anticuerpo policlonal primario (dilución 1:1.000, Santa Cruz, número de catálogo sc-1616) y el anticuerpo secundario anti-IgG de cabra conjugado con peroxidasa (dilución 1:3.000) .

Ejemplo de la solicitud

Prueba experimental 1

El virus transformado AAV/XBP1s-HA se aplicó localmente en cerebros de ratones salvajes para aumentar la expresión de XBP1s y su actividad. La expresión selectiva en el hipocampo de ratones adultos se indujo mediante inyecciones estereotáxicas bilaterales del virus AAV serotipo 6 para liberar XBP1s y, por otro lado, un vector control AVV/MOCK, en la zona de la región CA1 del hipocampo.

Dos semanas después de la inyección, las ratas se sometieron a pruebas de flexibilidad de la memoria. Se observaron resultados similares a los observados en animales TgXBP1s, con la expresión local de XBP1s en el hipocampo, lo que daba como resultado un mejor desempeño en las tareas cognitivas (Figura 10/17).

Para ver si la respuesta cognitiva se correlaciona con la sobreexpresión de alguno de los genes del agrupamiento (KIF 17, AMP A 3, BDNF, RYR3) relacionados con la memoria, se evaluó la sobreexpresión del ARNm de uno de estos genes en el hipocampo. Se observó que existe una correlación entre el aumento del ARNm del grupo de genes mencionado anteriormente y la respuesta cognitiva (Figura 11/17).

Prueba experimental 2

Para validar los resultados obtenidos en la prueba experimental 1, el virus se probó en otro modelo de roedor usando una prueba cognitiva que evalúa la memoria dependiente del hipocampo. Se inyectaron bilateralmente dos dosis diferentes de AAV/XBPls-HA (Figura 12/17, panel derecho) en la región CA3 del hipocampo de ratones, y dos semanas después de la cirugía se evaluó su comportamiento en la prueba del Laberinto de Oasis (15).

Los ratones que expresan XBP1s-HA en el hipocampo (Figura 12/17, panel izquierdo) presentan un aumento significativo en el porcentaje de intentos exitosos de encontrar comida escondida en el laberinto.

Además, estos efectos dependían de la dosis (Figura 12/17, panel derecho y figura 13/17).

Material y métodos

Animales y Procedimientos Quirúrgicos:

Para todos los experimentos, se usaron ratones macho, de 3 a 6 meses de edad, para XBP1Nes-/-, TgXBP1s y ratones del tipo salvaje C57BL/6. Los ratones se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 horas y tuvieron libre acceso a comida y agua, a menos que el experimento lo requiriera.

Para todos los experimentos en animales presentados en este desarrollo se usaron las directrices establecidas por el comité para el cuidado y uso de animales de la Universidad de Chile, Chile.

Generación de ratones transgénicos XBP1s.

Se subclonó el ADNc de Xbpls de ratones en el sitio Xho1 del vector2 MoPrP.Xho para controlar la expresión bajo el promotor PrP y la microinyección de células CBA-C57BL/6 derivadas de pronúcleos de ratones de ovocitos fecundados. El estado genético de los ratones se confirmó mediante PCR del ADN genómico a partir de las colas de ratones (3 semanas) usando los separadores para XBPls:

Cadena sentido: 5'-ACACGCTTGGGAATGGACAC-3'

Cadena antisentido: 5'-CCATGGGAAGATGTTCTGGG-3'

Pruebas de comportamiento

Todos los experimentos se realizaron a ciegas y se usaron diferentes cohortes de animales para cada prueba de comportamiento.

Condicionamiento del miedo contextual: En los primeros días se permitió a los animales a acostumbrarse en la cámara (Med Associates, Burlington, Vermont) durante 2 minutos y luego se les presentó un ruido base (80 dB) durante 30 segundos. Después de un intervalo de 2 segundos, los animales se expusieron a una descarga eléctrica de 0,5 mA, lo que se conoce como estímulo incondicionado (US). Este procedimiento se repitió cinco veces. Veinticuatro horas después del entrenamiento, los animales se colocan nuevamente en la cámara original y se evalúan los eventos de inmovilidad durante 5 minutos para determinar las asociaciones de los US con el contexto. Los eventos de inmovilidad se automatizan con el software Med Associates (Burlington, Vermont) diseñado para determinar 30 observaciones en cinco minutos. Este experimento se llevó a cabo en el Centro de Comportamiento de Roedores de la Universidad Case Western Reserve (CWUR) y luego se repitió en el Centro de Neurodescubrimiento de Harvard.

