CN113950533A - 新基因疗法构建体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于基因疗法的新载体，所述载体在治疗上非常有效，提供了包含所述载体的病毒颗粒、包含所述病毒颗粒的组合物、其用途、用于制备所述载体的方法和使用所述载体的疗法。

Description

新基因疗法构建体
技术领域
本发明提供了用于基因疗法的新载体，所述载体在治疗上非常有效，提供了包含所述载体的组合物、用途、制备载体的方法和使用所述载体的疗法。
背景技术
基因疗法可以广义地定义为“遗传物质的转移”以治愈、预防或改善疾病(后者至少通过改善患者的临床状态)。基因疗法的基本概念之一是将病毒转化为基因穿梭机，将目的基因递送到靶细胞中。已设计出使用多种病毒和非病毒载体的安全方法来做到这一点。出现了两种主要方法：体内修饰和离体修饰。逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒适合于基于治疗性基因的永久表达的基因治疗方法。基因疗法通常涉及将功能基因插入细胞以纠正细胞功能障碍或提供新的细胞功能。已用于产生病毒载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、慢病毒、单纯疱疹病毒(HSV1)、痘苗病毒。
特别适合基因疗法的是单基因疾病，即由单个无效或缺失的基因或基因对引起的疾病。基因替代疗法实际上是针对单基因疾病进行研究的，因为只需要修复一个基因的功能。
使用病毒载体向受神经系统疾病影响的患者递送基因对研究人员和临床医生来说是一个极具吸引力的概念。
截至2009年12月，已经启动了共1579项基因疗法临床试验；这些试验中的大多数是I期，而只有3.6％的试验是III期。
除此之外，这是因为利用基因疗法载体的治疗也被证明有多个致命的缺点。
直到十年前，将基因递送到脑的策略主要限于将病毒载体立体定向注射到脑，并且通过使用多次注射在整个脑中产生转基因表达袋来实现广泛的基因递送。
最近，病毒载体设计的进步和替代施用途径的探索使全局CNS基因递送变得现实。目前最突出的CNS基因递送载体是腺相关病毒(AAV)。多个特点使AAV载体成为将基因递送到CNS的理想载剂。尽管AAV自然地感染人类，但其是非致病性的并且被归类为依赖病毒，因为AAV的生产性感染仅在存在辅助病毒(腺病毒或疱疹病毒)的情况下发生。除了其安全性之外，AAV可以感染分裂细胞和非分裂细胞二者，并且能够提供长期稳定的基因表达，而不会引起相关的炎症或毒性。此外，快速发展的载体生产和纯化方法促进了基础研究应用以及生产临床试验所需的大产量的可能性。使用AAV，全局CNS基因递送的进步已经加速，以至于神经发育障碍如溶酶体贮积症、雷特综合征(Rett Syndrome)、CDKL5缺乏症(CDD)的治疗似乎触手可及。然而，基因疗法对患者并非没有风险。特别是对于CNS相关疾病，主要的警告是病毒载体将基因递送到CNS的效率低，因此需要大的载体剂量，从而带来免疫反应的风险，如血友病B的人体临床试验的情况(C.S.Manno等人.,Successful transduction ofliver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the hostimmune response.Nat Med 12,342-347(2006)；A.C.Nathwani等人.,Long-term safetyand efficacy of factor IX gene therapy in hemophilia B.N Engl J Med 371,1994-2004(2014))。此外，新基因可能插入到DNA中的错误位置，可能导致DNA的有害突变，或甚至癌症，如在啮齿动物研究中所示(A.Donsante等人.,AAV vector integration sites inmouse hepatocellular carcinoma.Science 317,477(2007))。
因此，迫切需要改善基因疗法的有效性，同时不增加或甚至减少使用整合在宿主基因组中的基因疗法载体可能引发的强烈不良副作用(就获得的治疗效果而言，这是最有效的)。
发明内容
本发明的作者提供了经修饰的基因疗法载体，包含编码分泌前导序列的第一核酸、所述第一核酸可操作地连接的编码蛋白质转导结构域(PTD)的第二核酸、所述第二核酸可操作地连接的编码治疗性蛋白质的第三核酸，这允许减少为实现仅携带治疗性蛋白质的相同载体的相同效力所需的病毒载量和/或感染数量。
与修饰前的相同载体相比，本发明的经修饰的基因疗法载体提供了提高的治疗活性，因为由于分泌前导序列被携带在基因修饰细胞外并且由于PTD，所产生的治疗性蛋白质在未经遗传修饰的细胞中内化，从而在未经载体修饰的细胞中也提供治疗效果，因此放大了与感染细胞数量相关的治疗效果。
上文描述的图14显示，与未修饰的载体相比，当通过根据本发明修饰的载体产生蛋白质时，分布到CNS中的治疗性蛋白质的量显著增加。
尽管经修饰的(AAV-前导序列-PTD-目的蛋白质)和未修饰的(AAV-目的蛋白质)表现出相当的感染效率，但在用根据权利要求的经修饰的载体治疗的小鼠的CNS中可检测到的治疗性蛋白质阳性的细胞数量比在用未修饰的载体治疗的小鼠中检测到的治疗性蛋白质阳性的细胞数量高得多(约5-10倍)。
该结果的技术结果是需要较少的感染和/或较低的病毒载量，以便在期望的治疗性蛋白质的量和定位方面获得改善的结果，从而大大减少所需的转化细胞的数量(这对应于降低基因疗法引起的副作用例如癌症发展等的机会)，并由于提高的有效性，为脑基因疗法提供了一种新工具。
在实践中，感染细胞产生的蛋白质被分泌并进入邻近细胞，从而放大了基因疗法的效果，因为即使转导的细胞数量很少，转导的细胞也会成为生产治疗性蛋白质的“工厂”，然后将治疗性蛋白质分配给相邻的细胞(见图1)。这显著降低了为整个目的器官(尤其是CNS)提供分泌性治疗因子而必须进行转导的细胞的数量，并且在这种情况下，基因递送的效率不一定需要很高。反过来，这允许施用小载体剂量，从而降低与大载体剂量相关的插入诱变和毒副作用的风险。
因此，本发明的目的是：
一种基因疗法载体，包含编码分泌前导序列的第一核酸、所述第一核酸可操作地连接的编码蛋白质转导结构域(PTD)的第二核酸、所述第二核酸可操作地连接的编码治疗性蛋白质的第三核酸；所述基因疗法载体在基因疗法治疗中的用途；一种基因疗法治疗，其中将治疗有效剂量的所述载体施用于有此需要的患者。
术语表
根据本说明书的基因疗法具有本领域普遍认可的含义，因此其是指通过将遗传物质转移到需要治疗的受试者中的疗法，即将核酸作为药物治疗性递送到患者的细胞中来治疗疾病。根据本领域和本发明的基因疗法可以通过使用非病毒或病毒方法将目的遗传物质转移到需要治疗的受试者中来实现。通常用于人类基因疗法的病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和腺相关病毒。病毒载体基因组或者整合到宿主的基因组中，或者保持为附加体。
根据本发明的基因疗法载体是指待转移到患者细胞中用于基因疗法的核苷酸构建体。该载体可以插入病毒颗粒中，该病毒颗粒由含有用于基因疗法的核苷酸构建体的病毒衣壳(即载体)组成。换言之，根据本发明的载体是包装在病毒颗粒内的基因插入物。
根据本说明书的腺相关病毒(AAV)载体具有本领域公知的含义。AAV载体已用于多种疾病的超过100项临床试验。AAV属于细小病毒。其为一种单链、无包膜的DNA病毒，尺寸为4.7kb，可引起人体细胞的潜伏感染。细小病毒代表了恶性肿瘤相关逆转录病毒的替代品。许多天然存在的AAV血清型和变体已从多种动物物种包括哺乳动物、鸟类和爬行动物中分离出来。其中，常见的AAV血清型包括AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13。除了这些血清型外，还有许多AAV变体和突变体已用于AAV载体介导的基因递送，包括AAV-DJ、AAV-LK03、AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV-Retro、AAV2.7m8等。
典型的AAV载体包含两个ITR(反向末端重复)区域，并且在所述两个ITR之间至少包含以下元件：启动子、目的基因和终止子/多腺苷酸化信号。
根据本说明书，用于脑基因疗法的最佳血清型是指本领域最熟知的更有效且适合于脑基因疗法的AAV血清型，即表现出强神经趋向性的血清型。因此，根据本说明书，取决于疗法的靶脑细胞，最佳血清型将是表现出最强趋向性和感染效率的血清型。
根据本说明书的病毒颗粒是指含有病毒核苷酸构建体(病毒载体)的病毒衣壳，根据本发明的病毒颗粒在本领域中也称为“基因转移载体”，并且因此由包含将在受感染细胞中转移的基因构建体的病毒颗粒组成。
根据本说明书，术语单基因疾病具有本领域常用的含义，是指由身体所有细胞中发生的单个基因的修饰引起的结果。突变可能存在于一条或两条染色体上(从每个亲本继承的一条染色体)。单基因疾病的实例有：镰状细胞病、囊性纤维化、多囊肾病和泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)。
尽管如此，根据说明书，术语单基因疾病还包括病理可以由一组基因中的一个或另一个基因的突变引起的疾病。这意味着当病理可以由不同基因(每个患者一个基因)的突变引起，并且因此一组已鉴定的基因中的单个突变基因导致患者的疾病时，该疾病被认为是根据本说明书的单基因疾病。
分泌前导序列具有本领域公知的含义，其是指存在于大多数新合成的蛋白质的N末端的短肽(前导序列)，其目的地是朝向分泌途径。数种分泌前导序列是本领域已知的。
根据本说明书的蛋白质转导结构域或蛋白质跨膜结构域(PTD)(或细胞穿透肽CTP)具有本领域公知的含义，其是指能够携带蛋白质、肽、核酸和纳米颗粒，包括病毒颗粒，穿过细胞膜进入细胞的小肽。通常，PTD可分为3种类型：长度为6-12个氨基酸的阳离子肽，主要由精氨酸、鸟氨酸和/或赖氨酸残基组成；疏水性肽，例如分泌性生长因子和细胞因子的前导序列；和细胞类型特异性肽，通过肽噬菌体展示文库的筛选鉴定。
附图说明
图1
经典基因疗法(A)和创新基因疗法(B)的潜在蛋白质递送之间的比较，后者基于插入用于从受感染细胞分泌蛋白质的前导序列加上靶基因中的蛋白质转导结构域。
图2
TATk-CDKL5蛋白的分泌。使用抗HA抗体的蛋白质印迹分析证实了TATk-CDKL5和CDKL5蛋白在转染的HEK293T细胞(细胞提取物，泳道1-2)中的表达以及TATk-CDKL5蛋白在浓缩(200X)培养基(泳道3)中的积累，表明TATk-CDKL5蛋白从HEK293T细胞分泌。
图3
实验计划。成年小鼠(出生后第90天，P90)用载剂(vehicle)、AAVPHP.B_CDKL5或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体进行全身治疗(尾静脉注射)，并在注射后90天收集脑样品。