La flexibilidad de la memoria

La prueba de flexibilidad de la memoria se llevó a cabo de acuerdo con la descripción de Chen y cols. (2000). El entrenamiento se lleva a cabo hasta diez pruebas por día, hasta que se aprende la ubicación de la plataforma mediante un criterio a priori de tres escapes latentes de menos de 20 segundos. Después de la finalización de las pruebas, el ratón se retiró del laberinto, se secó y se devolvió a su cubículo. Los datos relacionados con el tiempo de permanencia en cada cuadrante de la piscina se vincularon a un sistema de seguimiento de vídeo del laberinto de agua (HVS Image, Hampton, Reino Unido).

Laberinto de Oasis

Se usó un protocolo modificado del Laberinto de Oasis, que es una versión seca equivalente al laberinto de agua en el requisito de navegación espacial del hipocampo. El aparato consistía en arena en un campo abierto de 1,4 m de diámetro, es decir, a 50 cm del suelo con una pared de 20 cm de altura, es decir, en una habitación aislada con señales visuales distales constantes. Se colocaron sobre la mesa veintiún cajas espaciadas uniformemente (4,5 cm de diámetro, 2 cm de alto) y una de las cajas se cebó con 50 mg de alimento. Catorce días después de recuperarse de la cirugía, la tarea consistió en 15 pruebas de un minuto cada una por sesión, una sesión por día, durante cuatro días consecutivos. Todo el comportamiento de los animales se registró en video, con la ayuda de una cámara de video en posición cenital.

Respuesta de sobresalto

Los ratones se colocaron en un cilindro de plexiglás y se dejaron en reposo durante cinco minutos. Después de la aclimatación, cada sujeto se presentó a 36 pruebas en una sesión de prueba de 9 minutos. Se exponen a nueve niveles de sonido diferentes: 70, 74, 78, 82, 86, 90, 100, 110 y 120 (dB). Cada estímulo fue de 40 ms y se presentó en cuatro ocasiones con una finalidad pseudoaleatoria. El intervalo promedio entre pruebas fue de 15 s (osciló de 10 a 20 s). La respuesta de sobresalto se registró durante 65 ms (cada medición de la respuesta de 1 ms) en función de la aparición de la respuesta de sobresalto. La amplitud máxima de la conmoción se registró durante la ventana de muestreo de 65 ms que se usó como una medida dependiente.

Rotarod

Los ratones se colocaron sobre una barra que gira a 4 rpm durante un minuto de aclimatación. La barra se aceleró de 0,1 rpm/s a 40,0 rpm. La prueba continuó hasta que todos los ratones se cayeron de la barra. Para cada ratón se registró la latencia en las caídas y las rpm en el momento de la caída. Se llevaron a cabo tres pruebas por ratón y se calculó un promedio.

Placa caliente

El animal se colocó en la placa a 55°C. Se observó al animal hasta que mostró una respuesta nociceptiva (por ejemplo, lamiendo sus patas traseras, saltando o chillando) o hasta que se alcanzó el tiempo límite (30 segundos). Se retiró el animal y se registró la latencia de la respuesta. Se registró el tiempo límite para los animales que no respondieron antes del tiempo límite.

Reconocimiento de nuevos objetos

Las pruebas de reconocimiento de objetos se llevaron a cabo de la siguiente manera. Veinticuatro horas antes de la prueba, los animales se acostumbraron a un campo abierto durante 15 minutos. La prueba envuelve la presentación de dos objetos idénticos en un campo abierto de 45 x 45 cm durante diez minutos. Se permitió a los animales explorar libremente y se cuantificó la frecuencia y duración de las exploraciones. Una exploración se definió por contacto visual directo a una distancia de 1 cm o menos, o una interacción directa con el objeto. Una vez concluido el entrenamiento, los animales se colocaron de nuevo en su casa-jaula durante una hora. El nivel de la memoria de reconocimiento de objetos se midió cambiando uno de los objetos en el campo abierto y permitiendo que el animal explorara los dos objetos durante cinco minutos. El objeto novedoso era diferente pero su índice exploratorio era similar. Se usó la relación entre la novedad total y la exploración del objeto para determinar la relación de discriminación exploratoria. Se midió la actividad locomotora y la exploración de ambos objetos durante las sesiones de entrenamiento y prueba para identificar cualquier lado/preferencia del objeto o diferencias generales en la actividad locomotora/exploratoria.

Campo abierto

La actividad locomotora y las observaciones del comportamiento relacionado con la ansiedad se realizaron mientras el ratón se encontraba en un "campo abierto". El campo abierto consiste en una caja de 40 cm x 40 cm situada en una habitación con poca luz. Los animales se colocan en el campo abierto y se les permite explorar el recinto libremente durante 15 minutos. Durante este período, se miden los parámetros locomotores como la distancia total de movimiento, la velocidad, la velocidad angular y la dirección para determinar la actividad locomotora básica y la presencia de estereotipos.

Producción de vectores adeno-asociados

Se produjeron las partículas del virus AAV de serotipo 6 (AAV2/6) mediante transfección de células 293-AAV (Agilent Technologies, Santa Clara, California) y se purificaron en un gradiente de iodixanol seguido de cromatografía en columna de afinidad. El número de partículas de AAV que contiene el genoma en la suspensión, así como la infectividad de la suspensión del vector en células HEK₂93T se determinaron mediante pruebas TaqMan qPCR.

Preparación del plásmido adenoviral (pAAV) para XBP1s.

Para el desarrollo de este objetivo se clonó la secuencia de XBP1s murino en el plásmido adenoviral pAAV-PGK1-MCS, que expresa el transgén bajo el promotor PGK1. Debido a la ausencia de anticuerpos que permitan el reconocimiento de XBP1 en tejido murino, se incluyó en la estrategia de clonación la secuencia de marcaje HA (Figura 17/17 A), que luego permitirá identificar las células transducidas y la expresión de XBP1 s (sin excluir otras secuencias de epítopos como Flag, Gfp, His y Myc, entre otras). Por lo tanto, se generó la amplificación de XBP1 s con la secuencia de marcaje HA en el extremo 5' (panel izquierdo) y con la secuencia HA en el extremo 3' (panel derecho). Los clones obtenidos se confirmaron mediante secuenciación de ADN. De esta forma, se generaron los constructos pAAV PGK HA-XBP1s que codifican la proteína de fusión XBP1s con el marcaje HA al final del extremo amino terminal y pAAV PGK XBP1s-HA con el marcaje HA en el extremo carboxilo terminal. El plásmido adenoviral vacío pAAV PGK se utilizó como control.

Para confirmar la expresión de los constructos generados se transfectaron células HEK con los diferentes constructos, después de 48 horas de transfección se llevó a cabo la extracción de proteínas que se evaluaron mediante WB usando un anticuerpo anti-HA.

Como se puede ver en la Figura 17/17 B, se detectó una banda del peso molecular esperado para XBP1s (55 KDa) solo en las células transfectadas con el plásmido pAAV PGK HA-XBP¹ s y con pAAV ^p G^k XBP1 s-HA.

El ADNc de XBP1 s-HA que codifica el extremo C-terminal marcado con HA, la forma activa XBP1 de ratón, se generó mediante amplificación de pCMVsport6-mXBP1 s por PCR.