图4
载剂治疗的野生型(+/Y；n＝13)和Cdkl5 KO(-/Y；n＝15)以及根据图3中所示的治疗方案用AAVPHP.B_CDKL5或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体治疗的Cdkl5 KO小鼠(-/Y+CDKL5,n＝10；-/Y+TATk-CDKL5；n＝10)的体重(以克计)。在治疗前(第1天)和治疗后7、30和90天对小鼠进行称重。值代表平均值±SEM。
图5
经治疗的Cdkl5 KO小鼠的孤独症样特征。弹珠埋藏测试(Marble burying test)：与野生型小鼠(+/Y,n＝16)相比，Cdkl5 KO小鼠(-/Y,n＝17)埋藏较少弹珠。在用AAVPHP.B_CDKL5(n＝9)或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5(n＝9)治疗30(1M)或60(2M)天后，Cdkl5 KO小鼠比载剂治疗的Cdkl5 KO小鼠隐藏了更多的弹珠。值代表平均值±SEM。*p<0.05和***p<0.001与载剂治疗的野生型条件相比；###p<0.001与载剂治疗的Cdkl5 KO样品相比(ANOVA后的Fisher’s LSD检验)。
图6
经治疗的Cdkl5 KO小鼠的受损的运动协调性。转棒仪试验，在加速旋转棒上测量被动旋转(其中小鼠不执行任何协调运动而是从旋转装置被动传输的旋转)的频率。测试在4次试验中进行，试验间间隔为1小时。治疗后30天和60天对小鼠进行测试。与野生型小鼠(+/Y,n＝20)相比，Cdkl5 KO小鼠(-/Y,n＝20)表现出增加的被动旋转频率，表明受损的运动协调性。用AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5治疗的Cdkl5 KO小鼠(n＝9)在治疗后60天表现出运动协调性的改善，这在用AAVPHP.B_CDKL5治疗的Cdkl5 KO小鼠(n＝9)中不存在。值代表平均值±SEM。*p<0.05与载剂治疗的野生型条件相比；#p<0.05与载剂治疗的Cdkl5 KO样品相比(ANOVA后的Fisher’s LSD检验)。
图7
经治疗的Cdkl5 KO小鼠中以刻板跳跃来测量的刻板行为。在20分钟的试验期间中，在旷场场地的角落里的刻板跳跃次数(重复束中断<1秒)。与野生型(+/Y,n＝24)小鼠相比，Cdkl5KO小鼠(-/Y,n＝20)的重复刻板跳跃次数增加。用AAVPHP.B_CDKL5(n＝9)或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5(n＝9)治疗的Cdkl5 KO小鼠在治疗后30(1M)和60(2M)天后均表现出这种行为的显著改善。值代表平均值±SEM。***p<0.001与载剂治疗的野生型条件相比；#p<0.05和###p<0.001与载剂治疗的Cdkl5 KO样品相比(ANOVA后的Fisher’s LSD检验)。
图8
治疗后30(1M)天，在载剂治疗的野生型(+/Y,n＝14)和Cdkl5 KO(-/Y,n＝24)小鼠以及用AAVPHP.B_CDKL5(n＝9)或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5(n＝9)治疗的Cdkl5 KO小鼠中，在2分钟的间隔期间后肢紧握所花费的时间总量。值代表平均值±SEM。***p<0.001与载剂治疗的野生型条件相比；#p<0.05与载剂治疗的Cdkl5 KO样品相比(ANOVA后的Fisher’sLSD检验)。
图9
经治疗的Cdkl5 KO小鼠的多动症被测量为在20分钟的旷场测试期间行进的总距离和平均运动速度。与野生型(+/Y,n＝24)小鼠相比，Cdkl5 KO小鼠(-/Y,n＝24)表现出增加的运动活动，以更大的平均速度行进更长的总距离。用AAVPHP.B_CDKL5(n＝9)或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5(n＝9)治疗的Cdkl5 KO小鼠在治疗后30(1M)天60(2M)天均显示出这些行为的改善。值代表平均值±SEM。*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001与载剂治疗的野生型条件相比(ANOVA后的Fisher’s LSD检验)。
图10
用巴恩斯迷宫(Barnes Maze)评估经治疗的Cdkl5 KO小鼠的空间学习和记忆。图显示了在3天学习期间每天3次试验中找到目标孔的延迟。与野生型(+/Y,n＝14)小鼠相比，载剂治疗的Cdkl5 KO小鼠(-/Y,n＝14)和用AAVPHP.B_CDKL5治疗的Cdkl5 KO小鼠(n＝9)在学习期期间表现出找到目标孔的延迟增加。用AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5治疗的Cdkl5 KO小鼠(n＝8)表现出学习改善；当延迟表示为每天第一次试验的百分比时，这一点尤其明显(下图)。值代表平均值±SEM。*p<0.05,**p<0.01与载剂治疗的野生型条件相比；#p<0.05与载剂治疗的Cdkl5 KO样品相比(重复ANOVA后的Fisher’s LSD检验)。
图11
在载剂治疗的野生型(+/Y；n＝14)和Cdkl5 KO(-/Y；n＝14)小鼠以及用AAVPHP.B_CDKL5(n＝9)或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5(n＝8)治疗的Cdkl5 KO小鼠中用巴恩斯迷宫评估空间记忆。图显示了在探查日(第4天)找到目标孔的延迟(上部直方图)和找到目标孔之前的错误次数(下部直方图)。值代表平均值±SEM。*p<0.05与载剂治疗的野生型条件相比；#p<0.05与载剂治疗的Cdkl5 KO样品相比(重复ANOVA后的Fisher’s LSD检验)。
图12
使用全身体积描记法评估经治疗的Cdkl5 KO小鼠的睡眠呼吸暂停发生率。在非快速眼动(NREM)睡眠、快速眼动(REM)睡眠期间，载剂治疗的Cdkl5 KO(-/Y,n＝12)和野生型(+/Y,n＝13)小鼠以及用AAVPHP.B_CDKL5(n＝8)或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5(n＝8)治疗的Cdkl5 KO小鼠中的睡眠呼吸暂停发生率。*p<0.05与载剂治疗的野生型条件相比；#p<0.05与载剂治疗的Cdkl5 KO样品相比(重复ANOVA后的Fisher’s LSD检验)。
图13
来自载剂治疗的Cdkl5 KO(-/Y,n＝4)和来自用AAVPHP.B_CDKL5(n＝4)或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5(n＝4)治疗的Cdkl5 KO小鼠的皮层、纹状体和肝脏中CDKL5的mRNA表达。数据以Cdkl5-/Y未治疗条件的变化倍数给出。
图14
CDKL5和TATk-CDKL5蛋白分布到CNS中。图像显示注射后90天经治疗小鼠的纹状体中的TATk-CDKL5或CDKL5蛋白定位。使用抗HA抗体通过免疫组织化学对TATk-CDKL5或CDKL5的定位进行评估，并且用Hoechst对细胞核进行复染。比例尺＝70μm。
图15
TATk-CDKL5蛋白分布到纹状体中。图像显示注射后90天经治疗小鼠中的TATk-CDKL5蛋白定位。使用抗HA抗体通过免疫组织化学对TATk-CDKL5的定位进行评估(上图)，并且用Hoechst对细胞核进行复染(下图)。箭头表示可能通过局部扩散接收TATk-CDKL5的细胞；星号表示免疫标记细胞的细胞核。
具体实施方式
因此，本发明提供了一种经修饰的基因疗法载体，其在不显著改变其感染效率的情况下增加了相同未修饰载体的治疗效果。
观察到的令人惊讶的技术效果(在图14中清楚可见)是相对于分配到用未修饰载体进行基因疗法的器官中的治疗性蛋白质的量，分配到用根据本发明的经修饰的载体进行基因疗法的器官中的治疗性蛋白质的量显著增加。如上所述，本发明的经修饰的载体提供了改善的治疗有效性，并且为了获得用相同的未修饰载体可获得的相同结果，还允许较少感染数量和/或较低的每次感染病毒载量。
由于使用病毒载体进行基因疗法引起的不利副作用的报道(请注意，相对于非病毒载体，病毒载体的优点是更高的效率并提供靶细胞的持久转化)，允许降低获得治疗效果所需的病毒载量和/或感染数量的用于基因疗法的病毒载体是极其有利的并且显著提高了疗法的安全性。
特别地，无需放大病毒载量和/或感染数量(而是允许减少它们)而显著增强治疗效果的用于基因疗法的载体特别适用于CNS中，特别是进入脑的基因疗法，因为本领域报道的脑基因疗法的感染效率极低。
因此，本发明的一个目的是一种基因疗法载体，包含编码分泌前导序列的第一核酸、所述第一核酸可操作地连接的编码蛋白质转导结构域(PTD)的第二核酸、所述第二核酸可操作地连接的编码治疗性蛋白质的第三核酸。
根据说明书，已知用于基因疗法的任何病毒载体都适合实施本发明。已知的病毒基因疗法载体包括逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒和腺相关病毒。
根据本发明的合适载体的非限制性实例由单纯疱疹病毒1型(HSV-1)载体、慢病毒载体、腺病毒载体和AAV载体代表。AAV载体是用于实施本发明的优选载体。
正如技术人员所知，AAV载体是无包膜的25nm颗粒，具有4.7kb的外源DNA包装容量。它们已被临床证明在多种组织中是安全的。AAV的多种血清型是已知的，它们中的每一种都对某些器官或器官特异性细胞表现出强烈的趋向性。
根据现有技术，技术人员知道例如以下：
Figure BDA0003403723480000081
Figure BDA0003403723480000091
技术人员还熟知基于AAV的载体源自腺相关病毒血清型2，但也源自其他血清型(AAV1、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6)。野生型AAV2是非致病性的，在感染人类细胞后会在特定位点整合到19号染色体的长臂中。重组AAV2载体是通过在两个反向末端重复(ITR)之间插入治疗性基因，替换包括rep和cap基因在内但不包括ITR的所有编码序列来产生的。这种重组AAV质粒与“辅助”质粒在HEK 293细胞中共转染，该“辅助”质粒包含rep和cap AAV基因以及AAV基因适当表达所需的腺病毒E2A、E4和VA基因，但缺少AAV反向末端重复。
因此，生产性感染依赖于辅助病毒(腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒)的存在。Rep和cap基因是复制和衣壳化以及位点特异性整合(Rep78和Rep68蛋白)所必需的。因此，由于去除了所有内部编码序列，缺少这些基因的重组AAV载体是复制缺陷型的，除非与具有这些功能的辅助病毒共转染。基于AAV的载体仅包含原始AAV基因组的一对145个核苷酸长的ITR，它们对DNA插入片段的包装容量为4-5kb。
在一个实施方案中，本发明的经修饰的载体是根据上述任一实施方案的基因疗法载体，其中所述载体是具有用于CNS基因疗法的最佳血清型的载体。
如本领域已知的，当注射到脑实质中时，各AAV血清型显示出不同的特性，这使得每种血清型或多或少适合于CNS基因递送。AAV2是大多数人体临床试验中使用的血清型，主要是因为其已经被研究最长时间并且最详细。AAV2具有强烈的神经元趋向性，但在实质内注射时扩散有限。已报道注射到脑室下区的AAV4优先转导星形胶质细胞和室管膜细胞。已报道AAV5转导星形胶质细胞和神经元二者。AAV5的神经元转导范围大于AAV2，AAV5会扩散到明显更大的体积。AAV1、AAV8和AAV9主要具有神经元趋向性，并且当在实质内注射时，它们比AAV2转导明显更多的细胞，CNS递送的一般效率为：AAV9>AAV8>AAV1。因此，根据本发明，具有用于CNS基因疗法的最佳血清型的载体是对CNS细胞显示趋向性的载体。如上所述，AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8和AAV9中的任一种因此适合于执行本发明的该实施方案。取决于用于基因疗法的靶细胞，技术人员将在本领域有足够的信息来选择用于期望细胞疗法的最佳血清型。
在一个实施方案中，载体选自AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12和AAV13。在另一个实施方案中，载体选自AAV9、AAV8和AAV1，在另一个实施方案中，载体是AAV9。
如技术人员所知，AAV载体包含两个ITR(反向末端重复)，和在所述两个ITR之间的至少以下元件：启动子、目的基因和终止子/多腺苷酸化信号。
因此，根据本发明的AAV基因疗法载体包含以下或由以下组成：在两个反向末端重复(ITR)之间的启动子、分泌前导序列、所述分泌前导序列可操作地连接的编码蛋白质转导结构域(PTD)的第二核酸、所述第二核酸可操作地连接的编码治疗性蛋白质的第三核酸、多腺苷酸化信号。
本领域中的大多数AAV载体被设计具有AAV2 ITR，然而本发明不限于AAV2 ITR，尽管它们是优选的。
取决于疗法的靶标，根据本发明的启动子可以是任何合适的启动子。常用的启动子包括具有组成型活性的CMV(巨细胞病毒)启动子、EFIa(延伸因子1a)启动子、SV40(猿猴病毒40)启动子、鸡β肌动蛋白(CBA)和CAG(CMV、鸡β肌动蛋白、兔β珠蛋白)启动子、CBh(与经修饰的鸡β-肌动蛋白融合的CMV早期增强子)启动子，然而，也可以使用组织特异性启动子以具有组织特异性表达。例如，神经元特异性烯醇化酶启动子可以获得高水平的神经元特异性表达。
在一个优选的实施方案中，使用Gray等人Hum Gene Ther.2011Sep；22(9):1143–115中充分描述的CBh启动子。
在一个优选的实施方案中，本发明的基因疗法载体是包含编码以下的核苷酸构建体或由编码以下的核苷酸构建体组成：在两个AAV2反向末端重复(ITR)之间的800个核苷酸的CBh启动子、编码分泌前导序列的第一核苷酸序列、所述第一核苷酸序列可操作地连接的编码蛋白质转导结构域(PTD)的第二核酸、第二核酸序列可操作地连接的编码治疗性蛋白质的第三核酸和SV40多腺苷酸化信号。
CBh启动子由以下构成：1)GenBank登录号NC_006273.2，nt 175625-175294(CMV)；2)GenBank登录号X00182.1，nt 280-540；3)GenBank登录号X00182.1，nt 544-676；和4)GenBank登录号NC_001510.1，nt 2312-2403(VP内含子)。在本发明的一个实施方案中，可以使用Gray等人.HUMAN GENE THERAPY 22：1143-1153中公开的CBh启动子。
根据本发明，基因疗法载体包含编码分泌前导序列的第一核苷酸序列。分泌前导序列是短肽，其可以是本领域已知的能够将与其相连的蛋白质转运到哺乳动物细胞外，特别是人类细胞外的任何分泌前导序列。
技术人员知道多种分泌前导序列，并且可以根据产生的蛋白质和用于基因疗法的靶细胞来选择优选的一种。
下表提供了分泌前导序列的非限制性实例。
表1
前导序列名称 序列 SEQ ID NO
小鼠IgK METDTLLLWVLLLWVPGSTGD 1
人OSM MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASM 2
VSV-G MKCLLYLAFLFIGVNC 3
人IgG2 H MGWSCIILFLVATATGVHS 4
BM40 MRAWIFFLLCLAGRALA 5
Secrecon MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA 6
人lgKVIII MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC 7
CD33 MPLLLLLPLLWAGALA 8
tPA MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS 9
人胰凝乳蛋白酶原 MAFLWLLSCWALLGTTFG 10
人胰蛋白酶原-2 MNLLLILTFVAAAVA 11
人IL-2 MYRMQLLSCIALSLALVTNS 12
Gaussia luc MGVKVLFALICIAVAEA 13
白蛋白(HSA) MKWVTFISLLFSSAYS 14
流感血凝素 MKTIIALSYIFCLVLG 15
人胰岛素 MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA 16
可以将编码上述氨基酸序列的任何核苷酸序列插入本发明的载体中。
每个所述示例性分泌前导肽的序列是本领域已知的，因此可以容易地设计编码每个所述序列的核酸。
在一个优选的实施方案中，分泌前导序列是小鼠Igk。
此外，本发明的载体包含与编码分泌前导序列的核酸可操作地连接的蛋白质转导结构域或PTD。多种PTD是本领域已知的，并且在这种情况下，技术人员在选择所需的PTD方面也没有困难，这也取决于表达的治疗性蛋白质和靶细胞。在任何情况下，适合于实施本发明的PTD的非限制性实例是TATk、MPG、Pep-1、ARF(1-22)、BPrPr(1-30)、MAP、p28、VT5、C105Y、M918、DPV3、人乳铁蛋白，合适的PTD氨基酸序列的实例在下表2中描述：
PTD名称 序列 SEQ ID NO
HIV-1TATk YARKAARQARA 17
MPG GLAFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV 18
PEP-1 KETWWETWWTEWSQPKKRKV 19
ARF(1-22) MVRRFLVTLRIRRACGPPRVRV 20
BPrPr(1-30) MVKSKIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKP 21
MAP KLALKLALKALKAALKLA 22
Azurin p28 LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD 23
VT5 DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD 25
C105Y PFVYLI 26
M918 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV 27
DPV3 RKKRRRESRKKRRRES 28
人乳铁蛋白 KCFQWQRNMRKVRGPPVSCIKR 29
可以将编码上述氨基酸序列的任何核苷酸序列插入本发明的载体中。
如有必要，编码指定PTD的序列可以在编码弗林蛋白酶识别序列的部分进行修改，以避免在通过内质网和高尔基体的分泌转变过程中PTD结构域的切割和丢失，如”Deliveryof therapeutic proteins as secretable TAT fusion products”Mol Ther.2009Feb；17(2)：334-42.doi：10.1038/mt.2008.256.Epub 2008Dec 2中解释的。
根据本发明，上面列出的任何载体可以包含编码上面列出的任一种分泌前导序列的核酸，其可操作地连接至编码上面列出的任何PTD的核酸。
在一个优选的实施方案中，将使用包含与编码TATk的序列可操作地连接的编码小鼠Igk的序列的AAV载体。
本发明的基因疗法载体可以编码任何期望的治性疗蛋白质，特别是与单基因疾病相关的蛋白质。在优选的实施方案中，蛋白质是适合于CNS基因疗法的蛋白质。
所述蛋白质的非限制性实例是CDKL5、MECP2、FOXG1、SCN1A、NLGN3、SHANK3、ASPA、PAH。
技术人员可以很容易地在基因库中找到期望序列的必要信息，例如，上述蛋白质及其genbank登录号在下表3中报告。
基因名称 基因ID MIIM
细胞周期蛋白依赖性激酶样5(CDKL5) 6792 300203
甲基-CpG结合蛋白2(MECP2) 4204 300005
叉头框G1(FOXG1) 2290 164874
钠电压门控通道α亚基1(SCN1A) 6323 182389
神经连接蛋白3(NLGN3) 54413 300336
SH3和多个锚蛋白重复结构域3(SHNK3) 85358 606230
天冬氨酸酰化酶(ASPA) 443 608034
苯丙氨酸羟化酶(PAH) 5053 612349
上述任何实施方案或实施方案的任何组合中的载体可用于基因疗法，特别是用于CNS基因疗法，特别是用于脑基因疗法。
将本发明的优化载体递送至患者靶细胞的基因疗法可用于多基因疾病和单基因疾病二者的治疗。
在更多的情况下疾病由不同基因(超过一个)(当然是技术人员认为仍然适合通过病毒感染进行基因疗法的数量)的突变共存引起，则可以使用编码不同治疗性蛋白质的根据本发明的经修饰的载体的混合物，或者可以进行针对每个治疗性经修饰的载体的多次感染事件。
根据疾病和患者的一般健康状况，技术人员会知道哪种方案更合适。