- Cadena sentido

5'AGCT AT CGAT GAGAT GAT GGTGGTGGT GGCAGCGGCG3';

- Cadena antisentido

5'ACGTAGATCTTTAGACGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAGACACTAATCAG CTGGGGGAAAA 3'

y se subclonaron en el vector de expresión pAAV-pgkl-MCS que se deriva del plásmido pAAV-CMV-MCS (Clontech). Inyecciones estereotáxicas

Los ratones fueron anestesiados con anestesia de ketamina/xilazina (Ketamina: 100 mg/kg, xilazina: 10 mg/kg, Vetcom, Chile) y se colocaron en un estereotáxico con barras en la nariz y la oreja para los ratones (David Kopf Instruments, EE.UU.). Se llevaron a cabo inyecciones bilaterales de AAV/XBPls-HA, a Av /MOCK, AAV/BDNF-GFP o AAV/GFP con las siguientes concentraciones: 1 x 106 unidades de transducción/μl (TU) de AAV/XBP1s-HA y AAV/MOCK; se inyectaron 1 x 109 genomas virales/μl (VG) para AAV/BDNF-GFP y AAV/GFP. La expresión de EGFp se controló por ^p C^r en tiempo real tras la inyección del AAV para corroborar que la eficacia de la transducción era la misma que la obtenida en estos experimentos para ambas construcciones (datos no mostrados). La inyección de AAV se llevó a cabo en un solo punto, la inyección de 2 o 3 μl en la región CA1 del hipocampo usando una jeringa Hamilton de 5 μl (Hamilton, EE.UU.) en las siguientes coordenadas: AP: - 0,194 cm μl/min y la aguja se deja en su lugar durante 5 minutos antes de la retracción de la aguja.

Para las inyecciones estereotáxicas en los ratones, los animales fueron anestesiados usando el anestésico de inhalación de isoflurano (éter halogenado 2-cloro-2-difluorometoxi-1,1,1 -trifluoretano) y se mantuvieron al 1,0-2,0% de isoflurano en oxígeno al 100% y se colocan en un marco estereotáxico con la nariz y la oreja con barras para ratones. Se llevaron a cabo inyecciones bilaterales de AAV/XBPls-HA o AAV/MOCK con las siguientes concentraciones: 1 x 106 TU (1X) o 1 x 107 TU (10X). La inyección de AAVs se colocó en un solo punto, la inyección de 2 μl en la región CA3 del hipocampo usando una jeringa Hamilton de 5 μl (Hamilton, EE.UU.) en las siguientes coordenadas: AP: -0,33 cm, ML: 0,36 cm, DV: -0,33 cm (de acuerdo con el atlas de Paxinos y Watson, 1998). La inyección se llevó a cabo a una velocidad de 0,5 μl/min y la aguja se dejó en su lugar durante 5 minutos antes de retraerla.

Preparación de tejidos para el análisis bioquímico.

Los ratones fueron sacrificados por narcosis de CO², se extirparon los cerebros y se diseccionaron rápidamente la corteza, el hipocampo, el cerebelo y la amígdala de ambos hemisferios en una placa de plástico enfriada con hielo. El tejido se homogeneizó en 100 μl de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4) suplementada con una mezcla de inhibidores de proteasas (Roche Applied Science, EE.UU.). El homogeneizado se dividió para obtener ARNm y la extracción de proteínas se siguió por protocolos estándar de purificación y cuantificación.

Extracción de ARN y PCR en tiempo real.

Se aisló el ARN total del hipocampo, la amígdala, el cerebelo y el cerebro total. Después de la homogeneización en PBS se continuó con el protocolo de extracción de ARN de Trizol recomendado por el fabricante. El ADNc se sintetizó con un kit de transcripción inversa de alta capacidad de ADNc (Applied Biosystems). Se utilizaron SYBR green y un sistema Mx3005P QPCR (Stratagene) para la RT-PCR cuantitativa. La cantidad relativa de ARNm se calculó mediante el método de ciclo de umbral comparativo con p-actina como control. Los cebadores de las secuencias se obtuvieron en función del PrimerBank (Tabla VII).

Tabla VII

Western blot de tejido

Se llevó a cabo la extracción de proteínas a partir de tejido de ratón en Tampón RIPA (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, SDS al 0,1%, desoxicolato al 0,5%, Tritón X-100 al 0,5%) que contiene una mezcla de inhibidores de la proteasas y una mezcla de inhibidores de la fosfatasa (Sigma, EE.UU.). Un ejemplo de esta cuantificación se ejecutó con el kit de prueba BCA (Pierce, EE.UU.).