如果仅仅因为相同的病理可以由不同基因的突变引起，并且因此相同的病理表型由不同的病理基因型引起，其中限定的一组基因中的一个或另一个基因的突变会导致相同的病理的事实，疾病被定义为多基因型或多个基因型，则由于单个患者的病理原因是由单个基因的突变引起的(在纯合子或杂合子中)的事实，在本说明书的含义中病理学仍然属于“单基因型”疾病的定义。事实上，在这种情况下，相同的症状(根据医学属于同一疾病的定义)在基因角度上可以被认为是不同基因紊乱的总和，其全部提供相同的病理表型，因此由医生定义具有相同的病理学名称。只要单一治疗性蛋白质适合于治疗单一患者的疾病，根据本说明书，该疾病属于单基因疾病的定义。
目前基因疗法优先用于治疗(或尝试治疗)单基因疾病。因此，根据一个优选的实施方案，上述用途适用于单基因疾病和本文限定的那些。
可以用本发明的基因疗法载体通过基因疗法治疗的疾病的非限制性实例是德拉韦综合征(Dravet syndrome)、苯丙酮尿症、ASD、Phelan-McDermid综合征、卡纳万病(Canavan disease)或雷特综合征(Rett Syndrome)。因此，根据本说明书，取决于本发明载体中的第三核酸编码的蛋白质，可以治疗任何上述疾病。
其中已证明施用替代蛋白质有用的所有疾病都适合基因疗法，以及已知蛋白质突变或缺失是疾病的直接原因的所有疾病都可以进行基因疗法。
技术人员可以容易地找到其突变或缺失与基因疾病相关的所有蛋白质，因此，取决于所选择的蛋白质，本发明的载体可用于治疗期望的疾病。
已经探索了多种载体施用途径以针对特定疾病应用：
·直接注射提供了一种简单但侵入性的方法来有效地转导小区域
·注射到脑内的CSF中允许载体广泛分布在整个CNS中，但对脑实质的渗透有限
·进一步通过腰椎穿刺的鞘内注射使载体分布在整个CSF中，但主要靶向脊髓和背根神经节(DRG)。
·肌内注射通过逆行运输靶向运动和感觉神经元
·血管内施用可以实现整个CNS的广泛转导，但需要高载体剂量和外周暴露于载体。上述任何施用途径均可用于实施本发明载体的基因疗法。
本发明的载体可以根据本领域常用的技术制备。一般来说，最广泛使用的生产AAV(如修饰/重组AAV)的平台涉及用两种或三种质粒转染HEK293细胞，一种编码目的基因，一种编码AAV rec/cap基因，另一种包含由腺病毒或疱疹病毒提供的辅助基因。可以用贴壁细胞或悬浮适应的HEK293细胞进行生产。在其它AAV制造平台中，用于AAV制造的一种或多种遗传成分被整合到哺乳动物或昆虫生产细胞的基因组中。
用于产生AAV载体的方案是本领域已知的，并且任何已知方案均可用于实施本发明。
为了进行基因疗法，需要将本发明的载体递送至靶细胞。因此，载体将被包装在适合基因疗法的病毒颗粒(即包含载体的合适衣壳)中。衣壳将根据所使用的病毒载体进行选择。因此，本发明的另一个目的是由病毒衣壳和基因疗法载体组成的病毒颗粒代表，根据上述任何实施方案，该基因疗法载体包含编码分泌前导序列的第一核酸、所述第一核酸可操作地连接的编码蛋白质转导结构域(PTD)的第二核酸、所述第二核酸可操作地连接的编码治疗性蛋白质的第三核酸。
在一个优选的实施方案中，病毒颗粒将是AAV颗粒，因此在以上定义的任何实施方案中，由衣壳组成的颗粒是AAV衣壳和腺相关病毒载体(AAV)。
因此，在本发明的一个实施方案中，所述载体具有如前所述的用于CNS基因疗法的最佳血清型。
对于AAV载体，本领域已知多种AAV衣壳蛋白，并且可以根据疗法的靶细胞设计多种AAV衣壳。
已知AAV通过与存在于靶细胞表面的碳水化合物(通常为唾液酸、半乳糖和硫酸肝素)相互作用而进入细胞。已知衣壳序列中编码的糖结合优先性的差异会影响各种AAV的细胞类型转导优先性。
AAV9优先与半乳糖结合被认为赋予病毒独特的能力，使其能够穿过血脑屏障(BBB)并感染包括原代神经元在内的CNS细胞。
根据本发明，合适的AAV衣壳是AAV-PHP、AAV9、AAV-BR1、AAV-Retro衣壳中的一种。
在本发明的一个实施方案中，所述AAV-PHP衣壳是AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S或AAV-PHP.A。AAV-PHP衣壳蛋白(和相关衣壳)是众所周知的基于AAV血清型9衣壳的基因工程化AAV衣壳蛋白。
根据本发明，包装到病毒颗粒中的载体编码治疗性蛋白质，在一个具体实施方案中，所述治疗性蛋白质是如上文已经定义的用于CNS疗法的蛋白质。
所述治疗性蛋白质的非限制性实例包括CDKL5、MECP2、FOXG1、SCN1A、NLGN3、SHANK3、ASPA、PAH。
在本文提供的任何实施方案或实施例中的病毒颗粒特别旨在用于基因疗法治疗，换言之，旨在用于本说明书中以上参考基因疗法载体已经描述的基因疗法治疗。
为本发明的基因疗法载体提供的基因疗法方法/用途的所有定义和实例经必要修改后适用于本发明的病毒颗粒。
本发明的另一个目的是一种药物组合物，其包含上述任何实施方案中的病毒颗粒和合适的药学上可接受的载体，或由它们组成。该组合物是适合全身(包括静脉内)注射、中枢神经系统递送或气雾剂/鼻递送的组合物。例如，注射可以是静脉内注射、脑的特定区域例如脑室内、脑池的实质内施用，腰椎或鞘内施用，或动脉内注射(颈动脉注射可用于递送)，或通过直接施用至脑脊液。
用于上述施用的合适的药物载体是技术人员众所周知的，例如可以使用盐水溶液。
当旨在用于医学治疗时，本文描述的每个产品都将处于无菌形式。
因此，本发明的另一个目的是医学治疗，包括向有此需要的患者施用治疗有效剂量的本发明的病毒颗粒或药物组合物。
说明书中提供的与载体和使用该载体治疗的疾病相关的所有实施方案适用于病毒颗粒、药物组合物以及根据本发明的用途或医学治疗。包括施用途径。
以下实施例集中于本发明的一个具体实施方案，即根据本发明的AAV经修饰的载体，其中可操作地连接的编码分泌前导序列-PTD-目的基因的三个核苷酸序列分别编码IgK-TATκ-CDKL5。提供这些实施例以完整地展示实施本发明的一种方式和体内观察到的结果，然而，很明显，它们不旨在在任何方面限制本发明的权利要求或实施方案，因为根据说明书和实施例中的教导，可以使用不同的前导序列、PTD和基因，以实施要求保护的发明。
所有动物实验均按照意大利和欧洲共同体关于实验动物使用的法律进行，并得到博洛尼亚大学生物伦理委员会(Bologna University Bioethical Committee)的批准。
实施例
用于AAV病毒颗粒生产的一般方案
通过无腺病毒质粒转染方法(Matsushita T,Elliger S,Elliger C,PodsakoffG,Villarreal L,Kurtzman GJ,Iwaki Y,Colosi P.1998.Adeno-associated virusvectors can be efficiently produced without helper virus.Gene Ther 5:938-945)在HEK 293细胞中产生AAV载体，并修改为1至2升培养规模。简而言之，HEK 293细胞(AAV-293)购自安捷伦(Agilent)(AAV-293细胞)并在补充有10％胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Lonza,Basel,Switzerland)中生长。临质粒DNA转染之前，将培养基更换为无血清培养基。按照1:2的DNA:PEI重量比，使用标准聚乙烯亚胺(PEI)(1mg/mL)DNA转染程序以1:1:1的比例在HEK293细胞中转染以下三种质粒。用于AAV载体生产的三种质粒是：(1)pHELPER(来自安捷伦的腺病毒辅助质粒)，(2)pHLP-AAV-PHP.B(提供AAV2 Rep和AAV-PHP.B衣壳蛋白的AAV辅助质粒，基于从宾夕法尼亚大学James M.Wilson获得的AAV9辅助质粒构建)，和(3)包含位于两个AAV2反向末端重复(ITR)之间的转基因表达盒的AAV载体质粒，基于从Avigen Inc.获得的AAV载体质粒构建。转染后五天，收获培养基和细胞二者。收获的培养基和细胞经历一个冷冻和解冻循环，并通过离心去除细胞碎片。将培养基上清液制成8％聚乙二醇(PEG)8000和0.5M NaCl，在冰上孵育3小时，然后以10,000×g离心30分钟以沉淀病毒颗粒。将沉淀物重悬在含有50mM Tris-HCl(pH 8.5)和2mM MgCl2的缓冲液中，用Benzonase(EMD Millipore,Darmstadt,Germany)以200单位/mL的浓度处理1小时，然后通过两轮氯化铯(CsCl)密度梯度超速离心进行纯化(Grimm D,Zhou S,Nakai H,Thomas CE,Storm TA,Fuess S,Matsushita T,Allen J,Surosky R,Lochrie M,Meuse L,McClelland A,Colosi P,Kay MA.2003.Preclinical invivo evaluation of pseudotyped adeno-associated virus vectors for liver genetherapy.Blood 102:2412-2419)，然后用含0.001％Pluronic F68的磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行透析。最终病毒制剂在PBS/5％山梨糖醇/0.001％Pluronic F68中制备，并在-80℃储存直至使用。AAV载体滴度通过定量斑点印迹测定法来确定Powers JM,Chang XL,Song Z,Nakai H.2018.A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use forFunctional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activatingProteins.J Vis Exp 12doi:10.3791/56766)。
用于基因疗法的AAV载体的生产
为了通过AAV载体介导的基因递送在神经元中表达IgK-TATκ-CDKL5蛋白和CDKL5蛋白，构建了插入在AAV载体质粒中的处于强、长期和普遍存在的CNS表达启动子(CBh,S.J.Gray等人.,Optimizing promoters for recombinant adeno-associated virus-mediated gene expression in the peripheral and central nervous system usingself-complementary vectors.Hum Gene Ther 22,1143-1153(2011))的控制下的IgK-TATκ-CDKL5和CDKL5基因表达盒，我们可以利用其生产重组AAV载体。表达盒包含位于两个AAV2反向末端重复(ITR)之间的800bp CBh启动子、IgK-TATκ-CDKL5(3.2kb)或CDKL5(3.1kb)开放阅读框和0.1kb SV40多腺苷酸化信号。
重组AAV生产
重组AAV载体使用AAV-PHP.B衣壳(B.E.Deverman等人,Cre-dependent selectionyields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain.NatBiotechnol 34,204-209(2016))，并如(Grieger等人.Separate basic region motifswithin the adeno-associated virus capsid proteins are essential forinfectivity and assembly.J Virol.80,5199-210(2006).)中描述的通过人胚胎肾293(HEK293)细胞中的三重感染方法生产。简而言之，我们在临转染前将完全培养基更换为无血清培养基，用所需量的每种质粒DNA与聚乙烯亚胺(PEI)以DNA/PEI重量比为1:2的混合物转染细胞，并在转染后5天收获培养基和细胞用于病毒颗粒回收。使用25至50个225cm2烧瓶生产AAVPHP.B_CDKL5载体和AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体。收获的培养基(1L至2L)和细胞经历一个冷冻和解冻循环，并且通过以10,000×g离心15分钟以去除细胞碎片。将培养基上清液制备成8％聚乙二醇8000(PEG 8000)和0.5M NaCl，在冰上孵育3小时，然后以10,000×g离心30分钟以沉淀病毒颗粒。将沉淀重悬在含有50mM Tris-HCl(pH8.5)和2mM MgCl2的缓冲液中，用Benzonase(EMD Millipore,Darmstadt,Germany)以200U/ml的浓度处理1小时，然后通过两轮CsCl密度梯度超速离心进行纯化(J.M.Powers,X.L.Chang,Z.Song,H.Nakai,A Quantitative Dot Blot Assay for AAV Titration and Its Use forFunctional Assessment of the Adeno-associated Virus Assembly-activatingProteins.J Vis Exp,(2018))，然后用缓冲液(含5％d-山梨糖醇的磷酸盐缓冲盐水(PBS))进行透析。
动物管理和治疗
这项工作中使用的小鼠源自E.Amendola等人,Mapping pathologicalphenotypes in amouse model of CDKL5 disorder.PLoS one 9,e91613(2014)中开发的C57BL/6N背景中的Cdkl5无效(null)品系，并在C57BL/6J中回交三代。Cdkl5+/Y小鼠和Cdkl5-/Y同窝对照小鼠用于所有实验。出生日被指定为出生后第0天(P)，24小时龄的动物被认为是一天大的动物(P1)。断奶后，小鼠在温度(23℃)和湿度受控的环境中的12小时的光照/黑暗循环下每笼3-5只饲养，以任意取用的方式提供食物和水。动物的健康和舒适度由兽医服务控制。实验按照意大利和欧洲共同体关于实验动物使用的法律进行，并得到博洛尼亚大学生物伦理委员会的批准。在这项研究中，我们尽一切努力最大程度地减少动物的痛苦并将使用的动物数量保持在最低限度。
为了测试CDKL5基因疗法的功效，我们治疗了成年(P60)Cdkl5 KO(-/Y)小鼠。成年小鼠通过侧尾静脉(静脉内注射，IV)接受了0.2mL中AAVPHP.B的5×1011个病毒基因组(vg)颗粒(图3)。在注射后30天和60天，在Cdkl5 KO小鼠中评估治疗效果，参见治疗方案(图3)。病毒注射后九十天，处死小鼠并通过免疫组织化学评估CDKL5或GFP蛋白分布。这种实验设计使我们能够研究基因疗法在病毒注射后不同时间对相同动物的影响。
载体生物分布
使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN,CA)提取组织DNA，并使用SsoAdvancedUniversal SYBR Green Supermix(Bio-Rad,CA,USA)和靶向载体的CBh2启动子序列和小鼠agouti基因的引物/探针，通过实时PCR对载体基因组进行定量。小鼠agouti Fw 5’-GGCGTGGTCAGTGGTTGTG-3’、Rv 5’-TTTAGCTTCCACTAGGTTTCCTAGAAA-3’；CBh2Fw 5’-TACTCCCACAGGTGAGCGG-3’、Rv 5’-GGCAGGTGCTCCAGGTAAT-3’。拷贝数报告为每微克基因组DNA的载体基因组。
定量实时PCR和标准逆转录PCR
根据制造商的说明，使用TRI试剂(Sigma-Aldrich,MO,USA)从用载剂、AAVPHP.B_CDKL5(n＝4)或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5(n＝4)治疗的Cdkl5 KO小鼠的纹状体、皮质和肝脏中分离总RNA。根据制造商的说明，使用iScriptTMAdvanced cDNA Synthesis Kit(Bio-Rad,CA,USA)用5μg总RNA实现cDNA合成。我们使用了效率接近100％的引物。在iQ5实时PCR检测系统(Bio-Rad,CA,USA)中使用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad,CA,USA)进行实时PCR。使用的引物序列如下：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH；NM_008084.2)，Fw 5′-GAACATCATCCCTGCATCCA-3′，Rv 5′-CCAGTGAGCTTCCCGTTCA-3′，Fw(跨外显子3-4):5′-GCAGACACAAGGAAACACATGA-3′,Rv 5′-CAACTTTCCCCTCCGACGAA-3′。使用ΔΔCt方法进行相对定量。
组织学
小鼠用异氟烷(纯氧中4％)深度麻醉，并用4％多聚甲醛的100mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)进行灌注。取出脑并在固定液中储存过夜，在20％蔗糖的磷酸盐缓冲液中再保存24小时，然后用冷冰冷冻。切片、成像和数据分析的所有步骤都是盲法操作并由两个不同的操作员进行。用冷冻切片机将脑切成连续收集的多个30μm厚的冠状切片。端脑的12个切片中的一个用于免疫组织化学的HA(兔多克隆抗HA Ab，1:500，Cell Signaling)。将脑切片与一抗在4℃下孵育过夜，并与HRP缀合的抗兔二抗(1:200，Jackson Immunoresearch)孵育2小时。使用TSA Cyanine 3Plus Evaluation Kit(Perkin Elmer)进行检测。
蛋白质表达、分泌和蛋白质印迹分析
根据制造商的说明，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)转染试剂用以下载体转染HEK293T细胞：Igk-TATk-GFP、Igk-TATk-CDKL5、GFP和CDKL5。转染的细胞在无血清培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基，补充有2mM谷氨酰胺和抗生素：青霉素，100U/ml；链霉素，100mg/ml)中生长48小时。收集含有分泌蛋白的培养基，离心以沉淀细胞碎片并通过0.2mm注射器过滤器过滤。然后将培养基转移到截留分子量为50kDa的Amicon UltraCentrifugal Filters(Millipore)，并根据制造商的说明对蛋白质进行渗滤。在RIPA缓冲液(50mM Tris–HCl,pH 7.4,150mM NaCl,1％Triton-X100,0.5％脱氧胆酸钠,0.1％SDS和1mM PMSF,以及1％蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich))和浓缩培养基中对细胞提取物进行蛋白质印迹分析。通过Lowry方法测定蛋白质浓度(O.H.Lowry,N.J.Rosebrough,A.L.Farr,R.J.Randall,Protein measurement with the Folin phenolreagent.The Journal of biological chemistry 193,265-275(1951))。蛋白质在BOLTbis-tris plus凝胶(Thermo Fisher Scientific)上进行电泳并转移到Hybond ECL硝酸纤维素膜(Amersham Life Science)上。使用以下一抗：兔多克隆抗HA(1:500,CellSignaling)。使用以下二抗：抗兔IgG(1:5000,Jackson ImmunoResearch)抗体。使用Chemidoc XRS成像系统和Image LabTM软件(Bio-Rad)对数字化图像进行光密度分析。
行为试验
在对治疗不知情的情况下进行所有动物行为研究和分析。测试前让小鼠适应测试室至少1小时，并在一天的同一时间进行测试。载剂治疗的Cdkl5 KO(-/Y；n＝15)和野生型(+/Y；n＝15)小鼠的组用作行为测试的对照。
后肢紧握。将动物通过尾巴悬挂2分钟，并由两名操作员从视频记录中独立评估后肢紧握。紧握事件由四肢向身体内并朝向中线收缩定义。
弹珠埋藏。弹珠埋藏测试是通过将动物单独放置在具有5cm的无味标准铺垫材料和排列成4×5矩阵的20颗弹珠(直径14.3mm)的类似饲养笼的环境中并不受干扰地留置30分钟进行。对试验结束时至少埋入三分之二的弹珠数量计数。
加速转棒仪试验。在第一次测试阶段之前，动物在转棒仪装置(Ugo Basile)上以5rpm的恒定速度短暂训练30秒。30分钟后，以加速线性速度(270s+30s内5-35rpm最大速度)进行测试。进行了四次测试试验，试验间间隔为1小时。每次试验都记录从旋转棒上掉下来的延迟和被动旋转的次数(小鼠不执行任何协调运动而是从旋转装置被动运输的旋转)。
旷场。为了评估运动，将动物放置在方形场地(50×50cm)的中心，并使用设置在场地中心上方的摄像机监测它们的行为20分钟。通过EthoVision10XT软件(NoldusInformation Technology B.V.,The Netherlands)对运动活动的不同特征，包括总行进距离、平均运动速度以及在边界(墙壁)和中心花费的时间进行评分。场地角落的刻板跳跃(重复束中断<1秒)的数量由对基因型和治疗不知情的训练有素的观察者手动计数。在测试对象之间用70％乙醇清洁测试室。