Los extractos celulares totales se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Para el análisis de inmunoblot se usaron los siguientes anticuerpos: Hsp90 (1:3.000 Santa Cruz), anti elF2a fosforilado, elF2a y Hsp90 total (1:1.000, Cell Signaling), BDNF (1:1.000, Alomone Labs), KIF17 (1:1.000, Sigma), XBP1 (1:1.000, Poly6195-BioLegend), p-actina y ATF4 (1:1.000, Santa Cruz).

Preparación del tejido y análisis histológico

Los ratones fueron anestesiados con la mezcla de anestesia ketamina/xilazina y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Los ratones se anestesiaron profundamente con hidrato de cloral al 7% (350 mg/kg, ip) y se fijaron con paraformaldehído al 4%. Los cerebros fueron extraídos, luego fijados durante toda la noche a 4°C en la misma solución y posteriormente colocados en sacarosa al 30% (Merck, EE.UU.) a 4°C durante 48 horas. Los cerebros se congelaron en un compuesto óptimo para cortar secciones coronales a una temperatura adecuada (Tissue Tek, EE. UU.): se cortaron en un criostato (Leica, Alemania) 25 μm para ratones macho y 50 μm para ratones hembra que contenían el hipocampo y luego se llevó a cabo la tinción en secciones flotantes.

La inmunotinción se llevó a cabo mediante el kit universal ICQ LSAB plus (ABC Elite Kit, Vector Laboratories, EE. UU.). Las secciones se incubaron con H²O² al 3% en PBS durante 30 minutos y se bloquearon durante 2 horas con albúmina de suero bovino al 0,5% y Tritón X-100 al 0,1%. Los cortes se incubaron durante toda la noche a 4°C en una solución de bloqueo con HA (1:800, Covance) como un anticuerpo primario y se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario anti-ratón biotinilado (1:1.000). Después de lavar tres veces, las secciones se trataron con complejo avidina-biotina-peroxidasa. Las secciones se revelaron utilizando 3,3-diaminobencidina durante 5 minutos y se visualizaron en un microscopio invertido Olympus IX71 o en un DM5500 Leica para la digitalización de las secciones completas.

Preparación y electrofisiología del corte de hipocampo

Los cortes de hipocampo se prepararon de acuerdo con procedimientos estándar para ratones de 4 a 6 meses de edad. Se cortaron cortes transversales de 350 μm del hipocampo dorsal en líquido cefalorraquídeo frío artificial (ACSF, en mM: NaCl 124, NaHCOa 2,6, D-glucosa 10, KCl 2,69, KH²PO⁴1,25, CaCl²2,5, MgSO₄1,3 y NaHPO₄2,60) usando un vibratomo (Leica VT 1000s, Alemania) y se incubaron en ACSF durante más de una hora a temperatura ambiente. En todos los experimentos, se añadió picrotoxina (10 μM) a los medios de perfusión ACSF con el fin de suprimir la transmisión inhibidora GABAA. Para evocar el potencial postsináptico excitatorio de campo (fEPSP), se activaron fibras colaterales de Schaffer para la estimulación catódica bipolar, generada por un estimulador (Axon 700b, Molecular Devices, Sunnyvale, California) conectado a una unidad de aislamiento (Isoflex, AMPI, Jerusalén, Israel). Para generar la LTP, en ratones XBP1Nes-/- que usa estimulación de alta frecuencia (HFS) que consiste en tres trenes de estímulo con un intervalo entre trenes de 20 s. Cada tren consistía en 100 Hz durante 500 ms. En ratones TgXBP1s se usó la estimulación theta burst que consistía en 5 trenes de estímulo con un intervalo entre trenes de 20 s. Cada tren consistía en 8 ráfagas de 5 Hz, cada ráfaga tiene 4 pulsos a 100 Hz. Los registros se filtraron a 2,0-3,0 kHz, muestreando a 4,0 kHz usando un convertidor A/D, y se almacenaron con un ordenador pClamp 10 (Molecular Devices).