巴恩斯迷宫。训练小鼠从均匀分布在高架(地面上方60cm)圆形开放区域(直径100cm)(Ugo Basile,)的周边的20个孔(直径55cm)中定位目标孔(带有下方的逃生箱)。逃生箱被指定为类似于MWM中的隐藏平台，在目标孔下方包括斜坡，以便小鼠可以容易地进入逃生箱。小鼠最初被放置在被黑色圆柱覆盖的场地的中心，该黑色圆柱在试验开始后10秒被移除。连续三天每天三次试验对所有小鼠进行训练，试验间间隔为30分钟。最初未能在3分钟内定位目标孔的小鼠由操作员轻轻引导到目标。将小鼠留在逃生箱中1分钟，然后在下一次训练试验之前返回其饲养笼。第二天对小鼠进行“探查试验”(试验持续时间90秒)，其中逃生箱被移除。所有训练试验和探查试验都录像3分钟，并且进入逃生箱/目标孔的延迟和错误次数由EthoVision10XT软件(Noldus,)自动评分。
睡眠和呼吸模式的非侵入性评估。使用基于全身体积描记法(WBP)的验证技术对小鼠的入睡和呼吸表型进行非侵入性评估(S.Bastianini等人,Accurate discriminationof the wake-sleep states of mice using non-invasive whole-bodyplethysmography.Scientific reports 7,41698(2017)；V.Lo Martire等人,CDKL5deficiency entails sleep apnoea’s in mice.Journal of sleep research 26,495-497(2017)。简而言之，将每只小鼠放置在WBP室内部，在光照周期的前8小时用1.5l/h的空气冲刷。将呼吸(WBP室压力)信号与室湿度和温度一起连续记录，数字化并分别以128Hz、4Hz和4Hz的频率存储。在每次记录结束时将系统用100μl微型注射器(Hamilton,Reno,USA)校准。基于对动物基因型不知情的研究人员对原始WBP信号的检查，对清醒状态、非快速眼动睡眠(NREMS)状态和快速眼动睡眠(REMS)状态进行评分。由于在清醒期间频繁发生运动假象(artefact)，呼吸的定量分析仅限于≥12秒的稳定睡眠阶段。呼吸暂停被自动检测为瞬时总呼吸持续时间(TTOT)>3次的呼吸；在原始记录中检查每只小鼠和睡眠状态的平均TTOT，以及检测精度。
统计分析。来自多单个动物的数据代表了分析的统一性。结果表示为平均值±平均值的标准误差(±SE)。使用GraphPad Prism(第6版)进行统计分析。使用ROUT方法(Q＝1％)分析所有数据集以识别显著异常值，并使用Shapiro-Wilk检验进行正态性检验。使用以基因型为因素的单因素方差分析(ANOVA)分析具有正态分布的数据集的显著性。使用Fisher最小显著性差异(Fisher’s LSD)检验进行事后多重比较。使用Kruskal-Wallis检验分析具有非参数分布的数据集。使用Dunn多重比较检验或Mann-Whitney检验进行事后多重比较。对于转棒仪试验和巴恩斯迷宫的学习阶段，使用重复ANOVA进行统计分析。p<0.05的概率水平被认为是统计学显著的。
结果
用于基因疗法的分泌型AAV-Igk-TATk-CDKL5载体的成功生产
为了通过实验验证新构建的AAV载体基因组的设计效率，评估了Igk-TATk-CDKL5蛋白的分泌能力。使用人胚胎肾293(HEK293)细胞进行了瞬时质粒DNA转染试验。
在用AAV-Igk-TATk-CDKL5质粒转染HEK293细胞后48小时，蛋白质印迹分析在培养基中检测到TATκ-CDKL5蛋白(图2，第3行)，表明Igk-TATκ-CDKL5蛋白从转染细胞中有效分泌出来。如预期的，培养基中不存在不含Igk-TATk的CDKL5(图2，第4行)。
还证实了使用标准的无腺病毒三质粒转染系统从产生的AAV载体质粒的高产率重组AAV载体生产(数据未示出)。
CDKL5KO小鼠中AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5或AAVPHP.B_CDKL5载体基因疗法的效 果
为了测试成年小鼠Cdkl5丢失的影响是否可以被逆转，向2月龄的Cdkl5 KO雄性小鼠静脉内注射AAVPHP.B_CDKL5载体或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体(图3)。比较了5×10e11 vg剂量的AAVPHP.B_CDKL5载体或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体的效果。在注射后30天和60天评估治疗效果(参见治疗方案；图3)。载剂治疗的Cdkl5 KO(-/Y)和野生型(+/Y)小鼠的组用作行为测试的对照。在两个注射后时间窗口中重复行为测试，以评估CDKL5在脑中的生物利用度的影响是否随时间增加。一些只能在同一只动物上进行一次的行为测试在施用后30天(1M)或60天(2M)进行(见图3)。
对体重的影响
为了评估由于病毒感染和/或CDKL5表达导致的毒性作用的存在，评估了经治疗的Cdkl5 KO小鼠的体重并与载剂治疗的Cdkl5 KO小鼠进行比较。在注射前和注射后30天和90天记录Cdkl5 KO小鼠的体重。在治疗后1-3个月，未观察到经治疗小鼠和年龄匹配的载剂治疗小鼠之间的体重差异(图4)，表明CDKL5表达不影响动物健康。
对孤独症样特征的影响
Cdkl5 KO小鼠中Cdkl5功能的丧失与通过饲养笼社交行为分析的孤独症样(ASD样)表型相关(弹珠埋藏；C.Fuchs等人.,Heterozygous CDKL5 Knockout Female Mice Area Valuable Animal Model for CDKL5 Disorder.Neural plasticity 2018,9726950(2018)。使用弹珠埋藏测试来评估探索和环境兴趣。与野生型(+/Y)小鼠相比，Cdkl5 KO(-/Y)小鼠埋藏显著更少数量的弹珠(图5)。用AAVPHP.B_CDKL5载体或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体治疗后30天(1M)，Cdkl5 KO小鼠埋藏比载剂治疗的Cdkl5 KO小鼠更多数量的弹珠(图5)。治疗后60天，埋藏的弹珠的数量变得更高(图5)，表明CDKL5表达对脑功能的时间依赖性影响。重要的是，通过用TATk-CDKL5治疗实现了最大的改善，表明由TATk-CDKL5诱导的增加的CDKL5生物分布。
对受损运动功能的影响
我们在加速转棒仪试验中评估了经治疗的Cdkl5 KO小鼠的运动功能。小鼠在旋转棒上测试4次试验，试验间间隔为1小时，并且评估了被动旋转的频率(被动旋转次数/秒)，即其中小鼠不执行任何协调运动并从旋转装置被动传输的旋转。测试在治疗后30天和60天进行。与野生型小鼠相比，Cdkl5 KO小鼠在两次测试(1M和2M)的四次试验中表现出明显更多的被动旋转(图6)。值得注意的是，在用AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体治疗的Cdkl5 KO小鼠中，转棒仪行为表现得到改善；特别是，在第二次试验(2M)中，被动旋转的次数减少并变得与野生型小鼠相似(图6)。相比之下，在用AAVPHP.B_CDKL5载体治疗的Cdkl5 KO小鼠中仅注意到运动协调性的小幅改善(图6)。该证据表明TATk-CDKL5蛋白在改善Cdkl5 KO小鼠受损的运动功能方面更有效。
对刻板行为的影响
除了运动功能障碍之外，刻板运动是Cdkl5 KO小鼠的特征Fuchs和CDKL5患者N.Bahi-Buisson,T.Bienvenu,CDKL5-Related Disorders:From Clinical Descriptionto Molecular Genetics.Molecular syndromology 2,137-152(2012)。因此，我们通过对旷场场地角落的重复跳跃次数进行计数来评估经治疗的Cdkl5 KO小鼠的刻板行为。与野生型小鼠相比，Cdkl5 KO小鼠表现出更多次数的刻板跳跃(图7)。在用AAVPHP.B-_CDKL5载体或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体治疗的Cdkl5 KO小鼠中，刻板跳跃的次数急剧减少(图7)。特别地，在用AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体治疗的Cdkl5 KO小鼠中，跳跃次数变得与野生型小鼠相似，表明用TATk-CDKL5对刻板行为更好的治疗功效。
最后，为了检查基因疗法对运动刻板症的影响，在治疗之前和治疗30天之后测试了小鼠的后肢紧握(图8)。虽然野生型(+/Y)小鼠在较低比例的时间内表现出后肢紧握，但Cdkl5KO(-/Y)小鼠在测试阶段的约1/3中都处于紧握姿势(图8)。用AAVPHP.B_CDKL5载体或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体治疗的Cdkl5 KO小鼠表现出紧握减少(图8)，表明治疗诱导的运动刻板症的改善。重要的是，用AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体治疗的Cdkl5 KO小鼠表现出紧握时间更大程度且显著的减少，表明使用Igk-TATk-CDKL5的基因疗法对由于Cdkl5表达缺失而导致的刻板行为具有更大的积极影响。
对多动症的影响
Cdkl5 KO小鼠在旷场场地中表现出增加的多动症。与野生型小鼠相比，它们行进显著更长的距离，并且以更高的平均速度移动(图9)，表明增加的自发活动。我们发现用AAVPHP.B_CDKL5载体或AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体治疗的Cdkl5 KO小鼠表现出将这些行为降低到与野生型小鼠相当的水平的趋势，尽管不是统计学显著的(图9)。在用TATk-CDKL5治疗后60天获得最大的改善，同样在这种情况下。
对受损的学习和记忆行为表现的影响
使用巴恩斯迷宫在治疗后30天评估学习和记忆。我们发现，虽然与对照(+/Y)小鼠相比，载剂和AAVPHP.B_CDKL5治疗的Cdkl5 KO(-/Y)小鼠需要更长的时间来定位目标孔，但AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5治疗的Cdkl5 KO(-/Y)小鼠的学习能力得到改善(图10)。与野生型小鼠类似，用AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体治疗的Cdkl5 KO小鼠在同一天的试验中在测试的第一天和第二天表现出更快的学习改进(图10，下图)。在测试的第三天没有观察到学习的改善，因为小鼠记住了第一次试验中正确孔的位置(数据未示出)。
训练最后一天后的24小时，对参考记忆进行了探查测试。在Cdkl5 KO小鼠中观察到短期记忆受损，找到目标孔的延迟增加，并且找到目标孔之前的错误次数增加(图11)。用AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体治疗的Cdkl5-/Y小鼠显示找到孔的延迟有所改善，并且在检测到目标孔之前的错误次数显著改善(图11)。
这些结果表明TATk-CDKL5疗法对学习和记忆行为表现的影响。
对呼吸紊乱的影响
使用全身体积描记法(WBP)，我们最近发现，与对照小鼠相比，Cdkl5 KO中睡眠呼吸暂停的发生频率更高(G.Gao等人.,Clades of Adeno-associated viruses are widelydisseminated in human tissues.J Virol 78,6381-6388(2004))(图12)，表明Cdkl5 KO小鼠睡眠期间的呼吸紊乱。用AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5治疗导致REM睡眠期间呼吸暂停的次数急剧减少，变得与对照小鼠相似(图12)。
AAV载体转导的效率的评估
处死后，收集经治疗Cdkl5 KO小鼠的脑和肝脏。为了评估载体转导的效率，我们使用载体基因组特异性引物和用作数据归一化的内源对照的小鼠agouti基因的特异性引物对样品进行了基于SYBR Green的定量PCR分析，以确定收集的组织中每二倍体基因组当量中载体基因组(vg)拷贝数(即，vg/细胞)。我们的结果表明AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体和AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体具有相似的脑和肝转导效率(表1)。与AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5治疗的小鼠相比，AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5治疗小鼠的脑和肝脏中类似的CDKL5 RNA水平(图13)证实了转导效率。
脑中替代蛋白质的生物分布的评估
使用免疫组织化学分析了脑中CDKL5蛋白替代的效率。尽管AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体与AAVPHP.B_CDKL5载体相比表现出相似的感染效率(见表1)，但我们发现AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5载体导致更高的CDKL5蛋白质替代，因为TATk-CDKL5蛋白分泌和转导到相邻细胞中(图14和15)。
用于遗传性脑疾病疗法概念验证的开发
单基因疾病为使用不需要知晓突变基因的分子和细胞效应的疗法(例如基因疗法)提供了独特的机会。基因疗法包括用基因的健康拷贝替换突变的基因。然而，基因递送问题(尤其是在CNS中)尚未解决。我们发现，与没有IgK-TATk的CDKL5载体相比，携带IgK-TATk-CDKL5转基因机制的AAV载体显示出更高的治疗效果，证实了IgK-TATk-CDKL5方法的实用性和力量。
我们相信，这项研究提供了第一个原理证明，即基于IgK-TATk-CDKL5转基因的独特优势的创新基因疗法方法可以提高CDKL5疾病基因疗法的效率。我们方法的引人注目的特点是，未能接受治疗性基因的脑细胞也可以通过TATk-CDKL5的旁观者效应进行转导，从而增强治疗效果。
这些令人兴奋的结果意味着这种方法可能成为治疗CDD的有力工具，并且可以基于Igk-TATk融合蛋白方法的独特和引人注目的特性为其它单基因疾病的基因疗法开发开辟道路。
表1
CDKL5 TATk-CDKL5
皮质 0.14±0.01 0.16±0.08
小脑 0.54±0.09 0.56±0.28
肝脏 10.70±1.26 16.83±7.47
AAVPHP.B_CDKL5(n＝4)载体和AAVPHP.B_Igk-TATk-CDKL5(n＝4)载体的静脉内注射后的脑和肝脏转导。通过qPCR评估载体基因组向脑(皮质和小脑)和肝脏的传播。数值代表平均值±SEM。
序列表
<110> 俄勒冈健康科学大学（Oregon Health & Science University）
博洛尼亚大学（Alma Mater Studiorum- Università di Bologna）
<120> 增强脑基因疗法的效率的创新策略
<130> BI5340R-RVO
<160> 29
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 小鼠IgK
<400> 1
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp
20
<210> 2
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<223> 人 OSMMGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASM
<400> 2
Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met
20 25
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VSV-G
<400> 3
Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人IgG2 H
<400> 4
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BM40
<400> 5
Met Arg Ala Trp Ile Phe Phe Leu Leu Cys Leu Ala Gly Arg Ala Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Secrecon
<400> 6
Met Trp Trp Arg Leu Trp Trp Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Pro Met Val Trp Ala
20
<210> 7
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人IgKVIII
<400> 7
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys
20
<210> 8
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD33
<400> 8
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 9
<211> 23
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223> tPA
<400> 9
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Ser
20
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人胰凝乳蛋白酶原
<400> 10
Met Ala Phe Leu Trp Leu Leu Ser Cys Trp Ala Leu Leu Gly Thr Thr
1 5 10 15
Phe Gly
<210> 11
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人胰蛋白酶原2
<400> 11
Met Asn Leu Leu Leu Ile Leu Thr Phe Val Ala Ala Ala Val Ala
1 5 10 15
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人IL-2
<400> 12
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Gaussia luc
<400> 13
Met Gly Val Lys Val Leu Phe Ala Leu Ile Cys Ile Ala Val Ala Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白(HSA)
<400> 14
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Ser Ser Ala Tyr Ser
1 5 10 15
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 流感血凝素
<400> 15
Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Phe Cys Leu Val Leu Gly
1 5 10 15
<210> 16
<211> 24
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人胰岛素
<400> 16
Met Ala Leu Trp Met Arg Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu
1 5 10 15
Trp Gly Pro Asp Pro Ala Ala Ala
20
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV-1 TATk
<400> 17
Tyr Ala Arg Lys Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MPG
<400> 18
Gly Leu Ala Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 19
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PEP-1
<400> 19
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Val
20
<210> 20
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ARF(1–22)
<400> 20