Cultivos y transfecciones neuronales

Las células neuro2A y HEK293T se obtuvieron de la ATCC y se cultivaron en medio DMEM suplementado con suero bovino al 10% o al 5%, respectivamente, y antibióticos (10.000 U/ml de penicilina, 10 mg/ml de estreptomicina) a 37°C y 5% de CO². Las neuronas corticales y las del hipocampo se obtuvieron el día embrionario 18 descrito por Goslin y Banker (1991).

Estadísticas

Los datos se expresan como promedio y SEM. Dependiendo de los experimentos, los resultados se compararon estadísticamente mediante la prueba T de Student o la prueba de Mann-Whitney, el ANOVA de dos vías seguido de Holm-Sidack o Bonferroni como prueba post-hoc o el ANOVA de Kruskal-Wallis de una vía en intervalos seguido del Método de Dunn o Bonferroni como prueba post-hoc.

Referencias

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un vector adeno-asociado (AAV) para su uso en el tratamiento de un trastorno de la memoria o un trastorno del aprendizaje en un sujeto que lo necesite, en donde

- el AAV induce la sobreexpresión neuronal de XBP1s en el cerebro, preferiblemente en el hipocampo; y

- - el AAV comprende un genoma viral recombinante que comprende un casete de expresión, que comprende una región reguladora de la transcripción específica para tejido neuronal unida operativamente a un polinucleótido que codifica XBP1 s.

2. Un vector adeno-asociado (AAV) para su uso en un método no terapéutico para mejorar la memoria o mejorar el aprendizaje en un sujeto que no padece un trastorno de la memoria o un trastorno del aprendizaje,

en donde la administración del vector implica una etapa quirúrgica, como una inyección intratecal o intraventricular, mediante la cual el virus atraviesa la barrera hematoencefálica;

y en donde:

- el AAV induce la sobreexpresión neuronal de XBP1s en el cerebro, preferiblemente en el hipocampo; y - el AAV comprende un genoma viral recombinante que comprende un casete de expresión, que comprende una región reguladora de la transcripción específica para tejido neuronal unida operativamente a un polinucleótido que codifica XBP1 s.

3. Uso de un vector adeno-asociado (AAV) en un método no terapéutico para mejorar la memoria o el aprendizaje en un sujeto que no padece un trastorno de la memoria o un trastorno del aprendizaje,

en donde el vector se va a administrar de forma no quirúrgica, por ejemplo mediante administración intranasal, mediante la cual el virus atraviesa la barrera hematoencefálica;

y en donde:

- el AAV induce la sobreexpresión neuronal de XBP1s en el cerebro, preferiblemente en el hipocampo; y - el AAV comprende un genoma viral recombinante que comprende un casete de expresión, que comprende una región reguladora de la transcripción específica para tejido neuronal unida operativamente a un polinucleótido que codifica XBP1 s.

4. El vector adeno-asociado para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, o el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el serotipo del AAV se selecciona de un grupo que incluye AAV6, AAV7, AAV8 y AAV9.

5. El vector adeno-asociado para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1,2 y 4, o el uso de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en donde la región reguladora de la transcripción específica para el tejido neuronal se selecciona de CAMKII y Thy 1.

6. El vector adeno-asociado para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 5, o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde el casete de expresión comprende una región reguladora postranscripcional.

7. El vector adeno-asociado para su uso o el uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la región reguladora postranscripcional es el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota americana (WPRE).

8. El vector adeno-asociado para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 7, o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en donde las ITRs del virus adeno-asociado son ITRs derivadas de AAV6, AAV7, AAV8 o AAV9.

9. El vector adeno-asociado para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 8, o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 8, en donde XBP1s se expresa específicamente en células del hipocampo.

10. El vector adeno-asociado para su uso o el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde XBP1s se expresa específicamente en células en el área CA3 del hipocampo.

11. El vector adeno-asociado para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4 a 10, que comprende la administración de una composición farmacéutica que comprende el vector adeno-asociado y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. El vector adeno-asociado para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha composición comprende una dosis del virus en un intervalo de 109 a 1013 copias de genoma (CG) por ml de composición.

13. El vector adeno-asociado para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1,2 y 4 a 12, o el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en donde el mamífero es un ser humano.