Met Val Arg Arg Phe Leu Val Thr Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly
1 5 10 15
Pro Pro Arg Val Arg Val
20
<210> 21
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> BPrPr(1−30)
<400> 21
Met Val Lys Ser Lys Ile Gly Ser Trp Ile Leu Val Leu Phe Val Ala
1 5 10 15
Met Trp Ser Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro
20 25 30
<210> 22
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAP
<400> 22
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 23
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 天青蛋白p28
<400> 23
Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala
1 5 10 15
Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp
20 25
<210> 24
<400> 24
000
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C105Y
<400> 25
Pro Phe Val Tyr Leu Ile
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C105Y
<400> 26
Pro Phe Val Tyr Leu Ile
1 5
<210> 27
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M918
<400> 27
Met Val Thr Val Leu Phe Arg Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Cys Gly
1 5 10 15
Pro Pro Arg Val Arg Val
20
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> DPV3
<400> 28
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 22
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人乳铁蛋白
<400> 29
Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys Val Arg Gly Pro Pro
1 5 10 15
Val Ser Cys Ile Lys Arg
20

Claims (42)

1.一种基因疗法载体，包含编码分泌前导序列的第一核酸、所述第一核酸可操作地连接的编码蛋白质转导结构域(PTD)的第二核酸、所述第二核酸可操作地连接的编码治疗性蛋白质的第三核酸。
2.根据权利要求1所述的基因疗法载体，其中所述载体是腺相关病毒载体(AAV)。
3.根据权利要求2所述的基因疗法载体，其中所述载体是具有用于CNS基因疗法的最佳血清型的载体。
4.根据权利要求3所述的基因疗法载体，其中所述AAV载体是以下一种：AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13。
5.根据权利要求4所述的本发明的基因疗法载体，其中所述载体包含编码以下的核苷酸构建体：在两个AAV2反向末端重复(ITR)之间的CBh启动子、编码分泌前导序列的第一核苷酸序列、所述第一核苷酸可操作地连接的编码蛋白质转导结构域(PTD)的第二核酸、所述第二核酸可操作地连接的编码治疗性蛋白质的第三核酸和SV40多腺苷酸化信号。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的基因疗法载体，其中所述分泌前导序列是以下一种前导序列：小鼠IgK、人OSM、VSV-G、人IgG2H、BM40、Secrecon、人IgKVIII、CD33、Tpa、人胰凝乳蛋白酶原、人胰蛋白酶原-2、人IL-2、Gaussialuc、白蛋白(HSA)、流感血凝素或人胰岛素。
7.根据权利要求6所述的基因疗法载体，其中所述分泌前导序列具有由SEQ ID NO 1-16中的一种限定的序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的基因疗法载体，其中所述PTD是以下一种前导序列：TATk、MPG、Pep-1、ARF(1-22)、BPrPr(1-30)、MAP、p28、VT5、C105Y、M918、DPV3、人乳铁蛋白。
9.根据权利要求8所述的基因疗法载体，其中所述PTD具有由SEQ ID NO 17-29中的一种限定的序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的基因疗法载体，其中所述载体是AAV载体，所述分泌前导序列是小鼠IgK并且所述PTD是TATk。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的基因疗法载体，其中所述治疗性蛋白质是用于CNS疗法的蛋白质。
12.根据权利要求11所述的基因疗法载体，其中所述治疗性蛋白质是人的以下一种：CDKL5、MECP2、FOXG1、SCN1A、NLGN3、SHANK3、ASPA、PAH。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的基因疗法载体，用于在基因疗法治疗中使用。
14.根据权利要求13使用的所述基因疗法载体，其中所述治疗是单基因疾病的治疗。
15.根据权利要求13或14中任一项使用的所述基因疗法载体，其中所述治疗是CNS基因疗法治疗。
16.根据权利要求15使用的所述基因疗法载体，其中所述基因疗法治疗是针对影响脑的疾病。
17.根据权利要求16使用的所述基因疗法载体，其中所述影响脑的疾病是以下一种：FXS、德拉韦综合征、ASD、Phelan-McDermid综合征或雷特综合征。
18.一种病毒颗粒，由病毒衣壳和基因疗法载体组成，所述基因疗法载体包含编码分泌前导序列的第一核酸、所述第一核酸可操作地连接的编码蛋白质转导结构域(PTD)的第二核酸、所述第二核酸可操作地连接的编码治疗性蛋白质的第三核酸。
19.根据权利要求18所述的病毒颗粒，其中所述衣壳是AAV衣壳并且所述基因疗法载体是腺相关病毒载体(AAV)。
20.根据权利要求19所述的病毒颗粒，其中所述载体是具有用于CNS基因疗法的最佳血清型的载体。
21.根据权利要求20所述的病毒颗粒，其中所述AAV衣壳是AAV-PHP、AAV9、AAV-BR1、AAV-Retro衣壳中的一种。
22.根据权利要求21所述的病毒颗粒，其中所述AAV-PHP衣壳是AAV-PHP.B、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.S或AAV-PHP.A。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的病毒颗粒，其中所述分泌前导序列是以下一种前导序列：小鼠IgK、人OSM、VSV-G、人IgG2H、BM40、Secrecon、人IgKVIII、CD33、Tpa、人胰凝乳蛋白酶原、人胰蛋白酶原-2、人IL-2、Gaussialuc、白蛋白(HSA)、流感血凝素或人胰岛素。
24.根据权利要求23所述的病毒颗粒，其中所述分泌前导序列具有由SEQ ID NO 1-16中的一种限定的序列。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的病毒颗粒，其中所述PTD是以下一种前导序列：TATk、MPG、Pep-1、ARF(1-22)、BPrPr(1-30)、MAP、p28、VT5、C105Y、M918、DPV3、人乳铁蛋白。
26.根据权利要求25所述的病毒颗粒，其中所述PTD具有由SEQ ID NO 17-29中的一种限定的序列。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的病毒颗粒，其中所述载体是AAV载体，所述分泌前导序列是小鼠IgK并且所述PTD是TATk。
28.根据权利要求18至27中任一项所述的病毒颗粒，其中所述治疗性蛋白质是用于CNS疗法的蛋白质。
29.根据权利要求28所述的病毒颗粒，其中所述治疗性蛋白质是人的以下一种：CDKL5、MECP2、FOXG1、SCN1A、NLGN3、SHANK3、ASPA、PAH。
30.根据权利要求18至29中任一项所述的病毒颗粒，用于在基因疗法治疗中使用。
31.根据权利要求30使用的所述病毒颗粒，其中所述治疗是单基因疾病的治疗。
32.根据权利要求30或31中任一项使用的所述病毒颗粒，其中所述治疗是CNS基因疗法治疗。
33.根据权利要求32使用的所述病毒颗粒，其中所述基因疗法治疗是针对影响脑的疾病。
34.根据权利要求33使用的所述病毒颗粒，其中所述影响脑的疾病是以下一种：FXS、德拉韦综合征、ASD、Phelan-McDermid综合征或雷特综合征。
35.一种药物组合物，包含根据权利要求18-29中任一项所述的病毒颗粒和药学上可接受的载体。
36.根据权利要求35所述的药物组合物，用于在基因疗法治疗中使用。
37.根据权利要求36使用的所述组合物，其中所述治疗是单基因疾病的治疗。
38.根据权利要求35或36中任一项使用的所述组合物，其中所述治疗是CNS基因疗法治疗。
39.根据权利要求37使用的所述组合物，其中所述基因疗法治疗是针对影响脑的疾病的治疗。
40.根据权利要求38使用的所述组合物，其中所述影响脑的疾病是以下一种：CDKL5缺乏症、德拉韦综合征、苯丙酮尿症、ASD、Phelan-McDermid综合征、卡纳万病或雷特综合征。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的组合物，用于通过全身注射、中枢神经系统递送或气雾剂/鼻递送施用。
42.根据权利要求41所述的组合物，用于静脉注射施用，脑的特定区域例如脑室内、脑池的实质内施用，腰椎或鞘内施用，或动脉内注射施用，或用于直接施用至脑脊液中。
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